一、端粒酶激活与细胞永生化（论文文献综述）
刘育昆,邹登朗,祁得胜,刘忠浩,都玉蓉,马建滨[1]（2021）在《细胞永生化技术研究进展》文中进行了进一步梳理细胞永生化作为细胞生物学研究的热点,在细胞实验中发挥很大的作用,使目的细胞永生化,建立永生化细胞系,可以更好地开展细胞实验。细胞永生化技术的成功应用,不仅为生物实验研究提供了有力的工具,也为有效准确地诊断疾病提供了新道路。本文在细胞永生化基本机制的基础上,就细胞永生化技术方法、检测方法以及存在的问题等方面研究进展进行概述。
戴薇[2]（2019）在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中研究表明癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因（direct target gene,DTG）,包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因（包括126个激活基因和90个抑制基因）是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达（NF-κB-activated gene expression,Nage）载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列（decoy）与最小启动子序列（minimal promoter）融合构成NF-κB特异性启动子（decoy minimal promoter,DMP）,DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达（telomerase-activated gene expression,Tage）系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞（BMSC）不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶（homothallic switching endonuclease,HO）切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和NF-κB激活的基因表达（Nage）载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒（AAV）中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达（Nage）载体、端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
蒙正群[3]（2018）在《兔脾脏成纤维型细胞RS-17的建系及RHDV SCH04株感染试验》文中认为兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease,RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）引起的一种急性、高传染性和致死性兔病,该病主要以呼吸系统出血、实质器官淤血水肿、肝脏坏死、淤血及出血性变化为主要特征,严重危害着世界养兔业的发展。RHDV为单股正链RNA病毒,基因组全长约7.5kb。目前RHDV在体外尚无稳定分离培养的细胞系,严重影响着RHDV的细胞侵染机理和防控等方面的研究。为探索RHDV侵染机制,本研究通过酶消化法对乳兔脾脏原代细胞进行了分离培养与建系,并进行建系细胞的RHDV初步感染试验,具体内容如下:1、培养乳兔原代细胞的过程中,从脾脏组织中分离出一株成纤维型形态的细胞,命名为RS-17,通过对细胞传代培养条件优化、细胞标志性蛋白检测、细胞生长曲线、细胞核型以及细胞致瘤性等进行测定,以对细胞的生长特性以及生物学特性进行研究。结果显示RS-17细胞具有血清依懒性、成纤维细胞标志性蛋白检测阳性、具有正常的核型、无致瘤性,且目前细胞传至95代仍可稳定生长。这为RHDV感染机制相关研究提供了细胞材料。2、根据RHDV的基因结构,本文拟设计七对引物对本实验室保存的RHDV SCH04株进行全基因测序,并参照NCBI已登录的32株RHDV病毒VP60基因序列,ORF2基因序列以及全基因序列对其进行遗传进化分析以及比较,结果SCH04基因组全长7439 bp、与32株参考毒株全基因的核苷酸同源性为78.3%99.8%;与VP60基因序列核苷酸同源性79.1%以上,ORF2编码基因序列核苷酸与32株参考毒株核苷酸同源性为84.2%99.2%,进化树显示SCH04属于抗原变异株RHDVa（GI.1a）基因群。SCH04株全基因序列的测定与分析不仅丰富了RHDV的流行病学材料;而且为感染试验提供了可靠的RHDV背景资料。3、用RHDV SCH04毒株分别进行家兔原代肾脏细胞感染、RS-17感染、以及SCH04株RNA在RS-17细胞转染研究,感染后观察细胞的CPE并收取细胞利用Taq-Man实时荧光定量RT-PCR的检测方法进行检测。结果显示SCH04株在感染肾脏原代细胞后出现轻微CPE,荧光定量检测细胞内病毒核酸含量阳性;RS-17细胞在首次感染时细胞出现CPE,但是随着继续盲传,细胞CPE减弱,荧光定量检测病毒核酸含量随着传代次数增多而减少,传第4次后细胞病毒核酸检测阴性;RNA转染RS-17细胞后,随着时间延长,细胞皱缩变多,CPE明显,荧光定量检测细胞病毒核酸含量阳性,为进一步RHDV细胞侵染机制研究提供了科学参考。
黄今,杨融辉,马海英[4]（2015）在《细胞永生化机制及不同细胞永生化方法研究进展》文中提出永生化细胞是一种在理化刺激、基因突变、病毒感染等外界刺激下,可以在体外无限增殖的不衰老细胞株。细胞永生化机制有放射性因素、端粒-端粒酶激活、病毒基因转染及抑癌基因受抑制等学说。作者在总结细胞永生化原理的基础上阐述不同组织细胞永生化的技术方法及生长状态。
