一、日本研究发现对朊病毒有极强灭活能力的蛋白酶（论文文献综述）
丁铭宣[1]（2021）在《纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究》文中研究表明研究背景和目的:朊病毒病作为能在人与哺乳动物间传播的感染性神经退行性疾病,其潜伏期很长,且患上朊病毒病的患者无一例外地在发病数月至数年内去世。朊病毒有致命的神经毒性,其机理仍未完全明确地为人们所知,并且因为其疾病过程的快速进展,使得干预及治疗变得特别困难。尽管世界各地的学者都在竭尽所能地进行着相关的基础实验与临床试验,试图找到应对朊病毒的策略,但目前为止依然收效甚微。由于缺乏成熟的针对朊病毒病的有效疗法,甚至没有成功的临床试验,目前对于朊病毒病患者所能给予的干预手段基本以支持性和姑息性治疗为主。故找到对于人类朊病毒有效的药物或防治方法是近年来对于朊病毒方向的研究热点,也是人类探索朊病毒病的最终目的。多项研究报道,CEs在毒株接种前后对于朊病毒感染的动物都具有明显的保护作用,也可在一定程度上治疗受朊病毒感染的细胞,表现出了令人惊喜的防治潜力,但其对朊病毒的作用机制尚不明确。故本研究设计实验,选用在前人的研究中,对于患朊病毒病的动物防治效果较为优秀的一种CE——TC-5RW作为试验药物,在体内及体外,分别研究了TC-5RW对于动物及人类朊病毒的作用,试图进一步探究CEs防治朊病毒病的机制,推动包括TC-5RW在内的CEs作为临床试验新药造福朊病毒病患者的研究进程。研究方法:本研究利用表达仓鼠朊蛋白的转基因小鼠进行动物实验。在感染仓鼠263K朊病毒的当天,向小鼠腹腔内一次性注射TC-5RW进行给药处理,随即对动物生存期及病理征象进行观察、对脑Pr P进行二维蛋白质电泳、以及通过检测其皮肤组织内是否存在朊病毒播种活性,来探究TC-5RW体内注射对动物朊病毒病的作用。其中,对于皮肤组织内可能存在的微量朊病毒的播种活性,是利用s PMCA与RT-Qu IC两种新兴的、灵敏度极高的手段来进行检测的。同时本研究也应用了这两种检测手段,在检测体系中直接加入TC-5RW,通过体外实验探究该药物对感染动物或人类组织中的朊病毒播种活性的影响。此外,本研究为了进一步探究TC-5RW是否对朊病毒PrPSc存在直接作用,将TC-5RW与朊病毒感染的人或动物的脑匀浆共同温育一定时间,随后以蛋白酶K（proteinase K,PK）处理,通过蛋白质免疫印迹法（Western blot）来观察处理后存在蛋白酶抗性的PrPSc,又称蛋白酶抗性朊蛋白（proteinase K resistant prion protein,Pr Pres）水平变化。本研究通过以上实验方法,探寻TC-5RW在体内及体外对朊病毒播种活性的影响,及该药物直接作用对朊病毒蛋白酶抗性的影响,来分析其防治朊病毒病的可能机制。研究结果:本研究发现,TC-5RW的体内作用可使263K感染的转基因小鼠病症减轻,具体表现为:与对照组相比,治疗组小鼠生存期显着延长,且脑组织神经病理征象不明显。二维蛋白质电泳结果表明,治疗组小鼠与对照组小鼠脑PrP的分子量与电荷均无明显区别,说明该化合物不通过影响朊蛋白翻译后修饰的途径抑制朊病毒形成与累积。在体外实验中,首先以动物源朊病毒作为种子,发现向s PMCA检测体系中加入不同浓度的TC-5RW,可以抑制朊病毒的扩增;向RT-Qu IC体系加入TC-5RW,可延长RT-QuIC荧光值曲线的起峰时间,并使ThT荧光峰值降低,说明该药物的加入降低了重组蛋白被朊病毒种子转化为淀粉样构象的效率,即降低了朊病毒的播种活性。在以上实验中仅2μg/m L的TC-5RW存在就能明显抑制朊病毒的播种活性,且这种作用在一定程度上与TC-5RW浓度成正比。本研究还将TC-5RW与患病动物的脑匀浆直接共温育后以PK处理,发现Pr Pres水平明显降低,这种作用亦在一定程度上与TC-5RW浓度成正比。本研究还发现TC-5RW在体外对包括s CJD MM1、s CJD MV2、s CJD VV2、g CJD E200K、gCJD V180I、FFI在内的多种人类朊病毒亚型都具有相似的作用,可直接降低抗蛋白酶消化的Pr Pres水平,且终浓度为250μg/m L的TC-5RW存在于检测体系内可降低朊病毒播种活性,尤其对gCJD V180I及FFI的作用最为显着,药物浓度50μg/m L时甚至能完全抑制这两种亚型的RT-Qu IC反应。结论:本研究结果表明,TC-5RW不仅能够使朊病毒感染动物的潜伏期延长,病理征象减轻,还可降低其皮肤组织内PrPSc的播种活性。在体外实验中,向PMCA与RT-Qu IC体系中直接加入TC-5RW可以抑制人或动物PrPSc的播种活性。TC-5RW与PrPSc温育后,可促进其转化为容易被PK降解的结构,这可能暗示了其抑制朊病毒的作用机制。
杨韧[2]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中指出冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
郭茂森[3]（2020）在《不同山羊品种朊蛋白基因多态性及其与血液免疫性状的关联分析》文中研究说明朊蛋白基因（PRNP）是调控朊蛋白表达的重要基因,存在高度的变异性,研究发现山羊PRNP基因编码区存在10个氨基酸变异位点（102,127,143,146,154,211,218,219,222和240）和三个同义代替位点（42,125和138）,PRNP基因位于山羊13号染色体,研究发现山羊PRNP基因遗传多样性与痒病的抗病性/易感性显着相关。本试验以山东省规模化山羊养殖场为试验羊只,共采集851只山羊的血样,包括3个品种即鲁波山羊464只、莱芜黑山羊131只和崂山奶山羊256只,按年龄分为三组即1岁以下组、1岁-2岁组和2岁以上组。采取的技术路线是:首先,选取60只鲁波山羊提取DNA、设计引物和混池测序,找出所研究群体中该基因可能存在的多态性位点;对每只山羊的DNA样品进行测序,利用Chromas 2按照测序峰图再为每个多态位点进行基因型判定;用Pop Gen 32和SPSS 22分析PRNP基因多态位点和品种等对血液性状的效应值,找出与血液性状有关联的优势基因型。试验结果如下:1、在所研究群体中共发现11个SNP多态位点,其中有3个SNP位点（NH1、NH2和3’UTR）为首次发现。在内含子区发现的2个多态位点和突变碱基信息,分别是NH1（为G→A）和NH2（C→G）;CDS区的8个多态位点分别是CDS42（G→A）、CDS102（T→G）、CDS138（T→C）、CDS143（A→G）、CDS146（A→G）、CDS211（G→A）、CDS222（C→A）、CDS240（A→C）;3’UTR区发现的1个SNP被命名为3’UTR（C→G）。所研究三个山羊品种的所有位点的杂合度、F-统计量和基因流等遗传多样性参数也做了估计。2、结合参考文献,可以确定所研究群体中与山羊痒病抗性相关的多态位点有4个,包括CDS222R、CDS211O、CDS146N和CDS143L,其有利的等位基因均为突变型。综合分析表明,鲁波山羊、莱芜黑山羊和崂山奶山羊的有利或优势多态位点是不同的,分别为CDS146、CDS143和CDS211,其有利等位基因和纯合基因型的频率分别为0.2764和0.0793、0.5846和0.3231、0.1445和0.1445。而在CDS222位点上,三个品种中的个体数均较少,说明该位点不是山东山羊群体中的优势位点。3、山羊的品种和年龄对大部分血液性状都有显着或极显着的影响（P<0.05或P<0.01）。其中,山羊的品种对淋巴细胞比率、中间细胞比率和粒细胞比率具有极显着的效应（P<0.01）,对红细胞总数、血红蛋白浓度和红细胞分布宽度（SD）具有显着效应（P<0.05）。山羊年龄对淋巴细胞、红细胞压积、红细胞平均体积、血红蛋白浓度、红细胞分布宽度（SD和CV）具有极显着的效应（P<0.01）,对白细胞总数、淋巴细胞比率、中间细胞比率、中间细胞和粒细胞具有显着效应（P<0.05）。4、在11个位点中,有5个位点即NH1、CDS138、CDS143、CDS211和CDS222对血液性状没有显着性效应（P<0.05）,有6个位点即NH2、CDS42、CDS102、CDS146、CDS240和3’UTR对至少1个血液性状有显着性效应（P<0.05或P<0.01）。其中,位点NH2对淋巴细胞比率、中间细胞比率和粒细胞比率具有显着效应（P<0.05）,其优势基因型分别为DD、CC和CC基因型;位点CDS42对粒细胞比率具有显着效应（P<0.05）,优势基因型为FF基因型;位点CDS102对粒细胞比率具有极显着效应（P<0.01）,优势基因型为HH基因型;对粒细胞有显着效应（P<0.05）,优势基因型为GG基因型;位点CDS146对淋巴细胞比率有显着效应（P<0.05）,优势基因型为MM基因型;位点CDS240对淋巴细胞比率和中间细胞比率有显着效应（P<0.05）,优势基因型为SS和TT基因型;位点3’UTR对中间细胞比率有显着效应（P<0.05）,优势基因型为VV基因型。5、互作效应分析表明,除白细胞总数、血红蛋白和血红蛋白含量以外,其余十余项指标都存在品种与年龄之间的交互作用（P<0.05或P<0.01）。品种与位点NH2、CDS102、CDS143、CDS211、CDS240和3’UTR存在显着性的互作性状（P<0.05或P<0.01）。综上所述,PRNP基因在山东山羊中多态性比较丰富,且存在特有的位点;鲁波山羊、莱芜黑山羊和崂山奶山羊的抗痒病的有利或优势多态位点是不同的,分别为CDS146、CDS143和CDS211;有6个位点即NH2、CDS42、CDS102、CDS146、CDS240和3’UTR对至少1个血液性状有显着性效应;大多数血液性状都存在品种与年龄之间的交互作用,部分性状存在着品种与多态位点之间交互作用。
