一、树突状细胞体内迁移机制研究进展（论文文献综述）
张颖[1]（2021）在《力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析》文中认为癌症仍然被认为是全球范围内主要的死亡原因。癌症的发展与进化涉及到多种细胞群和细胞外环境之间跨越多个空间和时间尺度的复杂过程。免疫系统是肿瘤生物学的关键调节剂,是免疫应答以及免疫反应的重要系统,具有支持或抑制肿瘤发展,生长,侵袭和转移的能力。然而,由于肿瘤细胞具有较低的免疫特性,可以让肿瘤细胞能够有效的逃避免疫系统的识别以及清除。因此,通过研究影响肿瘤-免疫系统间相互作用的因素,了解肿瘤免疫系统的三种状态:肿瘤被免疫系统清除、肿瘤与免疫系统间达到平衡状态以及肿瘤细胞发生逃逸。至今,已有许多研究设计了数学计算模型以及实验来描述影响肿瘤生长和肿瘤免疫系统的生物学机制。研究结果表明肿瘤生长及进展与细胞和肿瘤微环境中的力学特性有着密不可分的关系。细胞外基质硬度,细胞间粘附力大小以及免疫检查点的变化往往与肿瘤的发展及扩散情况相关联。本文基于Cellular Potts Model的理论建立数学模型,通过数学建模方式分析研究了细胞间的力学特性对于肿瘤自身进展以及肿瘤和适应性免疫系统之间交互作用的影响。第二章中,通过建立细胞刚度以及细胞-ECM间黏附力对迁移影响的模型,研究了细胞外基质的动态变化对肿瘤细胞与基质间黏附力大小的影响,模拟结果表明肿瘤细胞的迁移速度与ECM刚度存在双相依赖性,ECM刚度的增加促进肿瘤细胞在较低刚度下的迁移。但在刚度较大的ECM上,肿瘤细胞需要聚集足够数量的整合素,增加的整联蛋白的表达会增加表面张力和细胞-ECM的黏附能。所以ECM刚度的进一步增加抑制了肿瘤细胞的迁移。在第三章中,我们加入了肿瘤免疫反应模型,通过结合肿瘤细胞进展以及免疫发展,建立肿瘤细胞与免疫细胞间的交互作用,利用该模型研究了免疫检查点如何影响细胞间的相互作用以及细胞间的粘附力变化对于肿瘤在免疫反应过程中的影响。结果表明,免疫检查点CTLA-4会通过作用T细胞的下游信号通路,影响细胞间粘附力的大小,有利于肿瘤细胞免疫逃逸的发生。
南福龙[2]（2021）在《新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的严重的禽类呼吸道、消化道传染病,给全世界养禽业造成巨大经济损失。NDV属于副粘病毒科,可以通过多种免疫抑制机制逃避宿主的免疫应答。虽然多种副粘病毒都能抑制宿主的抗原递呈,但关于NDV对宿主抗原递呈的影响研究较少。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为体内功能最强的专职抗原递呈细胞（Antigen presentation cell,APC）,摄取抗原后能刺激T淋巴细胞增殖活化,开启体内适应性免疫应答。已有研究表明多种NDV载体疫苗都能诱导机体产生高效的体液与细胞免疫应答,诱导DCs活化,但NDV强毒会诱导DCs凋亡,阻碍抗原递呈,抑制T细胞增殖活化。因此,探究NDV调控DCs活化与抗原递呈抑制机制可以更好地了解NDV免疫逃避机制,也为提升NDV载体疫苗免疫效力提供依据。本研究以NDV弱毒标准株LaSota和小鼠DCs为研究对象,体内外探究NDV的抗原递呈过程及抑制机制。主要研究内容如下:一.NDV感染能诱导小鼠DCs成熟。为探索NDV弱毒LaSota株能否诱导DCs活化,本研究首先以商品化重组IL-4和GM-CSF在体外联合诱导小鼠骨髓单核细胞分化成DCs。利用表达绿色荧光蛋白（EGFP）的r NDV（r NDV-EGFP）感染,发现LaSota能够感染DCs。随后通过流式检测感染后DCs表面成熟标志发现:NDV感染上调了MHC及共刺激分子CD80/86等表面标志;诱导DCs分泌除IL-12p70外的促炎因子TNF-α、IFN-α/β/γ;此外,感染DCs的吞噬能力下降同时具有很强的迁移能力。本研究表明,DCs能够被NDV诱导活化。二.NDV感染抑制DCs抗原递呈并诱导Th2型免疫应答。为揭示NDV对DCs抗原递呈的影响,本研究以CCK-8对DCs和T细胞共培养中T细胞增殖活性进行检测,结果发现NDV处理后的DCs刺激T细胞增殖能力下降,抗原递呈被抑制。感染后共培养CD4+及CD8+T细胞比例下降,Th2型细胞占比升高;DCs感染上清和共培养上清Th2型免疫抑制因子IL-10分泌上升,说明LaSota株感染后会抑制DCs的抗原递呈,并诱导CD4+Th0细胞向Th2型细胞分化。体外验证后,本文构建并拯救了表达2型萤火虫荧光素酶基因的重组新城疫病毒r L-Luc,接种小鼠后进行活体成像。结果表明感染12 h荧光值最高,随后下降,至72 h荧光已经很弱。给小鼠接种NDV,在不同时间点监测脾脏淋巴细胞变化,发现NDV感染小鼠后脾脏DCs含量先下降再上升后稳定,说明抗原递呈主要发生在感染开始至72 h之间;能有效募集成熟DCs至脾脏;脾脏B细胞占比升高,T细胞下降,Th2型细胞显着升高,说明LaSota感染在体内抗原递呈也会诱导Th2型应答。本研究表明NDV会抑制DCs抗原递呈,并在体内外介导Th2型免疫应答。三.NDV通过抑制小鼠DCs IL-12p70分泌抑制T细胞增殖。为探索NDV的抗原递呈抑制机制,本研究先以NDV感染DCs,12 h后以LPS处理48 h,发现NDV会抑制LPS诱导的IL-12p40亚基转录,降低IL-12p70分泌。对IL-12生成通路p38 MAPK通路关键蛋白进行检测发现,NDV感染并未影响通路蛋白总量,但降低了p38和p65在胞质和胞核中磷酸化水平。另外,本研究发现共培养时感染组IL-12p70刺激T细胞分泌的下游细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6均下降。本研究说明NDV通过抑制IL-12生成通路关键蛋白磷酸化入核,抑制IL-12p40生成,从而抑制IL-12p70的分泌和T细胞增殖与细胞因子的分泌。四.NDV通过抑制DCs IL-12p70的分泌增强病毒感染效率。为探究NDV抑制IL-12p70对自身感染的影响,先以r NDV-EGFP感染DCs再共培养,发现NDV能够通过DCs感染T细胞。随后以NDV直接感染T细胞,再以PMA刺激T细胞活化,结果表明NDV感染会抑制PMA刺激的IFN-γ、TNF-α生成。随后将DCs和T细胞的不同感染组合进行共培养,结果表明NDV感染DCs造成的IL-12p70降低是共培养中T细胞增殖和细胞因子分泌抑制的主要原因。接下来以外源宿主相关因子预处理DCs和T细胞再以LaSota感染,结果表明几种被抑制的细胞因子均能有效抑制NDV的感染。最后以不同NDV毒株处理DCs,检测发现多种NDV均会抑制宿主相关因子表达并抑制T细胞增殖活性。本研究表明NDV通过降低IL-12的表达,抑制了下游TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌,以此增强自身对DCs和T细胞的感染效率。综上所述,本研究证明了NDV弱毒LaSota株能诱导小鼠DCs活化,但会抑制p-p65磷酸化入核降低IL-12的分泌从而抑制DCs抗原递呈,在体内外诱导Th2型免疫应答,增强自身感染效率,这种对IL-12的抑制是NDV造成免疫抑制的通用机制。
宫文静[3]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中指出研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。
程玉洁[4]（2021）在《糖基转移酶Extl1在树突状细胞迁移中的调控作用及机制研究》文中认为树突状细胞（dendritic cell,DC）是机体内目前已知的功能最强大的专职性抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）,在实现免疫调节以及维持免疫稳态方面发挥着不可替代的重要作用。DC的功能减弱可能导致机体无法及时清除入侵病原体,而功能过强则可能诱发慢性炎症、自身免疫性疾病等免疫相关疾病。因此,研究DC天然免疫功能的内在调控机制对于深入了解天然免疫应答内在规律并寻找免疫相关疾病新型发病机制有重要意义。DC在机体内广泛分布于淋巴组织以及非淋巴组织中。DC的体内迁移对于其成熟活化及功能调控至关重要。DC通过其膜表面趋化因子受体CCR7感知其相应配体CCL19和CCL21的迁移信号,并在该信号的“指引”下开始由外周向体内次级淋巴组织迁移,进而促进T细胞介导的适应性免疫应答。寻找DC趋化与迁移过程的关键性调控分子有助于深入了解DC在天然免疫与炎症中的作用。Exostosin家族是一类具有N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（N-acetylglucosamine transferase,Glc NAc）活性的蛋白质,该家族包括Ext1、Ext2等多个成员,主要功能为介导硫酸肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans,HSPG）肝素链的起始和延伸。目前关于Exostosin家族成员在免疫应答和炎症中的作用尚不清楚。我们通过转录组学筛选发现了成熟DC（mature DC,m DC）在CCR7配体（CCR7L）CCL19和CCL21刺激表达上调的12个蛋白分子,q-PCR验证后明确Extl1（exostosin like glycosyltransferase 1）蛋白在CCR7L刺激后显着上调（>5倍）。以此为基础,我们围绕Extl1分子在DC活化、成熟及迁移调控中的作用和机制展开了研究。CCR7L诱导性蛋白Extl1调节DC活化及迁移CHIP实验结果证实CCR7L刺激能够促进RNA聚合酶II结合到Extl1基因启动子区并诱导H3K4me3修饰水平的上调,进而促进Extl1基因的转录活化。小RNA干扰Extl1表达后DC受CCR7L触发的迁移功能被抑制,而LPS刺激的炎性因子IL-6、TNF等表达量上调。以上结果提示,CCR7L诱导表达的Extl1分子能够促进DC迁移而抑制炎性因子表达,在DC成熟和迁移活化中可能发挥重要的调节性作用。Extl1分子通过HSPG非依赖途径调控DC迁移EXT家族能够介导硫酸肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans,HSPG）中肝素链的起始和延伸。HSPG表达于细胞表面或细胞外基质中,通过结合生长因子、趋化因子等各种分子参与细胞间或细胞与基质间的相互作用。Extl1在体内是否参与HSPG生成?是否通过HSPG途径发挥调控作用?据此,我们构建了DC条件性Extl1基因敲除(Extl1fl/flItgax-cre+)小鼠。通过流式细胞术检测DC中HSPG残基的特定位点3G10表达量变化发现,Extl1fl/flItgax-cre+DC中3G10表达量显着低于对照组,这一结果提示Extl1缺失会导致HSPG生成量减少。回输HSPG可以抑制干扰Extl1引起DC中升高的炎性因子IL-6以及TNF的表达量。而回输HSPG或使用HSPG消化酶Heparinase处理细胞后,CCR7介导的DC迁移能力均无显着改变。因此,Extl1分子在体内能够介导HSPG生成并通过该途径介导炎症的发生,同时通过HSPG非依赖途径调控DC迁移。Extl1分子抑制LPS诱导的炎症反应而促进CCR7介导的DC迁移DC感知到抗原刺激后,能够分泌炎性因子以介导体内炎症反应,与此同时上调膜表面共刺激分子的表达以促进T细胞活化。Extl1分子是否影响DC的成熟活化及天然免疫功能?我们通过流式细胞术检测Extl1fl/flItgax-cre+DC以及对照组细胞中主要活化标志物CD11c、CD40、CD80、I-Ab表达以及刺激T细胞增殖的功能,实验结果显示上述主要标志物表达量及对T细胞增殖的刺激功能均无明显差异。q-PCR检测结果提示Extl1fl/flItgax-cre+DC在LPS刺激后炎性因子IL-6、IL-12以TNF的表达量与对照组相比显着上调。体外迁移实验结果显示Extl1fl/flItgax-cre+DC中CCR7触发的迁移能力比对照组显着降低。体内FITC涂抹实验结果显示Extl1fl/flItgax-cre+小鼠体内具有迁移特性的DC中FITC比例被显着性抑制,而定居性DC群体中FITC比例未发生明显改变,说明Extl1fl/flItgax-cre+小鼠DC的体内迁移能力降低。