罗琼,熊树华,舒宽勇,李景平[5]（2013）在《16型人乳头瘤病毒E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变发展中的表达及意义》文中提出目的研究16型人乳头瘤病毒（HPV16）E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈癌组织的表达,探讨其与宫颈癌前病变恶性进展间的关系,为寻找预测宫颈癌前病变转归方向的分子指标做一探索。方法采用免疫组织化学EnVision二步法检测30例原发性浸润性宫颈癌（ICC组,n=30）、CIN[CINⅠ-Ⅱ组,n=60;CINⅢ（含原位癌）组,n=30]、正常宫颈组织标本（正常组,n=10）中HPV16E6、E7蛋白和端粒酶的表达。结果 HPV16E6、E7蛋白和端粒酶在正常组、CINⅠ-Ⅱ组、CINⅢ组和ICC组中的阳性表达均呈逐级增高趋势。HPV16E6蛋白的表达:ICC组高于正常组,CINⅢ组高于正常组、CINⅠ-Ⅱ组,差异均有统计学意义（P<0.05）;HPV16E7蛋白的表达:ICC组、CINⅢ组高于正常组,差异均有统计学意义（P<0.05）;端粒酶的表达:ICC组高于CINⅢ组,CINⅢ组高于CINⅠ-Ⅱ组,差异均有统计学意义（P<0.05）。HPV16E6与HPV16E7蛋白、HPV16E6蛋白与端粒酶、HPV16E7蛋白与端粒酶的表达呈正相关（r=0.272,P<0.05;r=0.279,P<0.05;r=0.376,P<0.01）。结论 HPV16E6、E7蛋白和端粒酶随宫颈病变CIN的升级其阳性表达率、表达强度呈逐渐递增趋势。在宫颈癌变过程中HPV16E6、E7蛋白和端粒酶的阳性表达均呈正相关。HPV16E6、E7蛋白和端粒酶作为CIN的预后因子还尚待进一步研究。
庄金秋,梅建国,王文秀,沈志强[6]（2012）在《细胞永生化技术及其应用研究进展》文中进行了进一步梳理细胞永生化是目前细胞生物学研究的热点之一。引起细胞永生化的因素很多,其中端粒酶在这一过程中发挥重要作用。细胞永生化技术在未来的成功应用,不仅为生物制品的研究与开发提供了有力工具,而且也为疾病的诊断与治疗提出了新的思路。该文就细胞永生化技术的原理、方法、途径及其应用等方面研究进展作一综述。
范瑞岗,万艳平[7]（2011）在《高危型人乳头瘤病毒E6蛋白与hTERT的相互作用研究进展》文中提出人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）是一类能特异性感染人皮肤和黏膜基底上皮细胞的双链闭合环状DNA病毒。宫颈癌的病因学研究表明,生殖道感染高危型HPV（High-risk HPV,HR-HPV）是宫颈癌和宫颈上皮内瘤变
庄金秋,梅建国,王文秀,沈志强[8]（2011）在《细胞永生化技术及其应用研究进展》文中提出细胞永生化是目前细胞生物学研究的热点之一.引起细胞永生化的因素很多,其中端粒酶在这一过程中发挥重要作用.细胞永生化技术在未来的成功应用,不仅为生物制品的研究与开发提供了有力工具,而且也为疾病的诊断与治疗提出了新的思路.就细胞永生化技术的原理、方法、途径及其应用等方面研究进展作一综述.
罗琼[9]（2009）在《HPV16E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变发展中的表达及意义》文中研究表明目的:研究HPV16 E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织的表达,探讨其与宫颈癌前病变的恶性进展之间的关系,为下一步寻找预测宫颈癌前病变转归方向的分子指标做一探索。方法:采用免疫组织化学Elivision法检测30例原发性浸润性宫颈癌（ICC）,90例宫颈上皮内瘤变（CIN）,包括CINⅠ-Ⅱ60例,CINⅢ（含原位癌）30例,10例正常宫颈组织标本中HPV16E6、E7蛋白和端粒酶的表达。实验数据的统计方法:计数资料采用χ2检验、Fisher确切概率法,强度等级资料采用秩转换的非参数检验（Kruskal-Walls H检验）,相关性检验采用Spearman相关分析。结果:1. HPV16E6蛋白在正常宫颈、CINⅠ-Ⅱ、CINⅢ和浸润性宫颈癌（ICC）组织中的阳性表达率分别为20.0%、35.0%、70.0%和86.7%,呈逐渐增高趋势。HPV16E6蛋白的表达强度ICC高于其它组织（P<0.05）,CINⅢ高于CINⅠ-Ⅱ和正常宫颈（P<0.05）; CINⅠ-Ⅱ、正常宫颈之间无明显差异（P>0.05）。2. HPV16E7蛋白在正常宫颈、CINⅠ-Ⅱ、CINⅢ和浸润性宫颈癌（ICC）组织中的阳性表达率分别为30.0%、63.3%、76.7%,96.7%,呈逐渐增高趋势。HPV16E7蛋白的表达强度ICC高于其它组织（P<0.05）,CINⅢ高于CINⅠ-Ⅱ和正常宫颈（P<0.05）,CINⅠ-Ⅱ高于正常宫颈（P<0.05）。3.端粒酶在正常宫颈、CINⅠ-Ⅱ、CINⅢ及浸润性宫颈癌中的阳性表达率分别为30.0%、41.7%、70.0%,93.3%,呈逐渐增高趋势。端粒酶的表达强度ICC高于其它组织（P<0.05）,CINⅢ高于CINⅠ-Ⅱ和正常宫颈（P<0.05）; CINⅠ-Ⅱ、正常宫颈之间无明显差异（P>0.05）。4. HPV16E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈病变组织中表达的相关性:HPV16 E6与HPV16E7蛋白的表达呈正相关（rs =0.272,P<0.05）;HPV16E6蛋白与端粒酶的表达呈正相关（rs =0.279,P<0.05）;HPV16E7蛋白与端粒酶在宫颈病变组织中的表达呈明显正相关（rs=0.376,P<0.01）。结论:1.HPV16E6、E7蛋白和端粒酶随宫颈病变CIN的升级而阳性表达率、表达强度呈逐渐递增趋势。2.在宫颈癌变过程中HPV16E6、E7蛋白和端粒酶的阳性表达均呈正相关关系。3. HPV16E6、E7蛋白和端粒酶可能作为CIN的预后因子还需做进一步研究。
