一、不同引物在血液PCR筛选HBV转基因小鼠中效果评价(论文文献综述)
曹韪凡[1](2020)在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中研究说明近年来,嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤(natural killer,NK)细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
孙瑶[2](2020)在《以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究》文中指出阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性发展的神经退行性疾病,是当代社会中老年人口中最常见的痴呆形式。AD的神经病理学特征包括由淀粉样蛋白(Aβ)形成的细胞外斑块、过度磷酸化微管相关蛋白(tau)积累形成的细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和广泛的神经元丢失。长久以来,“淀粉样蛋白级联假说”认为Aβ肽的异常积累是AD发病的关键。然而,迄今为止,集中于减少Aβ沉积的Aβ免疫疗法均未产生临床上有意义的结果。因此,单纯通过消除Aβ病理学不足以达到治愈AD的效果,而开发靶向tau病理学的治疗手段也成为了一种非常有潜力的治疗策略之一。Tau蛋白是哺乳动物神经系统中的一种主要的微管相关蛋白(由microtubule-associated protein(MAPT)基因编码),在生理条件下调节微管的组装和稳定性以及轴突运输。然而,在病理生理条件下,在AD和相关的病理性疾病(包括皮质基底变性(CBD),进行性核上麻痹(PSP),Pick病(PD)和额颞叶痴呆(FTLD))中,大量毒性表位的tau出现了异常高水平的磷酸化,如Ser202、Thr205、Ser238、Ser404等。MATP基因编码缺陷和tau蛋白过度磷酸化引起的疾病统称为tau蛋白病。迄今为止,散发性tau病中tau蛋白过度磷酸化的主要原因仍不确定。在家族性tau蛋白病患者中,已经鉴定出的包括G272V,P301L,P301S,V337M和R406W在内的遗传突变,易使tau蛋白过度磷酸化,从而损害了tau促进微管组装的能力。这些突变促进tau的聚集,形成成对的螺旋丝(PHF)和神经原纤维缠结(NFT)。为了研究tau病理在体内的病理过程和开发基于tau病理的药物,科学家们开发了一系列表达人突变tau基因的模型动物。这些tau转基因小鼠模型具有一些重要的AD病理特征,包括突触病理学、NFT形成和神经元丢失,已经成为探索tau功能障碍的机制和开发神经退行性疾病疗法的重要工具。其中TauP301S(PS19系)就是一种被广泛使用的阿尔茨海默tau病理小鼠模型。P301S转基因小鼠脑内人源tau蛋白表达水平比内源性tau小鼠高约5倍,从而导致P301S小鼠在脑内快速产生较为严重的tau病。P301S转基因小鼠在6月龄时产生tau纤维并逐渐发育,其在9-12月龄是逐渐富集并伴有明显的神经元死亡和脑萎缩。除此之外,tau转基因小鼠也存在肌肉萎缩和运动功能失调等行为学异常。然而,虽然目前P301S小鼠被广泛应用于AD药物的临床前评价中,普遍采用行为学和病理学等实验对药物的有效性进行评价,但对该小鼠模型的行为学、病理学、血清学等指标随年龄变化的趋势以及他们之间的关系知之甚少。另外,在老年痴呆疾病的流行病学研究中发现,男性和女性人群的AD发病率、发病症状、生存期等方面存在明显差异,但性别差异在以P301S小鼠为模型的药物研究中并未受到关注。在本研究中,我们首先系统地考察了不同性别和年龄的Tau P301S转基因小鼠在行为学、tau病理学、以及血浆和脑生物标志物方面的差异,并探究了tau蛋白病进程中这些因素之间的相关性,也筛选到了一些可以指示P301S小鼠tau病理发展的潜在的生物标记物指标。