因此,我们证实了Extl1分子能够抑制LPS诱导的DC炎症反应而促进CCR7介导的DC迁移。Extl1分子依赖于p-AKT和pp38信号活化调控DC迁移在明确Extl1分子对DC功能发挥的调控作用后,我们进一步探索Extl1分子对LPS及CCR7触发的主要信号通路的作用。流式细胞术检测LPS和CCR7L刺激后胞内主要天然免疫信号通路NF-?B、MAPK及AKT通路关键信号分子表达量,实验结果显示Extl1干扰组DC中LPS刺激的pp65表达量与对照组相比显着上调,而CCR7L刺激的p-AKT表达量显着下调。蛋白质免疫印迹实验结果显示Extl1干扰组DC中CCR7L刺激的p-AKT和pp38表达量比对照组显着下调。使用p-AKT通路抑制剂WORT和pp38通路抑制剂SB203580处理后,Extl1干扰组与对照组的迁移能力的差异消失。以上结果提示,Extl1分子主要影响LPS刺激的NF-?B信号通路,同时依赖于p-AKT和pp38信号活化调控DC迁移。Extl1分子促进Arrestin介导的CCR7内化及Vav3/Rac通路活化接下来,我们进一步研究Extl1分子促进DC迁移的分子机制。文献提示,DC实现迁移功能的重要前提是细胞板状伪足的生成。转运蛋白Arrestin介导的CCR7由胞膜向内体的转运内化能够促进下游板状伪足（Lamellipodia）相关Vav3/Rac通路活化并促进DC迁移信号传递。我们猜测Extl1分子是否通过影响CCR7内化及板状伪足生成从而实现对细胞迁移的调控。流式细胞术实验结果显示,Extl1fl/flItgax-cre+DC膜表面CCR7表达量明显低于对照组且CCR7内化速度明显降低。内源性IP实验结果证实Extl1fl/flItgax-cre+DC中Arrestin与CCR7与及内体标志性蛋白Rab5、Rab11的结合比对照组明显降低。通过q-PCR及蛋白印迹检测迁移受体CCR7、主要转运蛋白Arrestin以及板状伪足介导分子Vav3在m RNA及蛋白水平表达量的改变,实验结果显示Extl1fl/flItgax-cre+DC内上述分子m RNA层面表达量均无显着变化,CCR7和Arrestin蛋白水平表达量无改变,而Vav3及Rac蛋白表达明显下调。因此,Extl1分子能够促进Arrestin介导的CCR7向内体的内化转运,进而促进下游板状伪足生成相关Vav3/Rac通路活化。Extl1分子促进接触性超敏反应的炎症反应DC体内迁移是接触性超敏反应（contact hypersensitivity,CHS）中T细胞应答及炎症损伤的关键启动环节。为了研究Extl1分子对DC迁移调控作用的体内效应,我们进一步探究了Extl1fl/flItgax-cre+在接触性超敏反应中的发病程度及炎症反应。实验结果显示,Extl1fl/flItgax-cre+小鼠在受到DNFB致敏刺激后的耳朵增厚程度相较于对照组小鼠显着减弱,病理切片显示耳朵炎症损伤明显减弱。取致敏小鼠腋窝淋巴结细胞体外培养并进行DNBS再刺激后,Extl1fl/flItgax-cre+腋窝淋巴结CD4+T细胞的IL-17以及IFN-γ表达量均低于对照小鼠细胞。这一结果提示,Extl1分子能够促进机体超敏性炎症反应和组织损伤的发生。综上,我们发现糖基转移酶Extl1分子是CCR7介导的DC迁移的关键性调节分子。Extl1分子受CCR7刺激上调表达量,进而抑制LPS诱导的炎症因子表达而促进CCR7触发的DC迁移。Extl1通过促进Arrestin介导的CCR7内化及下游板状伪足生成相关Vav3/Rac通路活化促进CCR7介导的DC迁移,进而介导机体炎症反应和组织损伤。本研究揭示了DC介导的炎症反应的新型分子机制以及糖基转移酶Extl1分子在天然免疫中的新型调控功能,为DC功能失调相关性疾病如炎症性疾病、自身免疫性疾病等的临床治疗以及发病机制提供新的思路和解释。
纪巧荣[5]（2021）在《低氧影响小鼠实验性结肠炎发生发展的免疫学机制研究》文中研究指明【背景】近年来,由环境因素导致的胃肠道疾病逐渐被人们所关注,尤其在高海拔的偏远地区,胃肠道疾病和肠道寄生虫病的危害还相当严重。高原环境最主要的特征是低氧,低氧作为疾病最基本的病理环节,可出现于多种疾病的发生、发展过程,引起人体一系列生理机能的改变。低氧暴露对于呼吸、循环系统等相关研究也较多,而高原低氧环境对肠道免疫系统的影响,仍未受到足够关注。因此,研究高原人群肠道健康相关免疫机制,可为进入高原的人群提供健康保障,也为青藏高原的经济及国防提供有力的卫勤保障。【目的】胃肠道疾病如腹泻是严重危害人健康的感染性疾病之一。其中,肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic e.coli,EPEC）及出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic e.coli,EHEC）是细菌性腹泻的主要病原菌。由于高原地区缺氧引起的免疫抑制,尤其在高原地区由EPEC和EHEC引起的腹泻常导致严重的致死性疾病。因此,研究高原低氧影响机体抗感染能力的免疫学调节机制,对于高原感染性疾病的防治具有重要意义。本课题在成功建立C.rodentium感染模型的基础上,以低压氧舱模拟海拔5000米作为低氧实验条件,旨在探讨低氧对肠黏膜免疫的影响,且进一步明确低氧下抗原递呈细胞分化亚型、成熟活化状态的改变,以揭示高原低氧环境对机体抗病原菌感染的免疫反应机制。【方法】1.为了研究低氧影响宿主抵抗消化道病原菌感染的免疫反应机制,我们采取以下的研究方法:首先,建立低氧下结肠炎小鼠模型。32只雌性、8周龄BALB/c小鼠（18-20 g）,随机分为正常组（Normal）及低氧组（Hypoxia）,各组内又分为对照及C.rodentium感染组,每组8只小鼠,即共分为四组（n=8）,正常对照组（Control）、C.rodentium感染组（C.rodentium）、低氧对照组（Hypoxia）和低氧C.rodentium感染组（Hypoxia+C.rodentium）。结肠炎小鼠通过灌胃C.rodentium（约5×108 CFU/mouse）造模。正常组（Normal）小鼠饲养于IVC鼠笼中（2260 m,大气压582 mm Hg,PO2 121.6 mm Hg,相当于海平面16%O2,中国西宁）,低氧组（Hypoxia）小鼠饲养于低压氧舱,模拟海拔高度5000 m（大气压405 mm Hg,PO2 84.7 mm Hg,相当于海平面11%O2）,2周后取材。造模期间监测小鼠体重及排菌量,并于取材当天检测Normal组及Hypoxia组小鼠生理指标及血生化参数,包括肺动脉压（pulmonary artery pressure,PAP）、心率（heart rate,HR）,红细胞计数（red blood cell,Rbc）、血细胞比容（hematocrit,Hct）和血红蛋白（hemoglobin,Hb）。收集结肠进行H.E.染色,观察炎症病理改变,q RT-PCR检测肠黏膜中抗菌肽、炎性因子表达,酶联免疫吸附实验（Elisa）、流式细胞仪（FACS）检测肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node,MLN）及脾脏（Spleen）CD4+T细胞分型及相关细胞因子表达,并检测血清相关免疫球蛋白水平。同时,检测结肠组织HIF-1α及Th1、Th17细胞分化相关元件表达。此外,为明确C.rodentium结肠炎中黏膜屏障的改变,对各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1）及MUC2、i NOS进行检测。2.为了探讨低氧对黏膜抗原提呈细胞表型和功能的影响,我们采取以下的研究方法:首先,动物分组、模型建立及处理与上一部分一致。取材当天,收集肠系膜淋巴结（MLN）、派尔氏结（Peyer’s Patches）,分离、制备单细胞悬液（1×107cells/ml）,应用FACS检测树突状细胞（Dendritic cells,DC）不同分化亚型表达,包括髓系DC（MDC,CD11c+CD11b+CD8α-）及淋巴系DC（LDC,CD11c+CD11b-CD8a+）,q RT-PCR检测淋巴细胞表达IL-12、IFN-γ水平。进一步应用FACS检测CD11c+DC表面成熟标志因子（MHC-II、CD80、CD86）表达,分析低氧对DC成熟和活化状态的影响。【结果】低氧处理2周后,Hypoxia组小鼠PAP、Hct、Hb较Normal组明显升高,结肠HIF-1α水平也相应增高,表明低氧模型构建成功。监测小鼠体重、排菌量发现,Hypoxia+C.rodentium组较C.rodentium组小鼠体重减轻明显,且粪便排菌量增加。Hypoxia+C.rodentium组小鼠结肠病理检测表现出更为严重的炎症改变,病理学评分明显升高。与C.rodentium组小鼠比较,Hypoxia+C.rodentium组小鼠结肠组织抗菌肽Reg 3γ、IL-17、IL-22 m RNA明显降低,且伴有炎性因子TNF-α、IL-6、COX-2 m RNA的增加。Th反应相关因子检测显示,Hypoxia+C.rodentium组小鼠较C.rodentium组IFN-γ、IL-17、Ig G2a水平明显降低,且q RT-PCR也显示Hypoxia+C.rodentium组较C.rodentium组结肠IL-12、IL-23p19m RNA降低,且伴有Th1、Th17细胞的分化上游蛋白T-bet及RORγt m RNA的表达下降,提示低氧暴露下Th1及Th17免疫反应下调。此外,Hypoxia+C.rodentium组小鼠结肠TLR4、NF-κB升高,且伴有炎性因子TNF-α、IL-6、COX-2的明显增多。黏膜屏障相关因子检测显示,Hypoxia+C.rodentium组较C.rodentium组小鼠结肠Occludin、ZO-1、MUC2降低,并伴有i NOS的升高。对低氧下树突状细胞状态及表型检测发现,Hypoxia+C.rodentium组较C.rodentium组小鼠LDC亚型表达明显降低,且伴有IL-12、IFN-γ的降低。进一步分析CD11c+DC表面标志成熟因子显示,Hypoxia+C.rodentium组小鼠树突状细胞表面表达MHC-II、CD86较C.rodentium组明显减少。【结论】综上所述,我们通过建立低氧环境下小鼠C.rodentium结肠炎模型,研究低氧影响结肠炎发生发展的免疫学机制,结果发现,低氧暴露下,Th1、Th17免疫反应的下调及肠黏膜屏障的破坏,诱导加重了C.rodentium结肠炎。进一步对黏膜抗原提呈细胞表型和功能的研究发现,低氧通过影响树突状细胞成熟、分化亚型的表达,最终诱导T细胞在肠道免疫反应中的功能发挥。
黄涛[6]（2021）在《细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究》文中进行了进一步梳理CRL4作为E3泛素连接酶,可以结合不同的接头蛋白（称为DCAFs）,这些接头蛋白通过招募各自特定的底物到CRL4 E3泛素连接酶上发挥多种生理学功能。DCAF2（又称为CDT2或DTL）是CRL4的底物接头蛋白之一。CRL4DCAF2泛素连接酶是公认的细胞周期关键调节蛋白,对于促进细胞周期顺利通过S期和有丝分裂具有重要调控作用。CRL4DCAF2可以引发染色质复制起始蛋白（CDT1,SETD8）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21发生泛素化修饰并降解,从而促进细胞从S期顺利进入G2期。但由于缺乏可行的动物模型,CRL4DCAF2在体内尤其是免疫系统中的功能仍然未知。固有淋巴细胞和适应性免疫细胞在受到外来刺激后,会对细胞周期的进程产生不同的影响。T细胞接受到TCR和共刺激分子信号后,需要经历多个细胞周期进行快速增殖,而树突状细胞在经历模式识别受体介导的活化后,会退出细胞周期,并启动凋亡程序,这也体现在DCAF2的表达在树突状细胞激活地过程中迅速降低。NEDD靶向药物MLN4929,可以使CRL失活,其已经进行过多种类型的淋巴瘤和急性髓系白血病的治疗性临床试验。用MLN4924处理小鼠,会增加小鼠银屑病模型的严重程度,这与树突状细胞中缺失DCAF2造成的表型一致,说明DCAF2在自身免疫病中具有重要的负调控功能。通过转录组比对,我们发现DCAF2的缺失在树突状细胞中导致促炎细胞因子IL-23的表达特异性升高。进一步研究发现树突状细胞中的CRL4DCAF可以调节非经典NF-κB通路关键因子NIK的蛋白稳定性,进而负调节IL-23的产生。CRL4DCAF2会促进NIK的多聚泛素化修饰和随后的降解,我们发现这个过程不依赖于经典的TRAF2或TRAF3介导的NIK降解途径。另外,树突状细胞中条件性敲除DCAF2的年老小鼠表现出自身免疫性疾病倾向,在Aldara诱导的银屑病样皮肤炎症模型和实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中,该小鼠相较于野生型小鼠也具有更高的敏感性。我们的研究表明,细胞周期分子CRL4DCAF2除了作为细胞周期调控因子外,在先天免疫细胞中对于非经典NF-κB通路关键蛋白NIK的稳定性也有至关重要的调控作用。我们的研究揭示了CRL4DCAF2在树突状细胞中特异性调控促炎细胞因子IL-23的表达,并进一步引发相关自身免疫疾病的分子机制,为自身免疫性疾病和炎症性疾病提供了潜在的治疗靶点。