彭新荣[10]（2008）在《提高牛体细胞核移植效率的研究》文中进行了进一步梳理为提高牛体细胞核移植和生产转基因动物的效率,本研究主要从囊胚发育率,囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡指数三个方面研究了供体细胞转染端粒酶和癌化对体细胞核移植的影响,卵母细胞胞质成熟与重构胚胎发育的关系,激活方法与重构胚发育的关系,以及核移植胚胎体外培养与胚胎发育和冷冻的关系。试验研究结果如下。1、本研究首先用含人端粒酶催化亚基（hTERT）基因和报告基因EGFP的表达载体转染了牛耳成纤维细胞系,通过RT-PCR,端粒酶活性分析和Western杂交证明hTERT可以整合在牛耳成纤维细胞基因组中并表达端粒酶蛋白,人的端粒酶基因与牛的端粒酶相关基因可以互相协作,表达端粒酶蛋白。hTERT在牛耳成纤维细胞中的表达延长了细胞寿命,建立了一株染色体条带正常,贴壁生长的牛耳成纤维细胞系,命名为HBC3。2、HBC3的生长曲线仍保持正常细胞的生物学特性,EGF和胰岛素对HBC3仍有明显的促生长作用,添加EGF和胰岛素后细胞的倍增指数分别为5.1和4.7,其中EGF的促生长作用比胰岛素促生长的作用显着（P <0.05）。HBC3细胞系仍需依赖血清维持生长。但是,端粒酶的表达明显降低了血清引起的细胞凋亡,流式细胞仪进行细胞凋亡分析,结果表明,第64代的HBC3细胞凋亡率明显低于第12代的牛耳成纤维细胞（BFC）细胞,差异极显着（P <0.01）。3、HBC3做供体细胞的核移植重构胚可以发育到囊胚,重构胚的囊胚发育率与对照组差异不显着。但是,HBC3的重构胚囊胚细胞数显着少于用BFC构建的核移植胚胎,HBC3的囊胚细胞凋亡数和凋亡指数也明显少于BFC的重构胚,且差异显着（P <0.05）。4、致癌物DMBA与促癌物TPA联合作用BFC,得到两株寿命延长的细胞系,分别命名为ABF11和ABF12。ABF11的形态为长梭形,ABF12的形态为三角形,两株细胞系均有端粒酶活性,对ABF12进行了生物学特性分析,细胞在接种后,有较长的生长潜伏期,后进入对数生长期,但没有正常细胞的生长平台期,ABF12和BFC细胞系在分别在含血清的培养液生长9天的倍增指数分别为5.3和4.3,差异显着（P <0.05）,试验结果表明ABF12细胞系已经失去了细胞接触生长抑制性。传代后ABF12和BFC细胞系在无血清的培养液里生长9天的倍增指数分别为5.0和-1.2,结果表明ABF12已经失去了对血清的生长依赖性。用软琼脂培养ABF12细胞系14d, ABF12在软琼脂内生长了172个单细胞克隆,结果表明ABF12细胞已经失去了贴壁依赖性。5、ABFE12细胞用于体细胞核移植后,能支持胚胎发育至囊胚阶段,但囊胚发育率低于对照组,差异显着（P <0.05）。通过染色分析,ABF12重构胚的囊胚细胞数与对照组差异不显着,但囊胚细胞的凋亡指数明显高于对照组,二者分别为0.124和0.081,差异显着（P <0.05）。6、牛卵母细胞成熟培养液中添加EGF显着提高了牛卵母细胞成熟率,用EGF培养的卵母细胞在做为受体胞质进行体细胞核移植后,体细胞重构胚的囊胚率和囊胚细胞数均显着高于不添加EGF的对照组（P <0.05）。凋亡染色分析表明,EGF培养的卵母细胞做受体后,重构胚胎的凋亡指数为0.062,比对照组显着降低（P <0.05）。培养液中添加EGF的卵母细胞在冷冻保存和体外受精后,卵母细胞的形态正常率、受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显着高于对照组。牛卵母细胞成熟培养液中添加VE后,牛卵母细胞成熟率和重构胚的囊胚率与对照组相比均差异不显着。凋亡染色分析表明,用VE培养的卵母细胞做受体胞质,重构胚胎的囊胚细胞凋亡指数为0.064,与对照组相比,显着降低了（P <0.05）囊胚细胞的凋亡指数。而用VE培养的卵母细胞冷冻保存后,卵母细胞的形态正常率,体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均与对照组差异不显着。牛卵母细胞成熟培养液中添加OCS后,牛卵母细胞成熟率显着高于添加FBS培养组（P <0.05）,用OCS成熟培养的卵母细胞做胞质受体,进行体细胞核移植后,重构胚的囊胚率显着高于添加FBS的卵母细胞组（P <0.05）。囊胚细胞染色分析表明,OCS组的囊胚细胞数显着高于FBS卵母细胞组（P <0.05）,凋亡染色分析表明,OCS组的囊胚细胞凋亡指数为0.072,显着低于对照FBS组。而且,培养液中添加OCS的卵母细胞在冷冻保存和体外受精后,受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显着高于对照FBS组（P <0.05）。7、比较了不同浓度精子提取物胞质内注射对牛核移植重构胚胎的卵裂率和囊胚率的影响,结果发现单独注射精子提取物可以很好的支持体细胞胞重构胚发育到囊胚阶段,其中注射5mg/ml精子提取物组的重构胚卵裂率和囊胚率均显着高于其他两个注射剂量组（P <0.05）。5mg/ml精子提取物组的囊胚细胞数显着高于其他试验组（P <0.05）,而5mg/ml精子提取物组的凋亡指数为0.071,显着低于其他组（P <0.05）。其次,比较了精子提取物联合其他激活方法使用与单独使用精子提取物激活对核移植胚胎的影响。结果表明,单独注射精子提取物或联合其他方法一起使用对体细胞核移植胚胎的的卵裂率,囊胚率,囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡指数没有显着的影响。8、比较了传统的电激活和化学激活方法对核移植胚胎的影响,以及联合使用两种激活方法（电化学法）对核移植胚胎的卵裂率和囊胚率的影响,结果表明,电化学法激活核移植胚的卵裂率和囊胚率均显着高于单独使用电激活或化学激活方法。其次,比较了精子提取物与电化学方法对核移植胚胎的影响。这两种激活方法的卵裂率和囊胚率差异不明显,但是精子提取物激活的重构胚的囊胚细胞数明显要高于电化学法（P <0.05）,精子提取物法的囊胚凋亡指数也明显（P <0.05）低于后者。9、在牛体细胞核移植胚胎培养液中添加20ng/ml EGF,重构胚的囊胚发育率为34%,显着高于不添加EGF的对照组（P﹤0.05）。