结果表明,与野生型同窝小鼠相比,雄性P301S转基因小鼠在体重、存活率、后肢夹紧评分、脊柱后凸评分、复合表型评分总分、筑巢能力、脑中pTau(S202/T205)和胶质细胞水平方面表现出显着变化。相比之下,雌性P301S转基因小鼠仅对水迷宫实验和实验开放旷场实验敏感。此外,我们发现了血浆中巨噬细胞炎症蛋白(MIP-3α)缺乏和干扰素(IFN-γ)、白介素-5(IL-5)、IL-6上调,这些因子可以作为潜在的AD生物标志物。目前靶向磷酸化tau的主动免疫疗法是新型的AD治疗方法。然而现在处于临床前或临床阶段的Tau表位疫苗最多携带两个磷酸化位点,治疗效果有限。主动疫苗如何在体内维持高水平、长时程的抗体也有待探究。另外,疫苗的作用机制也未得到深入研讨。为解决这些问题,我们研发了一种以诺如病毒P颗粒为载体的靶向磷酸化tau病理位点的主动疫苗,并在P301S小鼠中进行免疫原性、安全性和有效性的评估。为了筛选出最优的tau疫苗的磷酸化表位,我们对AD患者中最易出现高度磷酸化tau位点的附近的截短的多肽进行组合,并筛选出了具有Ser202、Thr205、Ser396、Ser404磷酸化靶点的pTau31多肽抗原表位,该多肽可在在体内诱导产生针对四种磷酸化表位的特异性抗体,且不会产生针对磷酸化和非磷酸化tau蛋白的T细胞免疫反应。随后,我们将合成的pTau31多肽通过半胱氨酸/空气氧化法偶联到诺如病毒P颗粒蛋白载体上,成功获得以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗,PP-pTau31。我们在几种候选佐剂中筛选了能引起高抗体水平的、诱导的抗体持续时间长且无T细胞免疫反应风险的CpG和AS02佐剂组合用于主动疫苗的免疫。我们在P301S转基因小鼠中对PP-pTau31疫苗的免疫原性、安全性和有效性等方面进行考察。结果显示,PP-pTau31疫苗可成功降低P301S小鼠脑内磷酸化tau蓄积、降低脑内胶质细胞增生、缓解tau相关的运动功能障碍及改善认知水平,且不会诱发针对磷酸化和非磷酸化tau的T细胞免疫反应、无体内炎症因子和趋化因子异常,无脏器毒性。另外,我们还对PP-pTau31疫苗诱导的抗体的作用机制进行了探讨。结果表明,pTau31特异性抗体可能通过多种途径降低tau病理的影响:(1)血液中抗体通过结合血中游离的pTau造成血/脑中pTau浓度差,促进脑内病理tau蛋白外排入血,从而降低脑中磷酸化tau蛋白含量;(2)部分血液中的抗体跨越血脑屏障,结合脑中游离的病理tau蛋白,抑制其对神经元的毒性作用;(3)部分血液中的抗体跨越血脑屏障,与脑中的NFT结合形成抗体-抗原复合物,使其降解从而降低tau病理。综上,我们成功完成对TauP301S转基因鼠的行为学、病理学、血清学等方面的研究,掌握了各指标与发病进程的相关性,并发现了MIP-3α等潜在的生物标志物。在此基础上,我们也完成了一种以诺如病毒P颗粒为载体的Tau表位疫苗的开发,PP-pTau31。结果表明该疫苗可在TauP301S模型小鼠中产生高水平、长时间存在的pTau特异性抗体,在行为学、病理学等方面降低发病特征,并无T细胞免疫反应、细胞因子异常及脏器损伤等安全风险。
张骏[3](2020)在《羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备及其抗肝细胞癌研究》文中进行了进一步梳理目的:肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率排在世界第五位,是世界第三高死亡率的肿瘤。目前有多种HCC治疗方案,但是全球HCC患者5年生存率仍然低于5%,其主要原因是手术切除术、化学疗法通常会有严重的副作用。因此,迫切需要寻找和研究出一种安全有效的新药物或药物传递系统来改善以上的弊端,从而到达预防和治疗HCC的目的。国内外研究报道狼毒、京大戟、蒲公英等中药对多种肿瘤模型具有显着抑制作用,而越来越多的研究表明中药中的单体成分(雷公藤红素、斑蝥素)对肿瘤性疾病具有一定的治疗作用。羽扇豆醇是狼毒、京大戟、蒲公英等中药中的主要化学成分,大量研究证实羽扇豆醇在多种肿瘤细胞系和癌症模型中发挥了显着的抗肿瘤作用。