崔佳[7]（2020）在《ASAP1介导巨噬细胞和中性粒细胞迁移参与宿主抗结核分枝杆菌感染的研究》文中提出结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）是引起人畜重大慢性传染性疾病-结核病（Tuberculosis,TB）的单一病原菌。研究表明,宿主本身遗传特质影响结核病易感性,在俄罗斯人群和中国人群中全基因组关联分析（Genome Wide Association Study,GWAS）表明ASAP1（Arf GAP with SH3 domain,ankyrin repeat and PH domain 1）多态性与结核病易感性显着相关,然而ASAP1如何影响结核病易感性还未有报道。本文从反式遗传学的角度在斑马鱼模型和巨噬细胞系THP1和Raw264.7中敲除或敲低ASAP1后分析宿主对于结核病易感性的变化,并进一步从吞噬细胞生理功能的角度探究了ASAP1影响宿主对结核病易感性的机制。主要研究结果如下:1.asap1基因敲除斑马鱼模型的构建斑马鱼现已成为研究结核病的常见模式生物。本项目首先利用生物信息学分析了斑马鱼asap1a和asap1b基因,将斑马鱼asap1a和asap1b与人类ASAP1、小鼠的Asap1进行了染色体基因位点连锁性分析,并对斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白与人类、小鼠和大鼠的ASAP1蛋白进行了多重序列比对,通过进化树分析确定了斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白的进化位置。q RT-PCR方法检测发现斑马鱼asap1a和asap1b基因均系母性遗传控制,原位杂交显示两基因在斑马鱼体内通体表达,无组织特异性。应用基因编辑CRISPR/Cas9技术建立asap1a和asap1b基因敲除的斑马鱼,得到asap1a敲除突变斑马鱼3个品系,得到asap1b敲除突变斑马鱼3个品系,得到asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼1个品系,得到asap1a和asap1b双敲除突变且中性粒细胞荧光标记的斑马鱼1个品系。通过存活率分析发现,asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼在1-3天胚胎期死亡率明显增高,而asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼则无明显死亡率下降现象。通过q RT-PCR检测发现,asap1a单敲除突变斑马鱼中asap1b基因的表达量升高,在asap1b单敲除突变斑马鱼中未见asap1a基因的表达量有补偿性升高。另外,应用morpholino对斑马鱼asap1a和asap1b基因进行敲低,q RT-PCR和western blotting证实两基因共敲低。第一部分结果表明通过morpholino和基因编辑的手段在斑马鱼中成功建立了asap1a和asap1b敲低或敲除的突变体。2.应用斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型探讨Asap1影响巨噬细胞和中性粒细胞迁移能力进而影响宿主对结核病易感性关系海鱼分枝杆菌（Mycobacterium marinum,Mm）与结核分枝杆菌具有高度的同源性,是引起斑马鱼结核病的病原菌。斑马鱼的发育早期通体透明,能够通过应用荧光蛋白表达示踪细胞行为,所以在研究固有免疫相关吞噬细胞如巨噬细胞（macrophage,MΦ）和中性粒细胞（neutrophil）方面具有独特的可视化优势。本章首先在斑马鱼模型上系统研究Asap1对海鱼分枝杆菌易感性的影响,发现asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼对海鱼分枝杆菌易感性与野生型相比无明显的差异性,但asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼较野生型斑马鱼对海鱼分枝杆菌的感染能力增强。此结论与用morpholino敲低的asap1a和asap1b斑马鱼研究结果一致。在asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼中我们还发现,无论是尾部创口还是海鱼分枝杆菌感染后的定向趋化,巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力较之于野生型斑马鱼明显减弱。3.利用人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7研究ASAP1与结核分枝杆菌易感性的关系通过在人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7中建立敲低ASAP1的细胞模型,并经q RT-PCR与western blotting验证敲低效率。其次在THP1和Raw264.7中发现敲低ASAP1的细胞较野生型细胞感染结核分枝杆菌的能力增强。Transwell实验表明敲低ASAP1引起了THP1和Raw264.7细胞对于结核分枝杆菌的迁移能力减慢,进一步验证了在斑马鱼中得到的Asap1可能影响结核病易感性的机制结论。在细胞模型中,我们还进一步探究了敲低ASAP1后细胞骨架发生的重塑现象,其中actin puncta数量明显增加,并且相应的黏着斑蛋白Vinculin与桩蛋白Paxillin的聚合状态也发生了改变,这些都为解释ASAP1影响宿主抗结核分枝杆菌的机制提供了可能性。综合发现,降低ASAP1表达水平增强了宿主对于结核分枝杆菌的感染程度,并且影响了巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力,推测这可能是ASAP1影响宿主结核病易感性的生物学机制。此课题的实施和完成将丰富宿主遗传基因影响结核病易感性的认识,对结核病的预防、早前筛查或培育抗结核病家畜具有一定科学意义和应用价值。
张小凡[8]（2020）在《细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究》文中进行了进一步梳理棘球蚴病又称为包虫病,是由棘球属绦虫的幼虫（棘球蚴）寄生于人和多种食草类家畜引起的一种人兽共患病,其主要寄生部位为肝脏和肺脏。包虫病严重危害人类健康和畜牧业生产,为我国重点防治的重大疾病。由细粒棘球蚴寄生引起的囊型包虫病,在我国广泛流行,受危胁人口数、患病数和发病率居全球首位。树突状细胞（dendritic cells,DC）是一类功能最强的专职抗原提呈细胞,可有效启动初次免疫应答,在寄生虫感染时决定机体免疫应答方向。髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressorcells,MDSC）和调节性 T 细胞（regulatoryT cells,Treg）是两群主要引起免疫抑制作用的细胞,两者在细粒棘球绦虫原头节感染小鼠的外周血、腹腔和脾脏中明显富集。DC和MDSC可诱导Treg的产生,且DC可由MDSC分化产生。研究发现,寄生虫可释放携带多种生物活性物质（蛋白质、脂质和核酸等）的外泌体,参与寄生虫-寄生虫的信息交流,寄生虫-宿主的相互作用,在寄生虫感染致病过程中起重要作用。寄生虫源外泌体含有大量的miRNAs,可被宿主细胞摄取,进而调控宿主的免疫应答。然而,DC和抑制性细胞群（MDSC和Treg）在细粒棘球蚴感染小鼠的原发感染病灶肝脏的动态变化情况尚不清楚;原头节源外泌体及其含有的miRNAs在细粒棘球蚴感染致病过程中发挥的作用及机制尚未见报道。本研究建立细粒棘球蚴感染小鼠模型,利用流式细胞术检测小鼠感染早、中、晚期（3、6和12个月）肝脏白细胞DC、MDSC和Treg的比例动态变化情况。采用超速离心获得细粒棘球绦虫原头节源外泌体样囊泡（protoscoleces derived exosome like vesicles,PSC-ELVs）和囊液源外泌体样囊泡（hydatid fluid derived exosome like vesicles,HF-ELVs）,进行高通量测序以及生物信息学分析,获得PSC-ELVs和HF-ELVs的ncRNAs（包括 miRNAs、lncRNAs 和 circRNAs）表达谱,对 PSC-ELVs 中含量前20的miRNAs进行筛选和鉴定,分析预测其潜在的靶基因,构建lncRNA-mRNA-miRNA调控网络,初步探索PSC-ELVs中最为丰富的miRNAs可能参与宿主的免疫调控和发病机制,为进一步研究这两种ELVs中miRNAs在寄生虫-宿主相互作用中的免疫调控功能提供理论基础。细粒棘球绦虫排泄分泌抗原（excretion-secretion antigens,ES）可调控DC的成熟和功能,影响炎症因子释放,调节Th1/Th2型免疫应答。外泌体是ES的重要组成部分,广泛参与核酸运输,细胞间物质交换和抗原递呈等。本研究通过将原头节源外泌体与骨髓来源的树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDC）共培养,分析其对BMDC表面MHCII分子和共刺激分子表达,以及细胞因子分泌的影响,探索原头节源外泌体及其含有的miRNAs对DC的功能及作用机制,为原头节源外泌体及其含有的miRNAs参与宿主免疫应答的作用提供理论及分子基础,也为包虫病临床诊断和基因治疗等研究提供新思路。一、细粒棘球蚴感染小鼠树突状细胞和免疫抑制细胞群比例动态变化研究建立细粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型,每只感染组小鼠腹腔注射2 000个原头节,对照组腹腔注射等量生理盐水。小鼠感染后3、6和12个月（感染早、中、晚期）收集肝脏白细胞,采用流式细胞术检测小鼠肝脏白细胞中DC、MDSC及其亚型M-MDSC、PMN-MDSC与Treg细胞的比例;动态分析感染小鼠肝脏DC和免疫抑制细胞群（MDSC和Treg）比例的变化。结果显示,小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中DC细胞比例分别为（5.27±0.55）%、（6.87±0.32）%和（18.5±0.64）%,对照组分别为（5.92±0.43）%、（5.99±0.12）%和（13.73±0.22）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.05）。