一、RAPID AMPLIFICATION OF cDNA ENDS(RACE)（论文文献综述）
蒋晨旻[1]（2020）在《MRJP-1单克隆抗体和金标试纸制备技术研究及在蜂蜜真实性检测中的应用》文中提出蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露与自身分泌物结合后,经充分酿造而成的天然甜物质。作为营养丰富的天然功能食品,蜂蜜深受全球消费者喜爱,但它却极易被掺假。近些年来蜂蜜掺假愈演愈烈,掺假水平越来越高,成为国际上造假最为严重的食品之一。蜂蜜掺假除了影响整个行业的公平竞争外,用作掺假剂的某些成分可能成为过敏原,严重危害消费者的健康。确保蜂蜜的真实性仍然是科学研究的重点,因为迄今为止尚未开发出可靠的方法用以快速检测所有类型的蜂蜜掺假。本文以从蜂王浆（RJ）中提取得到王浆主蛋白-1（MRJP-1）为抗原,免疫小鼠,制备了MRJP-1特异性腹水型单克隆抗体。同时通过cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆了MRJP-1单抗基因的3’端和5’端,通过拼接获得了该基因的全长cDNA序列,构建了重组质粒并转染了中国仓鼠卵巢细胞（CHO-S）,成功表达了MRJP-1特异性单抗。同时建立了基于MRJP-1单抗的间接ELISA法和胶体金免疫试纸条（CGIS）的蜂蜜真实性快速检测方法。主要研究结果如下:（1）MRJP-1的分离及MRJP-1特异性腹水型单抗的制备将鲜RJ通过三次超高速离心,得到纯度为91.6%～94.7%的MRJP-1,作为抗原免疫小鼠,获得了七个杂交瘤细胞株:1H74D3、8H84E8、2G51E6、1F81D7、4G102B5、5H21D7、2B11B7。通过CGIS预实验,筛选出三株候选细胞株,分别是具有表位一的5H21D7（命名为MAM-1H）细胞株,表位二的4G102B5（命名为MAM-1G）细胞株和2B11B7（命名为MAM-1B）细胞株。将细胞株分别注射至小鼠体内,制备大量腹水型单抗。经HiTrap Protein G HP蛋白柱纯化,分别获得了4.2mg/mLMAM-1H,3mg/mLMAM-1G,4mg/mLMAM-1B。效价检测结果显示,MAM-1H效价约为1:32000,MAM-1G效价约为1:640000,MAM-1B 效价约为 1:1800000。（2）单抗基因的cDNA全长克隆及CHO-S表达通过RACE技术成功扩增得到了MAM-1H、MAM-1G重链和轻链基因的cDNA全长序列。其中MAM-1H重链基因的cDNA序列全长为1521 bp,包含54 bp的5’末端,99 bp的3’末端,1368 bp的开放阅读框,编码456个氨基酸,预测分子量约为56 kDa;轻链基因的cDNA序列全长为942 bp,包含90 bp的5’末端,204 bp的3’末端,648 bp的开放阅读框,编码216个氨基酸,预测分子量约为27 kDa。MAM-1G重链基因的cDNA序列全长为1503 bp,包含54 bp的5’末端,99 bp的3’末端,1350bp的开放阅读框,编码450个氨基酸,预测分子量约为55 kDa;轻链基因的cDNA序列全长为924 bp,包含66 bp的5’末端,210 bp的3’末端,648 bp的开放阅读框,编码216个氨基酸,预测分子量约为26 kDa。分别构建了同时包含重链基因cDNA全长序列和轻链基因cDNA全长序列的重组质粒,并转染CHO-S,得到了CHO-S表达的MRJP-1特异性单抗MAM-1G-CHO和MAM-1H-CHO,两者的浓度经测定分别为2.8202 mg/mL,3.5119 mg/mL。效价检测结果显示,MAM-1G-CHO的效价约为1:320000-1:640000;MAM-1H-CHO效价约为 1:16000-1:32000。与腹水型单抗MAM-1G、MAM-1H相比,细胞表达单抗浓度约是腹水型单抗浓度的一半,但其效价与腹水型单抗相近。因此细胞表达单抗仍有着较高的反应活性。SDS-PAGE结果表明,MAM-1G-CHO、MAM-1H-CHO都分别存在两条位于55 kDa的单抗重链条带和一条位于25 kDa左右的单抗轻链条带。通过特异性考察发现,MAM-1G-CHO、MAM-1H-CHO均能对MRJP-1有特异性识别,且不与葡萄糖、玉米糖浆、大米糖浆发生交叉反应。（3）MRJP-1单抗间接ELISA检测法的建立用MAM-1G作为一抗,羊抗鼠IgG-HRP为二抗,建立了 MRJP-1单抗间接ELISA检测蜂蜜真实性的新方法。其实验最佳条件为:1.5 μg/mL的MRJP-1在4℃下包被过夜;2%脱脂奶粉封闭1h;加入1:100000倍稀释的MAM-1G,于37℃反应1 h;加入1:250稀释的羊抗鼠IgG-HRP,于37℃反应1 h;最后加入TMB显色液,37℃反应15 min。得到了该间接ELISA法的标准曲线,确定了其线性检测范围在46.9 ng/mL-3 μg/mL。其样品回收率在92.17%-117.01%,变异系数在0.09%～7.58%,且与常见的掺假物大米糖浆、玉米糖浆不发生交叉反应。当商品化油菜蜜或荆条蜜的玉米糖浆掺假率≥30%时,利用该间接ELISA法测定的计算掺假率与理论掺假率的误差<10%。用细胞表达的MAM-1G-CHO代替腹水型单抗MAM-1G作为一抗,确定了其间接ELISA法线性检测范围在187.5 ng/mL-6 μg/mL。MAM-1G的检测灵敏度相对于MAM-1G-CHO要高,而MAM-1G-CHO的检测范围相对于MAM-1G要宽。所以可以根据实际检测情况的不同,选择不同的单抗进行蜂蜜掺假鉴别实验。（4）基于MRJP-1单抗的CGIS开发以MAM-1G作为胶体金标记单抗,MAM-1H为检测线（T线）抗体,羊抗鼠IgG为质控线（C线）抗体。经过优化,确定了 MAM-1G标记胶体金溶液的最佳pH=9.0,胶体金结合用MAM-1G浓度为0.6 mg/mL,胶体金标记MAM-1G喷量选择OD533=1.2,T线MAM-1H包被浓度为0.3 mg/mL,C线羊抗鼠IgG包被浓度为0.3 mg/mL。该试纸条重复性良好,与常见掺假物玉米糖浆、大米糖浆无交叉反应。采用所制备的CGIS,检测了七种不同蜜源的市售蜂蜜真实性,其结果与用元素分析-同位素比质谱法所得结果一致,验证了采用CGIS检测蜂蜜掺假具有实践上的可行性。
徐腾[2]（2019）在《卵形鲳鲹TLR21、TLR22及相关基因的克隆与表达分析》文中进行了进一步梳理Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）作为一类重要的模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）,主要负责识别病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMPs）,启动先天免疫系统抵御病原微生物的入侵。TLRs除了启动先天免疫外,还可调节适应性免疫,是连接先天免疫和适应性免疫的桥梁。TLR21和TLR22是TLRs家族的重要成员,主要存在于鸟类、两栖类或鱼类中;TRAF3和IRAK1是TLRs信号转导通路中的重要分子,在TLRs信号转导级联反应中具有重要作用。卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）是我国南方重要的海水养殖经济鱼类,随着养殖规模的不断扩大,病害不时发生,给卵形鲳鲹养殖业带来巨大经济损失。鉴于TLR21、TLR22、TRAF3和IRAK1在免疫中具有重要功能,本研究采用RACE-PCR和RT-PCR技术克隆了卵形鲳鲹TLR21（TrTLR21）、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1基因;应用生物信息学分析上述基因的序列特征和蛋白结构;采用荧光定量PCR技术分析上述基因在健康卵形鲳鲹组织中的分布;检测溶藻弧菌、LPS或PolyI:C刺激后上述基因在鳃、脾脏、头肾和肝脏中的免疫应答规律。主要研究成果如下:1.TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3 和 TrIRAK1 基因 cDNA全长分别为3184bp、3454bp、2818bp和2564bp。其中,TrTLR21和TrTLR22开放阅读框分别为2931 bp和2880 bp,推定编码976和959个氨基酸。TrTLR21和TrTLR22蛋白均具有信号肽和富含亮氨酸重复基序（leucine-rich repeat,LRR）的胞外结构域、跨膜域和胞内结构域（Toll/IL-1 reporter,TIR）,符合TLRs的典型特征,TrTLR21和TrTLR22的LRR基序数目不同,TrTLR21具有4个LRR-TYP基序和14个LRR基序,而TrTLR22有3个LRR-TYP基序,有13个LRR基序和1个LRR-CT基序。氨基酸同源性和系统进化树分析,TrTLR21和TrTLR22氨基酸序列与其它鱼类的氨基酸序列同源性分别在53.1%-81.8%和41.3%-82%之间,均与黄尾鲫（Seriola Lalandi）聚为一枝。TrIRAK1和TrTRAF3开放阅读框分别为2247 bp和1788 bp,分别推定编码748和595个氨基酸。TrIRAK1蛋白含有死亡结构域（death domain,DD）和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（Serine/Threonine protein kinases catalytic domain,S-TKc）;TrTRAF3蛋白具有环指结构域（RING domain）、锌指结构（zinc fingers）、卷曲螺旋结构（coiled-coil region,CCR）和MATH结构域。TrIRAK1和TrTRAF3氨基酸序列与其他鱼类氨基酸序列同源性分别在44.7%-76.1%和74.7%-93.9%之间。系统发育树显示TrIRAK1与红笛鲷（Lutjanus sanguineus）亲缘关系最近,TrTRAF3和高体鲫（Seriola dumerili）聚为一枝。结果表明,TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1在物种进化过程中高度保守。2.TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1在健康卵形鲳鲹的组织中呈组成型表达,但在不同的组织中表达水平具有明显差异。TrTLR21在脾脏中表达量最高,其次为头肾、皮肤、心脏、肠和鳃,在肌肉的表达量最低;TrTLR22在头肾中表达量最高,其次为脾脏、鳃和肠,在心脏的表达最低;TrIRAK1在鳃中表达量最高,其次为皮肤、脑、脾脏、肝脏和头肾,在肌肉的表达最低;TrTRAF3在脾脏中表达量最高,其次为肝脏和头肾,在肌肉的表达最低。3.溶藻弧菌、LPS 和 Poly1:C 刺激后,TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1的表达水平在脾脏、头肾等免疫器官中均呈上调现象,但在不同组织中和不同时间点上调水平存在差异。LPS刺激后,TrTLR21、TrTLR22和TrIRAK1在脾脏中表达水平分别在24 h、6 h和24 h达到峰值,而TrTRAF3在鳃中的表达水平在24 h达到峰值。溶藻弧菌刺激后,TrTLR21、TrTLR22和TrTRAF3在脾脏表达水平分别在24 h、6 h和12 h达到峰值;TrIRAK1在肝脏中表达水平在12 h达到峰值。polyI:C刺激后,TrTLR21、TrTLR22和TrIRAK1在肝脏的表达水平高分别在24 h、6 h和6 h达到峰值,而TrTRAF3在脾脏中的表达水平在24 h达到峰值。这些结果表明TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1均参与了卵形鲳鲹抗细菌和抗病毒的免疫反应。