但是,由于羽扇豆醇存在不溶于水,生物利用度低等缺点,从而限制了其开发使用。因此,需要一种新型药物载体改善其作用性质以及它的靶向性。本课题首先构建一个具有肝靶向性长循环能力的羽扇豆醇脂质体,然后作用于HepG2细胞研究该制剂的靶向性以及肿瘤相关的蛋白信号通路,最后利用SB(睡美人转座子)介导的高压尾静脉注射转染AKT/c-Met诱导的小鼠HCC模型作为实验动物模型,进一步验证最佳剂量下的羽扇豆醇肝靶向长循环脂质体的抗肿瘤能力、靶向能力及其分子机制。本课题为羽扇豆醇给药系统研究提供新思路,同时为基因转染建立的小鼠原位肝细胞癌模型应用于靶向给药体内药效学评价提供新的依据。方法:1.采用HPLC建立羽扇豆醇含量测定的方法;采用超滤离心法、过膜法以及鱼精蛋白沉淀法进行筛选适合羽扇扇豆醇脂质体包封率测定的方法;以包封率为评价指标,考察适合脂溶性药物的脂质体制备方法;采用单因素试验法筛选影响羽扇豆醇普通脂质体的因素,为后续羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备工艺提供参考。2.以包封率和粒径为评价指标,采用正交试验法,考察主要影响因素对羽扇豆醇肝靶向脂质体制备工艺的影响,优选最佳制备工艺;考察不同的冻干保护剂对羽扇豆醇脂质体包封率和粒径的影响,优选最佳冻干保护剂;采用TEM、SEM观察脂质体的形态,动态光散射法测粒径、PDI、ZETA电位;采用透析的方法考察游离羽扇豆醇、羽扇豆醇脂质体、羽扇豆醇肝靶向脂质体的体外释放行为,并对体外释放进行模拟方程拟合;以包封率和粒径为评价指标,考察游离羽扇豆醇、羽扇豆醇脂质体、羽扇豆醇肝靶向脂质体的稀释稳定性、长期稳定性以及血浆稳定性。3.体外靶向性研究中,采用流式细胞仪检测相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂对HepG2细胞摄取效果来进行定性研究;采用HPLC检测相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂在HepG2细胞中的摄取量来进行定量研究;体内靶向性研究,采用活体成像仪进行检测相同剂量不同剂型的制剂在FVB小鼠体内各脏器的分布情况。4.采用HPLC对相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂在SD大鼠中不同时间点的血药浓度进行检测,平均血药浓度-时间数据用DAS3.0软件以非房室模型进行统计矩拟合分析。5.体外药效学评价中,采用CCK8法测定相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对HepG2细胞生存率的影响;采用流式细胞仪检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对细胞凋亡、周期的影响;采用Western blot检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对HepG2细胞AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。6.采用高压尾静脉转染技术,在FVB/N小鼠肝脏内同时过表达AKT(带有HA-Tag)和c-Met(带有V5-Tag)进行肝细胞癌模型造模,研究相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的小鼠肝脏外观、肝脏重量、病理学组织的影响;采用qPCR检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠肝癌标志物的影响;采用Western blot检测相同剂量的不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的小鼠AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路相关蛋白的表达的影响。结果:1.