小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中MDSC 比例分别为（1.61±0.36）%、（5.68±0.69）%和（16.18±0.69）%,对照组分别为（2.19±0.42）%、（0.99 ±0.07）%和（4.18±0.84）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）;小鼠感染后3、6和12个月后肝脏白细胞中M-MDSC 比例分别为（0.69±0.27）%、（5.30±0.72）%和（10.75±0.29）%,对照组分别为（0.42± 0.24）%、（0.69±0.02）%和（2.12±0.13）%,感染后 6 和 12 个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）;小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中PMN-MDSC 比例分别为（0.93 ± 0.23）%、（0.32±0.02）%和（5.14±1.03）%,对照组分别为（1.77±0.26）%、（0.28±0.05）%和（1.99±0.90）%,感染后3和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.05）。小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中Treg细胞比例分别为（3.35 ± 0.14）%、（6.24±0.38）%和（3.41±0.07）%,对照组分别为（3.48±0.46）%、（3.65±0.45）%和（3.12±0.12）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）。小鼠感染原头节6和12个月后,肝脏白细胞中DC、MDSC与Treg细胞比例增加;其中MDSC比例变化更明显,以M-MDSC为主;同时可由M-MDSC分化形成的DC也明显升高,提示M-MDSC可能在小鼠感染细粒棘球蚴中后期发挥主要免疫抑制作用,且可能促进DC的产生。二、细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA表达谱分析通过对细粒棘球绦虫原头节（protoscoleces,PSCs）的培养液和绵羊可育囊的囊液（hydatid fluid,HF）进行超速离心获得PSC-ELVs和HF-ELVs。使用透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和Western blotting,对分离获得的两种外泌体进行鉴定,其大小,形态与外泌体一致,且含有特定的外泌体标记物。采用高通量测序分析了两种ELVs的ncRNAs（包括miRNAs、lncRNAs和circRNAs）表达谱,并利用GO和Pathway对PSC-ELVs中含量前20的miRNAs功能进行预测。在PSC-ELVs和HF-ELVs中,分别鉴定出1 18和58个miRNAs,两者共表达的miRNAs共有53个,其中PSC-ELVs特异表达65个,HF-ELVs特异表达5个。在PSC-ELVs和HF-ELVs分别鉴定出2 361和1 254个lncRNAs,其中两者共表达的lncRNAs共有1 004个,PSC-ELVs特异表达1 357个,HF-ELVs特异表达250个。PSC-ELVs中含量前20的miRNAs和circRNAs的表达量高于HF-ELVs中相应的miRNAs和circRNAs,而lncRNAs的表达量则低于HF-ELVs。通过荧光定量PCR检测,对miRNAs测序结果进行验证。此外,从PSC-ELVs含量前20的miRNAs中筛选出与宿主免疫应答有关的miRNAs,及其调控的lncRNAs 和 mRNAs,并构建了一个包含 5 个 miRNAs,41 个 lncRNAs 和 23 个mRNAs的ceRNA调控网络。PSC-ELVs含量前20的miRNAs的靶基因可能参与调控寄生虫感染过程中的炎症反应、MAPK级联反应和胶原分解代谢过程。此外,egr-miR-4989-3p 为 PSC-ELVs 和 HF-ELVs 中含量最高的 miRNA,与 egr-miR-277a-3p同属一个miRNA家族,具有相同的种子序列。本研究为首次鉴定获得PSC-ELVs和HF-ELVs中的ncRNAs谱,可能与宿主免疫应答和发病机理有关。这两种外泌体中含量丰富的miRNAs可能介导相关信号通路或与靶基因相互作用方式,在外泌体参与寄生虫-宿主相互作用中发挥重要的免疫调控作用。三、细粒棘球绦虫原头节源外泌体miRNA作用于树突状细胞的功能与机制研究通过将PSC-ELVs与BMDC共孵育,激光共聚焦显微镜观察发现PSC-ELVs可被BMDC内化摄取,qRT-PCR检测发现PSC-ELVs能将携带的miRNAs转运至BMDC中。通过qRT-PCR和ELISA分别检测处理后的BMDC细胞因子mRNA和蛋白质水平的表达,流式细胞术检测BMDC表面MHCⅡ类分子和共刺激分子表达水平,结果发现PSC-ELVs可有效诱导BMDC产生促炎性因子IL-6、IL-12、TNF-α、IL-β、IFN-γ和抑炎性因子IL-10,且大多数与LPS存在协同作用,上调细胞表面MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40、PDL1和PDL2的表达,这一结果提示PSC-ELVs可能携带某些毒力分子诱导BMDC成熟且往刺激型DC极化,呈现明显的促炎特性,可能产生Th1型细胞介导的免疫应答,有助于杀伤并清除入侵的病原体而保护机体。将miR-277a-3p和miR-4989-3p的mimic 和 inhibitor 转染 BMDC 后,qRT-PCR 检测发现,miR-277a-3p 和 miR-4989-3p诱导BMDC促炎性因子IL-6、IL-12和TNF-α的mRNA水平显着增加,抑炎性因子IL-10的mRNA水平显着降低,提示miR-277a-3p和miR-4989-3p可诱导BMDC产生炎性因子,往刺激型DC极化。miR-277a-3p和miR-4989-3pmimic诱导BMDC IGF1和NF-κB1的mRNA水平显着降低,NF-κB P65的mRNA和蛋白质水平显着增加,并增加其磷酸化水平,提示IGF1和NF-κB1是miR-277a-3p和miR-4989-3p潜在的靶基因,可能通过活化NF-κB P65并使其磷酸化,进而诱导促炎性因子产生。本研究为进一步明确原头节源外泌体及其含有的miRNAs调控宿主免疫应答机制及包虫病防治研究提供新思路和分子基础。
张曦文[9]（2020）在《肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究》文中提出肺癌是临床最常见的肿瘤,患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。肺癌的主要治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,能够有效激活T淋巴细胞免疫,是肿瘤免疫治疗中的调控关键。在肿瘤微环境中,肿瘤相关树突状细胞（Tumor-associated dendritic cells,TDCs）中脂质过氧化激活内质网应激,引起未折叠蛋白反（Unfolded Protein Response,UPR）,激活下游 IRE1α-XBP1 通路,产生的剪切型XBP1-s通过靶向多个脂质合成基因,诱导TDCs内脂质的异常积累,表现出未成熟表型和功能障碍,抑制了抗肿瘤免疫。有研究表明,PI3K-AKT-mTOR信号途径在脂质代谢中起重要调控作用,能够通过调节脂肪合成相关基因的表达来调控脂质合成,XBP1过表达会导致PI3K/mTOR表达的上调,敲除XBP1后,PI3K/mTOR表达下调,还有研究表明,抑制mTOR2可以下调脂质的生成。“脂浊”既为病理产物也是致病因素,多归属于中医学“痰浊”的病理范畴。肺瘤平膏是由“全国名中医”朴炳奎教授研制的临床治疗肺癌具有确切疗效的中药复方,具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效,可通过多作用靶点发挥抗肿瘤作用。前期研究表明,肺瘤平膏（FLP）能够明显提高DCs功能,通过调节DCs的抗原递呈功能发挥抗肿瘤效应,并且在调控PI3K/mTOR通路方面具有一定优势。作为肺瘤平膏中化痰类代表药物桔梗的主要有效组分,研究表明,桔梗皂苷D（PlatycodinD,PD）具有明确的抗肿瘤、免疫调节、降脂和抗氧化等功能,并且具有抑制ROS聚集、调节PI3K/mTOR信号的作用。因此,我们推测PD可能是FLP调控脂质代谢逆转TDCs功能的有效组分之一,可能通过抑制TDCs脂质异常堆积逆转TDCs功能,并希望对其效应机制进行初探。目的:（1）构建TDCs共培养体系,探究肺瘤平膏在毒胡萝卜素（TG）诱导ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及作用机制。（2）初探PD对TDCs的免疫调节功能,及探究TG激活ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及可能的效应机制。方法:（1）小鼠骨髓源树突状细胞的分离、培养,建立体外肿瘤相关树突状细胞共培养模型。（2）模拟肿瘤微环境,通过FLP含药血清干预TDCs模型后,流式细胞术观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达;通过混合淋巴细胞反应,CCK8检测混合淋巴细胞增殖、流式检测T淋巴细胞亚群活化,Luminex技术检测TDCs细胞因子分泌。（3）毒胡萝卜素干预TDCs模型,观察TG激活ERS,对IRE1α-XBP1通路的影响,及对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（4）FLP含药血清,作用TG干预后的ERS激活后的TDCs模型,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（5）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 FLP 含药血清对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。（6）通过LDH、CCK8检测技术,观察PD对DCs毒性和Lewis肺癌细胞的杀伤能力。（7）模拟肿瘤微环境,通过PD干预TDCs模型后,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（8）通过构建TG激活ERS后的TDCs模型,观察PD对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（9）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 PD 对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。结果:（1）流式检测诱导后DCs表面分子CD1 1c+阳性表达比例为76.5%,并与肺癌细胞培养上清共培养,冻融抗原刺激,构建TDCs共培养模型。（2）在模拟的肿瘤微环境中,FLP含药血清干预后,降低TDCs胞内脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86的表达最为明显（P<0.05）,FLP刺激共培养淋巴细胞增殖（P<0.05）,明显提高T细胞中Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）,降低Tregs细胞的表达（P<0.05）,提高细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（3）TG作用后,在TDCs培养模型中,BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA、蛋白表达增加（P<0.05）,脂质含量较模型组增加（P<0.05）,影响TDCs表面分子的表达,MCH-Ⅱ、CD80、CD86的表达均明显降低（P<0.05）;抑制混合淋巴细胞的增殖能力（P<0.05）,降低Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,提高Tregs亚群的表达（P<0.05）,同时抑制细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌（P<0.05）。