李章富[3]（2019）在《中心体蛋白Nlp相关长链非编码RNA的鉴定及生物学功能研究》文中研究说明长链非编码 RNA（Longnon-coding RNAs,LncRNAs）是一大类长度超过 200 nt的非编码RNA,它们利用自身RNA分子参与分子间相互作用而发挥功能。这种笼统的分类方法使lncRNAs在大小、结构、功能上存在多样性和复杂性,LncRNAs主要的生物学功能涵盖了顺式/反式调控基因转录、DNA修饰、RNA剪接、蛋白质支架、蛋白质修饰、miRNA海绵等。LncRNAs广泛地与DNA、RNA和蛋白质发生着复杂多样的相互作用。胚胎发育、心血管疾病、肿瘤发生发展过程中发现不少具有重要角色的lncRNAs。目前对lncRNAs的了解仅仅是冰上一隅,鉴于此我们开展了针对lncRNAs-蛋白质互作的研究,旨在探究lncRNAs-蛋白质相互作用在肿瘤细胞中的生物学功能。Nlp（Ninein like protein）是中心体γ-Tubulin环状复合物的重要成员,Nlp结合到γ-Tubulin定位到中心体上,参与了中心体复制、中心体成熟、微管锚定、有丝分裂纺锤体形成等众多细胞周期事件并发挥重要作用,Nlp表达的异常通常会引起中心体结构和数量的异常,导致单极或多极有丝分裂和核分裂细胞质不分裂等异常有丝分裂现象,进而造成基因组紊乱,导致细胞恶性转化。Nlp在细胞周期进程中与PLK1、NEK2、Aurora A/B、Cyclin B1等细胞周期调控蛋白时序性结合保证了细胞正常复制和生长。考虑到中心体在细胞中重要作用,及对Nlp这个中心体平台蛋白是否能搭载lncRNAs这类功能多样而复杂的分子,发挥对细胞周期调控的可能性,我们进行了本课题研究工作,旨在阐释lncRNAs与中心体蛋白Nlp相互作用对细胞有丝分裂的调控作用。我们通过Nlp RIP-seq在转录组范围内鉴定Nlp蛋白结合的RNAs,发现了上千条转录本,其中被注释为lncRNAs也达数百条之多,我们挑选了 34条进行qRT-PCR验证,其中显着地被Nlp富集的就有24条,我们对其中7条富集倍数高、多次鉴定结果一致的lncRNAs进行亚细胞定位和多种肿瘤细胞中表达水平检测,最终选择了 CCAT1和linc00665两个Nlp结合的lncRNAs,我们进一步通过RNA-FISH联合蛋白质免疫荧光观察lncRNAs与Nlp、γ-Tubulin是否存在共定位。发现CCAT1和linc00665分别都能与Nlp和y-Tubulin共定位。CCAT1体外RNA pulldown有力地支持了 CCAT1与Nlp和γ-Tubulin结合现象,RNA反义核酸纯化联合质谱鉴定证明CCAT1与Nlp是直接结合的,同时还能结合微管蛋白α-Tubulin和β-Tubulin但没有γ-Tubulin,证明CCAT1与γ-Tubulin的结合是间接的。另一方面,对于Nlp RIP发现的lncRNA linc00665,我们对其进行5’和3’末端RACE鉴定,发现在HeLa细胞中与Nlp结合的linc00665是一个新的转录本,它的第1、2号外显子与数据库收录的其他转录本一致。对CCAT1和linc00665的细胞学功能研究发现它们在HeLa细胞中都发挥促进细胞生长、迁移和侵袭的角色,CCAT1的过表达能帮助细胞抵抗紫杉醇对细胞的杀伤作用,另一方面导致HeLa细胞多极有丝分裂、中心体扩增细胞比例增加。综上,本课题研究工作成功鉴定出了两个中心体蛋白Nlp结合的lncRNAs CCAT1和linc00665,它们在细胞内与中心体蛋白Nlp、y-Tubulin相互作用,都存在一定程度的中心体定位,其中外源CCAT1过表达导致中心体过度复制、有丝分裂异常细胞比例增多现象,我们认为CCAT1和linc00665可能在一定程度上通过扰乱中心体结构和数量,破坏中心体稳态,增加有丝分裂异常,进而导致染色体不稳定、基因组不稳定,最终导致细胞生长加快、侵袭和迁移能力增强等恶性转化现象。
潘铖烺[4]（2019）在《镉胁迫下秋茄超氧化物歧化酶家族基因的表达调控与功能分析》文中研究表明红树林湿地在热带和亚热带沿海地区发挥着重要的生态功能。红树植物分布于河流入海口,该流域水流缓慢,土壤泥泞,有机质与硫化氢含量高。由于其独特的地理环境,红树林湿地常成为重金属的富集区。随着城市化的快速发展,红树林湿地的重金属污染状况受到越来越多人的关注。其中,重金属镉是严重威胁红树林湿地的污染物之一。秋茄（Kandelia obovata）作为红树林的优势种,广泛分布于亚洲。其对镉有较高的抗性但机理尚不完全清晰。前人的研究表明,秋茄对重金属的抗性很大部分归因于其在胁迫下显着增高的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性,以减少重金属胁迫对植物体造成的氧化损伤。但与秋茄SOD相关的研究仍多停留于总酶活性变化方面,对其同工酶和基因家族的表达调控研究还未见报道。深入解析秋茄SOD家族基因的生理机制对后期利用基因工程技术提高植物的重金属抗性有一定的指导意义。因此,本文主要对镉处理下的秋茄SOD家族基因的表达调控机制和功能进行分析。本研究在镉胁迫下对秋茄SOD家族基因转录本,基因结构,蛋白结构域,系统进化,表达模式和亚细胞定位等进行分析。同时在本氏烟草中构建过表达体系以验证其在镉胁迫下的功能。主要研究结果如下:1、从秋茄中分离获得7条SOD基因,隶属三个亚型,并且我们发现外显子缺失,内含子驻留和可变多聚腺苷酸化是秋茄SOD转录本多样性的成因。此外,秋茄SOD成员（KoSODs）与拟南芥SODs存在高度相似的基因结构,如外显子数量和内含子相位,除了 和KoFSD2两个成员。说明这两个成员可能和秋茄的物种特异性相关。2、11条SOD转录本共编码10个KoSOD蛋白。蛋白分子量大小在13.44到33.46 kDa之间。KoSOD蛋白多为稳定蛋白,且都为亲水蛋白。在与Bruguiera gymnorrhiza,Kandel aicandel和Arabidopsis thaliana的SOD序列比对后,我们发现秋茄SOD蛋白的活性位点,金属结合位点以及N/C端结构域都高度保守。系统进化关系和非同义替换与同义替换比率分析结果表明在不同植物中,锰亚型和铜锌亚型SOD在不同物种间的进化都存在纯化选择作用。而铁亚型SOD在随物种进化的过程中则易出现物种特异性。对秋茄SOD蛋白的亚细胞定位结果显示,KoCSD1和KoCSD3蛋白可能为细胞质型定位,而KoCSD2,KoFSDs和KoMSD则多定位在叶绿体和线粒体。3、秋茄SOD家族基因成员在镉胁迫下主要在秋茄根系、胚轴和茎中表达。有趣的是,各KoSOD成员的表达呈现明显的组织特异性。具体表现在:KoCSD2基因主要在茎和胚轴中表达,KoCSD3和KoFSDs则在根系中的表达量最高。KoMSD在根系、胚轴和茎中均有表达。此外,同亚型SOD的不同成员在响应镉胁迫的不同阶段表现出相互协调的表达模式。在秋茄SOD家族成员中,KoCSD3和KoFSD2两个成员在镉胁迫过程中的表达水平上调最为显着。4、镉胁迫下,秋茄根系表皮和外皮层出现明显的木质化和木栓化现象,加厚的外皮层起到阻挡作用使得进入根系的镉减少。对根系各组织镉含量测定结果显示根系表皮和外皮层的镉含量高于皮层和中柱。与之相似,在镉胁迫下根系表皮和外皮层中的氧化胁迫和SOD酶活性也显着高于皮层和中柱。qPCR结果表明KoFSD2在根系各组织中均有表达,而KoCSD3仅在根系表皮和外皮层表达。5、KoFSD2和KoCSDD3基因的启动子区域的顺式元件和转录因子预测结果表明有6种激素相关的顺式元件和两个转录因子被预测。而镉胁迫下秋茄根系各组织的内源激素含量变化表现为:表皮和外皮层内源ABA含量显着增加,皮层和中柱的生长素含量显着增加。同时通过外源添加激素处理验证KoFSD2和KoCSD3的表达可以受到外源ABA的诱导,但KoCSD3的表达水平在外源IAA的处理下没有显着变化。6、在本氏烟草中过表达KoFSD2和KoCSD3可以显着缓解镉胁迫对植株根系生长的抑制,说明转基因烟草与野生型烟草相比具有更高的镉抗性。T-KoFSD2和T-KoCSD3两种转基因烟草在SOD酶活性和过氧化氢含量的调控上具有不同的表型。过表达KoFSD2可诱导其下游过氧化氢酶以及谷胱甘肽还原酶的活性,以此缓解胞内过氧化胁迫。KoCSD3基因主要在根系表皮和外皮层表达,过表达该基因可诱导下游抗坏血酸过氧化物酶活性以此将胞内过氧化氢含量维持在一定水平,这可能与木质素累积和根系表皮和外皮层木质化增厚有关。
李利锋[5]（2017）在《嗜酸性喜温硫杆菌Sox硫氧化系统代谢功能和调控机制研究》文中研究表明嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.是化能自养的硫氧化细菌,革兰氏阴性,能够以连四硫酸盐（S4O62-）、硫代硫酸盐（S2O32-）、亚硫酸盐（SO32-）、硫化物（S2-）和元素硫（S0）等多种还原性无机硫化物为能源进行生长。A.caldus生长的最适pH是2～2.5、最适温度是45℃,是一种中度嗜热菌,在生物冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等过程中具有重要的作用。A.具有复杂的硫代谢系统和调控网络,实现各种硫化合物的高效利用,而硫代硫酸盐的氧化是其整个硫代谢中的关键步骤,Sox硫氧化系统又是其硫代硫酸盐代谢中的重要途径。由于缺少Sox（CD）2,A.caldus中为不完整Sox硫氧化系统,由基因组上两个独立的基因簇sox-Ⅰ和sox-Ⅱ编码。其中,SoxYZ是底物结合蛋白,SoxAX可以催化底物结合并实现自身的还原,产生电子,SoxB则负责将SoxYZ末端的磺酸基团氧化成硫酸报。A.caldus中不完整Sox系统中SoxYZ的再生机制及工作方式,以及两套Sox系统是如何调控的,目前还没有报道。因此,基于无痕敲除等分子生物学技术,研究A.caldus中Sox系统的转录方式、基因敲除株的生长变化、代谢产物变化、硫氧化基因转录变化,对于解析Sox系统工作方式和调控机制具有重要意义,同时也可以深入了解A.caldus的硫代谢及其调控网络,揭示硫代谢的分子机制,为高效浸矿基因工程菌株的构建提供理论指导。本论文的工作主要从以下几个方面展开:一、A.culdus MTH-04中Sox硫氧化系统生物信息学及转录水平分析:通过对A.caldus基因组中两套sox基因簇sox-Ⅰ和sox-Ⅱ进行基因簇排列和组成的分析、比较发现,两套系统中核心组分SoxAX、SoxYZ和SoxB具有较高的相似性。对两套Sox系统中各蛋白进行系统发育分析发现,两套系统的Sox蛋白具有共同的进化来源。本文,首次发现sox-Ⅰ基因簇前有一个依赖转录因子sigma54的双组分调控系统A59042484和A59042485,将其组氨酸激酶命名为TspS,调控蛋白命名为TspR（Tsp,two component system（TCS）of Sox pathway）,并且在多个化能自养的硫氧化菌中发现了tspSR-soxXAYZB类型的基因簇。两套sox基因簇在硫粉和连四硫酸盐为能源时生长过程中基因转录变化分析发现,在连四硫酸盐培养时sox基因转录水平较高,但是sox-Ⅰ和sox-Ⅱ具有相反的变化趋势,说明两套系统功能的发挥可能受到不同方式的转录调控,从而在不同的生长时期发挥功能。二、A.caldus MTH-04中sox基因敲除菌株的构建:运用基于同源重组的无痕敲除方法,通过构建含有soxB-Ⅱ基因上下游同源臂和I-SceI酶切位点的自杀质粒pSDUDI::soxB-Ⅱ（UHA+DHA）,接合转移进入A.caldus野生型筛选得到单交换;向单交换中转入pSDU-I-Sce Ⅰ质粒促进同源重组,成功筛选得到 △soxB-Ⅱ 敲除株;通过构建自杀质粒 pSDUDI::soxYZB-Ⅱ（UHA+DHA）,在 △soxAX-Ⅱ的基础上敲除基因soxYZB-Ⅱ,成功构建△sox-Ⅱ敲除株,实现了对sox-Ⅱ基因簇的敲除。两种敲除株的成功构建为分析相应基因的功能奠定基础,但是,sox-Ⅰ处基因的敲除则经过大量的筛选,都未能得到其敲除株,推测其可能具有更加关键的基础性作用。三、A.caldus MTH-04 sox基因敲除菌株功能的研究:针对本文构建的敲除株△soxB-Ⅱ、△sox-Ⅱ和实验室已有的△soxYZ-Ⅱ、△soxX4-Ⅱ敲除株,从生长特性、转录水平和代谢物检测等方面进行了系统的研究分析。通过测定硫粉、连四硫酸盐、硫代硫酸盐为能源时的生长曲线发现,soxB-Ⅱ和sox YZ-Ⅱ的敲除对菌株生长影响不明显,敲除株△soxXA-Ⅱ和△sox-Ⅱ的生长明显弱于野生型,生长量不足野生型的一半;RT-qPCR分析敲除株AsoxB-Ⅱ、△sox-Ⅱ、△soxYZ-Ⅱ、△soxXA-Ⅱ中硫代谢基因转录变化发现,soxB-Ⅱ和soxYZ-Ⅱ的敲除可以通过另一套sox基因（sox-1）的上调弥补,因此,对整个菌株生长和代谢的影响不大。然而,soxXA-Ⅱ和sox-Ⅱ基因的敲除导致的基因缺失并不能通过另一套基因的上调实现补偿,且会影响tetH和doxD基因的转录,实现代谢途径由Sox系统向S4I途径的转化,导致能量代谢效率的下降,因而对生长的影响较大。高效液相色谱检测连四硫酸盐的消耗及元素硫产生的结果显示,连四硫酸盐消耗曲线与生长曲线的结果一致,sox基因敲除导致菌体元素硫含量的减少,其含量由高到低的顺序依次为野生型、△soxB-Ⅱ、△soxYZ-Ⅱ、△soxXA-Ⅱ和△sox-Ⅱ。硫代硫酸盐培养野生型产生单质硫,同时Sox系统的减弱导致元素硫产生的减少,因此,我们认为不完整Sox系统的活化再生可能是通过多聚硫的断裂,形成硫球实现SoxYZ的再生,实现整个硫代硫酸盐代谢途径的循环。四、A.caldus MTH-04中sigma因子与硫代谢及环境压力的关系:Sigma因子是细菌基因转录的关键,本章系统开展了不同硫能源培养条件和环境压力下A.caldus Sigma因子转录水平分析,并通过构建sigma54的过表达菌株验证其与Sox系统的关系。通过分析硫粉和连四硫酸盐为能源时的sigma因子的转录水平发现:所有的sigma因子在两种能源条件下都能检测到稳定表达,且sigma因子在生长过程中的转录水平不同,说明sigma因子在菌体生长过程中参与硫代谢等相关基因的转录调节。pH、热刺激、渗透压和铜刺激等环境压力条件下分析发现,持家基因的sigma因子也会参与到环境刺激条件下基因转录的调控,同一类别的sigma因子在A.caldus中可能参与不同的生长和刺激条件下的基因的转录的调控。通过对不同能源和不同环境压力条件下的分析,我们发现sigma54基因的转录处于相对稳定的水平,可能并未参与环境刺激相关基因的调控。同时,我们基于基因组序列分析发现sigma54依赖的双组分调控系统TspS和TspR,可能参与Sox系统的转录调控,因此我们构建了 基因的过表达菌株,以分析sigma54是否负责Sox系统的转录起始。通过对过表达sigma54的重组菌株的RT-qPCR分析,证实了其与sox-Ⅰ转录调控的关系,证明σ54可以激活sox-Ⅰ的转录。五、A.caldus MTH-04中σ54依赖的双组分调控系统TspS/R对sox-Ⅰ基因簇的调控:σ54（RpoN）类型的转录起始具有以下特点:识别启动子特异性的-12和-24区,需要激活蛋白参与,激活蛋白接合启动子上游的上游激活序列UAS,实现RNA聚合酶与启动子DNA复合休构象的改变。其中,sox-Ⅰ基因簇中的TspR蛋白既是双组分中的调控蛋白也是σ54的激活蛋白。首先,基于生物信息学分析发现A.caldus及其他化能自养菌中存在tspSR-sox类似的基因簇;通过快速扩增cDNA末端（5’RACE）确定.soxX-Ⅰ转录起始位点;运用凝胶阻滞分析（EMSA）分析TspR蛋白与不同大小的启动子P1的接合作用,确定UAS的区域;构建一系列的启动子探测质粒分析了不同大小的启功子和不同关键位点突变的启动子的活性,确定了启动子P1的-12/-24区保守的GC/GG,鉴定了UAS保守的TGT/ACA序列;基于双组分蛋白的序列和结构域的相似性及启动了-12/-24和UAS保守序列,通过生物信息学分析提出其它硫氧化菌株中类似调控机制的合理假设;基于实验结果和σ54依赖的转录起始的机制,首次提出了A.caldus中σ54依赖的双组分调控系统TspS/R对sox-Ⅰ基因簇的调控的模型。六、A.caldus MTH-04中sox-Ⅱ基因簇共转录分析及启动子初步鉴定:首先通过共转录分析确定sox-Ⅱ操纵子的组成,发现与sox-Ⅰ中只有一个操纵子不同,sox-Ⅱ中各个sox基因位于两个操纵子上，且基因簇附近未发现调控蛋白，因此我们首先对sox-Ⅱ中可能的启动了进行分析。共转录分析应有启动子和生物信息学及转录数据分析中可能的启动子通过启动了探测质位和5’RACE进行分析,成功构建四种启动子探测质粒 pJRD215-P2515-gusA、pJRD215-P2519-gusA、pjRD215-P2523-gusA 和pJRD215-P2525-gusA,并在体内验证了启动子的活性。结果发现,四种启动子均有转录活性。通过5’RACE试图确定四个基因的转录起始位点（TSS）,但只成功地确定了两个基因A59042515和A59042519的转录起始位点,因而,可以得到启动子可能的关键序列,初步解析了sox-Ⅱ的转录调控元件。