陈嘉[4]（2020）在《朊病毒感染脑组织低丰度细胞因子筛选及其与朊病毒病相关性初探》文中研究表明朊病毒感染后可观察到中枢神经系统炎症细胞的活化和多种细胞因子的含量升高,但一些低丰度和不常见的细胞因子却鲜有报道。为了评估朊病毒感染过程中罕见细胞因子的潜在变化,我们利用Luminex方法分析筛选了感染不同羊瘙痒因子的小鼠脑组织17种细胞因子的含量。结果发现干扰素诱导的蛋白10（IP10）、角质形成细胞趋化因子（KC）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）在朊病毒感染小鼠脑组织中含量上调,随后利用三种细胞因子的商品化ELISA试剂盒和特异性免疫组织化学方法进行了验证。通过特异性荧光定量PCR方法检测IP10、M-CSF和KC,发现三种细胞因子在朊病毒感染小鼠终末期脑组织中的转录水平异常升高,应用数字PCR技术确认了IP10在多种羊瘙痒因子感染小鼠脑组织中转录水平上调。对朊病毒感染后不同时间点采集的脑组织进行动态分析发现,三种细胞因子的含量随病程呈时间依赖性增加,在感染终末期动物脑组织中IP10含量的增加尤为明显。此外,研究发现45例散发型克-雅病患者脑脊液中IP10的含量虽然组内差异较大,但整体明显高于非朊病毒病患者。为揭示IP10与朊病毒病之间的关系及其在中枢神经系统的分布规律,我们利用IP10特异性免疫组织荧光方法对羊瘙痒因子139A和ME7感染小鼠终末期的脑组织切片进行比较分析,发现在朊病毒感染的皮层、海马和丘脑中,IP10与神经元和小胶质细胞的标志物存在共定位,而与星形胶质细胞的标志物不存在共定位;利用CXCR3特异性免疫蛋白印迹、细胞免疫荧光、RT-PCR方法,证实IP10的主要受体CXCR3在朊病毒感染小鼠终末期脑组织中蛋白及转录水平异常升高;特异性免疫组织化学研究发现CXCR3主要分布于朊病毒感染的海马、皮层、丘脑及小脑等四个脑区的细胞浆中,尤其在丘脑分布更为明显,且CXCR3的颗粒样沉积会出现在脑组织空泡的周围;特别是对朊病毒感染小鼠脑组织连续切片进行IP10、CXCR3与PrPSc特异性免疫组织化学分析,结果发现在朊病毒感染海马、皮层、丘脑及小脑四个脑区的相同位置均可观察到PrPSc、IP10、CXCR3三者共同的阳性信号,提示CXCR3-IP10与PrPSc斑块形成具有明显关联性。在本研究中首次发现了M-CSF作为重要细胞因子在朊病毒感染中枢神经系统的显着变化,丰富了IP10和KC在朊病毒感染中枢神经系统中含量变化特征,同时初步探究了CXCR3-IP10与朊病毒感染的相关性,进一步明确CXCR3-IP10与朊病毒病理形成的因果关系,为丰富朊病毒病致病机制提供可信证据。
张祥毅[5]（2020）在《朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系》文中指出正常构象朊蛋白（PrPC）错误折叠后成为朊病毒(PrPSc),这个构象转变过程被认为是朊病毒疾病最基本的致病因素,但其潜在的分子机制至今仍不清楚。PrPC是一种利用C端磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol anchor,GPI anchor）锚定于神经细胞膜“脂筏”区（Lipid raft）,并广泛表达的糖蛋白。已知PrPC与细胞膜脂质体有相互作用,该作用能改变PrPC结构的稳定性。近期研究表明,朊蛋白近N端阳性电荷区（23-28氨基酸位点,CC1）可以促进朊病毒疾病的发展;而以不同株系的野生型朊病毒感染八肽重复区（51-90氨基酸位点,OR）敲除的转基因鼠,会造成宿主两极化的朊病毒疾病发病进程,例如RML-prion会促进敲除鼠的疾病进程,而BSE-prion则延缓疾病进程;因此本文将从上述的两个蛋白质区域着手,探讨朊蛋白N端与脂质体的相互作用对构象转变的影响,以及对朊病毒疾病发生发展的影响。为了探索CC1区在朊蛋白构象转变过程中所起的作用,我们首先制备两种CC1区的重组朊蛋白（recombinant PrPC,rec PrPC）,其中之一是移除该区域氨基酸序列上全部正电荷的Met4-1突变体,另一种则是删除该区域全部氨基酸序列的ΔN6突变体。通过不同的体外生物实验测定,我们发现相较于WT的构象转变能力,Met4-1及ΔN6这两种突变体的转变能力下降,但均能形成蛋白酶K（PK）抗性构象（r PrP-res）,且所有rec PrPSc对野生型小鼠C57BL/6j均具有致病性,造成100%小鼠死亡率;但相较于WT-rec PrPSc诱导的致病小鼠,ΔN6-rec PrPSc显着地延长了小鼠生存期,而Met4-1-rec PrPSc却显着地缩短了生存期,这种不一致的现象很可能是因为三种rec PrPSc各自有不同的构象,从而导致不同的传播与神经毒性模式。其次,我们藉由分析在rec PrPC构象转变过程中CC1区与阴离子脂质体（POPG）的相互作用,证明了CC1区主要通过增强静电作用力与POPG相互作用,促进PrP构象转变;因此CC1区在疾病中可能扮演促进PrP构象转变,加重神经病理损伤的角色。为了进一步了解OR区在朊蛋白构象转变过程中所起作用,我们制备了OR区氨基酸序列全删除的重组朊蛋白ΔOR突变体。通过一轮sPMCA体外扩增,WT-和ΔOR-rec PrPC均能被诱导为具PK抗性的r PrP-res,相较于WT的构象转变能力,ΔOR的转变能力显着上升。其次,我们利用CRISPR-Cas9技术构建的Prnp-ΔOR+/-小鼠自交后代进行朊病毒疾病造模后,发现随着小鼠PrPC-ΔOR表达量逐渐递增（WT<Heter<ΔOR）,其朊病毒疾病模型小鼠的生存期越长,脑组织中PrPSc沉积越少以及神经损伤越轻。接着我们分析在rec PrPC构象转变过程中OR区与阴离子脂质体（POPG）的相互作用,发现OR区主要通过减弱疏水作用力与POPG相互作用,阻碍PrP构象转变;藉此产生构象转变效率下降但却有更强神经毒性的PrPSc。本研究的实验结果阐明了CC1区和OR区在PrPC转变为PrPSc中扮演了不同的角色,也为朊病毒致病进程的分子机制提供了崭新的思路。
李慧莹[6]（2019）在《不同样本中诺如病毒核酸检测方法的研究》文中研究指明诺如病毒（Norovirus,NoV）是引起全球急性胃肠炎的主要致病原,全年均可感染,主要感染儿童、老人和免疫力低下人群。诺如病毒可以食物和水源为载体导致人类患病,又被称作食源性病毒（Foodborne Virus）和水源性病毒（Waterborne Virus）。食源性病毒和水源性病毒主要通过粪-口途径传播,因其传染性强和传播速度快等特征,成为严重威胁人民群众的健康和生命安全,甚至影响社会稳定的重大因素。在食源性病毒和水源性病毒引起的食品安全事故或突发公共卫生事件中,诺如病毒占据了重要地位。由于食品种和水源的种类繁多,成分复杂,污染的病毒含量低,病毒分布不均一,且含有各种抑制病毒检测的因子等因素,使得食源性病毒和水源性病毒检测成为全球公共卫生面临的重点和难点。我国已建立了全国病毒性腹泻监测网络,具备了完整的引起腹泻病毒病相关病毒的检测技术体系。但我国建立食源性病毒和水源性病毒检测体系起步晚,体系还不完善。目前我国仅发布了食品（硬质表面食品、软质水果、生食蔬菜和贝类消化腺）中诺如病毒检测的食品安全国家标准（GB 4789.42-2016）,该标准是在欧盟的ISO/TS 15216-2的基础上建立,并没有进行检测方法优化。并且该国标也不包括脂肪、蛋白类即时食品中和水中诺如病毒检测方法。而在欧盟的ISO/TS 15216-2中也是仅有瓶装水中诺如病毒的检测,缺少大量水中诺如病毒的检测方法。但是目前大部分水源性病毒的暴发均与现场水源（地表水、地下水和自来水）有关,而为了能检测到现场水源中低浓度和分布不均的病毒粒子,需要建立适宜的方法来开展现场采样和提高病毒检测的灵敏度。本研究旨在对已有的临床样本中诺如病毒核酸检测方法进行实验室评价和应用;通过建立水和食品中诺如病毒检测方法与形成水和食品中病毒检测方法的操作规范,为我国水源性和食源性病毒病的检测、监测和应对提供了可借鉴的标准化实验室检测技术。一、临床样本中诺如病毒检测方法的实验室评价和应用实验室评价已发表的诺如病毒GI、GII基因型多重荧光定量反转录聚合酶链反应（Realtime RT-PCR）检测方法,应用该方法对内蒙古呼和浩特市2012年-2017年1863份住院儿童急性胃肠炎粪便样本进行诺如病毒检测。结果显示在1863份住院儿童粪便样本中,诺如病毒阳性率24.25%（12.78-32.92%）,诺如病毒全年感染,冬季为感染高峰期。获得306条诺如病毒VP1区基因序列,包括6个基因型:GII.3（71.24%）,GII.4（23.53%）,GII.2,GII.5,GII.6,和GII.13。诺如病毒聚合酶区序列分析显示GII.P12/GII.3、GII.Pe/GII.4和GII.P4/GII.4是主要流行基因型。二、水中诺如病毒检测方法的建立与应用以鼠诺如病毒（Murine Norovirus-1,MNV-1）作为模式病毒和过程对照病毒,结合膜吸附洗脱富集技术（viral adsoption-elution,VIRADEL）和 Realtime RT-PCR,按照采集水的体积及采样方式的不同建立和评估了两种不同的水源性诺如病毒富集方法。结果显示（1）瓶装、桶装水采用阴或阳离子膜吸附法进行病毒初次浓缩,病毒滞留率分别可以达到99.92%和98.23%;无论是阴离子膜还是阳离子膜,1%Tralk洗液洗脱效果最佳;超滤法对洗脱液进行二次浓缩,最终将待检水样浓缩至200μL;该检测体系能在10个小时内较好地完成0.1mL-5L水中诺如病毒和甲肝病毒的浓缩和检测,并且诺如病毒和甲肝病毒的回收率分别为15.25%和6.76%。最后该方法通过了三家实验室的验证。（2）自主研发了一种适合野外现场采样的病毒采集系统（Biotroy半自动微生物采集系统）。该系统能在野外现场无外电源的条件下2个小时内完成1000L环境水的采集（水流速10L/min）;仅需将过滤完水样的Nanoceram膜装置低温带回实验室,用Tralk洗液洗脱病毒,再通过PEG-6000沉淀和超滤二次浓缩最终获得了 1mL浓缩水样,并且Tralk洗液对Nanoceram膜的MNV-1洗脱率达到70.45%。