建立了羽扇豆醇的HPLC含量测定方法;羽扇豆醇在氯仿中的溶解度最高,在水中不溶;最终确定过膜法为羽扇豆醇脂质体包封率的测定方法,薄膜分散法为羽扇豆醇脂质体的制备方法;通过单因素试验法确定了影响羽扇豆醇脂质体制备工艺最大的因素是药脂比、磷胆比、PEG2000-DSPE。2.通过正交试验工艺考察,包封率为考察指标,最终确定羽扇豆醇肝靶向脂质体最佳制备工艺为磷胆比7:1,药脂比1:10,Gal-PEG-DSPE在处方中的质量百分比为10%;以包封率和粒径为评价指标,选择蔗糖为冻干保护剂时所有比例粒径和包封率均在合格范围内,且在15%的质量百分比的时候包封率最高,最终确定加入处方质量比15%的蔗糖为冻干保护剂;释放度考察中游离羽扇豆醇(Free Lupeol)在10h内释放了接近70%,而羽扇豆醇脂质体(Lupeol-L)、羽扇豆醇肝靶向脂质体(Gal-Lupeol-L)在10 h内只释放了大约40%,动力学拟合后发现Free Lupeol的释放符合一级动力学方程,Lupeol-L、Gal-Lupeol-L的释放符合Weibull方程;稀释稳定性考察结果表明羽扇豆醇脂质体在稀释20倍的条件下比较稳定,长期稳定性考察结果表明羽扇豆醇冻干脂质体在4℃冰箱存放6个月是稳定的,溶血性考察结果表明Free Lupeol有轻微溶血,而Lupeol-L、Gal-Lupeol-L不溶血。3.体外靶向定性研究结果表明靶向组的摄取强度要高于游离药物组和非靶向药物组,定量研究结果表明Gal-Lupeol-L是游离Lupeol摄取量的1.65倍,是Lupeol-L摄取量的1.17倍(P<0.05);体内靶向性研究结果表明Gal-NR-L组在小鼠肝脏部位的荧光一直持续到24h,而游离NR和NR-L组的小鼠在肝脏部位的荧光5 h时基本消失。4.药动学研究结果表明羽扇豆醇靶向组的药时曲线下面积约为游离药物组的3倍;羽扇豆醇靶向组的平均滞留时间MRT和血浆半衰期T1/2分别约为游离药物组的2.36倍和3.21倍。5.Free Lupeol、Lupeol-L、Gal-Lupeol-L作用于HepG2细胞24 h、48 h的IC50值分别为163μM、126μM、87μM,122μM、82μM、61μM;Free Lupeol、Lupeol-L、Gal-Lupeol-L的凋亡率分别为4.3%、8.73%、18.51%,Gal-Lupeol-L可以阻滞HepG2细胞于G2/M期;与Free Lupeol组相比,Gal-Lupeol-L组处理后的HepG2细胞AKT/mTOR相关蛋白(p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、FASN)、Ras/MAPK通路下游的主要效应分子p-ERK1/2表达以及肿瘤增殖标志物PCNA表达也都显着降低。6.成功制备了高压尾静脉转染AKT、c-Met质粒共表达的肝细胞癌模型,Gal-Lupeol-L给药组小鼠的肝脏指数和肝脏重量较游离组明显减轻(P<0.05);Gal-Lupeol-L组相较Free Lupeol组的小鼠肝脏肝小叶结构更为清晰,空泡减轻的更为明显,胞浆更加丰富;与Free Lupeol和Lupeol-L组相比,Gal-Lupeol-L给药后的小鼠肝脏AFP、GPC3、Epcam的mRNA表达水平降低的更为明显(P<0.01);与Free Lupeol处理组相比,Gal-Lupeol-L组处理后的AKT/c-MET诱导的HCC小鼠的AKT/mTOR相关蛋白(p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、FASN)、Ras/MAPK通路下游的主要效应分子p-ERK1/2表达以及肿瘤增殖标志物PCNA表达降低的更为明显。结论:成功的制备了包封率高、粒径小于200 nm的肝靶向羽扇豆醇脂质体;相较于游离羽扇豆醇和非靶向羽扇豆醇脂质体,它在体外和体内都具有更好的靶向性;在药动学方面,羽扇豆醇肝靶向脂质体在体内的平均滞留时间MRT和血浆半衰期T1/2都要优于游离羽扇豆醇;羽扇豆醇肝靶向脂质体在体外对HepG2细胞显示出比较好的细胞毒性、凋亡效率,对AKT/c-Met通路相关蛋白表达降低的效果更好;羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠具有一定的抗肿瘤作用并且相关通路抑制作用相较于游离羽扇豆醇和非靶向羽扇豆醇脂质体更好。