任洪杰[6]（2015）在《大蒜MADS-box基因的克隆与表达分析》文中认为大蒜（Allium sativum L.）为单子叶葱科葱属,一年或二年生二倍体（2n=2x=16）蔬菜作物。原产于西亚和中亚,因含有丰富的营养成分和耐储运等特点而被广泛种植。为初步解释大蒜花器官发育及败育的分子机制,本研究以大蒜常规品种‘伊宁红皮’为试验材料,应用RACE方法克隆6个大蒜MADS-box基因的cDNA全长,运用生物信息学方法对基因的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发育分析。半定量PCR和实时定量PCR分析基因在不同器官的表达模式。研究结果如下:1.应用RACE方法分离了 6个大蒜MADS-box基因,分别命名为AsPI、AsAG、AsAGL6、AsSEP1、AsSEP3、AsSVP;全长分别为 939bp、1021bp、1132bp、1103bp、1042bp、1022bp;开放阅读框长度分别为 615bp、690bp、726bp、738bp、735bp和 657bp;分别编码 204、229、241、245、244、218个氨基酸。2.系统发育分析表明,B功能基因AsPI属于PI/GLO进化系;C功能基因AsAG属于AG-like进化系;AsAGL6基因属于单子叶AGL6-like进化系;E功能基因AsSEP1属于LOFSEP进化系,E功能基因AsSEP3基因属于SEP3-like进化系。3.实时定量PCR分析结果表明:AsPI在花芽中高丰度表达,在花芽的第一时期中表达量最高,在营养器官根、假茎、嫩叶、蒜皮中几乎不表达,在蒜薹中表达量极低;AsAG在花芽三个时期中表达量呈现递增的趋势,在营养器官假茎、嫩叶中几乎不表达,在根、蒜皮、蒜薹中表达量极低;AsAGL6在花芽的第三时期中表达量最高,在营养器官中几乎不表达;AsSEP1在花芽和蒜薹中表达量较高,在其他营养器官中几乎不表达,AsSEP3在花芽的第三时期表达量最高;AsSVP的表达模式与所克隆的其他MADS-box基因有所不同,AsSVP在花芽中表达量较低,在营养器官根、假茎、嫩叶中却高丰度表达,在蒜皮和蒜薹中中度表达,这与SVP基因抑制开花的特性相符。4.构建大蒜AsSVP基因过表达载体,用农杆菌侵染法转染拟南芥,结果发现与野生型相比svp突变体表现出开花时间延迟,野生型拟南芥在生长28天后,有14片莲坐叶出现花蕾;而转基因植株在生长36天后,有24片莲坐叶出现花蕾。验证了AsSVP基因对开花具有抑制作用。
于存[7]（2015）在《一色齿毛菌锰过氧化物酶基因的克隆与差异表达分析》文中研究说明白腐真菌（White rot fungi）通过分泌包含漆酶（Lacase）、锰过氧化物酶（MnP）、木质素过氧化物酶（LiP）等几种主要的木质素降解酶可以有效降解木质素及多种芳香族化合物,在环境污染问题日益严重的当今社会,利用白腐菌及其木质素降解酶进行环境污染治理的应用越来越多。凭借MnP广泛的底物多样性及其在木质素降解酶系统中占有的重要地位,对MnP的研究与应用受到了国内外研究学者的广泛关注。由于菌种及环境条件的束缚,白腐菌及其分泌木质素降解酶系的应用受到不同程度的限制,因此开发新的菌种以及明确木质素降解酶系的作用机制是实现白腐菌及其木质素降解酶在环境治理等方面大规模应用的前提。因此,本论文以在自然界中分离得到的一色齿毛菌（Cerrena unicolor）为研究对象,通过形态学与分子生物学技术完成了试验菌株的鉴定,并在明确了一色齿毛菌较强的染料脱色能力及其产锰过氧化物酶的能力之后,对一色齿毛菌锰过氧化物酶同工酶基因进行了克隆及序列分析,在此基础上,利用荧光定量PCR技术全面的分析了在不同诱导条件下一色齿毛菌锰过氧化物酶同工酶基因之间的差异表达情况,为今后阐明锰过氧化物酶基因的作用机制奠定了良好的基础。主要的研究结果如下:1.从采自长白山地区带有一色齿毛菌子实体的腐朽木段上分离、纯化得到一色齿毛菌菌株CB1的菌丝体,对纯化后菌丝进行了培养特性及菌丝显微结构的观察,结果表明,纯化得到菌丝的培养特性及菌丝的显微结构特征与一色齿毛菌特征相吻合。此外,对一色齿毛菌菌株CB1进行了ITS序列的扩增,并构建了包含试验菌株CBI在内的16个不同来源一色齿毛菌lTS序列的系统进化树,结果试验菌株CB 1的ITS序列与不同菌株来源的一色齿毛菌的ITS相似度较高且系统进化归为一类,从而经形态学与分子生物学的综合鉴定试验菌株CB1为一色齿毛菌,命名为Cerrena unicolor CB1（以下简称菌株CB1）。2.在完成了试验菌株CB1的鉴定之后,进行了菌株CB1对染料（活性黑和活性红）在固体条件下的脱色研究,结果表明,一色齿毛菌对活性黑和活性红在固体条件下都有较好的脱色效果,其中对50 mg·L-1的活性黑在10 d时的脱色以及对100 mg·L-1的活性红在12 d时的脱色均达到100%,即使对高浓度500 mg.L-1的活性黑与活性红在12 d时的脱色也达到50%以上。在此基础上,对一色齿毛菌在液体条件下脱色活性黑和活性红两种染料进行了定量的系统研究,结果与脱色活性黑相比,菌株CB1对活性红的脱色能力更强,250 mg·L-1的活性黑对染料脱色产生抑制,而500mg·L-1的活性红对菌株CB1脱色的抑制作用不明显。菌株CB1在液体条件下最利于脱色活性黑和活性红的碳源条件分别为:果糖和葡萄糖;最利于脱色的氮源种类分别为尿素和硝酸按;最利脱色的pH均为:pH=5;最适合的Cu2+Mn2+的添加浓度均为0.1 mmol·L-1;最利于脱色的接菌量均为直径=8 mm的新鲜平皿菌丝7片。3.为探讨一色齿毛菌CB1产MnP的能力及其MnP的应用前景,我们首先进行了菌株CB1初始产木质素降解酶条件下菌株CB1产MnP酶活曲线的测定,结果表明:菌株CB1在培养的3d时产生MnP,在第7天时,MnP酶活性达到最高,之后培养过程中MnP活性呈波动性的降低。在确定了最佳产MnP时间之后,进行了菌株CB1产MnP条件的优化,结果表明:一色齿毛菌CB1最优的产MnP条件为:果糖10g.L-1、硝酸铵0.2 g.L-1、Mn2+加入量2.67 mmol.L-1、pH值为5.5、150r·min-1摇瓶培养、250 mL三角瓶中装入70 mL培养液、接菌量为直径=8mm的菌丝9片、在34℃下进行培养。在完成了菌株CB1产MnP条件的优化后,进行了菌株CB1优化后胞外粗酶液对5种染料的脱色研究,结果表明:菌株CB1胞外酶液对偶氮类染料的脱色更为彻底,对三苯甲烷及杂环类染料的脱色能力次之。其中在4 d时对刚果红的脱色率达到91.3%,在6 d时对活性黑的脱色率达到95.9%,对活性红、结晶紫和中性红在8 d时的脱色率分别为89.4%,75.2%和72.3%。4.在明确了一色齿毛菌CB1及其MnP的应用价值之后,为了对其进行深入的了解,利用简并PCR、染色体步移、RACE等技术对菌株CB1锰过氧化物酶的同工酶基因进行了克隆。结果克隆得到3条锰过氧化物酶的同工酶全长序列分别命名为:Cu-mnp1、Cu-mnp2与Cu-mnp3。其中Cu-mnp1的DNA全长4268 bp,包含15个内含子、cDNA全长1092 bp、开放阅读框（ORF）包含1092 bp、编码363 aa的氨基酸序列;Cu-mnp2的DNA全长3005bp,包含13个内含子、cDNA全长1429 bp、开放阅读框（ORF）包含1 128 bp、编码375 aa的氨基酸序列:Cu-mnp3的DNA全长3001 bp,包含5个内含子、cDNA全长1326 bp、开放阅读框（ORF）包含1083 bp、编码363 aa的氨基酸序列;此外,利用生物信息学手段对克隆得到的Cu-mnp1～3进行了核苷酸序列及对应氨基酸序列的全面分析。5.克隆得到菌株CB1的锰过氧化物酶同工酶基因之后,为了解锰过氧化物酶同工酶基因的转录机制,综合的研究了不同诱导条件下Cu-mnp1～3基因的转录。结果表明:试验范围内与Cu-mnp1和Cu-mnp3的转录相比Cu-mnp2的转录几乎可以忽略不计,添加适量的Mn2+可以诱导Cu-mnp1和Cu-mnp3的转录,而对Cu-mnp2的转录几乎无影响:本论文首次研究了不同染料对Cu-mnp1～3基因转录的影响,结果:偶氮类染料（活性黑和刚果红）对Cu-mnp1～3基因转录水平的影响一致,在培养后期3个基因的转录都有一定程度的上升,我们推测低浓度的染料可以促进mnp基因的转录而高浓度染料对mnp基因的转录有一定的抑制作用;为验证上述推测进行了活性黑不同浓度对Cu-mnp1～3基因转录的影响。结果表明:添加低浓度的活性黑可以促进mnp基因的转录,而过高浓度的活性黑反而不利于mnp基因的转录;综合研究碳源、氮源种类及浓度对Cu-mnp1～3基因转录的影响,结果表明:Cu-mnpl～3适合转录的碳源和氮源种类、浓度并不完全相同,综合研究结果表明mnp可以利用多种碳源和氮源以及在不同浓度下发挥作用,可见mnp基因家族对碳源和氮源的利用存在选择性但也有一个广泛的利用空间。
郭雅静,罗兴录,钟建崑,陈会鲜[8]（2014）在《利用改良RACE方法克隆木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的研究》文中研究说明首次从木薯中分离克隆出AGPase小亚基的基因5’端cDNA序列,最终为进一步成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的cDNA全长序列提供依据。本研究以木薯作为试验材料,设计锚定引物,并根据木薯AGPase小亚基基因已知序列设计PCR特异引物,利用逆转录引物AUP1反转录总RNA,然后分离纯化反转录产物,通过对三大酶促反应（逆转录反应,TdT加尾,巢式及降落PCR技术）的具体改良,并将其与传统方法进行比较。利用改良后方法,首次成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因5’端cDNA序列。同时,本研究通过对RACE技术的改良与传统方法相比,在操作上更加简单、快速;在序列获得上更加高效;在试验成本上更加低廉。本研究可以高效且快速的成功获得木薯淀粉关键酶AGPase小亚基基因5’端序列,具有一定的实用性及简便性。
任义[9]（2014）在《丹酚酸酯酶的分离纯化及基因克隆》文中研究指明丹酚酸酯酶能够特异性地水解丹酚酸B,生成丹参素和Przewalskinic acid A。本论文主要对微生物Absidia sp.D30s产丹酚酸酯酶的分离纯化和基因调取进行了研究。采用分子筛层析法和离子交换层析法,对Absidiasp.D30s菌经诱导所产的粗酶液进行分离纯化。经三次柱法层析得到丹酚酸酯酶纯酶。经SDS-PAGE结果发现,该酶蛋白为双亚基蛋白,两个亚基的酶蛋白分子量分别为38 kDa（亚基Ⅰ）和18 kDa（亚基Ⅱ）。丹酚酸酯酶的最适反应温度为40℃;最适反应pH是5.0;K+、Na+、Ca2+、Mg2+4种金属离子对酶活力有促进作用;高浓度的Zn2+对酶活力有抑制作用;而金属离子Cu2+、Fe3+对酶反应有明显的抑制作用。将纯化的丹酚酸酯酶经过电印迹转移后,测定两个亚基的N端序列分别为GLTTQKSAPWGLGSI（亚基 Ⅰ）、VKAVAVLRGDSKISG（亚基Ⅱ）。根据丹酚酸酯酶的 N端序列设计简并引物、RT-PCR进行基因序列的调取。根据3’RACE和5’RACE技术,分别扩增出了丹酚酸酯酶两个亚基的3’端和5’端的多个基因片段并测序。最后分别将所得到的基因片段进行拼接和验证,得到丹酚酸酯酶亚基Ⅰ和亚基Ⅱ的基因全序列。亚基Ⅰ的基因全长为1829 bp,CDS区长度为1212 bp;亚基Ⅱ的基因全长为764 bp,CDS区长度为465 bp。