（4）FLP含药血清作用于TG干预后的TDCs,脂质含量明显下降（P<0.05）,恢复TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86表达水平较为明显（P<0.05）,提高TG干预后的混合淋巴细胞增殖能力（P<0.05）,提高Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）、降低Tregs细胞的亚群表达（P<0.05）,促进TG作用后 TDCs 细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（5）qPCR、Western blot 结果显示,对于 TG 激活 ERS 后,BiP-IRE1 α-XBP 1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白表达量增加（P<0.05）;FLP含药血清干预TG作用后的TDCs,FLP+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1通路mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,对重要脂质调节转录因子XBP1-s,具有降低其mRNA和蛋白表达的作用;同时,肺瘤平膏含药血清作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,并且明显降低AKT蛋白的磷酸化水平。（6）LDH结果显示,30uM以下的PD浓度,对DCs无明显损伤,或影响DCs细胞LDH的释放;CCK-8实验结果显示,PD能够有效杀伤Lewis肺癌细胞,其IC50值在13uM左右。（7）在TDCs共培养体系中,PD高中低浓度均能够有效降低TDCs中的脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,提高CD80（PDH、PDM,P<0.05）、CD86（PDM、PDL,P<0.05）的表达;PDH较强混合淋巴细胞的增殖（P<0.05）;PD高中低组均能提高Th、CTL细胞的亚群表达率（P<0.05）,抑制 Tregs 亚群表达（PDH,P<0.05）;提高 IL-12p70（PDH、PDM,P<0.05）IFN-γ（PDH,P<0.05）细胞因子的分泌。（8）TG干预诱导RES后,PD高、中、低剂量组均能降低TG干预后TDCs中脂质含量（P<0.01）;PDH能够提高表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,各剂量组均能提高CD80及CD86的表达（P<0.05）,PDH具有提高淋巴混合细胞的增殖能力（P<0.05）,PDH、PDM能够明显提高Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,PD各剂量组均能降低Tregs细胞亚群的表达（P<0.05）,并能促进 TDCs 分泌 IL-12p70（PDH,P<0.05）、IFN-γ（PDH、PDM,P<0.05）细胞因子。（9）qPCR、Western blot结果显示,TG激活ERS后,PD+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA和蛋白的表达（P<0.01）,同时,PD+TG组作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,其中降低p-AKT磷酸化蛋白表达（P<0.05）水平作用较为明显。结论:基于本实验条件下,我们推测:（1）TG诱导ERS,激活IRE1α-XBP1通路,产生XBP1-s剪切形式,可造成TDCs脂质异常堆积和TDCs的功能障碍。（2）FLP含药血清能够逆转TG激活ERS诱导XBP1剪切造成的TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能障碍。（3）PD可能是FLP发挥改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的有效组分之一。（4）FLP含药血清及其有效组分PD调节改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的作用机制可能是通过调控BiP-IRE1α-XBP1 和 PI3K-AKT-mTOR 通路实现的。
马占川[10]（2020）在《MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究》文中研究指明研究背景与目的:在炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease,IBD）中,多种免疫细胞和肠道菌群相互影响共同导致肠炎进展。其中,由于Th17细胞在肠炎中的关键作用成为近年来研究的热点。我们先前的研究结果表明髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）通过分泌 Ⅰ 型精氨酸酶（arginase-1,Arg-1）促进Th17细胞的分化,从而加重系统性红斑狼疮的进展。但是在炎症性肠炎中,MDSC与Th17细胞的关系仍不明确,阻碍了肠炎治疗的研究。此外,橡黄素在肠炎治疗中的表现出一定功效,但其作用机制还有待于进一步研究。因此,本研究以髓系细胞Arg-1敲除（ArgmyeKO）小鼠构建肠炎模型,研究MDSC对Th17细胞功能的影响,并探究橡黄素在肠炎治疗中的作用机制,为炎症性肠炎的治疗提供新的思路。研究方法:（1）3.5%葡聚糖硫酸钠喂养ArgmyeKO小鼠或野生型小鼠8～12天得到肠炎小鼠。从喂养之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,直至小鼠死亡,测量结直肠长度。以时间为横坐标评分为纵坐标绘制肠炎小鼠疾病得分曲线,以时间为横坐标存活率为纵坐标绘制肠炎小鼠生存曲线,对比两组肠炎小鼠结直肠长度,借此评估肠炎状态下Arg-1对小鼠的影响。（2）流式分选纯化肠炎小鼠脾脏MDSC,与带有CFSE标记的CD3、CD28刺激的小鼠T细胞共培养3天,流式检测评估Arg-1敲除对MDSC功能的影响。（3）在肠炎发病前后收集小鼠外周血,脾脏细胞以及派氏集合淋巴结细胞检测MDSC、Th17细胞、Treg细胞以及γδT细胞的比例。取肠炎小鼠结直肠做HE染色评估免疫细胞浸润状态和肠粘膜屏障受损情况。（4）流式检测肠炎小鼠MDSC Arg-1的分泌,检测Th17细胞IL-17A、IL-17F以及IL-22的分泌;荧光定量PCR检测肠炎小鼠结直肠组织中ACTI、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。（5）流式分选纯化野生型小鼠脾脏MDSC,转输给ArgmyeKO小鼠,记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测转输MDSC后肠炎小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。（6）在第0,3,5,7天给肠炎小鼠腹腔注射橡黄素,橡黄素用量按0.5 μM/g体重计算。记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测肠炎小鼠外周血,脾脏以及肠道固有层中MDSC 比例以及Arg-1和pSTAT3的水平,分选脾脏MDSC荧光定量PCR检测ESRI、ESR2的水平,检测小鼠脾脏和外周血派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδT细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。荧光定量PCR检测橡黄素治疗后肠炎小鼠结直肠组织中ACT1、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。研究结果:（1）肠炎期间Argmye KO小鼠体重下降明显,便血严重,肠组织中大量免疫细胞浸润,死亡率高于WT组小鼠。（2）肠炎期间ArgmyeKO小鼠结直肠组织IL-17A表达水平低于WT组小鼠;IL-17F表达水平高于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结中Th17细胞IL-17A的分泌量低于WT组小鼠,而IL-17F表达量则高于WT组小鼠。（3）肠炎期间ArgmyeKO小鼠肠组织和外周血中MDSC L比例低于WT组小鼠;其中M-MDSC 比例显着低于WT组,G-MDSC 比例组间无统计学意义。脾脏MDSC 比例在组间无统计学意义。此外,ArgmyeKO小鼠MDSC三个抑制分子Arg-1,iNOS,IDO表达水平低于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠结直肠中ACT1和COX-2表达量高于WT组小鼠;IL-22,IL-23,OCLN表达量在ArgmyeKO小鼠结直肠中更低。（4）转输WT来源的MDSC后,ArgmyeKCO小鼠便血减轻,体重流失程度减轻,结直肠比对照组小鼠更长。流式结果显示转输MDSC后,ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞分泌更多的IL-17A;而IL-17F的表达量低于对照组。（5）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠疾病评分降低,体重降低程度减轻,结直肠长度比对照组小鼠更长。流式结果显示治疗组小鼠外周血,脾脏和肠组织中MDSC 比例明显升高。MDSC表面雌激素受体表达量上升,胞内pSTAT3水平提高,MDSC分泌更多Arg-1。（6）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠结直肠组织IL-17A、IL-17F表达量升高。流式结果显示派氏集合淋巴结,肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδ T细胞分泌更多IL-17A;而IL-17F水平也高于对照组小鼠。治疗组小鼠结直肠中ACT1,IL-22,IL-23和OCLN表达量高于对照组小鼠;COX-2表达水平下降。结论:本研究发现在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,激活MDSC中ESR/STAT3信号通路可以上调MDSC Arg-1的分泌水平。经橡黄素治疗后,肠炎小鼠体内MDSC 比例显着升高并分泌大量Arg-1。Arg-1提高Th17细胞IL-17A的表达同时抑制IL-17F的水平,促进肠粘膜修复相关因子的表达,从而缓解肠炎。我们的数据强调了 MDSC来源的Arg-1在小鼠肠炎中对Th17细胞IL-17A和IL-17F的调节作用,揭示了橡黄素缓解肠炎发病的机制,并为肠炎的治疗提供了新的思路。
二、树突状细胞体内迁移机制研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、树突状细胞体内迁移机制研究进展（论文提纲范文）
（1）力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 癌症的免疫特性 |
| 1.1.1 癌症的发展 |
| 1.1.2 免疫系统 |
| 1.1.3 肿瘤免疫系统 |
| 1.1.4 免疫编辑 |
| 1.2 细胞力学特性 |
| 1.2.1 细胞基质的刚度对肿瘤的影响 |
| 1.2.2 细胞间粘附力对肿瘤的影响 |
| 1.3 肿瘤免疫反应建模 |
| 1.3.1 肿瘤的数学模型 |
| 1.3.2 肿瘤与免疫作用的数学模型 |
| 1.4 本章小结及主要研究内容 |
| 第2章 基质刚度调节细胞与基质间的黏附对肿瘤迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 细胞-ECM黏附的影响 |