温灿[4](2019)在《高效持久清除乙肝病毒的新型抗体研究》文中研究指明单克隆抗体因其与抗原结合具有高度特异性与强亲和力,已成为抗体药物研发的主要类型。但随着研究的深入,它的诸多缺陷如与抗原结合次数有限、带来非预期的抗体清除效应和抗原累积效应等缺陷也浮出水面。研究热点不再局限于天然抗体的筛选,而是通过改造提升抗体药物的药效。利用基因工程改造以提高抗体与抗原的结合次数,延长抗体半衰期是近年来研究的重点。本研究拟通过对两株抗HBV抗体进行pH依赖抗原结合和Fc的双重改造,获得能够延长体内半衰期的清道夫抗体。主要研究内容包括以下四部分:第一,pH依赖抗原结合改造抗体库的构建、筛选与检测。本研究综合三维结构模拟及合理库容的考虑,最终确定了24或26个组氨酸突变位点。利用噬菌体展示构建了氨基酸组合突变噬菌体抗体库,经过3或4轮筛选获得共5株可变区改造抗体。在pH 7.4时,这5株噬菌体抗体能保持与亲本相当的强抗原结合活性,在pH 6.0时则与抗原呈现弱结合的特点。第二,抗体的表达、纯化和功能评估。构建真核表达载体,在FreeStyleTM 293F细胞中表达5株改造抗体并纯化,进行性质鉴定及功能评估。5株抗体仍能保持中性环境下与亲本相当的抗原结合活性,但酸性环境下与抗原弱结合。利用HBV转基因鼠,对pH依赖抗原结合改造抗体进行体内效果评估。pH依赖抗原结合变体在保持与亲本相当抗原清除效果的同时,较亲本有0.5倍动物体内抗原抑制作用时间的延长。第三,清道夫抗体的构建及细胞水平的功能评估。1)将两株HBV清除效果好的pH改造改造变体进行Fc区段的改造,即V4突变(M252Y、N286E、N434Y,加强中性条件下与hFcRn亲和力)。利用稳定表达带EGFP的hFcRn的MDCK细胞株进行体外细胞吞噬效果评估,结果和亲本抗体相比,带有V4改造的清道夫抗体能显着促进MDCK细胞吞噬HBsAg。2)将一株pH依赖抗原结合改造抗体进行Fc区段的改造,即DY突变(K326D、D328Y,加强中性条件下与mFcγRⅡ亲和力),利用 THP-1和鼠原代巨噬细胞进行体外细胞吞噬效果评估。带有DY改造的清道夫抗体较亲本可以明显促进两种巨噬细胞吞噬HBsAg。第四,清道夫抗体在动物模型中的功能评估。利用HBV腺相关病毒感染稳定表达hFcRn的转基因小鼠,HBV转基因鼠,评估清道夫抗体的功能。结果显示带V4突变的清道夫抗体具有与亲本抗体相同的抗原清除效果,同时具有更长的抑制时间(约1倍以上的延长)。带DY突变的清道夫抗体在抗原清除能力上比亲本抗体强一个数量级以上且有12 d抗原抑制时间的延长。总之,本研究获得的清道夫抗体较亲本抗体有显着加强了抗原清除效率和延长了抗原抑制时间,具有成为HBV二代治疗性抗体的潜力,对慢乙肝的治疗具有深远的影响。
吕鹏[5](2019)在《胞外囊泡作为纳米载体用于靶向给药的初步研究与应用》文中认为细胞外囊泡(EVs)是几乎所有的细胞均可分泌的膜囊泡。EVs包括凋亡小体、微泡和外泌体。EVs的释放在正常的生理条件下起到细胞与细胞之间信息交流传导,物质如蛋白质、核酸等的运输作用,在病理条件下参与多种疾病,如癌症、心血管疾病等的发生发展,并起到推动重要作用。EVs能够穿越机体的多种生理屏障(例如血脑屏障BBB),传播到体液并到达远处组织。由于EVs在血液循环中有良好稳定性、生物相容性和极低的免疫原性,以及固有的靶向能力,EVs已经成为理想的纳米药物载体工具,并成为当今药物载体领域的研究热点。以往的研究表明,EVs作为纳米药物载体的优势已经相当显着,但是EVs具有这些优势的具体分子机制仍需进一步阐明。同时,制备具有靶向递送能力的EVs,以及拓展EVs在载药方面的应用,对EVs的临床转化具有重要的推动作用。