（3）对北京市昌平区京密水渠饮用水进行了病毒富集,通过高通量测序和病毒宏基因组分析了该饮用水的病毒谱,发现了 5个病毒科的哺乳动物病毒谱,其中一些与人类疾病相关,包括通过粪口途径传播的主要常见病毒如诺如病毒（NoV GII.17）、肠道病毒（Enterovirus 71,EV 71）、甲肝病毒（HAV）和爱知病毒（Aichivirus,Aichi1）。本研究建立了适合实验室的瓶装、桶装水中诺如病毒富集检测方法和适合野外现场的大量水中诺如病毒的富集和检测方法,并应用自主研发的Biotroy半自动微生物采集系统对我国北京市昌平区京密水渠开展了饮用水中病毒的富集和检测。三、食品中诺如病毒检测方法的优化与评估以MNV-1为模式病毒和过程对照病毒,结合Realtime RT-PCR检测方法,优化和评估了软浆果、碳水化合物类食品及蛋白质、脂肪类即食食品中诺如病毒的检测方法。（1）考察Tralk洗液、TGBE洗液、TPB洗液和NaPP洗液对软浆果（草莓和葡萄）和碳水化合物类食品（生菜和洋葱）中MNV-1的洗脱效果,比较洗脱液的二次浓缩方法PEG6000沉淀和超滤对MNV-1的浓缩效果。评估优化后方法对不同食品中诺如病毒的富集效果。结果表明软浆果草莓中TGBE洗液-PEG6000沉淀组合方法的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为103基因拷贝/10g;葡萄中TGBE洗液-超滤的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为104基因拷贝/10g;生菜中Tralk洗液-PEG沉淀的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为103基因拷贝/10g;洋葱中Tralk洗液-超滤的MNV-1回收效果优于其他组合,诺如病毒检测限为104基因拷贝/10g。（2）比较了洗脱-浓缩方法和直接RNA提取法回收蛋糕和午餐肉中MNV-1的回收效果,结果显示前者没有检测到蛋糕和午餐肉的MNV-1,后者成功回收到了 MNV-1,但是诺如病毒的检测限高于其他种类食品,分别为106基因拷贝/10g和104基因拷贝/10g。本研究建立了软浆果、碳水化合物类食品和脂肪蛋白类即食食品中诺如病毒的检测方法。优化和完善了我国食品中诺如病毒检测体系。四、贝类中病毒的检测以MNV-1为模式病毒和过程对照病毒,结合Realtime RT-PCR检测方法,初步探讨了贝类中诺如病毒两种不同检测方法的检测效果。（1）比较蛋白酶K结合PEG沉淀和蛋白酶K结合直接RNA提取两种贝类中诺如病毒检测效果。用蛋白酶K结合PEG沉淀得到的MNV-1回收效果优于蛋白酶K结合直接RNA提取方法获得的MNV-1回收效果。（2）收集我国北京市330份贝类样本,蛋白酶K结合PEG沉淀处理贝类消化腺和肠道后,利用高通量测序和病毒宏基因组分析获得贝类中的病毒谱。本研究通过高通量测序后共获得了 4594270条被注释病毒的基因序列,其中以动物为宿主的病毒序列占21%（965185/4594270）。而在以动物为宿主的病毒序列中,被注释到哺乳动物为宿主的病毒序列占1.26%（12205/965185）,包括20个病毒科,其中就有小RNA病毒科（Picornaviridae）的12个病毒属和杯状病毒（Caliciviridae）的诺如病毒属（Norovirus）和札如病毒属（Sapovirus）,包括常见的人疾病暴发相关的EV、HAV 和 NoV,其中 NoV 的基因型包括 GII.1、GII.2、GII.13、GII.14 和GII.17。NoV GII.2基因序列与目前我国NoV主要流行株的氨基酸同源性达到100%,而GII.17与流行株的氨基酸同源性为98%。总之,实验室评价了已发表诺如病毒Realtime RT-PCR检测方法,通过该方法获得了 2012年-2017年内蒙古呼和浩特市5岁以下住院儿童诺如病毒的分子流行特征。本研究自主研发了一套适合现场水样采集的Biotroy半自动微生物采集系统,建立了水和食品中诺如病毒的回收检测方法,形成了水和食品中诺如病毒检测方法操作规范,并结合病毒宏基因组学方法初步探讨了饮用水源和贝类中的病毒谱。
沈鑫[7]（2019）在《人工条件下鸡毛降解过程中真菌群落的动态变化》文中研究指明角蛋白是一种纤维性与难溶型的结构蛋白,是自然界中仅次于纤维素和几丁质的第三大丰富聚合物,角蛋白是构成皮肤、毛发、羽毛、角等的重要组成部分。降解后的角蛋白是丰富的蛋白质来源,可用于生产饲料或包覆膜材料以及生物医学材料等等。传统的物理化学降解角蛋白易对环境造成污染,所得产物也不理想,而微生物降解角蛋白是一种温和、高效、绿色的方法,具有广阔的发展潜力和极高的实用价值。本研究基于传统的真菌平板分离培养和高通量测序技术分析,分析医院绿地土壤加入无菌鸡毛粉后不同时期的真菌群落组成变化。筛选出一株对鸡毛粉角蛋白有高效降解能力的真菌,通过正交试验探索其最佳发酵条件。基于传统的真菌平板分离培养结果可知,加入富角蛋白的无菌鸡毛粉不同时期（初期3d、中期30d、后期90d）的医院绿地土壤中真菌群落组成有较大差异。通过经典的平板分类方法,从加入鸡毛粉的医院土中共分离到真菌372株,经形态特征和分子鉴定,它们分属19属33种。从医院绿地土分离获得的真菌类群中,初期（YY1）样本中分离到6属12种155株真菌,初期（YY1）样本的真菌优势类群是青霉属Penicillium,占分离真菌总数的59%。中期（YY2）样本中分离到10属15种134株真菌,中期（YY2）样本中蜡蚧属Lecanicillium是优势类群,占总数的48%。后期（YY3）样本中分离到7属11种83株真菌,后期（YY3）样本中真菌优势类群则是小孢子属Microsporum,占总数的53%。随着鸡毛的降解,不同时期内医院土中的真菌优势类群发生明显的动态变化。将富含角蛋白有机物的无菌鸡毛粉加入一医院的绿地土后,基于高通量测序技术分析真菌群落的组成及相对丰度,发现在富含角蛋白基质鸡毛粉降解过程中共有真菌6门15纲39目71科128属。加入鸡毛粉的不同时期（初期3d、中期30d、后期90d）医院土真菌群落结构发生较大的变化。添加鸡毛粉3d的医院土（YY1）中真菌群落多样性丰富,优势种是芽殖久浩酵母Guehomyces pullulans（57.42%）;加入鸡毛粉30d后（YY2）,群落组成中不少真菌群落的相对丰度明显下降,优势种为一分类地位未定的真菌属,其相对丰度是77.57%;加入鸡毛粉90d后（YY3）,一些潜在的人类病原真菌的相对丰度有所上升,真菌优势种是石膏样小孢子菌Microsporum gyseum（55.17%）,而初期的真菌优势种芽殖久浩酵母Guehomyces pullulans的相对丰度则明显的降低。研究表明富含角蛋白的鸡毛粉对医院绿地土壤中的真菌群落,特别是一些人体潜在病原真菌的相对丰度和群落组成具有明显的调节作用。基于传统的真菌平板分离培养的方法,从加入鸡毛粉中期的医院绿地土中分离到一株能够高效降解角蛋白的真菌GZZC1Y2-12,通过菌株形态特征和分子鉴定可知高效降解角蛋白菌株1Y2-12属于蜡蚧属Lecanicillium,根据ML系统发育树将该菌株命名为Lecanicillium testudineum。采用正交试验探索该菌株降解角蛋白的最佳发酵条件,结果可知,影响菌株1Y2-12产酶的各因素主次顺序为N源﹥无机离子﹥C源,其中N源对菌株发酵产酶活力的影响最显着。菌株1Y2-12产酶的最佳培养条件为A2B3C1,在此条件下菌株1Y2-12发酵产酶的值为22.03U/mL。
王珂[8]（2019）在《日本乙型脑炎病毒感染介导血脑屏障通透性改变的机制研究》文中认为乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）是由日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的急性的蚊虫传播人畜共患病。乙型脑炎的主要特点是中枢神经系统（Central nervous system,CNS）广泛的炎症,并伴随着血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）完整性的破坏。虽然在病理学上,乙型脑炎病毒感染导致急性脑炎和血脑屏障的破坏,但是其机制仍不清楚。本研究利用JEV感染的体内和体外模型,探讨了JEV感染导致血脑屏障破坏的机制。结果显示,JEV感染小鼠后,在外周只有第1天和第2天能检测到少量残余的病毒,随后无法检测到病毒,说明外周的病毒很快被清除;在中枢神经系统中,JEV感染后第2天就能检测到病毒,在第4天病毒载量急剧增加,第5天基本达到顶点。血脑屏障通透性检测发现,通透性的极显着增加发生在JEV感染后第4天。以上结果说明乙型脑炎病毒在外周器官中未大量复制,部分病毒在未改变血脑屏障通透性的情况下入侵中枢神经系统,并在中枢神经系统中大量复制,引起血脑屏障的破坏,最终导致小鼠死亡。在脑组织中,IP-10、IFN-γ、IL-6和CCL4的表达量在感染后第1天就有极显着的增加,而CCL2和CCL3的表达量在第3-4天开始有显着增加。CCL5的表达量在JEV感染的第3天有约15-20倍的增加;而TNF-α表达量在第4天有极显着的增加。利用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3作为血脑屏障单层细胞模型的体外研究发现,乙型脑炎病毒感染小鼠的脑匀浆上清无论乙型脑炎病毒是否灭活,均能破坏内皮细胞的完整性,证实了是炎性因子而不是乙型脑炎病毒自身增加了血脑屏障的通透性。本课题首先进行了IFN-γ中和实验,以探究在本实验模型中IFN-γ对血脑屏障的破坏。结果显示,中和IFN-γ之后能够明显减少JEV感染情况下紧密连接蛋白的表达下调,说明IFN-γ在破坏血脑屏障过程中发挥重要作用。进一步实验发现中和IFN-γ是通过减少紧密连接蛋白的表达下调来维持血脑屏障的完整性。