| 2.3.2 细胞外基质刚度变化改变细胞-细胞外基质黏附对肿瘤细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 细胞毒性T淋巴细胞抗原-4 调节T细胞-DC间黏附对肿瘤杀伤的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 T 细胞的免疫特性 |
| 3.3.2 CTLA-4可调节T细胞-DC粘附力大小 |
| 3.3.3 CTLA-4影响T细胞的增殖 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 肿瘤生长-免疫系统模型代码 |
| 附录1 Main Python Script部分 |
| 附录2 XML Script部分 |
| 附录3 Python部分 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒蛋白功能及载体疫苗研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒结构 |
| 1.1.2 NDV基因组和功能蛋白 |
| 1.2 NDV免疫逃避机制 |
| 1.2.1 V蛋白抑制JAK/STAT通路 |
| 1.2.2 V蛋白降解模式识别受体MDA-5 |
| 1.2.3 V蛋白抑制MAVS的信号转导 |
| 1.2.4 V蛋白促进MEK/ERK通路的激活 |
| 1.2.5 V蛋白抑制细胞凋亡 |
| 1.3 新城疫载体疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 新城疫载体疫苗发展历史 |
| 1.3.2 新城疫载体疫苗的应用 |
| 第二章 树突状细胞与抗原递呈 |
| 2.1 DCs的亚群分类 |
| 2.1.1 经典DC |
| 2.1.2 其他DC亚群 |
| 2.2 DC与抗原递呈 |
| 2.2.1 DC的抗原摄取与迁移 |
| 2.2.2 DC的成熟与T细胞活化 |
| 2.2.3 CD4~+T细胞分化 |
| 第三章 副粘病毒抑制抗原递呈 |
| 3.1 副粘病毒对DC功能的影响 |
| 3.1.1 对DC表面成熟标记的影响 |
| 3.1.2 对DC细胞因子分泌的影响 |
| 3.1.3 对DC迁移的抑制 |
| 3.1.4 对DC吞噬能力的影响 |
| 3.2 副粘病毒抑制DC与T细胞的互作 |
| 3.2.1 诱导共培养细胞的凋亡 |
| 3.2.2 感染后DC表面糖蛋白会抑制T细胞增殖 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 NDV感染诱导DC成熟 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 毒株、细胞及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 小鼠骨髓源DC的分离培养 |
| 1.1.4 小鼠淋巴细胞分离 |
| 1.1.5 流式细胞术检测 |
| 1.1.6 上清细胞因子分泌的测定 |
| 1.1.7 DC的抗原摄取能力检测 |
| 1.1.8 DC迁移能力检测 |
| 1.1.9 DC细胞活性测定 |
| 1.1.10 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 BMDCs的培养与鉴定 |
| 1.2.2 NDV的感染效率检测 |
| 1.2.3 DC表面成熟分子标志检测 |
| 1.2.4 DC细胞因子分泌检测 |
| 1.2.5 DC吞噬能力检测 |
| 1.2.6 DC迁移能力检测 |
| 1.2.7 DC和T细胞的凋亡检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 宿主选择及NDV感染效率 |
| 1.3.2 小鼠DC感染后表型成熟 |
| 1.3.3 NDV弱毒感染并未诱导过高凋亡水平 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 NDV感染抑制DC抗原递呈并诱导Th2型应答 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 毒株、质粒及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 T细胞增殖(抗原递呈)检测 |
| 2.1.4 上清细胞因子分泌的测定 |
| 2.1.5 表达萤火虫荧光素酶的重组新城疫质粒prL-Luc构建 |
| 2.1.6 重组病毒的拯救 |
| 2.1.7 重组病毒的鉴定 |
| 2.1.8 荧光素酶活性检测 |
| 2.1.9 动物实验及分组 |
| 2.1.10 流式细胞术 |
| 2.1.11 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NDV感染DC体外刺激小鼠T细胞增殖能力检测 |
| 2.2.2 共培养上清细胞因子分泌检测 |
| 2.2.3 NDV感染DC体外刺激小鼠T细胞分化能力检测 |
| 2.2.4 NDV诱导抑炎因子IL-10 的检测 |
| 2.2.5 prL-Luc质粒构建 |
| 2.2.6 重组病毒的鉴定 |
| 2.2.7 小鼠活体成像观察 |
| 2.2.8 脾脏DC成熟水平检测 |
| 2.2.9 脾脏淋巴细胞检测(体内抗原递呈) |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NDV感染的DC功能不成熟导致小鼠T细胞增殖抑制 |
| 2.3.2 NDV感染会诱导免疫抑制因子IL-10 表达 |
| 2.3.3 NDV在小鼠的体内抗原递呈 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 NDV通过抑制小鼠DC IL-12p70分泌抑制T细胞增殖 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 毒株及实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 DC的细胞处理与分组 |
| 3.1.4 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3.1.5 上清细胞因子分泌的测定 |
| 3.1.6 流式细胞术检测 |
| 3.1.7 Western blot检测 |
| 3.1.8 p-p65的ELISA检测 |
| 3.1.9 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 NDV抑制IL-12p70的生成 |
| 3.2.2 NDV通过抑制IL-12p40表达抑制IL-12p70生成 |
| 3.2.3 NDV通过抑制p38通路抑制p65的磷酸化入核 |
| 3.2.4 NDV感染并未抑制IL-12 受体表达 |
| 3.2.5 NDV感染抑制小鼠DC刺激T细胞的炎性因子分泌 |
| 3.2.6 外源细胞因子添加能恢复NDV造成的小鼠T细胞抑制 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 NDV抑制IL-12 的方式 |
| 3.3.2 NDV通过IL-12抑制小鼠T细胞下游细胞因子分泌和增殖 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV通过抑制DC IL-12p70的分泌增强病毒感染效率 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 毒株及实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 NDV的感染效率检测 |
| 4.1.4 NDV直接抑制T细胞的细胞因子生成和抗原递呈检测 |
| 4.1.5 不同NDV对抗原递呈的抑制水平 |
| 4.1.6 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 NDV抑制小鼠T细胞的细胞因子表达 |
| 4.2.2 IL-12p70降低是抗原递呈抑制的主要原因 |
| 4.2.3 IL-12 可以抑制NDV的感染 |
| 4.2.4 IFN-γ、TNF-α 和IL-6 均可以抑制NDV感染T细胞 |
| 4.2.5 多种NDV均能通过抑制IL-12造成小鼠T细胞增殖抑制 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 NDV能通过小鼠DC感染T细胞造成增殖抑制 |
| 4.3.2 NDV抑制IL-12 及下游细胞因子分泌增强感染效率 |
| 4.3.3 多株NDV都能抑制DC IL-12 分泌抑制T细胞增殖 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 ILT4对非小细胞肺癌血管生成的作用和预后分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4调控非小细胞肺癌血管内皮细胞迁移和血管生成的机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分体内验证ILT4通过诱导血管生成促进肿瘤进展 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述:ILT4和VEGF-A的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）糖基转移酶Extl1在树突状细胞迁移中的调控作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)CCR7L诱导性蛋白Extl1 调节DC活化及迁移 |
| (二)Extl1 分子通过HSPG非依赖途径调控DC迁移 |
| (三)Extl1分子抑制LPS诱导的炎症反应而促进CCR7介导的DC迁移 |
| (四)Extl1 依赖于p-AKT和 pp38 信号活化促进DC迁移 |
| (五)Extl1 分子促进CCR7 内化及Vav3/Rac通路活化 |
| (六)Extl1 分子促进接触性超敏反应的炎症反应 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 趋化因子受体 CCR7 依赖的树突状细胞迁移的调控机制 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）低氧影响小鼠实验性结肠炎发生发展的免疫学机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 低氧影响宿主抗消化道病原菌感染的免疫反应机制 |
| 第1章 背景 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 技术路线图 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 低氧C.rodentium感染小鼠模型的建立 |
| 3.2 低氧暴露对C.rodentium结肠炎的影响 |
| 3.3 低氧下Th免疫反应的改变 |
| 3.4 低氧对HIF-1α及 Th免疫反应调控的影响 |
| 3.5 低氧对TLR4/NF-κB炎性通路的影响 |
| 3.6 低氧C.rodentium结肠炎黏膜屏障的改变 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 第二部分 低氧对黏膜抗原提呈细胞表型和功能的影响 |
| 第1章 背景 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 技术路线图 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 低氧对DC分化亚型的影响 |