本论文中,我们结合蛋白质组学技术从蛋白质冠的角度阐明了 EVs作为药物载体的优势,并利用基因工程改造技术使EVs具备靶向能力,同时利用基因工程改造的EVs装载大分子生物颗粒—溶瘤腺病毒颗粒,来拓展EVs在药物递送和癌症治疗方面的应用,也为EVs的临床转化起到很好的推动作用。本论文主要内容概括如下:1.第一章,我们归纳了胞外囊泡(EVs)作为药物载体的研究现状,并且对胞外囊泡的纯化方法进行了详细介绍,对胞外囊泡装载纳米药物的制备方法进行了考察,同时总结了载药EVs在疾病的临床诊断和治疗的研究现状。根据以上内容,我们确定了本研究课题的研究方向。2.第二章,我们总结了本论文中用到的实验方法和技术。本研究主要是以生物学技术为主要技术手段,实验技术和方法具有相似性,特总结于此。3.第三章,我们采用蛋白质组学的方法,从EVs与机体的血液蛋白相互作用方面作为出发点,研究EVs在体液循环中形成的蛋白质冠(protein corona,PC),并对其进行生物信息学分析,探讨EVs作为纳米药物载体在血液循环中稳定性强、生物相容性好以及免疫原性低的相关分子机制,并进一步挖掘其中关键蛋白,作为后续EVs的进一步应用奠定了理论基础,进一步地为EVs的临床转化起到很好的推动作用。4.第四章,我们研究了一种以EVs为基础的新型生物大分子药物递送系统(BCMNs)。该系统通过在EVs表面修饰靶向配体,使得EVs具备靶向特定组织器官,甚至特定细胞的能力。进一步的,将生物大分子纳米颗粒—溶瘤腺病毒颗粒(Oncolytic Adenovirus,OA)装载进 BCMNs,制备了 OA@BCMNs 纳米结构。发现BCMNs能够帮助溶瘤病毒OA逃避机体中和抗体的中和作用。同时,具有靶向作用的BCMNs能够增强溶瘤病毒OA在特定部位(如肿瘤组织)的富集,进一步地增强溶瘤病毒OA的癌症治疗效果。该系统成功地将生物大分子纳米颗粒进行靶向递送,拓展了 EVs的应用范围。
涂淮[6](2017)在《补肾清毒法对HBV转基因小鼠先天免疫的作用观察》文中研究说明目的:本文通过研究慢性乙肝病毒感染影响先天免疫的两个主要途径:Toll样蛋白受体、RIG-I样受体介导的信号通路,从分子水平探讨先天免疫在HBV转基因小鼠的作用途径,阐明补肾清毒法治疗乙型肝炎病毒可能的机制和作用靶点,探寻慢性乙型肝炎与"肾虚邪伏"病机的科学依据,为补肾清毒法治疗慢性乙型肝炎提供新的思路。方法:将50只HBV转基因小鼠分为五组:补肾清毒汤高、中、低剂量三组,西药组,模型对照组,另取10只正常小鼠做对照组。在SPF级动物房饲养60天后采取肝脏组织,提取肝脏细胞总RNA,逆转录为cDNA,在ABI 7500实时荧光定量基因扩增仪进行相对定量PCR扩增,以GAPDH作为内标基因,采用△△CT方法进行数据分析,比较Toll样蛋白受体、RIG-I样受体介导的信号通路相关分子在各组中的表达情况。结果:1.模型对照组与正常小鼠Toll样蛋白受体、RIG-I样受体介导信号通路的相关分子表达情况:模型对照组与正常小鼠相比,Toll样蛋白受体(TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-8、TLR-9)mRNA表达相近,差异无统计学意义(P&0.05)。模型对照组与正常小鼠相比,RIG-Ⅰ样受体中RIG-ImRNA表达升高,MDA5mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);IPS-1mRNA表达相近,差异无统计学意义(P>0.05)。模型对照组与正常小鼠相比,效应因子中INF-α、INF-β、TNF-α、TGF-β、IL-6表达相近,差异无统计学意义(P>0.05);MCP-1、IL-1β表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.补肾清毒汤对HBV转基因小鼠Toll样蛋白受体、RIG-I样受体介导信号通路的相关分子表达情况的影响:补肾清毒汤低、中、高剂量组和西药组与模型对照组相比,TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-9mRNA表达相近,差异无统计学意义(P>0.05);补肾清毒汤中剂量组与模型对照组相比,TLR-8 mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。