陈艳萍[10]（2015）在《大豆GmSK1和GmbZIP99基因的克隆及功能分析》文中指出大豆（Glycine max L.）是重要的粮食和经济作物,含有丰富的蛋白质,不仅是人类蛋白和脂类的主要来源,也是重要的饲料和工业原料。在大豆的生长发育过程中,各种病害、高温、干旱、低温、涝害、土壤盐渍化等逆境条件严重影响了大豆的生长发育,从而影响其产量和品质,给大豆生产造成了巨大损失。开展大豆抗逆育种,提高大豆对各种逆境的抵抗能力是保证大豆高产优质的重要途径。植物在逆境胁迫下,一方面通过蛋白降解系统调节这些蛋白质的周转或降解不正常蛋白,实现生命活动的动态平衡,泛素-26S蛋白酶体途径是真核细胞中最重要的具高效和高度选择性的蛋白质降解途径。另一方面通过调节逆境防御相关基因的表达,使植物适应新的环境因素,其中转录水平的调控是由转录因子完成的。因此,深入研究泛素-26s蛋白降解途径和基因转录调控的机制,对开展植物抗逆性改良具有重要意义。本研究从大豆中克隆了 SKP1同源基因GmSK1和bZIP转录因子基因GmbZIP99,进行了序列分析和功能研究。SKP1（S-phase kinase-associated-protein 1）家族蛋白是普遍存在于真核生物中的一类小分子量蛋白质,与Cullin1/Cdc53、Rbx1/Roc1/Hrt1和F-box蛋白一起形成SCF复合体参与泛素介导的蛋白质降解过程。本研究利用大豆基因组数据库,通过生物信息学手段从大豆基因组中鉴定出15个SKP1家族基因,分布于大豆的1 1条染色体上,系统进化树分析将其分成2个亚家族。利用基因芯片数据和实时荧光定量分析了大豆SKP1基因在根、茎、叶、花、英和种子不同器官中的表达模式。发现大多数SKP1基因在大豆中呈组成型表达,不同基因的表达模式存在差异,分别在不同的器官中优势表达。从大豆中分离到了一个SKP1同源基因,命名为GmSK1（Glycine max SKP1-like1）,序列分析结果显示GmSK1 cDNA全长为1125 bp,包含2个外显子和1个内含子,位于第11号染色体上。DNA杂交结果显示该基因以多拷贝的形式存在于大豆基因组中。GmSK1编码155个氨基酸,具有SKP1蛋白的结构特征,是典型的SKP1蛋白,与多个植物来源的SKP1蛋白有较高的同源性。系统发生分析表明GmSK1属于亚家族Ⅰ。亚细胞定位结果显示该蛋白定位于细胞质和细胞核中。对GmSK1进行激素诱导表达分析结果表明,ABA、JA和SA诱导后GmSK1的表达量均上升,推测GmSK1参与植物激素信号转导。干旱（20%PEG6000）、低温（4℃）和高盐（150 mM的NaCl溶液）处理均能诱导GmSK1的表达,表明GmSK1参与干旱、冷、盐等胁迫反应过程。GmSK1在烟草中异源过表达时,T1代和T2代转基因植株与野生型烟草相比植株矮小、叶片小、生长缓慢。进一步对转基因烟草进行8%PEG6000和150 mM的NaCl处理,发现转基因烟草中过量表达大豆GmSK1基因可明显提高烟草植株对干旱和高盐的耐受性。碱性亮氨酸拉链（basic region/leucine zipper motif,bZIP）转录因子是转录因子中较大的基因家族之一,在真核生物中广泛分布。本文从大豆中分离到了一个编码bZIP转录因子的基因GmbZIP99,cDNA全长为1767bp,编码469个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域和D类转录因子特征基序;与拟南芥、苜蓿、烟草、水稻、玉米等多种植物的bZIP基因有较高的同源性。系统发生分析也表明GmbZIP99属于D类bZIP转录因子。DNA杂交结果显示该基因以寡拷贝的形式存在于大豆基因组中。亚细胞定位结果显示该蛋白定位于细胞核中。酵母单杂实验说明该蛋白具有转录激活活性。实时荧光定量分析结果表明GmbZIP99在大豆根、茎、叶、花、荚中均能表达,但不同组织中表达量有差异,其中GmbZIP99在花中表达量最高,其次为根、茎、荚、叶,种子中表达量极低。激素诱导表达分析结果表明,ABA、JA和SA诱导后GmbZIP99的表达量均上升,推测GmbZIP99参与植物激素信号转导。干旱（20%PEG6000）、低温（4℃）和高盐（150 mM的NaCl溶液）处理均能诱导GmbZIP99的上升表达,说明GmbZIP99可能与旱、盐和冷胁迫相关,可以提高大豆对干旱、高盐和冷害的抗性。
二、RAPID AMPLIFICATION OF cDNA ENDS(RACE)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RAPID AMPLIFICATION OF cDNA ENDS(RACE)（论文提纲范文）
（1）MRJP-1单克隆抗体和金标试纸制备技术研究及在蜂蜜真实性检测中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蜂蜜掺假概述 |
| 1.2 蜂蜜掺假途径 |
| 1.2.1 蜂蜜生产过程中的掺假 |
| 1.2.2 蜂蜜来源的掺假 |
| 1.3 掺假蜂蜜的检测 |
| 1.3.1 糖的检测 |
| 1.3.2 2-乙酰呋喃-3-吡喃葡萄糖苷(AFGP)的检测 |
| 1.3.3 矿物质的检测 |
| 1.3.4 挥发性化合物的检测 |
| 1.3.5 酶的检测 |
| 1.3.6 水分的检测 |
| 1.3.7 非标志物检测法 |
| 1.4 王浆主蛋白-1(MRJP-1) |
| 1.5 RACE技术 |
| 1.6 免疫层析技术 |
| 1.7 单克隆抗体技术与动物福利 |
| 1.8 研究的目的、意义及技术路线 |
| 1.8.1 研究的目的、意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 1.8.3 研究技术路线图 |
| 第二章 MRJP-1特异性腹水单克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料、试剂和设备 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抗原MRJP-1的制备 |
| 2.2.2 抗原表征 |
| 2.2.3 动物免疫 |
| 2.2.4 脾淋巴细胞的准备 |
| 2.2.5 骨髓瘤细胞的准备 |
| 2.2.6 饲养层细胞的准备 |
| 2.2.7 细胞融合 |
| 2.2.8 阳性孔的筛选 |
| 2.2.9 阳性孔的亚克隆 |
| 2.2.10 腹水的制备与纯化 |
| 2.2.11 单抗表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 MRJP-1的表征 |
| 2.3.2 小鼠免疫效价的检测 |
| 2.3.3 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 2.3.4 WB鉴定结果 |
| 2.3.5 纯化单抗效价 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CHO-S表达MRJP-1特异性单抗制备 |
| 3.1 材料、试剂和设备 |
| 3.1.1 细胞与质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 杂交瘤细胞扩增与复苏 |
| 3.2.2 总RNA提取 |
| 3.2.3 RNA片段完整性检测 |
| 3.2.4 RACE引物的设计 |
| 3.2.5 SMARTer RACE法克隆小鼠单抗基因 |
| 3.2.6 重轻链调取 |
| 3.2.7 PCR回收产物的连接与转化 |
| 3.2.8 构建载体 |
| 3.2.9 重组载体的构建 |
| 3.2.10 单抗基因重组质粒的细胞转染 |
| 3.2.11 单体浓度检测 |
| 3.2.12 效价检测 |
| 3.2.13 特异性检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞总RNA的提取 |
| 3.3.2 单抗重链/轻链基因 5’/3’-RACE |
| 3.3.3 序列分析 |
| 3.3.4 目的基因的获得及重组质粒的构建 |
| 3.3.5 单抗表达及纯化 |
| 3.3.6 细胞表达抗体表征 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于MRJP-1单克隆抗体的蜂蜜真实性间接ELISA检测 |
| 4.1 材料、试剂和设备 |
| 4.1.1 主要实验材料 |
| 4.1.2 蜂蜜和试剂 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 间接ELISA考察蜂蜜真实性方法的建立 |
| 4.2.2 抗原最佳包被浓度以及最佳血清稀释度的确立 |
| 4.2.3 抗原最佳包被时间的确立 |
| 4.2.4 最佳封闭时间的确立 |
| 4.2.5 抗原抗体最佳作用时间 |
| 4.2.6 检测范围及标准曲线的建立 |
| 4.2.7 重复性分析 |
| 4.2.8 特异性实验 |
| 4.2.9 准确率分析 |
| 4.2.10 市售蜂蜜掺假检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 MAM-1G间接ELISA考察蜂蜜真实性方法的建立 |
| 4.3.2 检测范围及标准曲线的建立 |
| 4.3.3 重复性分析 |
| 4.3.4 特异性实验 |
| 4.3.5 准确度 |
| 4.3.6 蜂蜜模拟掺假检测分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 基于MRJP-1单克隆抗体的胶体金试纸条制备及应用 |
| 5.1 材料、试剂和设备 |
| 5.1.1 主要实验材料 |
| 5.1.2 主要实验试剂 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.1.4 试剂配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 配对抗体的筛选 |
| 5.2.2 胶体金的制备 |
| 5.2.3 胶体金-单抗结合物的制备 |
| 5.2.4 结合垫制备 |
| 5.2.5 点膜 |
| 5.2.6 CGIS参数的优化 |
| 5.2.7 CGIS的装配 |
| 5.2.8 蜂蜜样品检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 胶体金表征 |
| 5.3.2 配对单抗的筛选 |
| 5.3.3 CGIS参数的优化 |
| 5.3.4 CGIS性能指标 |
| 5.3.5 蜂蜜真实性快速考察 |
| 5.3.6 EA-IRMS验证试验 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 本研究主要成果 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
（2）卵形鲳鲹TLR21、TLR22及相关基因的克隆与表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 TLRs的发现、结构和分类 |
| 2 TLRs信号通路 |
| 3 TLR21/TLR22/IRAK1/TRAF3研究进展 |
| 3.1 TLR21研究进展 |
| 3.2 TLR22研究进展 |
| 3.3 IRAK1研究进展 |
| 3.4 TRAF3研究进展 |
| 4 卵形鲳鲹免疫与病害防控研究进展 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 卵形鲳鲹TLR21和TLR22基因的克隆与表达分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验鱼与菌株 |
| 2.2 刺激物 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 卵形鲳鲹总RNA的提取与检测 |
| 3.2 cDNA的合成 |
| 3.2.1 反转录cDNA第一链的合成 |
| 3.2.2 SMART cDNA链的合成 |
| 3.3 卵形鲳鲹TLR21和TLR22中间片段的克隆 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 中间片段的扩增 |
| 3.3.3 PCR产物电泳和胶回收 |
| 3.3.4 PCR产物与pMD18-T连接 |
| 3.3.5 感受态细胞TOP10的制备 |
| 3.3.6 连接产物转化 |
| 3.3.7 菌液鉴定与测序 |
| 3.4 RACE-PCR技术克隆卵形鲳鲹TLR21/TLR22基因cDNA末端 |
| 3.5 卵形鲳鲹TLR21和TLR22序列分析方法 |
| 3.6 卵形鲳鲹TLR21和TLR22的表达分析 |
| 3.6.1 引物设计 |
| 3.6.2 卵形鲳鲹健康组织样品采集 |
| 3.6.3 总RNA提取与cDNA的合成 |
| 3.6.4 qPCR检测 |
| 3.7 卵形鲳鲹的刺激处理与采样 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 卵形鲳鲹总RNA提取样品质量检测 |
| 4.2 卵形鲳鲹TLR21和TLR22基因中间和末端片段扩增结果 |
| 4.3 卵形鲳鲹TLR21和TLR22序列的分析 |
| 4.3.1 卵形鲳鲹TLR21的序列特征和蛋白结构 |
| 4.3.2 卵形鲳鲹TLR22的序列特征和蛋白结构 |
| 4.3.3 卵形鲳鲹TLR21同源性分析和系统发育树的构建 |
| 4.3.4 卵形鲳鲹TLR22同源性分析和系统发育树的构建 |
| 4.3.5 卵形鲳鲹TLR21蛋白功能位点预测 |
| 4.3.6 卵形鲳鲹TLR22蛋白功能位点预测 |
| 4.4 卵形鲳鲹TLR21和TLR22在正常组织中的分布情况 |
| 4.5 卵形鲳鲹TLR21和TLR22免疫应答实验 |
| 4.5.1 LPS刺激后TrTLR21和TrTLR22的表达变化 |
| 4.5.2 polyI:C刺激后TrTLR21和TrTLR22的表达变化 |
| 4.5.3 溶藻弧菌刺激后TrTLR21和TrTLR22的表达变化 |
| 5 讨论 |
| 5.1 卵形鲳鲹TLR21和TLR22基因序列特征分析 |