添加EGF的胚胎的囊胚细胞凋亡指数为0.062,显着低于对照组的细胞凋亡指数。对EGF组和对照组的胚胎进行冷冻保存并解冻培养,EGF组胚胎在解冻24h后的存活率显着高于对照组（P﹤0.05）,在解冻48h后的存活率也显着高于对照组（P﹤0.05）。在牛体细胞核移植胚胎培养液中分别添加0.1μg/ml和1μg/ml孕酮后均显着提高了重构胚的囊胚发育率均显着高于对照组21%的囊胚率。添加0.1μg/ml和1μg/ml孕酮组的细胞凋亡指数分别为0.090和0.085,两组之间的胚胎细胞凋亡数和凋亡指数均差异不显着,与对照组相比差异也不显着。不同孕酮组胚胎在解冻24h后的存活率与对照组差异不显着。在解冻48h后的存活率与对照组差异不显着。在牛体细胞核移植胚胎培养液中添加100μg/ml抗氧化剂VE并没有对核移植胚胎的卵裂率产生不利影响。添加VE显着提高了重构胚胎的发育率,降低了囊胚的凋亡指数,对照组的细胞凋亡指数为0.090,VE组为0.037,差异极显着（P﹤0.01）。10、首先,分别在核移植胚胎的冷冻保存液中添加海藻糖和蔗糖,用海藻糖冷冻的胚胎解冻后24h和48h的存活率显着（P﹤0.05）高于添加蔗糖的试验组。其次,分别对不同发育时期的核移植重构胚胎进行冷冻保存。解冻后桑胚的24h和48h的胚胎存活率显着（P﹤0.05）低于早期囊胚组和晚期囊胚组。
二、端粒酶激活与细胞永生化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、端粒酶激活与细胞永生化（论文提纲范文）
（1）细胞永生化技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 细胞永生化原理 |
| 2 促细胞永生化的几种方法 |
| 2.1 筛选自发突变产生的永生化细胞 |
| 2.2 化学致癌物以及射线因素产生细胞永生化 |
| 2.3 病毒感染诱导细胞永生化 |
| 2.3.1 人乳头状瘤病毒(HPV) |
| 2.3.2 EB病毒 |
| 2.3.3 猴肾病毒(SV40) |
| 2.4 端粒-端粒酶激活诱导细胞永生化 |
| 2.5 可回复性永生化 |
| 3 永生化细胞检测方法 |
| 3.1 检测永生化细胞外源基因的整合与表达 |
| 3.2 端粒酶活性的检验 |
| 3.3 永生化细胞表面抗原的检测 |
| 3.4 永生化细胞功能的检测 |
| 4 结语与展望 |
（2）NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
| 1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
| 1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
| 1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
| 1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
| 1.3 端粒酶与癌症 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 癌症干细胞 |
| 1.4.1 CSC的生物学特性 |
| 1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
| 1.4.3 NF-κB与 CSC |
| 1.5 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞siRNA干扰 |
| 2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
| 2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR |
| 2.3.6 Ch IP-qPCR |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
| 2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
| 2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
| 2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
| 2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
| 2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
| 2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.9 qPCR检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 细胞培养和转染 |
| 3.3.3 Western blotting |
| 3.3.4 细胞增殖能力测定 |
| 3.3.5 相对端粒长度检测 |
| 3.3.6 病毒包装和纯化 |
| 3.3.7 病毒滴度测定 |
| 3.3.8 病毒感染 |
| 3.3.9 动物实验 |
| 3.3.10 qPCR检测 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
| 3.4.2 Nage载体特异性验证 |
| 3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.4 相对端粒长度检测 |
| 3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
| 3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 细胞培养和转染 |