考虑到IP-10在感染后第1天就有极高的表达量,随后一直维持高表达,是乙型脑炎病毒感染后中枢神经系统中变化最早且最显着的因子。IP-10中和实验显示中和IP-10能够减轻血脑屏障的破坏,减少紧密连接蛋白的表达下调,说明IP-10和IFN-γ均位于JEV感染诱导的细胞因子网络的中心。通过检测乙型脑炎病毒感染小鼠后IP-10在脑组织中的表达发现星形胶质细胞是乙型脑炎病毒感染后IP-10的主要来源,神经元和小胶质细胞也能产生部分IP-10。利用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3的研究发现IP-10并没有破坏内皮细胞的完整性,因此推测IP-10是通过调节其他炎性因子的表达,进而破坏血脑屏障的完整性。通过分析IP-10与其他炎性因子表达及血脑屏障破坏时空关系,发现TNF-α极有可能位于IP-10下游。进一步用IP-10和乙型脑炎病毒处理星形胶质细胞,均能在处理后的细胞上清中检测到较高水平TNF-α,而中和IP-10之后能够明显下调TNF-α的表达,说明IP-10通过自分泌或旁分泌的途径作用于星形胶质细胞,从而产生TNF-α。TNF-α是通过改变内皮细胞的跨内皮通透性,调节内皮细胞紧密连接蛋白的表达和转位,进而影响血脑屏障内皮细胞的通透性。进一步研究发现,乙型脑炎病毒感染能够诱导星形胶质细胞上调表达IP-10的受体CXCR3。IP-10与受体CXCR3结合之后,能够激活MAPK信号通路。IP-10主要激活并磷酸化JNK（c-Jun N-terminal kinase）,使其下游的立即早期转录因子c-Jun磷酸化,进而诱导TNF-α的表达。而TNF-α直接破坏血脑屏障的完整性,外周免疫细胞更容易进入中枢神经系统并能引起中枢胶质细胞的活化,最终强烈的炎性风暴导致了小鼠的死亡。综上所述,乙型脑炎病毒感染主要是通过诱导炎性因子,导致血脑屏障完整性的破坏,进而引起动物的死亡。乙型脑炎病毒感染产生的IFN-γ能够直接增加血脑屏障的通透性,而产生的IP-10并不直接作用于血脑屏障内皮细胞,而是通过诱导下游的炎性因子来增加血脑屏障的通透性。在中枢神经系统中,星形胶质细胞是IP-10的主要来源。IP-10通过结合其受体CXCR3,激活JNK-c-Jun信号通路,进而诱导TNF-α的表达。而TNF-α是通过改变内皮细胞紧密连接蛋白的表达与胞内分布来调控血脑屏障的通透性。阐明IP-10/TNF-α细胞因子网络诱导的BBB破坏能够为黄病毒科其他致脑炎病毒的发病机制提供借鉴,也能够为BBB相关的CNS疾病的治疗提供潜在的治疗靶点。
严普[9]（2019）在《朊病毒病患者脑脊液特异性tau蛋白ELISA方法的建立及初步应用》文中提出朊病毒（Prion Disease,PrD）,又称为可传播性海绵状脑病（Transmissible Spongiform Encephalopathy,TSE）,是一种侵袭人类及其他哺乳动物中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）的传染性、神经退行性疾病,具有潜伏期长和100%致死率的特点。目前人类朊病毒病主要分为:克-雅病（Creutzefeldt-Jakob Disease,CJD）、库鲁病（Kuru）、吉斯特曼-施特劳斯综合症（Gerstmann-Straüssler-Scheinker syndrome,GSS）和致死性家族型失眠症（Fatal Familial Insomnia,FFI）,以CJD最为常见。CJD又可分为散发型（sCJD）、医源型（iCJD）、家族或遗传型（fCJD or gCJD）及变异型克-雅病（vCJD）。目前临床检测方法有对患者脑组织进行活检,通过检测血液中PRNP基因突变情况判断遗传型克-雅病,以及检测sCJD患者脑脊液中14-3-3蛋白含量的升高来辅助疾病的诊断。脑组织活检对病人身体损伤极大,根据血液中PRNP基因是否突变只可判断遗传型克-雅病,存在很大局限性,而脑脊液中14-3-3蛋白的检测则特异性不强。因此,临床急需有效的朊病毒病诊断方法。微管由微管蛋白和微管相关蛋白（tau蛋白）组成,其中tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白,微管系统是神经细胞骨架成分,可参与多种细胞功能。研究证明,tau蛋白与多种神经性疾病存在紧密联系,并在朊病毒病患者及啮齿动物模型脑组织中明显升高,其中含外显子2（tau-exon 2）和外显子10（tau-exon 10）的特异型tau蛋白占总tau蛋白含量的大部分,因此本研究建立tau蛋白ELISA方法并应用于不同类型的朊病毒病患者脑脊液中。在本研究中,用含有pGEX-2T-E2和pGEX-2T-E10质粒的原核菌体表达出目的蛋白GST tau-exon 2/10,测定目的蛋白浓度,GST tau-exon 2蛋白浓度为0.166μg/uL,GST tau-exon 10蛋白浓度为0.473μg/μL,制备单克隆抗体。制备完成的GST tau-exon 2蛋白单克隆抗体编号为1-4（1.8 mg/mL）,4-1（1.7 mg/mL）,GST tau-exon 10蛋白单克隆抗体编号为6-4（2.6 mg/mL）,5-6（1.8 mg/mL）。用已制备的小鼠单克隆抗体使用蛋白免疫印迹方法分别检测GST tau-exon 2/10蛋白,证明所制备抗体特异性,使用蛋白免疫印迹方法在神经细胞模型和小鼠脑组织分别检测tau蛋白证明抗体敏感性。使用已制备的抗体建立更强敏感性的双抗夹心ELISA方法,最终GST tau-exon 2/10蛋白特异性单克隆抗体双抗夹心ELISA方法的条件确定如下:包被抗体H-150浓度为8μg/ml,检测抗体GST tau-exon 2（1-4）蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 2（4-1）蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 10（6-4）蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 10（5-6）蛋白鼠源单克隆抗体的工作浓度分别选定为1μg/mL,1μg/mL,0.8μg/mL,1μg/mL。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗稀释比例为1:5,000。应用已建立好的双抗夹心ELISA法对包括sCJD、GSS、FFI、T188K位点突变的gCJD及非CJD患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量进行检测,结果显示sCJD患者脑脊液中含外显子2的tau蛋白相比于非CJD患者明显升高,具有极显着统计学差异（p<0.001）,sCJD患者脑脊液中含外显子10的tau蛋白相比于非CJD患者明显升高,具有显着统计学差异（p<0.01）。T188K位点突变的gCJD患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相对于非CJD患者明显增高,具有显着统计学差异（p<0.01）。而GSS和FFI患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相对于非CJD患者无明显差异,无统计学差异（NS）。本研究建立的特异性tau蛋白双抗夹心ELISA方法可以有效的检测出不同类型朊病毒患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量的水平变化,为朊病毒病的检测提供有效的检验方法并对朊病毒病的机制研究提供理论依据。
李小雨[10]（2019）在《基于不同信号放大策略的朊蛋白电化学免疫传感研究》文中研究表明朊蛋白是一种存在于人或动物神经系统的蛋白质,与传染性海绵脑病（TSE）等神经退行性疾病密切相关,朊蛋白病主要是由正常细胞型朊蛋白（PrPC）发生错误折叠转变为致病型朊蛋白(PrPSc)所致,致病的朊蛋白在体内沉积,感染中枢神经细胞,最终导致生物体死亡,具有极高的致死率。在发病早期,朊蛋白(PrPSc)在体内含量极低,不易被检测。而一旦发病,致病型朊蛋白含量急剧增加,对中枢神经系统造成不可逆转的伤害。因此发展快速灵敏检测朊蛋白(PrPSc)的方法对朊蛋白病的早期预防和诊断具有极其重要的意义。现如今对朊蛋白的开展的各项研究中,一般使用细胞型朊蛋白（PrPC）来代替致病型朊蛋白(PrPSc),这是因为致病型朊蛋白(PrPSc)具有极强的感染性,会对研究人员的健康造成威胁,故本文检测目标物均采用细胞型朊蛋白（PrPC）。电化学生物传感器具有设计简单,响应速度快、灵敏度高、检测成本低等优点在分析化学领域有着广泛的应用。它不仅可用于重金属离子浓度的检测,还能在核酸（DNA或RNA）、肿瘤标记物、生物小分子、靶向药物检测中得到大量应用。基于电化学生物传感器的诸多优点,本文运用多种信号放大策略构建生物传感平台,并成功用于朊蛋白（PrPC）的检测,而通过改变相应的目标物识别分子,设计的传感器也能用于致病型朊蛋白(PrPSc)的灵敏检测,论文主要工作如下:（1）将β-环糊精电聚合到纳米金修饰的玻碳电极表面,聚β-环糊精薄膜提供了大量的β-环糊精空腔结构,朊蛋白抗体通过主-客体识别效应进入环糊精空腔固定在电极表面,当朊蛋白存在时,目标物朊蛋白和抗体发生特异性反应负载在电极表面,阻断[Fe（CN）6]3-/4-的电子传递通道。基于这种“堵塞效应”,[Fe（CN）6]3-/4-的氧化还原电流降低,可实现定量检测朊蛋白。在最优的实验条件下,该传感器检测PrPC的线性范围为15 fM(0.378 pg mL-1)-1500 fM(37.8 pg mL-1),检测限低至2.1 fM(3σ,0.052 pg mL-1)。该传感器设计结构简单,灵敏度高,选择性好,检测成本低,通过改变抗体类型,所构建的传感器可用于致病型朊蛋白(PrPSc)或其它肿瘤标记物的检测。