| 3.2 低氧对DC成熟活化状态的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 低氧与肠道免疫功能改变 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（6）细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 非经典NF-κB信号通路的组成与调控 |
| 1.2 非经典NF-κB信号在树突状细胞中的功能 |
| 1.3 树突状细胞在自身免疫病中的作用 |
| 1.4 细胞周期的调控机制 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DCAF2的表达在树突状细胞激活后下调 |
| 3.2 树突状细胞中DCAF2 的缺失破坏免疫稳态并导致自身免疫反应 |
| 3.3 树突状细胞中DCAF2 的缺失促进实验性自身免疫病的发展 |
| 3.4 DCAF2在DC中特异性抑制IL-23 表达 |
| 3.5 DCAF2 负调控非经典NF-κB信号的活化 |
| 3.6 DCAF2 的缺失通过非经典NF-κB信号引发过度的炎症反应 |
| 3.7 DCAF2 负调控NIK的蛋白质稳定及下游信号通路 |
| 3.8 DCAF2 诱导NIK的泛素化修饰和降解 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 细胞周期蛋白参与调控免疫反应的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议 |
（7）ASAP1介导巨噬细胞和中性粒细胞迁移参与宿主抗结核分枝杆菌感染的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 论文综述 |
| 1 结核病流行现状与疫苗预防研究进展 |
| 1.1 结核病流行现状 |
| 1.2 结核病疫苗预防研究进展 |
| 1.3 结核分枝杆菌与巨噬细胞和中性粒细胞的相互作用 |
| 2 ASAP1基因与结核病易感性的研究进展 |
| 2.1 ASAP1基因在人群中与结核病易感性的研究进展 |
| 2.2 ASAP1基因 |
| 2.3 ASAP1及其相关基因抗结核免疫应答的机制研究进展 |
| 3 斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型研究结核病易感性的研究进展 |
| 3.1 斑马鱼作为模式动物的优点 |
| 3.2 海鱼分枝杆菌 |
| 3.3 斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型研究结核病易感性的研究进展 |
| 4 本课题的研究背景及目的意义 |
| 5 论文技术路线 |
| 第二章 asap1基因敲除斑马鱼模型的构建 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 斑马鱼 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 应用q RT-PCR技术检测斑马鱼胚胎在不同发育时期的表达 |
| 2.2.2 原位杂交 |
| 2.2.3 斑马鱼asap1a与asap1b基因的生物信息学分析 |
| 2.2.4 斑马鱼asap1a与 asap1b基因的克隆 |
| 2.2.5 斑马鱼asap1a与 asap1b基因敲除载体的构建 |
| 2.2.6 斑马鱼asap1a与asap1b基因敲除突变体F0代的建立 |
| 2.2.7 斑马鱼asap1a与 asap1b基因敲除杂合突变体和纯合突变体的筛选 |
| 2.2.8 Tg(mpx:GFP;asap1a-/-;asap1b-/-)转基因斑马鱼品系的构建 |
| 2.2.9 应用斑马鱼morpholino对asap1a与asap1b基因敲低 |
| 2.2.10 Western blotting检测morpholino对斑马鱼asap1a与asap1b基因敲低效率 |
| 2.2.11 斑马鱼各突变体生存情况与表型统计 |
| 2.2.12 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 斑马鱼asap1a与 asap1b的生物信息学分析 |
| 3.2 斑马鱼asap1a与 asap1b的时空表达 |
| 3.3 CRISPR/Cas9 基因编辑中斑马鱼asap1a-g RNA与 asap1b-g RNA敲除效率检测 |
| 3.4 CRISPR/Cas9 基因编辑构建斑马鱼asap1a和 asap1b敲除突变体 |
| 3.5 斑马鱼各突变体生存情况与表型统计结果 |
| 3.6 单敲除突变体中asap1a与 asap1b基因的补偿现象 |
| 3.7 应用斑马鱼morpholino对 asap1a与 asap1b基因敲低 |
| 3.8 斑马鱼asap1a morphants,asap1b morphants和 asap1a/1b morphants的表型分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 应用斑马鱼模型探讨Asap1介导巨噬细胞、中性粒细胞迁移反应与结核病易感性关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 动物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 荧光海鱼分枝杆菌的制备 |
| 2.2.2 尾静脉注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.3 卵黄注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.4 中耳和后脑室注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.5 中性红染色法观察巨噬细胞的迁移反应 |
| 2.2.6 利用qPCR定量海鱼分枝杆菌细菌数的标准曲线建立 |
| 2.2.7 斑马鱼幼鱼RNA/DNA的共提取 |
| 2.2.8 斑马鱼结核病易感表型的回转实验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 荧光海鱼分枝杆菌 |
| 3.2 Morpholino敲低asap1 基因后鱼胚体内的细菌载量变化 |
| 3.3 Morpholino敲低asap1 基因后鱼存活率的变化 |
| 3.4 Morpholino敲低asap1 基因后巨噬细胞的迁移变化 |
| 3.5 CRISPR/Cas9敲除asap1基因后鱼胚体内的细菌载量变化 |
| 3.6 利用qPCR建立海鱼分枝杆菌细菌数定量方法 |
| 3.7 asap1敲除突变体感染海鱼分枝杆菌后的存活率分析 |
| 3.8 CRISPR/Cas9敲除asap1基因后中性粒细胞与巨噬细胞的迁移变化 |
| 3.9 细胞炎症因子的检测 |
| 4 小结与讨论 |
| 第四章 利用人单核巨噬细胞系THP1 和鼠巨噬细胞系Raw264.7 研究ASAP1 与结核病易感性的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 荧光结核分枝杆菌的制备 |
| 2.2.2 细胞培养与分化 |
| 2.2.3 Raw264.7和THP1感染结核分枝杆菌 |
| 2.2.4 ASAP1敲低的Raw264.7和THP1细胞建立 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 Western blotting |
| 2.2.7 巨噬细胞对于结核分枝杆菌的易感性分析实验 |
| 2.2.8 Transwell实验 |
| 2.2.9 免疫荧光检测细胞骨架和黏着斑变化 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 荧光结核分枝杆菌的制备 |
| 3.2 ASAP1参与Mtb感染的THP1和Raw264.7 细胞 |
| 3.3 ASAP1在THP1和Raw264.7细胞中的敲低 |
| 3.4 敲低ASAP1引起THP1和Raw264.7细胞感染Mtb后细菌载量变化 |
| 3.5 敲低ASAP1抑制巨噬细胞的迁移 |
| 3.6 敲低ASAP1 引起THP1 细胞骨架的改变 |
| 4 小结与讨论 |
| 第五章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略表 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
| 个人情况与联系方式 |
（8）细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 细粒棘球蚴感染小鼠树突状细胞和免疫抑制细胞群比例动态变化研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 建立细粒棘球蚴小鼠感染模型 |
| 2.4.2 肝脏白细胞悬液制备 |
| 2.4.3 流式细胞术检测肝脏DC细胞比例 |
| 2.4.4 流式细胞术检测肝脏MDSC及其亚型比例 |
| 2.4.5 流式细胞术检测肝脏Treg细胞比例 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 DC细胞在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 3.2 MDSC及其亚群在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 3.3 Treg细胞在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA表达谱分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样本来源 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细粒棘球绦虫原头节和囊液分离 |
| 2.4.2 细粒棘球绦虫原头节体外培养 |
| 2.4.3 细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体分离和纯化 |
| 2.4.4 透射电镜分析(TEM) |
| 2.4.5 纳米粒径跟踪分析(NTA) |
| 2.4.6 Western blotting |
| 2.4.7 外泌体总RNA的提取和纯化 |
| 2.4.8 外泌体总RNA浓度和纯度测定 |
| 2.4.9 miRNA文库构建及测序 |
| 2.4.10 全转录组测序文库构建及测序分析 |
| 2.4.11 ceRNA调控网络构建 |
| 2.4.12 荧光定量PCR (qRT-PCR)分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体的分离鉴定 |
| 3.1.1 透射电镜分析(TEM) |
| 3.1.2 纳米粒径跟踪分析(NTA) |
| 3.1.3 Western blotting检测外泌体特有蛋白标志物 |
| 3.2 外泌体源miRNAs测序结果分析 |
| 3.2.1 样本测序结果基本情况 |
| 3.2.2 PSC-ELVs和HF-ELVs中保守miRNAs鉴定 |
| 3.2.3 PSC-ELVs和HF-ELVs中miRNAs数量和表达水平分析 |
| 3.2.4 靶基因预测及其功能富集和信号通路分析 |
| 3.2.5 荧光定量PCR (qRT-PCR)验证 |
| 3.3 外泌体源lncRNAs和circRNAs表达谱分析鉴定 |
| 3.4 mRNA-miRNA-lncRNA相互作用网络 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 细粒棘球绦虫原头节源外泌体miRNA作用于树突状细胞的功能与机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细粒棘球绦虫原头节源外泌体的分离鉴定:同第二章内容 |