| 4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
| 4.3.4 端粒合成检测 |
| 4.3.5 相对端粒长度检测 |
| 4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
| 4.3.7 病毒感染 |
| 4.3.8 动物实验 |
| 4.3.9 qPCR检测 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Tage系统特异性验证 |
| 4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
| 4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.4 相对端粒长度检测 |
| 4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
| 4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
| 4.4.7 Tage系统优化 |
| 4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 细胞培养和转染 |
| 5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
| 5.3.4 病毒感染 |
| 5.3.5 细胞活力测定 |
| 5.3.6 RT-qPCR检测 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
| 5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
| 5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
| 5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
| 5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
| 5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（3）兔脾脏成纤维型细胞RS-17的建系及RHDV SCH04株感染试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 RHDV简介 |
| 1.1 分类 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 RHDV遗传进化分析 |
| 1.4 RHDV的分离培养 |
| 2 细胞永生化 |
| 2.1 放射性物质辐射 |
| 2.2 原癌基因及抑癌基因 |
| 2.3 病毒基因转染 |
| 2.4 端粒-端粒酶激活 |
| 3 研究意义与目的 |
| 第二章 兔脾脏成纤维细胞RS-17的建系 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液的配制 |
| 2.2 乳兔脾脏原代细胞的培养 |
| 2.3 乳兔脾脏细胞的传代培养 |
| 2.4 RS-17的保存 |
| 2.5 RS-17的复苏 |
| 2.6 MTT法检测血清依赖性 |
| 2.7 RS-17标志性蛋白的免疫荧光检测 |
| 2.8 RS-17细胞生长曲线的测定 |
| 2.9 RS-17细胞染色体观察 |
| 2.10 RS-17细胞致瘤性 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 兔原代细胞观察 |
| 3.2 RS-17细胞的传代 |
| 3.3 RS-17的冻存与复苏 |
| 3.4 RS-17细胞血清依懒性 |
| 3.5 RS-17细胞标志性蛋白的免疫荧光检测 |
| 3.6 RS-17细胞的生长曲线 |
| 3.7 RS-17细胞染色体观察 |
| 3.8 RS-17细胞致瘤性 |
| 4 讨论 |
| 第三章 RHDVSCH04株全基因测序及遗传进化分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物、毒株、菌种 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 RHDVSCH04株家兔感染 |
| 2.3 病毒RNA提取 |
| 2.4 RT-PCR |
| 2.5 胶回收 |
| 2.6 胶回收产物的克隆和序列测定 |
| 2.7 序列同源性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SCH04株家兔感染 |
| 3.2 SCH04株基因组的扩增 |
| 3.3 SCH04株与参考毒株各基因序列同源性比较分析 |
| 4 结果分析与讨论 |
| 第四章 RHDVSCH04株细胞感染试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料、细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 RHDVSCH04株病毒匀浆液的制备 |
| 2.2 SCH04株感染兔肾脏原代细胞 |
| 2.3 SCH04株感染RS-17细胞以及盲传 |
| 2.4 SCH04株病毒RNA转染RS-17细胞 |
| 3 结果 |
| 3.1 SCH04株原代细胞感染 |
| 3.2 RS-17细胞感染以及盲传 |
| 3.3 病毒RNA转染 |
| 4 结果分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（4）细胞永生化机制及不同细胞永生化方法研究进展（论文提纲范文）
| 1细胞永生化机制 |
| 1.1放射性因素 |
| 1.2端粒-端粒酶激活 |
| 1.3病毒基因转染 |
| 1.4原癌基因与抑癌基因 |