（2）通过杂交链式反应形成G-四联体结构催化氧化还原反应的信号放大策略发展了一种朊蛋白电化学免疫传感器。通过Au-NH2将朊蛋白一抗固定在电极表面,当目标物存在时与一抗发生特异性免疫反应,二抗修饰的DNA单链做引发链诱导电极表面S1和S2互补链发生杂交链式反应,hemin的加入使富含鸟嘌呤（G）的碱基形成G-四联体结构,G-四联体具有酶的生物催化作用可以催化H2O2的还原和L-半胱氨酸的氧化,加速电子传导,实现传感平台信号放大,达到检测朊蛋（PrPC）的目的。该免疫传感器检测朊蛋白的线性范围0.5 pg mL-1-100 ng mL-1,检测限为0.38 pg mL-1（3σ）。同时,所制备的传感器具有令人满意的选择性、重现性和稳定性,可广泛用于生物分析及疾病早期诊断治疗等方面。（3）基于杂交链式反应和沉淀反应的策略,构建了一种简单新颖朊蛋白电化学传感器。三明治夹心结构传感平台通过抗原-抗体特异性免疫反应构建,Ab2标记的DNA1链用作引发链和DNA2部分碱基互补配对杂交,然后加入四段DNA链,Ab2上标记的两个引发链的ds-DNA可以引起互补的S1,S2和S3,S4分别发生HCR过程,形成双股长链DNA结构,hemin的加入可使富含鸟嘌呤（G）的碱基形成G-四联体结构,催化4-氯-1-萘酚氧化生成沉淀附着于电极表面导致[Fe（CN）6]3-/4-电子传递减弱。实验结果表明,该传感器有优异的选择性和重现性,线性范围为0.5 pg mL-1-100 ng mL-1,检测限为0.31 pg mL-1（3σ）。（4）基于导电聚合物/金纳米粒子复合物与适配体的作用制备了朊蛋白电化学免疫传感器。通过抗原抗体免疫反应将目标物固定在电极上,适配体一端与抗原特异性结合,巯基标记的一端与PMB-AuNPs通过Au-S键将其引入传感平台,由于PMB本身具有良好的电化学活性,可产生明显的DPV响应电流,从而实现对朊蛋白的灵敏检测。该传感器检测PrPC的线性区间为0.5 pg mL-1-100 ng mL-1,检测限为0.45 pg mL-1（3σ）,可在遗传分析、基因疾病的诊断和治疗等领域广泛应用。（5）基于导电聚合物染料分子和金纳米粒子制备了一种双信号的朊蛋白电化学免疫传感器。制备的聚苯基对苯二胺（PPP）-AuNPs导电聚合物吸附MB,通过抗原抗体适体的特异性反应构建传感平台将PPP-MB-AuNPs复合物引入电极表面。由于PPP和MB都具有电化学活性,DPV测试出现两个还原峰且两个峰电位差值大于200 mV,通过计算PPP和MB的峰电流之和,峰电流与朊蛋白的浓度在1 pg mL-1-100 ng mL-1范围内成线性关系,检测限为0.41 pg mL-1（3σ）。该双信号的免疫传感器对实际血清样品表现出优良的选择性,可用于分析临床实际样品。（6）基于杂交链式反应和染料小分子制备了一种免疫传感器用于朊蛋白的特异性检测。一抗通过Au-NH2键固定在电极表面,目标物朊蛋白和Ab2-S0复合物与一抗形成三明治夹心免疫结构。利用HCR过程制备DNA串联体,将电活性的MB分子嵌入到双链DNA沟槽中。最后以此信号探针为载体利用方波伏安法（SWV）记录电化学信号。实验结果表明,该法可用于灵敏检测朊蛋白。检测线性范围为0.5 pg mL-1-10 ng mL-1,检测限为0.17 pg mL-1（3σ）。该免疫传感器可用于疾病早期的筛查与诊断,具有很强的实用意义。
二、日本研究发现对朊病毒有极强灭活能力的蛋白酶（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、日本研究发现对朊病毒有极强灭活能力的蛋白酶（论文提纲范文）
（1）纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 朊蛋白、朊病毒与朊病毒病 |
| 1.2 朊病毒的检测 |
| 1.2.1 传统检测手段及临床诊断标准 |
| 1.2.2 新兴的检测技术 |
| 1.3 朊病毒病的治疗方法与进展 |
| 1.3.1 临床治疗手段及探索 |
| 1.3.2 针对朊病毒防治的科研进展 |
| 1.3.3 纤维素醚及其在朊病毒治疗中的应用前景 |
| 第2章 材料、仪器与试剂的配制 |
| 2.1 材料、试剂与抗体 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3.1 脑匀浆裂解缓冲液 |
| 2.3.2 皮肤匀浆裂解缓冲液 |
| 2.3.3 TC-5RW生理盐水溶液 |
| 2.3.4 TC-5RW水溶液 |
| 2.3.5 肌氨酸溶液 |
| 2.3.6 PK溶液 |
| 2.3.7 PMSF溶液 |
| 2.3.8 LB液体培养基 |
| 2.3.9 0.1×BBMM |
| 2.3.10 8M盐酸胍 |
| 2.3.11 0.2M磷酸氢二钠溶液 |
| 2.3.12 0.2M磷酸二氢钠溶液 |
| 2.3.13 变性缓冲液 |
| 2.3.14 复性缓冲液 |
| 2.3.15 洗脱缓冲液 |
| 2.3.16 透析液 |
| 2.3.17 0.1 M磷酸钠缓冲液 |
| 2.3.18 PMCA转换缓冲液 |
| 2.3.19 Western blot电泳缓冲液 |
| 2.3.20 Western blot转膜缓冲液 |
| 2.3.21 Western blot洗膜缓冲液TBST |
| 2.3.22 Western blot封闭牛奶缓冲液 |
| 2.3.23 Western blot上样缓冲液 |
| 2.3.24 2D脱水缓冲液 |
| 2.3.25 2D再水化缓冲液 |
| 2.3.26 2D平衡缓冲液A |
| 2.3.27 2D平衡缓冲液B |
| 2.3.28 10mM ThT溶液 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 研究路线 |
| 3.2 实验伦理与安全 |
| 3.3 动物实验 |
| 3.4 大脑与皮肤样本的制备 |
| 3.5 组织病理实验方法 |
| 3.5.1 组织的石蜡包埋与切片 |
| 3.5.2 Pet blot染色流程 |
| 3.5.3 H&E染色流程 |
| 3.6 重组蛋白的纯化 |
| 3.6.1 表达仓鼠重组蛋白细菌的培养与表达 |
| 3.6.2 包涵体的制备 |
| 3.6.3 蛋白纯化 |
| 3.6.4 蛋白分装 |
| 3.7 RT-QUIC流程 |
| 3.7.1 样本稀释 |
| 3.7.2 制备反应体系 |
| 3.7.3 上样 |
| 3.7.4 开始及结束程序 |
| 3.8 SPMCA流程 |
| 3.9 TC-5RW与脑匀浆共温育实验 |
| 3.10 二维蛋白质印迹 |
| 3.11 蛋白质印迹 |
| 3.12 统计分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 纤维素醚TC-5RW体内注射对朊病毒感染转基因小鼠的作用 |
| 4.1.1 TC-5RW治疗使朊病毒感染小鼠症状减轻 |
| 4.1.1.1 TC-5RW治疗组小鼠生存期明显延长 |
| 4.1.1.2 TC-5RW治疗组小鼠脑内PrPSc沉积和海绵状变性减轻 |
| 4.1.2 TC-5RW治疗组小鼠脑内PrP的 2D结构无明显变化 |
| 4.1.3 TC-5RW治疗组小鼠皮肤组织中无法检测到朊病毒播种活性 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 纤维素醚TC-5RW在体外对动物朊病毒的作用研究 |
| 4.2.1 TC-5RW加入PMCA体系抑制患病仓鼠脑PrPSc的播种活性 |
| 4.2.2 TC-5RW加入RT-QuIC体系影响了动物脑与皮肤PrPSc的播种活性 |
| 4.2.3 TC-5RW在体外与动物朊病毒共同孵育可促进其被蛋白酶降解 |
| 4.3 纤维素醚TC-5RW在体外对不同亚型人类朊病毒的作用研究 |
| 4.3.1 TC-5RW加入PMCA体系抑制人类PrPSc的播种活性 |
| 4.3.2 TC-5RW在体外与人类朊病毒共同孵育可促进其被蛋白酶降解 |
| 4.3.3 TC-5RW加入RT-QuIC体系抑制各种人类朊病毒病PrPSc的扩增 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）不同山羊品种朊蛋白基因多态性及其与血液免疫性状的关联分析（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 鲁波山羊、崂山奶山羊和莱芜黑山羊的特点 |
| 1.1.1 鲁波山羊的特点 |
| 1.1.2 崂山奶山羊的特点 |
| 1.1.3 莱芜黑山羊的特点 |
| 1.1.4 鲁波山羊、崂山奶山羊和莱芜黑山羊的抗病性状 |
| 1.2 PRNP基因的研究进展 |
| 1.3 朊蛋白 |
| 1.3.1 朊蛋白基因和蛋白的结构 |
| 1.3.2 朊蛋白基因的表达调控 |
| 1.4 PRNP基因与山羊、绵羊痒病 |
| 1.4.1 痒病研究进展 |
| 1.4.2 PRNP基因与绵羊痒病 |
| 1.4.3 PRNP基因与山羊痒病 |
| 1.5 目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验样品的采集 |
| 2.1.2 试验仪器设备 |
| 2.1.3 试验试剂及来源 |
| 2.1.4 主要数据库及生物学软件 |
| 2.1.5 常用试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 血常规的测定 |
| 2.2.2 血液基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 PRNP基因的克隆及多态性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 混池测序结果以及基因分型 |
| 3.1.1 混池测序结果 |