| 5.2 卵形鲳鲹TLR21和TLR22在正常组织中的表达与免疫应答分析 |
| 第三章 卵形鲳鲹IRAK1基因的克隆与表达分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验鱼与菌株 |
| 2.2 刺激物 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 卵形鲳鲹总RNA的提取与检测 |
| 3.2 cDNA的合成 |
| 3.2.1 反转录cDNA第一链的合成 |
| 3.2.2 SMART cDNA链的合成 |
| 3.3 卵形鲳鲹IRAK1中间片段的克隆 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 中间片段的克隆 |
| 3.3.3 PCR产物检测和胶回收 |
| 3.3.4 PCR产物与pMD-18T连接 |
| 3.3.5 感受态细胞TOP10的制备 |
| 3.3.6 连接产物的转化 |
| 3.3.7 菌液鉴定与测序 |
| 3.4 RACE-PCR技术克隆卵形鲳鲹IRAK1 cDNA末端 |
| 3.5 卵形鲳鲹IRAK1基因序列分析方法 |
| 3.6 卵形鲳鲹IRAK1的表达分析 |
| 3.6.1 引物设计 |
| 3.6.2 卵形鲳鲹健康组织样品采集 |
| 3.6.3 总RNA提取与cDNA的合成 |
| 3.6.4 qPCR检测 |
| 3.7 卵形鲳鲹刺激处理与采样 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 卵形鲳鲹总RNA提取样品质量检测 |
| 4.2 卵形鲳鲹IRAK1基因中间和末端扩增结果 |
| 4.3 卵形鲳鲹IRAK1序列分析 |
| 4.3.1 卵形鲳鲹IRAK1序列特征和蛋白结构 |
| 4.3.2 卵形鲳鲹IRAK1同源性分析和系统发育树的构建 |
| 4.3.3 卵形鲳鲹IRAK1蛋白功能位点预测 |
| 4.4 卵形鲳鲹IRAK1在正常组织中的分布 |
| 4.5 卵形鲳鲹IRAK1免疫应答结果 |
| 4.5.1 LPS刺激后TrIRAK1的表达变化 |
| 4.5.2 polyI:C刺激后TrIRAK1的表达变化 |
| 4.5.3 溶藻弧菌刺激后TrIRAK1的表达变化 |
| 5 讨论 |
| 第四章 卵形鲳鲹TRAF3基因的克隆与表达分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验鱼与菌株 |
| 2.2 刺激物 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 卵形鲳鲹总RNA的提取与检测 |
| 3.2 cDNA的合成 |
| 3.2.1 反转录cDNA第一链的合成 |
| 3.2.2 SMART cDNA链的合成 |
| 3.3 卵形鲳鲹TRAF3中间片段的克隆 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 中间片段的克隆 |
| 3.3.3 PCR产物检测和胶回收 |
| 3.3.4 PCR产物与pMD-18T连接 |
| 3.3.5 感受态细胞TOP10的制备 |
| 3.3.6 连接产物的转化 |
| 3.3.7 菌液鉴定与测序 |
| 3.4 RACE-PCR技术克隆卵形鲳鲹TRAF3 cDNA末端 |
| 3.5 卵形鲳鲹TRAF3序列分析方法 |
| 3.6 卵形鲳鲹TRAF3的表达分析 |
| 3.6.1 引物设计 |
| 3.6.2 卵形鲳鲹健康组织样品采集 |
| 3.6.3 总RNA提取与cDNA的合成 |
| 3.6.4 qPCR检测 |
| 3.7 卵形鲳鲹刺激处理与采样 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 卵形鲳鲹总RNA提取样品质量检测 |
| 4.2 卵形鲳鲹TRAF3中间和末端扩增结果 |
| 4.3 卵形鲳鲹TRAF3序列分析 |
| 4.3.1 卵形鲳鲹TRAF3序列特征和蛋白结构 |
| 4.3.2 卵形鲳鲹TRAF3同源性分析和系统发育树的构建 |
| 4.3.3 卵形鲳鲹TRAF3蛋白功能位点预测 |
| 4.4 卵形鲳鲹TRAF3基因在正常组织中的分布 |
| 4.5 卵形鲳鲹TRAF3基因免疫应答结果 |
| 4.5.1 LPS刺激后TrTRAF3的表达变化 |
| 4.5.2 polyI:C刺激后TrTRAF3的表达变化 |
| 4.5.3 溶藻弧菌刺激后TrTRAF3的表达变化 |
| 5 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）中心体蛋白Nlp相关长链非编码RNA的鉴定及生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. LncRNAs基因定位和命名 |
| 2. LncRNAs相关生物信息学数据库 |
| 3. LncRNAs发挥功能的机制 |
| 3.1 lncRNA通过顺式/反式作用调控基因表达 |
| 3.2 LncRNA参与染色质修饰 |
| 3.3 蛋白支架和蛋白活性调节 |
| 3.4 lncRNA参与RNA拼接 |
| 4. RNA结合蛋白与RNA的结合模式 |
| 4.1 经典的RNA结合蛋白与RNA结合模式 |
| 4.2 非经典RNA结合蛋白 |
| 5. LncRNA-蛋白质相互作用研究方法 |
| 5.1 蛋白质为中心研究RNA-蛋白质相互作用 |
| 5.2 RNA为中心研究蛋白质-RNA相互作用 |
| 6. Nlp蛋白简介 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 感受态细胞 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要试剂盒 |
| 1.5 其他试剂 |
| 1.6 主要仪器设备 |
| 1.7 引物和小干扰RNA (siRNA)设计及合成 |
| 1.8 重要试剂、缓冲液及培养基配制 |
| 1.9 生物学软件和网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养及相关细胞表型实验 |
| 2.2 细胞瞬时转染 |
| 2.3 细胞总RNA提取、逆转录及qRT-PCR检测 |
| 2.4 细胞总蛋白提取及蛋白质定量 |
| 2.5 感受态细胞转化 |
| 2.6 质粒大量提取及鉴定 |
| 2.7 蛋白质印迹(Western blot) |
| 2.8 RNA-蛋白质免疫共沉淀(RIP)实验 |
| 2.9 RNA核浆分提 |
| 2.10 免疫荧光(Immunofluorescence) |
| 2.11 RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) |
| 2.12 cDNA末端快速克隆的技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE) |
| 2.13 Biotin标记的RNA体外转录及纯化 |
| 2.14 Biotin-RNA pull-down试验 |
| 2.15 RNA反义核酸纯化联合质谱鉴定直接RNA结合蛋白 |
| 2.16 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1. Nlp蛋白RIP测序结果分析 |
| 2. 测序结果验证 |
| 3. RIP-qRT-PCR验证候选lncRNAs与中心体蛋白γ-Tubulin结合 |
| 4. CCAT1作为中心体lncRNA角色的证明 |
| 4.1 Nlp RIP-Seq数据中CCAT1转录本测序峰分布特征 |
| 4.2 CCAT1与Nlp蛋白共定位研究 |
| 4.3 CCAT1与γ-Tubulin蛋白共定位研究 |
| 5. CCAT1对肿瘤细胞生物学行为影响的研究 |
| 5.1 CCAT1促进肿瘤细胞生长 |
| 5.2 CCAT1增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力 |
| 5.3 CCAT1过表达导致中心体拷贝数异常和多极有丝分裂增加 |
| 5.4 CCAT1过表达帮助HeLa细胞抵抗紫杉醇对细胞的杀伤作用 |
| 6. CCAT1对Nlp和γ-Tubulin相互作用的影响 |
| 7. CCAT1与Nlp/γ-Tubulin相互作用的体外分子机制探讨 |
| 7.1 RNA体外pulldown实验证明CCAT1与Nlp和γ-Tubulin的结合 |
| 7.2 CCAT1片段化pulldown鉴定CCAT1与Nlp和γ-Tubulin蛋白的结合区域 |
| 8. CCAT1与Nlp/γ-Tubulin相互作用的体内分子机制探讨 |
| 8.1 CCAT1反义核酸纯化细胞内CCAT1-蛋白质复合物 |
| 8.2 RNA反义核酸纯化联合质谱鉴定出CCAT1结合蛋白分析 |
| 8.3 CCAT1结合蛋白的GO(Gene ontology)分析 |
| 9. Linc00665肿瘤相关生物学功能研究 |
| 9.1 Linc00665在肿瘤中表达水平分析 |
| 9.2 Linc00665敲降抑制了HeLa细胞生长 |
| 9.3 linc00665促进HeLa细胞迁移和侵袭 |
| 10. Linc00665在HeLa细胞中转录本的鉴定 |
| 10.1 Linc00665 5'末端序列鉴定 |
| 10.2 Linc00665 3'末端序列鉴定 |
| 10.3 鉴定出linc00665新转录本 |
| 11. Linc00665与Nlp和γ-Tubulin共定位研究 |
| 11.1 Linc00665与Nlp共定位研究 |
| 11.2 Linc00665与γ-Tubulin共定位研究 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 基金资助 |
| 在读期间已发表及待发表的英文论文 |
| 文献综述 |
| References |
| 致谢 |
（4）镉胁迫下秋茄超氧化物歧化酶家族基因的表达调控与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 红树植物与镉毒害概况 |
| 1.1.1 镉对植物的影响 |
| 1.1.2 红树植物秋茄 |
| 1.1.3 秋茄镉耐受机制研究概况 |
| 1.2 活性氧与抗氧化酶系统概况 |
| 1.2.1 植物体中的活性氧 |
| 1.2.2 植物体中的抗氧化系统 |
| 1.2.3 抗氧化酶间的相互关系 |
| 1.3 超氧化物歧化酶研究进展 |
| 1.3.1 超氧化物歧化酶的分类 |
| 1.3.2 超氧化物歧化酶的结构 |
| 1.3.3 超氧化物歧化酶的功能 |
| 1.3.4 植物超氧化物歧化酶基因的表达调控 |
| 1.3.5 镉胁迫对植物超氧化物歧化酶的影响 |
| 1.3.6 植物超氧化物歧化酶基因克隆的研究现状 |
| 1.4 立题依据及研究内容 |
| 1.4.1 立体依据与研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究目标与拟解决的关键科学问题 |
| 1.4.4 技术路线 |
| 第2章 镉胁迫下秋茄SOD家族基因的克隆与分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 育苗与胁迫处理 |
| 2.2.2 秋茄DNA、总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.2.3 目的片段的回收与测序 |
| 2.2.4 序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 秋茄SOD家族基因cDNA全长序列的获得 |
| 2.3.2 秋茄SOD家族基因DNA序列的获得 |
| 2.3.3 秋茄SOD基因家族各亚型成员的核酸序列分析 |
| 2.3.4 秋茄SOD基因家族各亚型成员基因结构分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 秋茄SOD基因序列的特异性与3'RACE的改进 |
| 2.4.2 秋茄SOD基因转录本的多样性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 秋茄SOD家族基因的生物信息学分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 秋茄SOD家族成员蛋白的基本理化性质分析 |
| 3.2.2 秋茄SOD家族系统进化分析 |
| 3.2.3 秋茄SOD家族成员蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 秋茄SOD家族成员蛋白的基本理化性质分析 |
| 3.3.2 秋茄SOD蛋白序列多重比对与保守基序分析 |
| 3.3.3 秋茄SOD家族的系统进化分析 |
| 3.3.4 秋茄SOD家族成员蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.5 秋茄SOD蛋白的信号肽、跨膜结构及功能位点预测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 秋茄SOD基因家族成员系统进化分析 |
| 3.4.2 秋茄SOD基因家族成员的亚细胞定位 |