| 2不同细胞永生化的方法及机制 |
| 2.1肝细胞永生化方法 |
| 2.2上皮细胞永生化方法 |
| 2.3心肌细胞永生化方法 |
| 2.4胚胎滋养层细胞永生化方法 |
| 3展望 |
（5）16型人乳头瘤病毒E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变发展中的表达及意义（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HPV16 E6、E7蛋白和端粒酶表达的检测 |
| 1.2.2 HPV16 E6、E7蛋白和端粒酶表达结果判断标准 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HPV16 E6蛋白在宫颈病变中的表达 |
| 2.2 HPV16 E7蛋白在宫颈病变中的表达 |
| 2.3 端粒酶在宫颈病变中的表达 |
| 2.4 HPV16 E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈病变组织中表达的相关性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 HPV16 E6、E7蛋白表达的意义 |
| 3.2 端粒酶表达的意义 |
| 3.3 宫颈癌及癌前病变中HPV16 E6、E7蛋白和端粒酶表达的相互关系和意义 |
（7）高危型人乳头瘤病毒E6蛋白与hTERT的相互作用研究进展（论文提纲范文）
| 1 HR-HPV E6蛋白与细胞转化 |
| 2 端粒酶及h TERT |
| 3 E6蛋白与h TERT相互作用的机制 |
| 3.1 通过c-Myc介导 |
| 3.2 通过E6AP介导 |
| 3.3 通过Cp G岛甲基化作用 |
| 3.4 通过转录后水平调控 |
| 4 结语 |
（8）细胞永生化技术及其应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 细胞永生化的作用机理 |
| 2 促使细胞永生化的基本方法 |
| 2.1 端粒和端粒酶 |
| 2.1.1 端粒 |
| 2.1.2 端粒酶 |
| 2.2 传统细胞永生化基因 |
| 2.2.1 病毒 |
| 2.2.1. 1 EB病毒 |
| 2.2.1. 2 SV40病毒 |
| 2.2.1. 3 其它病毒 |
| 2.2.2 原癌基因 |
| 2.2.3 抑癌基因p53与p RB突变体 |
| 2.2.4 放射因素 |
| 2.3 基因转染 |
| 3 已建成的永生化细胞系 |
| 4 永生化细胞的检测方法 |
| 4.1 检测外源基因在细胞中的整合及表达情况 |
| 4.2 端粒酶活性的检测 |
| 4.3 永生化细胞表面抗原的检测 |
| 4.4 永生化细胞功能的检测 |
| 5 永生化细胞目前存在的问题及发展前景 |
（9）HPV16E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变发展中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1.主要材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 免疫组化结果判断 |
| 2.4 统计处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 HPV16E6 蛋白、HPV16E7 蛋白和端粒酶在宫颈病变中的表达 |
| 3.2 HPV16E6、HPV16 E7 蛋白和端粒酶在不同宫颈组织表达中的相 关性 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 HPV16 E6 和 E7 蛋白在不同宫颈组织中的表达与意义 |
| 4.2 端粒酶在不同宫颈组织中的表达与意义 |
| 4.3 HPV16 E6、E7 蛋白和端粒酶在宫颈病变组织中表达的相关性 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（10）提高牛体细胞核移植效率的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 体外培养细胞的永生化 |
| 1.1 永生化的概念和永生化细胞的特性 |
| 1.2 细胞永生化的机理 |
| 1.2.1 端粒、端粒酶与永生化 |
| 1.2.2 p16~(INK4a)-CDK4/6-cyclin D-Rb-E2F 信号通路与永生化 |
| 1.2.3 p14ARF－MDM2-p53 信号通路与永生化 |
| 1.2.4 表观遗传与永生化 |
| 1.3 细胞永生化的方法 |
| 1.3.1 理化因素 |
| 1.3.2 转染病毒 |
| 1.3.3 转染原癌基因 |
| 1.3.4 转染TERT 基因 |
| 1.3.5 其他 |
| 1.4 细胞癌变与永生化 |
| 1.5 永生化的应用以及存在的问题 |
| 1.5.1 细胞分化与肿瘤发生的分子机制研究 |
| 1.5.2 细胞治疗与生物人工器官 |
| 1.5.3 药物代谢与毒理研究 |
| 1.5.4 生产转基因动物中的潜在应用价值 |
| 第二章 影响体细胞核移植效率的因素 |
| 2.1 胚胎凋亡与体细胞核移植 |
| 2.1.1 胚胎凋亡的影响因素 |
| 2.1.2 胚胎凋亡的检测 |
| 2.2 供体细胞与体细胞核移 |
| 2.2.1 细胞的传代次数对核移植的影响 |
| 2.2.2 供体细胞的组织来源对核移植的影响 |
| 2.2.3 细胞周期阶段对核移植的影响 |
| 2.2.4 使核供体与受体卵母细胞相协调 |
| 2.2.5 核的重编程 |
| 2.3 卵母细胞成熟 |
| 2.3.1 卵母细胞成熟的形态变化 |
| 2.3.2 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 2.3.3 卵母细胞成熟的调控因子 |
| 2.4 重构胚激活与体细胞核移植 |