| 3.1.2 混池测序基因分型 |
| 3.2 不同山羊所有位点等位基因及基因型频率 |
| 3.3 血常规测定结果 |
| 3.4 血液基因组DNA提取结果 |
| 3.5 三个品种山羊的所有位点多态性分析 |
| 3.5.1 三个品种山羊的所有位点遗传变异统计值 |
| 3.5.2 三个品种山羊的所有位点杂合度统计值 |
| 3.5.3 三个品种山羊的所有位点F-统计量和基因流统计值 |
| 3.5.4 三个品种山羊之间Nei氏遗传相似度和遗传距离 |
| 3.6 不同因素与各项血液指标之间的显着性分析 |
| 3.7 品种和年龄与不同位点两两交互作用与各项血液指标之间的显着性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 筛选目的片段 |
| 4.2 不同山羊对羊痒病的易感性 |
| 4.3 不同山羊品种内与品种间的遗传距离 |
| 4.4 血液免疫指标与机体抗病力的关系 |
| 4.5 不同因素与血液免疫指标的关系 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）朊病毒感染脑组织低丰度细胞因子筛选及其与朊病毒病相关性初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 朊病毒及朊病毒病 |
| 1.1.1 朊病毒概述 |
| 1.1.2 朊病毒病概述 |
| 1.1.3 朊病毒相关细胞因子 |
| 1.2 趋化因子CXCL10及其受体CXCR3 |
| 1.2.1 趋化因子 |
| 1.2.2 CXCL10/CXCR3概述 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 朊病毒模型 |
| 2.1.2 主要设备及仪器 |
| 2.1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SMB细胞系培养 |
| 2.2.2 细胞裂解液的制备 |
| 2.2.3 脑组织匀浆的制备 |
| 2.2.4 脑组织蜡块的制备 |
| 2.2.5 RNA提取 |
| 2.2.6 设计引物 |
| 2.2.7 实时定量PCR |
| 2.2.8 数字PCR |
| 2.2.9 免疫印迹 |
| 2.2.10 免疫组织化学 |
| 2.2.11 免疫荧光 |
| 2.2.12 酶联免疫吸附 |
| 2.2.13 Luminex多重细胞因子检测 |
| 2.2.14 蛋白浓度测定 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 朊病毒感染啮齿动物脑组织中IP10、KC、M-CSF变化特征 |
| 3.1.1 朊病毒感染啮齿动物脑组织中天然免疫因子变化特征 |
| 3.1.2 朊病毒感染啮齿动物终末期脑组织中IP10、KC、M-CSF含量升高 |
| 3.1.3 朊病毒感染啮齿动物终末期脑组织中IP10、KC、M-CSF转录上调 |
| 3.1.4 朊病毒感染啮齿动物终末期脑组织中IP10、KC、M-CSF的分布特征 |
| 3.1.5 朊病毒感染过程中脑组织IP10、KC、M-CSF的动态表达水平 |
| 3.1.6 朊病毒患者脑脊液中IP10含量升高 |
| 3.2 朊病毒感染中IP10-CXCR3信号通路的特征性变化 |
| 3.2.1 朊病毒感染脑组织IP10与神经细胞的关系 |
| 3.2.2 CXCR3在朊病毒感染动物脑组织和细胞中的表达特征 |
| 3.2.3 朊病毒感染动物和细胞模型中CXCR3的转录特征 |
| 3.2.4 朊病毒感染动物脑组织中CXCR3的分布 |
| 3.2.5 CXCR3-IP10与PrPSc沉积的相关性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多种朊病毒感染动物模型脑组织中CXCL10、KC、M-CSF变化情况 |
| 4.2 CXCL10-CXCR3在朊病毒感染中的特征性变化 |
| 5 结论 |
| 5.1 筛选出朊病毒感染脑组织罕见细胞因子IP10、KC、M-CSF |
| 5.2 阐明朊病毒感染脑组织IP10/CXCR3与朊病毒病相关性 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一节 朊病毒疾病概述 |
| 第二节 朊病毒的发现与研究现状 |
| 第三节 朊蛋白N端研究现状 |
| 第四节 研究朊蛋白N端的意义及其创新点 |
| 第五节 本文实验流程概述 |
| 第六节 朊蛋白其它研究热点简介 |
| 第一章 N端重组突变体朊蛋白的构建及基于sPMCA的重组突变体朊病毒扩增能力比较 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第二章 N端CC1区突变型稳定细胞系的建立与基于细胞系的朊病毒感染能力比较 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第三章 朊病毒感染小鼠模型的建立与鉴定 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第四章 朊蛋白N端与脂质体的相互作用 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析与讨论 |
| 结论与展望 |
| 第一节 全文结论 |
| 第二节 未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）不同样本中诺如病毒核酸检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 诺如病毒 |
| 1.1.介绍 |
| 1.2. 基因和病毒结构 |
| 1.3. GII4基因型诺如病毒 |
| 2. 食源性病毒和水源性病毒 |
| 2.1. 介绍 |
| 2.2. 根据临床特点分类 |
| 2.3. 食源性和水源性诺如病毒 |
| 2.4. 诺如病毒的传播途径 |
| 3. 不同样本中诺如病毒检测 |
| 3.1. 临床样本、食品样本和水样本 |
| 3.2. 诺如病毒检测策略 |
| 3.3. 病毒分离 |
| 3. 本文关注的科学问题 |
| 第一部分 腹泻样本中诺如病毒检测方法实验室评价与应用 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验仪器 |
| 1.2. 常用试剂 |
| 1.3. 常用耗材 |
| 1.4. 实验病毒株 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 核酸提取 |
| 2.2. 病毒检测方法实验室评价 |
| 2.3. 诺如病毒检测方法在临床样本中的应用 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 病毒Realtime RT-PCR检测方法评估 |
| 3.2. 呼和浩特市诺如病毒分子流行情况 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 水中诺如病毒检测方法建立与应用 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验仪器 |
| 1.2. 常用试剂 |
| 1.3. 常用耗材 |
| 1.4. 实验病毒株 |
| 1.5. 常用溶剂的配置方法 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 细胞复苏、传代培养和冻存 |
| 2.2. MNV-1病毒培养和病毒滴定测定 |
| 2.3. 核酸提取 |
| 2.4. 病毒检测方法研究 |
| 2.5. 瓶装或桶装水中病毒浓缩 |
| 2.6. 大量水中病毒浓缩 |
| 2.7. 高通量测序 |
| 3. 结果 |
| 3.1. MNV-1 Realtime RT-PCR标准曲线建立 |
| 3.2. 瓶装和桶装水中病毒回收效果 |
| 3.3. Biotroy半自动微生物采集系统回收MNV-1效果评价 |
| 3.4. 饮用水中病毒回收 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 食品中诺如病毒检测方法优化与评估 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验仪器 |
| 1.2. 常用试剂 |
| 1.3. 常用耗材 |
| 1.4. 病毒毒株 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 模拟样本制备 |
| 2.2. 病毒洗脱 |
| 2.3. 二次浓缩 |
| 2.4. 直接RNA提取 |
| 2.5. 病毒检测 |
| 2.6. ISC-RT-qPCR检测NoVs |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 碳水化合物类食品中MNV-1回收效果 |
| 3.2. 脂肪、蛋白类食品中MNV-1回收效果 |
| 3.3. 食品中诺如病毒的回收效果 |
| 3.4. 基于受体捕获诺如病毒检测草莓中诺如病毒 |
| 4. 实验讨论 |
| 第四部分 贝类中病毒检测 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验仪器 |
| 1.2. 常用试剂 |
| 1.3. 常用耗材 |
| 1.4. 过程对照病毒MNV-1毒株制备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 贝类样本收集 |
| 2.2. 贝类样本处理 |
| 2.3. 贝类病毒的分离 |