补肾清毒汤中剂量组、高剂量组RIG-I mRNA与模型对照组相比,表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且随着补肾清毒汤剂量升高,RIG-ImRNA呈下降的趋势;补肾清毒汤低、中、高剂量组与模型对照组相比,MDA5 mRNA表达相近,差异无统计学意义(P>0.05)。西药组与模型对照组相比,MDA5 mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。补肾清毒汤低、中、高剂量组与模型对照组相比,IL-1β、MCP-1mRNA表达均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.HBV转基因小鼠肝损害与Toll样蛋白介导的信号通路无关;补肾清毒汤也不影响Toll样蛋白受体表达。2.补肾清毒汤可降低HBV转基因小鼠效应因子IL-1β、MCP-mRNA表达,是补肾清毒汤治疗乙型肝炎的作用靶点之一。3.RIG-I可能通过炎症小体信号通路生成IL-1β、MCP-1,导致HBV转基因小鼠肝损害;补肾清毒汤调节先天免疫的作用机制可能是通过调节这条信号通路,降低炎症反应来实现的。4.基于"肾虚邪伏"病机创立的补肾清毒法治疗HBV转基因小鼠可能不是通过直接杀灭病毒,而是通过改善机体的免疫功能,降低炎症反应,达到保护肝脏的目的。为补肾清毒法治疗慢性乙型肝炎提供科学的依据和新的思路,对临床具有指导意义。
赵月[7](2014)在《人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究》文中指出乙型肝炎(HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种以肝脏损伤为主要特征的严重危害人类健康的传染病之一。由于HBV具有严格的宿主特异性,因而缺乏理想的细胞模型或动物模型,从而阻碍了HBV的研究。本研究采用人源HBV对沙鼠和C57BL/6小鼠进行感染试验,目的在于探讨人源HBV能否引起小鼠感染,并探讨小鼠作为研究HBV传播和致病机制的动物模型的可能性。本研究选取沙鼠和C57BL/6小鼠用作人源HBV阳性血清的人工感染试验动物,采用ELISA、PCR、Real-time PCR、免疫组织化学和Western blot等方法对人源HBV感染后沙鼠和C57BL/6小鼠的血清、粪便和肝脏等组织进行HBV相关病原和抗体的检测,来探讨HBV在沙鼠和C57BL/6小鼠体内的感染情况,并通过沙鼠和C57BL/6小鼠体内细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的定位和表达,初步揭示HBV感染致肝细胞损伤的机制。研究结果如下:1、人源HBV感染沙鼠后1d,在肝脏和肾脏组织中可检测到HBV DNA;感染后2d和4w,只在肝脏中检测到HBV DNA。感染C57BL/6小鼠后1d,肝脏中可检测到HBV DNA。在血清、粪便、脑组织和唾液腺中,未能检测到HBV DNA。血清ELISA检测结果表明,在感染后1w内,HBsAg和HBeAg在小鼠血清中呈一过性出现;感染后1w,在沙鼠和C57BL/6小鼠的血清中均可检测到HBsAb和HBcAb,而且HBsAb能够在整个试验过程中持续性在血清中被检测到。肝脏组织中HBV相关抗原免疫组化染色结果表明沙鼠和C57小鼠感染人源HBV后肝脏中可检测到抗原阳性信号,且强度随感染时间的延长而增强。Western blot检测发现在感染后7d沙鼠肝脏中HBV抗原PreS1蛋白有明显的表达。2、沙鼠和C57BL/6小鼠感染人源HBV后均出现明显的组织病理学变化,呈现典型的病毒性肝炎的病理学变化。主要表现为肝窦扩张、淤血,肝细胞胞浆疏松、颗粒变性,汇管区淋巴细胞浸润和胆管增生等,病变程度随感染时间的延长而显严重。电镜观察发现,试验组小鼠肝细胞结构松散,内质网扩张,线粒体出现严重肿胀、空化。