| 2.4.1 物理激活 |
| 2.4.2 化学激活 |
| 2.4.3 精子提取物激活 |
| 2.5 胚胎培养与体细胞核移植 |
| 2.6 胚胎的冷冻保存 |
| 2.6.1 冷冻保护剂的种类 |
| 2.6.2 影响胚胎冷冻的其它因素 |
| 2.6.3 影响冷冻效果的其他因素 |
| 前言 |
| 第三章 人端粒酶催化亚基转染牛耳成纤维细胞 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞来源 |
| 3.1.2 试剂与用品 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 原代细胞培养和G418 致死浓度筛选 |
| 3.2.2 脂质体法转染pEGFP-hTERT 基因 |
| 3.2.3 抗性细胞克隆的挑取和保存 |
| 3.2.4 RT-PCR 检测 |
| 3.2.5 端粒酶活性检测 |
| 3.2.6 Western Blotting 检测 |
| 3.2.7 细胞软琼脂生长分析 |
| 3.2.8 染色体条带分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 基因转染与阳性单克隆的挑选 |
| 3.3.2 RT-PCR 检测阳性细胞克隆在m RNA 水平的表达 |
| 3.3.3 细胞端粒酶活性的检测 |
| 3.3.4 细胞端粒酶催化亚基的Western Blotting 分析 |
| 3.3.5 阳性细胞克隆HBC3 细胞系的传代 |
| 3.3.6 HBC3 细胞软琼脂生长分析 |
| 3.3.7 HBC3 细胞染色体条带分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 HBC3 细胞系的生物学特性检测和核移植 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 卵巢来源 |
| 4.1.2 试剂药品 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 EGF 和胰岛素对HBC3 生长的影响 |
| 4.2.2 血清饥饿对HBC3 生长和凋亡的影响 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测BFC 和HBC3 细胞的凋亡 |
| 4.2.4 HBC3 的体细胞核移植 |
| 4.2.5 囊胚细胞计数和凋亡的影响 |
| 4.2.6 统计方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 EGF 和胰岛素对HBC3 生长的影响 |
| 4.3.2 血清饥饿对HBC3 生长和凋亡的影响 |
| 4.3.3 流式细胞仪检测HBC3 细胞的凋亡 |
| 4.3.4 不同供体细胞的核移植 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 HBC3 的生物学特性 |
| 4.4.2 端粒酶活性与核移植重构胚的发育 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 细胞癌化对体细胞核移植的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 卵巢来源 |
| 5.1.2 试剂仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 牛耳成纤维细胞的化学致癌物处理 |
| 5.2.2 ABF11 和ABF12 癌化细胞系的分离和形态观察 |
| 5.2.3 ABF11 和ABF12 的端粒酶活性检测 |
| 5.2.4 ABF12 生长曲线的测定 |
| 5.2.5 血清饥饿对ABF12 生长和凋亡的影响 |
| 5.2.6 ABF12 的软琼脂生长试验 |
| 5.2.7 ABF12 的染色体条带分析 |
| 5.2.8 ABF12 的体细胞核移植试验 |
| 5.2.9 囊胚细胞计数和凋亡染色 |
| 5.2.10 统计方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 ABF11 和ABF12 细胞系的建立和形态观察 |
| 5.3.2 ABF11 和ABF12 的端粒酶活性检测 |
| 5.3.3 ABF12 生长曲线 |
| 5.3.4 血清饥饿对ABF12 生长的影响 |
| 5.3.5 ABF12 的软琼脂生长试验 |
| 5.3.6 ABF12 的染色体条带分析 |
| 5.3.7 ABF12 的体细胞核移植试验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 卵母细胞体外成熟对体细胞核移植的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 卵巢来源 |
| 6.1.2 试剂仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 卵母细胞的采集 |
| 6.2.2 卵母细胞体外成熟培养 |
| 6.2.3 卵母细胞的去核操作 |
| 6.2.4 供体细胞的准备 |
| 6.2.5 透明带下注射法核移植 |
| 6.2.6 核移植胚胎的激活 |
| 6.2.7 核移植胚胎的体外培养 |
| 6.2.8 卵母细胞的程序化冷冻 |
| 6.2.9 卵母细胞的体外受精和培养 |
| 6.2.10 胚胎细胞计数与凋亡染色 |
| 6.2.11 统计方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 成熟培养液中添加EGF 对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.3.2 成熟培养液中添加VE 对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.3.3 成熟培养液中添加血清对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 第七章 核移植胚胎的激活和发育阻滞 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 卵巢来源 |