| 2.4. 高通量测序 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 比较不同贝类中诺如病毒检测方法 |
| 3.2. 贝类中病毒宏基因组分析结果 |
| 3.3. 贝类中动物病毒基因组的分析结果 |
| 3.4. 贝类中胃肠炎疾病相关的病毒基因组分析 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）人工条件下鸡毛降解过程中真菌群落的动态变化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 角蛋白 |
| 1.1.1 角蛋白的结构与特性 |
| 1.1.2 角蛋白的降解方法 |
| 1.1.3 角蛋白的应用 |
| 1.2 角蛋白酶 |
| 1.2.1 角蛋白酶的定义与分类 |
| 1.2.2 角蛋白酶基因的分子生物学研究 |
| 1.2.3 产角蛋白酶的微生物 |
| 1.2.3.1 真菌 |
| 1.2.3.2 细菌 |
| 1.2.3.3 放线菌 |
| 1.3 真菌对角蛋白的降解机制 |
| 1.4 不同生境中真菌群落的变化 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.1.1 样品的制备 |
| 2.1.2 试验用具 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 试验试剂 |
| 2.1.5 乳酸石碳酸棉蓝染色液 |
| 2.1.6 培养基 |
| 2.1.7 本试验所用引物 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 土样真菌的分离 |
| 2.2.2 真菌的形态鉴定 |
| 2.2.3 真菌的分子鉴定 |
| 2.2.3.1 真菌的DNA提取 |
| 2.2.3.2 PCR扩增及测序 |
| 2.2.3.3 PCR产物的检测 |
| 2.2.3.4 序列数据处理及系统发育的分析 |
| 2.2.4 统计分析 |
| 2.2.4.1 相对多度 |
| 2.2.4.2 多样性指数分析 |
| 2.2.5 二代高通量测序 |
| 2.2.5.1 宏基因组DNA提取 |
| 2.2.5.2 PCR扩增及测序 |
| 2.2.5.3 数据处理 |
| 2.2.6 高效降解角蛋白真菌产酶条件的研究 |
| 2.2.6.1 孢子悬浮液的制备 |
| 2.2.6.2 粗酶液的制备 |
| 2.2.6.3 酶活力的测定 |
| 2.2.6.4 高效角蛋白降解菌液体发酵产酶的单因素优化 |
| 2.2.6.5 正交试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 添加富角蛋白基质土样中可培养真菌群落多样性分析 |
| 3.1.1 加入鸡毛粉不同时期医院绿地土真菌的群落组成差异 |
| 3.1.2 加入鸡毛粉不同时期医院绿地土真菌群落组成的多样性差异 |
| 3.1.3 富角蛋白的基质对病原真菌类群相对丰度的影响 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 基于高通量测序对添加富角蛋白基质土样中不同时期真菌群落组成的动态变化 |
| 3.2.1 加入鸡毛粉后医院绿地土壤相对丰度及群落组成发生明显变化 |
| 3.2.2 加入鸡毛粉后医院绿地土中一些潜在人体病原真菌的动态变化 |
| 3.2.3 鸡毛粉加入后医院绿地土真菌群落组成的α-多样性差异 |
| 3.2.4 富角蛋白基质对病原真菌类群相对丰度的影响 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 高效降解角蛋白真菌的鉴定及其产酶培养组分的优化 |
| 3.3.1 高效角蛋白降解真菌的鉴定 |
| 3.3.1.1 形态描述 |
| 3.3.1.2 分子鉴定 |
| 3.3.2 高效角蛋白降解菌液体发酵产酶的单因素优化 |
| 3.3.2.1 不同C源培养基对菌株1Y2-12产角蛋白酶活力的影响 |
| 3.2.2.2 不同N源培养基对菌株1Y2-12产角蛋白酶活力的影响 |
| 3.2.2.3 不同无机离子源培养基对菌株1Y2-12产角蛋白酶活力的影响 |
| 3.3.3 正交试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 添加富角蛋白基质土样中可培养真菌群落多样性分析 |
| 4.2 基于高通量测序对添加富角蛋白基质土样中不同时期真菌群落组成的动态变化 |
| 4.3 高效降解角蛋白真菌的鉴定及其产酶培养组分的优化 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 主要参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）日本乙型脑炎病毒感染介导血脑屏障通透性改变的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 黄病毒 |
| 1.2 日本乙型脑炎病毒 |
| 1.3 乙型脑炎病毒的病原学特点 |
| 1.4 乙型脑炎病毒的发病机制 |
| 1.5 乙型脑炎病毒入侵中枢神经系统 |
| 1.5.1 直接感染神经末梢途径 |
| 1.5.2 “特洛伊木马”式入侵途径 |
| 1.5.3 直接感染脑微血管内皮细胞途径 |
| 1.6 血脑屏障的破坏 |
| 1.6.1 病毒感染破坏BBB |
| 1.6.2 病毒诱导的因子破坏BBB |
| 1.6.3 与血脑屏障调控相关细胞因子和趋化因子 |
| 第二章 研究目的与意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒、质粒与小鼠 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验药品、抗体与试剂盒 |
| 3.1.4 试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞的复苏 |
| 3.2.2 JEV P3株的扩增与毒价测定 |
| 3.2.3 JEV感染小鼠 |
| 3.2.4 小鼠脑上清的获取 |
| 3.2.5 脑上清或病毒处理内皮细胞 |
| 3.2.6 细胞RNA和蛋白、组织样品提取 |
| 3.2.7 RNA的提取和浓度测定 |
| 3.2.8 RNA处理和反转录 |
| 3.2.9 细胞内JEV增殖情况分析 |
| 3.2.10 Western Blot |
| 3.2.11 HE染色与免疫组化(IHC) |
| 3.2.12 间接免疫荧光(IFA),激光共聚焦和SIM超分辨 |
| 3.2.13 BBB通透性检测 |
| 3.2.14 IP-10和IFN-γ中和实验 |
| 3.2.15 Transwell实验 |
| 3.2.16 原代神经元的培养 |
| 3.2.17 原代混合胶质细胞的培养 |
| 3.2.18 混合胶质细胞中星形胶质细胞的分离纯化 |
| 3.2.19 分离的星形胶质细胞流式分析 |
| 3.2.20 ELISA检测炎性因子的表达 |
| 3.2.21 Luminex测定炎性因子的表达 |
| 3.2.22 细胞核和细胞质蛋白的提取 |
| 3.2.23 xCelligence测定内皮细胞的屏障功能 |
| 3.2.24 手术器械的消毒 |
| 3.2.25 实验动物及废物无害化处理 |
| 3.2.26 实验动物伦理声明 |
| 3.2.27 数据的统计与分析 |
| 第四章 结果与分析 |
| 4.1 炎性因子是破坏血脑屏障的主要因素 |
| 4.1.1 JEV扩毒与病毒载量检测 |
| 4.1.2 JEV感染小鼠后血清和脑组织中病毒滴度检测 |
| 4.1.3 JEV感染与血脑屏障破坏之间的关系 |
| 4.1.4 炎性因子是破坏BBB的关键因素 |
| 4.2 IFN-γ能够破坏血脑屏障的完整性 |
| 4.2.1 中和IFN-γ对JEV感染小鼠的BBB具有保护作用 |
| 4.2.2 IFN-γ中和抗体通过减少紧密连接蛋白的降解来减轻BBB的破坏 |
| 4.2.3 IFN-γ中和抗体不影响JEV病毒在小鼠脑内的复制 |
| 4.3 中和IP-10对JEV感染小鼠的作用 |
| 4.3.1 中和IP-10对小鼠的BBB具有保护作用 |
| 4.3.2 IP-10中和抗体通过减少紧密连接蛋白的降解来保护BBB的完整性 |
| 4.4 星形胶质细胞是IP-10的主要来源 |
| 4.5 IP-10不影响bEnd.3内皮细胞的通透性 |
| 4.6 JEV感染小鼠产生的IP-10能够诱导TNF-α的表达 |
| 4.7 TNF-α介导紧密连接蛋白的下调和转位进而破坏BBB的完整性 |
| 4.8 IP-10通过其受体CXCR3介导TNF-α的表达 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 已发表论文 |
| 致谢 |
（9）朊病毒病患者脑脊液特异性tau蛋白ELISA方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 朊病毒病的主要特征 |
| 1.2 朊病毒的基本特征 |
| 1.3 Tau蛋白基本特征 |
| 1.4 检测朊病毒病的方法 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常用缓冲液及溶液 |
| 2.1.2 主要化学试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 实验使用抗体 |
| 2.1.5 神经细胞系及动物模型 |
| 2.1.6 CSF样本 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 GST tau-exon2/10蛋白的诱导表达 |