| 2.4.2 原头节源外泌体总蛋白浓度测定 |
| 2.4.3 小鼠骨髓来源的DC体外培养 |
| 2.4.4 外泌体内化实验 |
| 2.4.5 miRNA功能获得性和缺失性研究 |
| 2.4.6 BMDC总蛋白制备 |
| 2.4.7 Western blotting |
| 2.4.8 ELISA |
| 2.4.9 BMDC总RNA提取 |
| 2.4.10 荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.4.11 流式细胞术检测 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PSC-ELVs总蛋白含量 |
| 3.2 BMDC纯度鉴定 |
| 3.3 BMDC摄取原头节源外泌体 |
| 3.4 原头节源外泌体转运miRNAs至BMDC |
| 3.5 转录水平原头节源外泌体活化BMDC |
| 3.6 原头节源外泌体诱导BMDC产生炎性因子 |
| 3.7 原头节源外泌体诱导BMDC表面标志物表达水平的改变 |
| 3.8 原头节外泌体源miR-277a-3p和miR-4989-3p诱导BMDC上调炎性因子表达 |
| 3.9 miR-277a-3p和miR-4989-3p潜在靶基因 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表文章及申请专利 |
| 附件 |
（9）肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分: 文献综述 |
| 综述一: 中医药调节肿瘤免疫应答防治肿瘤的研究进展 |
| 1 先天性免疫调节 |
| 2 适应性免疫调节 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二: 树突状细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中的作用 |
| 1 树突状细胞亚群分类 |
| 2 肿瘤免疫中树突状细胞功能 |
| 3 肿瘤对树突状细胞功能的调节作用 |
| 4 肿瘤治疗中的树突状细胞功能 |
| 5 基于树突状细胞的肿瘤免疫疗法 |
| 6 抗肿瘤树突状细胞疫苗 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三: 桔梗皂苷D的抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 1 调控肿瘤细胞凋亡途径 |
| 2 调控肿瘤细胞自噬 |
| 3 调控肿瘤细胞增殖 |
| 4 抑制血管生成 |
| 5 抑制肿瘤的侵袭和转移 |
| 6 体内抗肿瘤调控 |
| 7 免疫调节及降脂活性 |
| 8 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一: 肿瘤相关树突状细胞的诱导培养 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状脂质及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 毒胡萝卜素激活内质网应激对肿瘤相关树突状细胞中脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四: 肺瘤平膏含药血清逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质及功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六: 桔梗皂苷D对树突状细胞毒性和肿瘤细胞杀伤能力的研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞脂质含量及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八: 桔梗皂苷D逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验九: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（10）MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 炎症性肠炎 |
| 1.2.1 炎症性肠炎概述 |
| 1.2.2 炎症性肠炎的机制 |
| 1.2 Th17细胞 |
| 1.2.1 Th17细胞概述 |
| 1.2.2 Th17细胞的起源和发育 |
| 1.2.3 Th17细胞的可塑性 |
| 1.2.4 Th17细胞在IBD中的功能 |
| 1.3 调节性免疫细胞概述 |
| 1.3.1 调节性T细胞 |
| 1.3.2 调节性B细胞 |
| 1.3.3 调节性红细胞 |
| 1.3.4 调节性的髓系细胞 |
| 1.4 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.1 MDSC的起源 |
| 1.4.2 MDSC的功能 |
| 1.4.3 MDSC扩增的调控机制 |
| 1.4.4 MDSC功能的调控机制 |
| 1.4.5 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.6 MDSC在炎症性肠炎中的作用 |
| 1.5 自身免疫病中MDSC与Th17细胞的关系 |
| 1.6 炎症性肠病中MDSC和Th17细胞的展望 |
| 第2章 肠炎小鼠中MDSC影响Th17细胞IL-17A和IL-17F的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 2.3.2 炎症性肠炎小鼠模型的构建 |
| 2.3.3 肠炎分级评分标准 |
| 2.3.4 外周血单个核细胞的分离 |
| 2.3.5 脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.3.6 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 2.3.7 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 2.3.8 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 2.3.9 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.10 细胞表面染色 |
| 2.3.11 细胞内染色 |
| 2.3.12 抑制实验 |
| 2.3.13 抑制实验检测 |
| 2.3.14 荧光定量PCR |
| 2.3.15 转输实验 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠Th17细胞IL-17A表达降低,IL-17F表达升高 |
| 2.4.2 肠炎条件下Arg~(myKO)小鼠MDSC比例下降 |
| 2.4.3 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 2.4.4 转输WT小鼠来源的MDSC缓解Arg~(myeKO)小鼠肠炎 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 橡黄素通过ESR/STAT3通路促进MDSC存活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 数据库 |
| 3.2.2 软件 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 3.3.2 体外实验橡黄素处理髓系细胞 |
| 3.3.3 橡黄素治疗肠炎小鼠 |
| 3.3.4 肠炎分级评分标准 |
| 3.3.5 橡黄素互作基因的预测 |
| 3.3.6 基因富集和通路分析 |
| 3.3.7 小鼠骨髓细胞的分离 |
| 3.3.8 荷瘤小鼠脾脏细胞的分离 |
| 3.3.9 人脐带血单个核细胞的分离 |
| 3.3.10 细胞表面染色 |
| 3.3.11 细胞内染色 |
| 3.3.12 荧光定量PCR |
| 3.3.13 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MDSC雌激素受体的激活通过STAT3通路上调Arg-1的分泌 |
| 3.4.2 扩增的MDSC减轻DSS诱导的小鼠肠炎 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在肠炎小鼠中橡黄素通过MDSC产生的Arg-1调节Th17细胞因子分泌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 4.3.2 橡黄素治疗实验 |
| 4.3.3 外周血单个核细胞的分离 |
| 4.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 4.3.5 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 4.3.6 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 4.3.7 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 4.3.8 体外刺激PBMC实验 |
| 4.3.9 细胞表面染色 |
| 4.3.10 细胞内染色 |
| 4.3.11 荧光定量PCR |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 橡黄素通过上调ESR/pSTAT3促进MDSC促进Arg-1分泌 |
| 4.4.2 MDSC分泌的Arg-1促进Th17细胞IL-17A的表达,抑制IL-17F的水平 |
| 4.4.3 MDSC来源的Arg-1促进小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
四、树突状细胞体内迁移机制研究进展（论文参考文献）
- [1]力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析[D]. 张颖. 太原理工大学, 2021(01)
- [2]新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究[D]. 南福龙. 吉林大学, 2021(01)
- [3]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
- [4]糖基转移酶Extl1在树突状细胞迁移中的调控作用及机制研究[D]. 程玉洁. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [5]低氧影响小鼠实验性结肠炎发生发展的免疫学机制研究[D]. 纪巧荣. 青海大学, 2021(01)
- [6]细胞周期蛋白DCAF2在树突状细胞免疫应答中的功能和机制研究[D]. 黄涛. 浙江大学, 2021(01)
- [7]ASAP1介导巨噬细胞和中性粒细胞迁移参与宿主抗结核分枝杆菌感染的研究[D]. 崔佳. 山西大学, 2020(03)
- [8]细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究[D]. 张小凡. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [9]肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究[D]. 张曦文. 中国中医科学院, 2020(01)
- [10]MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究[D]. 马占川. 吉林大学, 2020(08)