| 3.4.3 秋茄SOD基因家族成员可能受到不同的磷酸化修饰调控 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 镉胁迫下秋茄SOD家族基因的表达分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 秋茄总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 4.2.2 秋茄镉胁迫下生理指标的测定和同工酶谱分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 秋茄镉胁迫下SOD家族基因的表达分析 |
| 4.3.2 镉胁迫下秋茄不同组织的SOD酶活性和同工酶谱分析 |
| 4.3.3 镉胁迫下秋茄根系生理指标的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 KoFSD2和KoCSD3的启动子克隆与表达调控分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 植物材料的准备 |
| 5.2.2 秋茄根系组织分离与指标测定 |
| 5.2.3 镉胁迫下KoFSD2和KoCSD3在秋茄根各组织中的定量表达 |
| 5.2.4 KoFSD2和KoCSD3启动子序列的克隆及外源激素处理下的表达分析 |
| 5.2.5 镉胁迫下秋茄根系各组织内源激素含量的测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 镉胁迫下秋茄根部组织的变化 |
| 5.3.2 镉胁迫下秋茄根系各组织中SOD同工酶及KoFSD2和KoCSD3的表达 |
| 5.3.3 KoFSD2和KoCSD3启动子序列激素相关顺式元件与转录因子预测 |
| 5.3.4 外源激素对秋茄根系各组织中KoFSD2和KoCSD3表达水平的影响 |
| 5.3.5 镉胁迫下秋茄根系各组织中内源激素含量的变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 镉胁迫下秋茄根系各组织的结构变化与镉的含量差异 |
| 5.4.2 镉胁迫下秋茄根系各组织的生理响应 |
| 5.4.3 KoFSD2和KoCSD3的调控因素和镉胁迫下秋茄根系各组织的激素含量变化 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 KoFSD2和KoCSD3基因的功能验证 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 表达载体的构建 |
| 6.2.2 烟草遗传转化体系的构建 |
| 6.2.3 转基因烟草对镉胁迫的响应 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 表达载体的构建 |
| 6.3.2 转基因烟草TO代植株的获得 |
| 6.3.3 镉胁迫下转基因烟草T2代植株的生理指标测定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 存在的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间待发表的论文 |
（5）嗜酸性喜温硫杆菌Sox硫氧化系统代谢功能和调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 第一章 研究背景综述 |
| 1.1 嗜酸性喜温硫杆菌简介 |
| 1.2 嗜酸性喜温硫杆菌硫氧化系统的研究进展 |
| 1.3 Sox硫氧化系统研究进展 |
| 1.3.1 Sox系统的代谢功能的研究 |
| 1.3.2 Sox系统转录调控机制的研究 |
| 1.4 转录调控机制研究进展 |
| 1.4.1 σ因子分类 |
| 1.4.2 σ因子转录起始机制 |
| 1.4.3 双组分调控系统的研究 |
| 1.4.4 A.caldus中的双组分系统 |
| 1.5 本论文研究意义和内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 嗜酸性喜温硫杆菌Sox硫氧化系统的生物信息学及转录分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.1.2.1 试剂 |
| 2.1.2.2 仪器 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.3.1 喜温硫杆菌的培养 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.4.1 RNA提取 |
| 2.1.4.2 cDNA的合成 |
| 2.1.4.3 荧光定量PCR |
| 2.1.4.4 蛋白序列比对 |
| 2.1.4.5 进化树构建 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 喜温硫杆菌MTH-04两套sox基因的比较 |
| 2.2.2 不同硫氧化菌株中Sox系统的比较分析 |
| 2.2.3 Sox蛋白的系统发育分析 |
| 2.2.4 两套sox基因在不同生长过程中的转录变化 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 嗜酸性喜温硫杆菌Sox硫氧化系统基因敲除株的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.1.2.1 试剂 |
| 3.1.2.2 仪器 |
| 3.1.3 培养基及培养条件 |
| 3.1.3.1 大肠杆菌的培养 |
| 3.1.3.2 喜温硫杆菌的培养 |
| 3.1.3.3 抗生素使用浓度 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.4.1 常规反应体系 |
| 3.1.4.2 DNA纯化回收 |
| 3.1.4.3 质粒提取 |
| 3.1.4.4 基因组提取 |
| 3.1.4.5 大肠杆菌SM10感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.1.4.6 大肠杆菌转化 |
| 3.1.4.7 喜温硫杆菌与大肠杆菌的接合转移 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 敲除株△soxB-Ⅱ的构建 |
| 3.2.1.1 重组自杀质粒pSDUDI::soxB-Ⅱ(UHA+DHA)的构建 |
| 3.2.1.2 soxB-Ⅱ单交换的筛选验证 |
| 3.2.1.3 双交换菌株△soxB-Ⅱ的筛选 |
| 3.2.2 敲除株△sox-Ⅱ的构建 |
| 3.2.2.1 重组自杀质粒pSDUDI::soxYZB-Ⅱ(UHA+DHA)的构建 |
| 3.2.2.2 大肠杆菌SM10与喜温硫杆菌△soxXA-Ⅱ接合转移筛选sox-Ⅱ单交换 |
| 3.2.2.3 sox-Ⅱ敲除株的筛选 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 嗜酸性喜温硫杆菌sox基因敲除株特性的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.1.3 培养基培养条件 |
| 4.1.3.1 DMSZ 71培养基 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.1.4.1 RNA提取、cDNA合成、荧光定量RT-qPCR |
| 4.1.4.2 生长曲线的测定 |
| 4.1.4.3 高效液相色谱测定单质硫含量 |
| 4.1.4.4 高效液相色谱测定连四硫酸盐含量 |
| 4.2 实验结果与讨论 |
| 4.2.1 以硫粉为能源时敲除株生长曲线 |
| 4.2.2 以连四硫酸盐为能源时生长曲线及连四硫酸盐消耗曲线 |
| 4.2.3 以硫代硫酸钠为能源时生长曲线 |
| 4.2.4 以硫粉为能源时敲除株转录水平分析 |
| 4.2.5 以连四硫酸盐为能源时敲除株转录水平分析 |
| 4.2.6 以硫代硫酸钠为能源时敲除株转录水平分析 |
| 4.2.7 HPLC检测元素硫的产生 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 嗜酸性喜温硫杆菌中sigma因子与硫代谢及环境压力的关系 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 试剂与仪器 |
| 5.1.3 培养基培养条件 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.2 实验结果与讨论 |
| 5.2.1 硫粉为能源时sigma因子在生长过程中的转录变化 |
| 5.2.2 连四硫酸盐为能源时sigma因子在生长过程中的转录变化 |
| 5.2.3 不同pH条件下sigma因子的转录情况 |
| 5.2.4 热刺激条件下sigma因子的转录情况 |
| 5.2.5 硫酸铜刺激下sigma因子的转录情况 |
| 5.2.6 渗透压刺激下sigma因子的转录情况 |
| 5.2.7 σ~(54)过表达菌株的构建及其对sox-Ⅰ的激活作用 |
| 5.2.7.1 σ~(54)过表达菌株的构建 |
| 5.2.7.2 rpoN的过表达菌株A.caldus (pJRD215-P_(tetH)-rpoN)生长测定 |
| 5.2.7.3 rpoN的过表达菌株A.caldus (pJRD2 15-P_(tetH)-rpoN)转录分析 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 喜温硫杆菌MTH-04中σ~(54)依赖的双组分调控系统对Sox-Ⅰ硫氧化系统的调控研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 试剂和仪器 |
| 6.1.3 培养基与培养条件 |
| 6.1.4 基因簇的共转录分析 |
| 6.1.5 RNA提取及cDNA合成 |
| 6.1.5.1 试剂盒提取A.caldus总RNA |
| 6.1.6 cDNA末端快速扩增实验(5'RACE) |
| 6.1.6.1 引物设计 |
| 6.1.6.2 RNA提取 |
| 6.1.6.3 cDNA合成 |
| 6.1.6.4 cDNA纯化 |
| 6.1.6.5 cDNA加尾 |
| 6.1.6.6 PCR扩增加尾后的cDNA |
| 6.1.6.7 巢式PCR扩增进一步浓缩产物: |
| 6.1.7 SDS-PAGE相关实验操作 |
| 6.1.7.1 所需溶液及配方 |
| 6.1.7.2 SDS-PAGE的配制 |
| 6.1.7.3 蛋白样品的准备 |
| 6.1.7.4 蛋白电泳 |
| 6.1.8 重组蛋白的纯化与超滤浓缩 |
| 6.1.8.1 重组蛋白纯化 |
| 6.1.8.2 HisTrap HP镍柱的再生 |
| 6.1.8.3 蛋白浓度测定 |
| 6.1.8.4 蛋白的超滤浓缩及缓冲液的更换 |
| 6.1.9 凝胶阻滞分析(EMSA) |
| 6.1.9.1 非变性丙烯酰胺凝胶的配制 |
| 6.1.9.2 接合反应 |
| 6.2 实验结果与讨论 |
| 6.2.1 tspSR-sox基因簇的生物信息学分析 |
| 6.2.1.1 喜温硫杆菌MTH-04和其他硫氧化菌株中tspSR-sox基因簇的比较分析 |
| 6.2.1.2 TspS和TspR蛋白结构域分析 |
| 6.2.2 共转录分析确定A.caldus sox-Ⅰ基因簇的组成 |
| 6.2.3 sox-Ⅰ中σ~(54)依赖的启动子的验证 |
| 6.2.4 凝胶阻滞分析TspR蛋白与启动子P_1相互作用 |
| 6.2.4.1 TspR蛋白表达质粒pET22b-tspR的构建 |
| 6.2.4.2 TspR蛋白的表达及纯化 |
| 6.2.4.3 TspR蛋白与启动子P_1的相互作用 |
| 6.2.5 P_1启动子探测质粒的构建 |
| 6.2.5.1 基础质粒pUC19-P_1-1Kb-gusA的构建 |
| 6.2.5.2 启动子-12和-24区关键位点的突变及启动子活性分析 |
| 6.2.5.3 不同大小的P_1启动子探测质粒的构建及活性分析 |
| 6.2.5.4 P_1启动子UAS位点突变质粒的构建及活性分析 |
| 6.2.6 比较分析其他硫氧化菌tspSR-sox基因簇中σ~(54)依赖的启动子 |
| 6.2.7 sox-Ⅰ转录调控模型 |
| 6.3 本章小结 |
| 第七章 嗜酸性喜温硫杆菌sox-Ⅱ基因簇共转录分析及启动子鉴定 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 菌株与质粒 |
| 7.1.2 试剂与仪器 |
| 7.1.3 培养基培养条件 |
| 7.1.4 实验方法 |
| 7.1.4.1 RNA提取、cDNA合成、荧光定量RT-qPCR |
| 7.1.4.2 共转录分析 |
| 7.1.4.3 cDNA末端快速扩增实验(5'RACE) |
| 7.2 实验结果与讨论 |
| 7.2.1 sox-Ⅱ基因簇的共转录分析 |
| 7.2.2 sox-Ⅱ启动子探测质粒的构建 |
| 7.2.2.1 质粒pJRD215-P2515-gusA的构建 |
| 7.2.2.2 质粒pJRD215-P2519-gusA的构建 |
| 7.2.2.3 质粒pJRD215-P2523-gusA的构建 |
| 7.2.2.4 质粒pJRD215-P2525-gusA的构建 |
| 7.2.2.5 sox-Ⅱ启动子探测质粒转化大肠杆菌SM10 |
| 7.2.3 sox-Ⅱ启动子活性的体内分析 |