| 7.1.2 精子提取物的获得 |
| 7.1.3 试剂仪器 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 卵母细胞的采集和成熟培养 |
| 7.2.2 卵母细胞的去核操作 |
| 7.2.3 供体细胞的准备 |
| 7.2.4 核移植重构胚胎的构建 |
| 7.2.5 核移植胚胎的激活方法的比较 |
| 7.2.6 核移植胚胎的体外培养 |
| 7.2.7 孤雌激活胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.2.8 体外受精胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.2.9 胚胎细胞计数与凋亡染色 |
| 7.2.10 与统计分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 不同浓度精子提取物对体细胞核移植胚胎激活的效果 |
| 7.3.2 精子提取物结合电化学方法激活对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 7.3.3 电激活和化学激活方法对牛体细胞核移植体外发育的影响 |
| 7.3.4 孤雌激活胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.3.5 体外受精胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 精子提取物对体细胞核移植胚胎的激活 |
| 7.4.2 精子提取物与电化学方法的激活效果比较 |
| 7.4.3 体细胞重构胚体外发育的阻滞 |
| 7.5 结论 |
| 第八章 重构核移植胚胎的体外培养和冷冻 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 卵巢来源 |
| 8.1.2 试剂仪器 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 卵母细胞的采集和成熟培养 |
| 8.2.2 卵母细胞的去核操作 |
| 8.2.3 供体细胞的准备 |
| 8.2.4 透明带下注射法核移植和电融合 |
| 8.2.5 核移植胚胎的激活 |
| 8.2.6 核移植胚胎的体外培养 |
| 8.2.7 囊胚细胞团计数和凋亡染色 |
| 8.2.8 核移植重构胚胎的程序化冷冻保存 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 EGF 对重构胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.3.2 孕酮对体外培养的核移植重构胚发育和冷冻保存的影响 |
| 8.3.3 VE 对核移植重构胚体外发育的影响 |
| 8.3.4 海藻糖对体外培养的核移植重构胚冷冻保存的影响 |
| 8.3.5 不同培养阶段的重构胚胎冷冻保存效果 |
| 8.4 讨论 |
| 8.4.1 EGF 对核移植胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.4.2 孕酮对核移植胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.4.3 VE 对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 8.4.4 海藻糖对核移植胚胎冷冻效果的影响 |
| 8.4.5 不同发育时期的核移植胚胎胚胎冷冻效果分析 |
| 8.5 结论 |
| 论文总结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、端粒酶激活与细胞永生化（论文参考文献）
- [1]细胞永生化技术研究进展[J]. 刘育昆,邹登朗,祁得胜,刘忠浩,都玉蓉,马建滨. 野生动物学报, 2021(02)
- [2]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)
- [3]兔脾脏成纤维型细胞RS-17的建系及RHDV SCH04株感染试验[D]. 蒙正群. 四川农业大学, 2018(02)
- [4]细胞永生化机制及不同细胞永生化方法研究进展[J]. 黄今,杨融辉,马海英. 东南大学学报(医学版), 2015(05)
- [5]16型人乳头瘤病毒E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变发展中的表达及意义[J]. 罗琼,熊树华,舒宽勇,李景平. 南昌大学学报(医学版), 2013(04)
- [6]细胞永生化技术及其应用研究进展[A]. 庄金秋,梅建国,王文秀,沈志强. 中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集, 2012
- [7]高危型人乳头瘤病毒E6蛋白与hTERT的相互作用研究进展[J]. 范瑞岗,万艳平. 中国现代医药杂志, 2011(11)
- [8]细胞永生化技术及其应用研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,王文秀,沈志强. 生命科学研究, 2011(04)
- [9]HPV16E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变发展中的表达及意义[D]. 罗琼. 南昌大学, 2009(03)
- [10]提高牛体细胞核移植效率的研究[D]. 彭新荣. 西北农林科技大学, 2008(11)