| 2.2.2 GST tau-exon2/10蛋白的纯化 |
| 2.2.3 纯化后GST tau-exon2/10蛋白的透析 |
| 2.2.4 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.5 免疫印迹方法检测蛋白含量 |
| 2.2.6 脑组织匀浆的制备 |
| 2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.8 细胞裂解液的制备 |
| 2.2.9 双抗夹心ELISA |
| 2.2.10 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GST tau-exon2/10重组蛋白诱导表达纯化 |
| 3.1.1 GST tau-exon2/10重组蛋白表达 |
| 3.1.2 GST tau-exon2/10重组蛋白纯化 |
| 3.1.3 GST tau-exon2/10重组蛋白鉴定 |
| 3.2 Tau蛋白外显子2和10单克隆抗体的制备及验证 |
| 3.2.1 单抗的制备及特异性评价 |
| 3.2.2 利用神经细胞模型验证制备的单抗 |
| 3.2.3 利用小鼠脑组织验证制备的单抗 |
| 3.2.4 制备的抗体敏感性检验 |
| 3.3 Tau蛋白外显子2和10双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 3.3.1 包被抗体的选择 |
| 3.3.2 包被抗体最佳工作浓度的选择 |
| 3.3.3 检测抗体最佳工作浓度的选择 |
| 3.3.4 实验条件的最终确立 |
| 3.4 建立的ELISA方法在朊病毒感染患者脑脊液中的初步应用 |
| 3.4.1 sCJD患者CSF中含外显子2和10的tau蛋白含量相对于non-CJD患者明显增高 |
| 3.4.2 T188K突变gCJD患者CSF中含外显子2和10的tau蛋白含量高于non-CJD |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于不同信号放大策略的朊蛋白电化学免疫传感研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 电化学生物传感器 |
| 1.1.1 电化学生物传感器概述 |
| 1.1.2 电化学生物传感器原理 |
| 1.1.3 电化学生物传感器类别 |
| 1.2 电化学免疫传感器 |
| 1.2.1 电化学免疫传感器分类 |
| 1.2.2 抗原-抗体固定方法 |
| 1.3 电化学免疫传感器中的信号扩增技术 |
| 1.3.1 纳米材料信号放大 |
| 1.3.2 酶催化信号放大 |
| 1.4 朊蛋白 |
| 1.4.1 朊蛋白发现 |
| 1.4.2 朊病毒疾病简介 |
| 1.4.3 朊病毒的致病机理 |
| 1.4.4 朊病毒疾病检测研究进展 |
| 1.5 电化学免疫传感器的未来发展趋势和展望 |
| 1.6 本课题选择的意义和内容 |
| 第2章 基于聚β-环糊精/金纳米粒子修饰电极的朊蛋白电化学免疫传感器研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验药品 |
| 2.2.3 电极预处理和BSA/Ab/Pβ-CD/AuNPs/GCE的制备 |
| 2.2.4 朊蛋白电化学测试 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 修饰电极的表征 |
| 2.3.2 传感器的可行性分析 |
| 2.3.3 实验条件优化 |
| 2.3.4 朊蛋白(PrPC)浓度检测 |
| 2.3.5 选择性、重现性和稳定性分析 |
| 2.3.6 回收率 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 基于杂交链式反应hemin/G-quadruplex DNA仿酶的朊蛋白电化学免疫传感器研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 Ab2-S0 的制备 |
| 3.2.4 修饰电极的制备 |
| 3.2.5 朊蛋白(PrPC)检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 修饰电极的表征 |
| 3.3.2 免疫传感器的电化学表征 |
| 3.3.3 PrPC传感器的可行性分析 |
| 3.3.4 实验条件优化 |
| 3.3.5 朊蛋白(PrPC)浓度检测 |
| 3.3.6 回收率 |
| 3.3.7 选择性、重现性和稳定性分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于杂交链式反应和hemin/G-quadruplex催化沉淀反应的朊蛋白电化学免疫传感器研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 Ab2-DNA1 的制备 |
| 4.2.4 修饰电极的制备 |
| 4.2.5 朊蛋白(PrPC)检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 修饰电极的表征 |
| 4.3.2 PrPC传感器的可行性分析 |
| 4.3.3 实验条件优化 |
| 4.3.4 朊蛋白(PrPC)浓度检测 |
| 4.3.5 选择性和重现性分析 |
| 4.3.6 回收率 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 基于聚亚甲基蓝/金纳米粒子及适配体的朊蛋白电化学免疫传感器研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 PMB-AuNPs材料的制备 |
| 5.2.4 电化学免疫传感器的组装 |
| 5.2.5 朊蛋白(PrPC)检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 修饰电极的表征 |
| 5.3.2 PrPC传感器的可行性分析 |
| 5.3.3 实验条件优化 |
| 5.3.4 朊蛋白(PrPC)浓度检测 |
| 5.3.5 选择性、重现性和稳定性分析 |
| 5.3.6 回收率 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 基于聚合物-染料/金纳米粒子复合物及适配体的朊蛋白电化学免疫传感器研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 PPP-MB-AuNPs材料的制备 |
| 6.2.4 电化学免疫传感器的组装 |
| 6.2.5 朊蛋白(PrPC)检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 修饰电极的表征 |
| 6.3.2 PrPC传感器的可行性分析 |
| 6.3.3 实验条件优化 |
| 6.3.4 朊蛋白(PrPC)浓度检测 |
| 6.3.5 选择性、重现性和稳定性研究 |
| 6.3.6 回收率 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 基于杂交链式反应和生物小分子结合的朊蛋白电化学免疫传感器研究 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验部分 |
| 7.2.1 实验仪器 |
| 7.2.2 实验试剂 |
| 7.2.3 Ab2-S0 和信号探针的制备 |
| 7.2.4 电化学免疫传感器的组装过程 |
| 7.2.5 朊蛋白(PrPC)检测 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 探针的UV-vis谱图 |
| 7.3.2 修饰电极的表征 |
| 7.3.3 PrPC传感器的可行性分析 |
| 7.3.4 实验条件优化 |
| 7.3.5 朊蛋白(PrPC)浓度检测 |
| 7.3.6 选择性、重现性和稳定性研究 |
| 7.3.7 回收率 |
| 7.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间发表及完成的论文目录 |
| 致谢 |
四、日本研究发现对朊病毒有极强灭活能力的蛋白酶（论文参考文献）
- [1]纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究[D]. 丁铭宣. 吉林大学, 2021(01)
- [2]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [3]不同山羊品种朊蛋白基因多态性及其与血液免疫性状的关联分析[D]. 郭茂森. 山东农业大学, 2020(11)
- [4]朊病毒感染脑组织低丰度细胞因子筛选及其与朊病毒病相关性初探[D]. 陈嘉. 黑龙江八一农垦大学, 2020(08)
- [5]朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系[D]. 张祥毅. 华东师范大学, 2020
- [6]不同样本中诺如病毒核酸检测方法的研究[D]. 李慧莹. 中国疾病预防控制中心, 2019(02)
- [7]人工条件下鸡毛降解过程中真菌群落的动态变化[D]. 沈鑫. 贵州大学, 2019(09)
- [8]日本乙型脑炎病毒感染介导血脑屏障通透性改变的机制研究[D]. 王珂. 华中农业大学, 2019
- [9]朊病毒病患者脑脊液特异性tau蛋白ELISA方法的建立及初步应用[D]. 严普. 黑龙江八一农垦大学, 2019(09)
- [10]基于不同信号放大策略的朊蛋白电化学免疫传感研究[D]. 李小雨. 湖南大学, 2019(07)