| 7.2.3.1 sox-Ⅱ启动子探测质粒接合转移导入A.caldus |
| 7.2.3.2 sox-Ⅱ启动子探测质粒转录活性分析 |
| 7.2.4 sox-Ⅱ启动子转录起始位点的确定 |
| 7.3 本章小结 |
| 第八章 全文总结与展望 |
| 8.1 本论文的主要创新点 |
| 8.2 研究不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间学术成果 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）大蒜MADS-box基因的克隆与表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 花器官的发育 |
| 1.3 由ABC模型到花器官四因子模型的发展 |
| 1.4 MADS-box基因 |
| 1.4.1 B功能MADS-box基因在花器官决定中的作用 |
| 1.4.2 C功能MADS-box基因在花器官决定中的作用 |
| 1.4.3 E功能MADS-box基因在花器官决定中的作用 |
| 1.4.4 AGL6-like基因在花器官决定中的作用 |
| 1.4.5 SVP/StMADS11-like基因研究进展 |
| 1.5 大蒜简介 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 研究方法与技术路线 |
| 1.7.1 研究方法 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 2 大蒜MADS-box基因的克隆 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验试剂 |
| 2.2.1 RNA提取试剂 |
| 2.2.2 RACE法克隆所用试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 大蒜花芽总RNA的提取 |
| 2.3.2 RACE反应引物的设计 |
| 2.3.3 大蒜MADS-box基因3'RACE片段的扩增 |
| 2.3.4 大蒜MADS-box基因5'RACE片段的扩增 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 大蒜花芽总RNA提取结果 |
| 2.4.2 大蒜3'RACE PCR扩增结果 |
| 2.4.3 大蒜5'RACE PCR扩增结果 |
| 2.4.4 大蒜MADS-box基因全长cDNA序列 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 大蒜MADS-box基因的序列特征与系统进化分析 |
| 3.1 大蒜MADS-box基因的序列特征分析 |
| 3.1.1 大蒜MADS-box基因的序列分析与结构预测 |
| 3.2 大蒜MADS-box基因的同源性分析和系统进化分析 |
| 3.2.1 大蒜AsPI基因的同源性分析与系统进化分析 |
| 3.2.2 大蒜AsAG基因的同源性分析与系统进化分析 |
| 3.2.3 大蒜AsAGL6基因的同源性分析与系统进化分析 |
| 3.2.4 大蒜AsSEP1、AsSEP3基因的同源性分析与系统进化分析 |
| 3.2.5 大蒜AsSVP基因的同源性分析与系统进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 大蒜MADS-box基因的表达分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 实验试剂和仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 半定量PCR分析基因表达特性 |
| 4.3.2 实时定量PCR分析基因表达特性 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 大蒜MADS-box基因半定量PCR结果与分析 |
| 4.4.2 大蒜MADS-box基因实时定量PCR结果与分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 大蒜AsSVP基因的功能验证 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 大蒜AsSVP基因植物表达载体的构建 |
| 5.3.2 农杆菌介导法拟南芥遗传转化 |
| 5.3.3 拟南芥转基因苗筛选与检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 大蒜AsSVP全长序列 |
| 5.4.2 BP反应后的阳性克隆检测 |
| 5.4.3 LR反应后的阳性克隆检测 |
| 5.4.4 三亲杂交法介导农杆菌 |
| 5.4.5 大蒜AsSVP转基因植株的鉴定 |
| 5.4.6 转基因拟南芥表型观察 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）一色齿毛菌锰过氧化物酶基因的克隆与差异表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 木材腐朽 |
| 1.2.1 木材腐朽概念 |
| 1.2.2 木材腐朽类型 |
| 1.2.3 木材腐朽菌概述 |
| 1.2.3.1 木材腐朽菌分布及种类 |
| 1.2.3.2 木材腐朽菌的分类 |
| 1.3 白腐真菌的概述 |
| 1.3.1 白腐真菌的研究进展 |
| 1.3.2 白腐菌的应用及特点 |
| 1.3.3 白腐菌对脱色的研究进展 |
| 1.3.4 白腐菌木质素降解酶系统 |
| 1.4 锰过氧化物酶研究进展 |
| 1.4.1 锰过氧化物酶概述 |
| 1.4.2 锰过氧化物酶的降解机制 |
| 1.4.3 锰过氧化物酶的应用进展 |
| 1.4.4 锰过氧化物酶的分子生物学研究进展 |
| 1.4.4.1 锰过氧化物酶基因的克隆 |
| 1.4.4.2 锰过氧化物酶的结构及功能 |
| 1.4.4.3 锰过氧化物酶启动子序列分析 |
| 1.4.4.5 锰过氧化物酶同工酶的转录调控 |
| 1.5 分子生物学及相关技术 |
| 1.5.1 分子生物学的发展 |
| 1.5.2 RACE技术及其在基因克隆上的应用 |
| 1.5.3 染色体步移技术及其在克隆未知基因上的应用 |
| 1.5.4 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.6 相关生物信息学概况 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.8 研究的主要内容 |
| 1.9 课题来源 |
| 2 色齿毛菌CB1的分离鉴定与系统发育分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌种来源 |
| 2.1.2 主要仪器及试剂 |
| 2.1.3 一色齿毛菌培养特性的试验与观察 |
| 2.1.4 一色齿毛菌CB1总DNA的提取 |
| 2.1.5 一色齿毛菌CB1 ITS序列的扩增及其系统发育分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 一色齿毛菌CB1形态特征及培养特性 |
| 2.2.2 一色齿毛菌CB1的ITS序列扩增及其系统发育分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 色齿毛菌CB1对活性染料的脱色研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌种来源 |
| 3.1.2 主要仪器及试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 C.unicolor CB1对两种不同浓度活性染料固体条件下的脱色 |
| 3.2.2 C.unicolor CB1对两种不同浓度活性染料液体条件下的脱色 |
| 3.2.3 不同碳源和氮源条件下Cunicolor CB1对活性染料的脱色 |
| 3.2.4 不同接菌量对Cunicolor CB1脱色活性染料的影响 |
| 3.2.5 pH对Cunicolor CB1脱色活性染料的影响 |
| 3.2.6 Mn~(2+)和Cu~(2+)对C unicolor CB1脱色活性染料影响 |
| 3.2.7 染料吸光值的测定及脱色率的计算 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 一色齿毛菌对不同浓度活性黑和活性红染料固体条件下的脱色 |
| 3.3.2 一色齿毛菌对不同浓度活性黑和活性红染料液体条件下的脱色 |
| 3.3.3 碳源种类对C.unicolor CB1脱色效果的影响 |
| 3.3.4 氮源种类对C.unicolor CB1脱色效果的影响 |
| 3.3.5 Cu~(2+)浓度对C.unicolor CB1脱色效果的影响 |
| 3.3.6 Mn~(2+)浓度对C.unicolor CB1脱色效果的影响 |
| 3.3.7 pH对C.unicolor CB1脱色效果的影响 |
| 3.3.8 接种量对C.unicolor CB1脱色效果的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 一色齿毛菌CB1木质素降解酶的测定及其MnP发酵条件的优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌种来源 |
| 4.1.2 主要仪器及试剂 |
| 4.1.3 一色齿毛菌产MnP的条件优化 |
| 4.1.3.1 初始产酶培养方式下一色齿毛菌产木质素降解酶活性检测 |
| 4.1.3.2 碳源和氮源的筛选 |
| 4.1.3.3 2次正交试验 |
| 4.1.3.4 正交试验结果验证 |
| 4.1.3.5 优化后一色齿毛菌CB1胞外酶液对5种染料的脱色试验 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 初始产酶培养条件下一色齿毛菌CB1产木质素降解酶的活性规律曲线 |
| 4.2.2 不同碳源和不同氮源对一色齿毛菌CB1产MnP活性的影响 |
| 4.2.3 2次正交试验结果 |
| 4.2.4 正交试验结果验证 |
| 4.2.5 优化后的一色齿毛菌CB1胞外酶液对5种染料的脱色 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 色齿毛菌CB1锰过氧化物酶同工酶基因的克隆与序列分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌种来源 |
| 5.1.2 主要仪器及试剂 |
| 5.1.3 试验引物 |
| 5.1.4 提取一色齿毛菌CB1总DNA及RNA |
| 5.1.5 一色齿毛菌cDNA的合成 |
| 5.1.6 简并PCR扩增一色齿毛菌3个MnP基因片段 |
| 5.1.7 PCR产物凝胶回收 |
| 5.1.8 回收后基因片段的连接与转化 |
| 5.1.9 染色体步移法(Genome Walking)扩增3个MnP全长DNA基因及启动子区域 |
| 5.1.10 扩增一色齿毛菌3个MnP的cDNA全长 |
| 5.1.10.1 5'RACE具体步骤: |
| 5.1.10.2 3'RACE具体步骤: |
| 5.1.11 Cu-mnp1～3基因序列的生物信息学分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 一色齿毛菌总DNA的提取及简并PCR扩增MnP基因片段 |
| 5.2.2 一色齿毛菌MnP同工酶基因的克隆与序列分析 |
| 5.2.2.1 一色齿毛菌Cu-mnp1基因全长的获得 |
| 5.2.2.2 一色齿毛菌Cu-mnp1基因5'端非翻译区序列的扩增 |
| 5.2.2.3 扩增Cu-mnp1全长cDNA序列 |
| 5.2.2.4 一色齿毛菌总RNA的提取及Cu-mnp2和Cu-mnp3全长cDNA序列的扩增 |
| 5.2.2.5 Cu-mnp2全长DNA序列的扩增 |
| 5.2.2.6 Cu-mnp3全长DNA序列的扩增 |
| 5.2.3 Cu-mnp1～3的全长cDNA、DNA及启动子序列的分析 |
| 5.2.3.1 Cu-mnp1全长cDNA、DNA及启动子序列的分析 |
| 5.2.3.2 Cu-mnp2全长cDNA、DNA及启动子序列的分析 |
| 5.2.3.3 Cu-mnp3全长cDNA、DNA及启动子序列的分析 |
| 5.2.3.4 一色齿毛菌Cu-mnp1～3基因序列之间的比较分析 |
| 5.2.3.5 Cu-mnp1～3蛋白结构分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6. 一色齿毛菌MnP三个同工酶基因差异转录分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌种来源 |
| 6.1.2 主要仪器及试剂 |
| 6.1.3 试验引物 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 一色齿毛菌诱导培养和菌丝的收集 |
| 6.2.2 一色齿毛菌总RNA的提取、检测和反转录 |
| 6.2.3 简并PCR扩增一色齿毛菌gpdcDNA序列 |
| 6.2.4 定量用gpd、Cu-mnp1～3的cDNA片段的扩增 |
| 6.2.5 实时荧光定量PCR |
| 6.2.6 实时荧光定量PCR数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 一色齿毛菌gpd的cDNA序列扩增 |
| 6.3.2 定量引物的检测及定量结果的可用性分析 |
| 6.3.3 不同Mn~(2+)浓度对Cu-mnp1～3基因转录的影响 |
| 6.3.4 不同染料对Cu-mnp1～3转录的影响 |
| 6.3.5 活性黑染料浓度对Cu-mnp1～3转录的影响 |
| 6.3.6 正交试验9个处理对应Cu-mnp1～3的转录量 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论与讨论 |
| References |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）利用改良RACE方法克隆木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 菌株与试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 总RNA提取及逆转录 |
| 1.4.2 逆转录产物Rnase H (60 U/μL) 处理 |
| 1.4.3 纯化后产物进行Td T加尾 |
| 1.4.4 运用巢式及降落式PCR |
| 1.4.5 胶回收PCR产物 |
| 1.4.6 回收产物连接到p MD-T18 vector |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 木薯RNA提取及其逆转录 |
| 2.3 木薯目的基因AGPase小亚基5’端序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 传统RACE法的不足 |
| 3.2 改良后RACE法的优点 |
| 3.3 改良后RACE法需改进的地方 |
| 4 结论 |
（9）丹酚酸酯酶的分离纯化及基因克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 丹参的植物形态及生长习性 |
| 1.2 丹参的中药属性 |
| 1.3 丹参的化学成分 |
| 1.3.1 丹参脂溶性成分 |
| 1.3.2 丹参水溶性成分 |
| 1.4 药理作用的研究 |
| 1.4.1 丹酚酸B的药理作用 |
| 1.4.2 丹参素的药理作用 |
| 1.5 蛋白质的纯化 |
| 1.6 蛋白质电印迹及N-端序列测定 |
| 1.6.1 蛋白质的电印迹 |
| 1.6.2 蛋白质N-端序列的测定与分析 |
| 1.7 真核生物基因克隆的策略研究 |
| 1.7.1 RNA的提取 |
| 1.7.2 PCR技术 |
| 1.7.2.1 RT-PCR技术 |
| 1.7.2.2 RACE技术 |
| 1.8 序列的测定与分析 |
| 1.8.1 序列的测定 |
| 1.8.2 序列分析 |
| 1.9 丹酚酸酯酶的研究现状及本论文的研究内容 |
| 1.10 本论文的研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 微生物产酶发酵的方法以及粗酶液的制备 |
| 2.2.1.1 基质培养基的制备 |
| 2.2.1.2 诱导物溶液的制备 |
| 2.2.1.3 微生物产酶发酵的方法 |
| 2.2.1.4 粗酶液的制备与活力检测 |
| 2.2.2 酶的分离纯化及纯度鉴定 |
| 2.2.2.1 分子筛层析 |
| 2.2.2.2 第一次离子交换层析 |
| 2.2.2.3 第二次离子交换层析 |
| 2.2.2.4 酶蛋白分子量及纯度测定 |
| 2.2.3 酶性质的研究 |
| 2.2.3.1 酶反应的最适温度 |
| 2.2.3.2 酶反应最适pH |
| 2.2.3.3 金属离子对酶活力的影响 |
| 2.2.4 蛋白质电印迹及N-端序列的测定 |
| 2.2.4.1 蛋白质电印迹(即蛋白质转膜) |
| 2.2.4.2 酶蛋白N-端序列的测定 |
| 2.2.5 RNA的提取及质量检测 |
| 2.2.5.1 菌体的收集 |
| 2.2.5.2 RNA的提取 |
| 2.2.5.3 RNA的质量检测 |
| 2.2.6 总RNA的精制 |
| 2.2.7 丹酚酸酯酶基因全序列的调取 |
| 2.2.7.1 利用RACE技术对3'端部分基因序列的扩增及测定 |
| 2.2.7.2 利用RACE技术对5'端部分基因序列的扩增及测定 |
| 2.2.7.3 基因序列CDS区的获得 |
| 2.2.7.4 基因序列的验证 |
| 2.2.8 丹酚酸酯酶基因全序列的相似性分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 粗酶活力的测定 |
| 3.2 丹酚酸酯酶的分离纯化 |
| 3.2.1 凝胶分子筛层析分离酶蛋白 |
| 3.2.2 离子交换第一次分离酶蛋白 |
| 3.2.3 离子交换第二次分离酶蛋白 |
| 3.2.4 酶蛋白纯度的鉴定 |
| 3.2.5 酶分子量的测定 |
| 3.3 酶性质的研究 |
| 3.3.1 酶反应最适温度 |
| 3.3.2 酶反应最适pH |
| 3.3.3 金属离子对酶活力的影响 |
| 3.4 蛋白质电印迹及蛋白质N-端序列的测定 |
| 3.4.1 蛋白质电印迹 |
| 3.4.2 蛋白质N-端序列的测定 |
| 3.5 RNA的提取及质量检测 |
| 3.5.1 RNA的提取 |
| 3.5.2 RNA的质量检测 |
| 3.6 丹酚酸酯酶基因全序列的调取 |
| 3.6.1 利用RACE技术对3'端部分基因序列的扩增及测定 |
| 3.6.1.1 引物的设计与合成 |
| 3.6.1.2 基因序列的扩增 |
| 3.6.1.3 基因序列的测定 |
| 3.6.2 利用RACE技术对5'端部分基因序列的扩增及测定 |
| 3.6.2.1 引物的设计与合成 |
| 3.6.2.2 基因序列的扩增 |
| 3.6.2.3 基因序列的测定 |
| 3.6.3 基因序列CDS区的获得 |
| 3.6.4 基因序列的验证 |
| 3.6.4.1 引物的设计与合成 |
| 3.6.4.2 基因序列的扩增 |
| 3.6.5 丹酚酸酯酶基因CDS区相似性分析 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 丹酚酸酯酶亚基Ⅰ基因测序彩图 |
| 附录B 丹酚酸酯酶亚基Ⅱ基因测序彩图 |
| 附录C 丹酚酸酯酶亚基Ⅰ基因测序方向图 |
| 附录D 丹酚酸酯酶亚基Ⅱ基因测序方向图 |
| 致谢 |
（10）大豆GmSK1和GmbZIP99基因的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 引言 |
| 第一章 泛素-26S蛋白酶体途径及SKP1蛋白研究进展 |
| 1 泛素-蛋白酶体途径的结构 |
| 1.1 泛素 |
| 1.2 蛋白泛肽化标记酶系 |
| 1.3 26S蛋白酶体 |
| 1.4 去泛素化酶 |
| 2 泛素-26s蛋白酶体途径作用机理 |
| 3 植物中泛素-26s蛋白酶体途径的功能 |
| 3.1 泛素-26s蛋白酶体途径与植物激素信号转导 |
| 3.2 泛素-26s蛋白酶体途径与光形态建成 |
| 3.3 泛素-26s蛋白酶体途径与光周期调控 |
| 3.4 泛素-26s蛋白酶体途径与花发育 |
| 3.5 泛素-26s蛋白酶体途径与自交不亲和反应 |
| 3.6 泛素-26s蛋白酶体途径与细胞周期调控 |
| 3.7 泛素-26s蛋白酶体途径与非生物逆境胁迫 |
| 3.8 泛素-26s蛋白酶体途径与植物抗病性 |
| 4 植物SKP1蛋白研究进展 |
| 5 研究展望 |
| 第二章 植物BZIP转录因子研究进展 |
| 1 转录因子概况 |
| 1.1 转录因子的概念 |
| 1.2 转录因子的结构 |
| 1.3 转录因子作用的分子机理 |
| 2 植物转录因子的分类及其功能 |
| 2.1 WRKY转录因子 |
| 2.2 MYB类转录因子 |
| 2.3 AP2/ERF类转录因子 |
| 2.4 NAC转录因子 |
| 2.5 bHLH转录因子 |
| 3 植物BZIP转录因子研究进展 |
| 3.1 植物bZIP转录因子的结构特征 |
| 3.2 植物bZIP转录因子的分类 |
| 3.3 植物bZIP转录因子的功能 |
| 4 研究展望 |
| 研究目的和意义 |
| 第二部分 研究报告 |
| 第三章 大豆SKP1同源基因GMSK1的克隆与功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 植物基因组DNA的提取 |
| 1.3 总RNA的提取、纯化及cDNA第一链的合成 |
| 1.4 GmSK1基因cDNA全长的克隆 |
| 1.5 GmSK1基因编码区内含子结构分析 |
| 1.6 GmSK1基因编码蛋白及其结构域预测 |
| 1.7 GmSK1基因Southern杂交分析 |
| 1.8 大豆SKP1基因家族的鉴定与分析 |
| 1.9 激素和胁迫诱导下GmSK1基因的表达分析 |
| 1.10 GmSK1蛋白在洋葱表皮细胞中的定位 |
| 1.11 植物表达载体的构建 |
| 1.12 转基因烟草植株的获得 |
| 1.13 转35S::GmSK1基因烟草阳性植株的鉴定 |
| 1.14 转35S::GmSK1基因烟草对盐和干旱胁迫的反应 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GmSK1基因的克隆 |
| 2.2 GmSK1基因序列分析与蛋白的结构预测 |
| 2.3 GmSK1基因组内含子结构分析 |
| 2.4 GmSK1多序列比对和系统发生分析 |
| 2.5 大豆基因组中的GmSK1拷贝数鉴定 |
| 2.6 大豆SKP1基因家族的鉴定与分析 |
| 2.7 GmSK1基因的表达分析 |
| 2.8 GmSK1亚细胞定位 |
| 2.9 GmSK1在烟草中的功能分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大豆SKP1基因家族的特点 |
| 3.2 GmSK1是大豆SKP1基因家族中一员 |
| 3.3 GmSK1参与植物激素信号转导途径 |
| 3.4 GmSK1调控非生物胁迫应答过程 |
| 第四章 大豆BZIP转录因子GMBZIP99的克隆与表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 植物基因组DNA的提取 |
| 1.3 总RNA的提取、纯化及cDNA第一链的合成 |
| 1.4 GmbZIP99基因cDNA全长的克隆 |
| 1.5 大豆基因组中的GmbZIP99拷贝数鉴定 |
| 1.6 GmbZIP99核苷酸序列及编码蛋白氨基酸序列的分析 |
| 1.7 GmbZIP99基因表达分析 |
| 1.8 亚细胞定位 |
| 1.9 GmbZIP99转录激活活性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GmbZIP99基因的克隆 |
| 2.2 GmbZIP99基因序列分析与蛋白的结构预测 |
| 2.3 大豆基因组中的GmbZIP99拷贝数鉴定 |
| 2.4 GmbZIP99多序列比对和系统发生分析 |
| 2.5 GmbZIP99基因表达分析 |
| 2.6 亚细胞定位 |
| 2.7 GmbZIP99转录激活活性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GmbZIP99属于大豆bZIP转录因子 |
| 3.2 GmbZIP99参与植物激素信号转导途径 |
| 3.3 GmbZIP99与逆境胁迫响应相关 |
| 全文结论 |
| 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 实验方法 |
| 附录二 常用培养基和相关试剂的配置 |
| 攻读博士学位期间发表及待发表的研究论文 |
| 致谢 |
四、RAPID AMPLIFICATION OF cDNA ENDS(RACE)（论文参考文献）
- [1]MRJP-1单克隆抗体和金标试纸制备技术研究及在蜂蜜真实性检测中的应用[D]. 蒋晨旻. 浙江大学, 2020
- [2]卵形鲳鲹TLR21、TLR22及相关基因的克隆与表达分析[D]. 徐腾. 广西大学, 2019(01)
- [3]中心体蛋白Nlp相关长链非编码RNA的鉴定及生物学功能研究[D]. 李章富. 北京协和医学院, 2019
- [4]镉胁迫下秋茄超氧化物歧化酶家族基因的表达调控与功能分析[D]. 潘铖烺. 厦门大学, 2019(08)
- [5]嗜酸性喜温硫杆菌Sox硫氧化系统代谢功能和调控机制研究[D]. 李利锋. 山东大学, 2017(05)
- [6]大蒜MADS-box基因的克隆与表达分析[D]. 任洪杰. 东北林业大学, 2015(05)
- [7]一色齿毛菌锰过氧化物酶基因的克隆与差异表达分析[D]. 于存. 东北林业大学, 2015(05)
- [8]利用改良RACE方法克隆木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的研究[J]. 郭雅静,罗兴录,钟建崑,陈会鲜. 中国农学通报, 2014(27)
- [9]丹酚酸酯酶的分离纯化及基因克隆[D]. 任义. 大连工业大学, 2014(05)
- [10]大豆GmSK1和GmbZIP99基因的克隆及功能分析[D]. 陈艳萍. 南京农业大学, 2015(06)