肾小管.上皮细胞胞质疏松,线粒体肿胀、嵴消失,内质网囊泡化,可见髓鞘样小体,胞浆内可见病毒包涵体,胞核内可见病毒样粒子。3、肝脏组织中增殖与修复相关蛋白免疫组化染色结果表明HBV感染后,沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中PCNA和HSP70蛋白在体内表达出现先升高后下降的趋势,攻毒后蛋白表达显着高于对照组(P<0.05),表明HBV感染后机体出现了相应的抗损伤机制来减少损害。4、细胞凋亡相关分子的免疫组化染色结果表明感染后沙鼠和C57BL/6小鼠体内Bax、Bcl-2、 Caspase-3和Fas/FasL的表达量均有不同程度的升高,显着高于对照组(P<0.05),表明HBV感染后细胞凋亡的线粒体途径被激活,细胞凋亡在HBV感染导致肝细胞损伤的机制中发挥了重要作用。5、内质网应激(ERS)相关分子免疫组化染色结果表明感染后沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中GRP78、CHOP、JNK及Caspase-12的表达均显着高于对照组(P<0.05)。Western blot结果也证实感染后肝脏ERS相关分子的表达量较对照组均有所升高。ERS相关蛋白表达量的升高表明HBV感染后启动了内质网应激反应,促进了肝细胞的凋亡。6、对沙鼠肝脏线粒体DNA不同区域基因序列扩增,观察、分析比较了人源HBV感染8w后,沙鼠肝脏线粒体DNA水平的变化,发现人源HBV感染后在沙鼠肝脏线粒体DNA的D-loop、 CytB和CytC三个区域均出现了一个碱基位点的改变,这些改变可能与线粒体结构或功能的变化相关。上述研究结果表明,人源HBV感染可引起沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织发生明显的病理损伤和炎症反应,采用PCR、血清ELISA和肝脏免疫组织化学检测在感染鼠体内检到HBV DNA及其相关抗原的存在,HBV可在小鼠体内进行短期的复制表达,表明沙鼠和C57BL/6小鼠具有作为HBV感染动物模型的潜质。通过对HBV感染后沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏的细胞损伤、细胞凋亡和内质网应激等相关因子表达量的变化初步观察研究发现,HBV感染后可通过激活线粒体途径和内质网应激途径促进肝细胞的凋亡,这可能是HBV感染引起肝细胞损伤的重要机制。
揣侠[8](2012)在《乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用》文中认为乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV))感染是严重危害人类健康的主要疾病之一。尽管预防性乙肝疫苗的广泛接种,极大的降低了HBV感染的发病率,但仍存在部分疫苗无/低应答人群及免疫逃逸现象,因而迫切需要研制新型有效的治疗性疫苗,打破机体的免疫耐受状态;并且由于HBV宿主范围狭窄,只感染人和少数灵长类动物,缺乏理想的小动物模型,限制了人们对HBV生物学特性、发病机制及新型疫苗与药物的研发和评价等方面的研究。基于HBV动物模型研究现状及疫苗发展的需求,本文在前期研究的基础上,将1.3拷贝的HBV基因组插入到自灭活HIV-1慢病毒载体系统转移载体骨架,构建重组的HBV转基因载体,并利用高压尾静脉注射的方法注入到小鼠体内,建立HBV成体转基因小鼠模型;同时制备含S+PreS1融合抗原的新型HBV颗粒样疫苗与重组病毒载体疫苗,优化不同佐剂组合方案或颗粒样疫苗与不同重组病毒载体疫苗联合应用,分析其在小鼠中诱导的抗原特异的免疫应答,初步优化HBV疫苗的免疫方案;进一步利用已建立的HBV成体转基因小鼠模型,基于前期优化的新型HBV疫苗的免疫方案,综合分析HBV疫苗所诱导的抗原特异性免疫应答特点,并评价疫苗免疫后在HBV感染小鼠体内的免疫保护和免疫清除作用。本研究取得的主要结果简述如下:一、乙肝成体转基因小鼠模型的建立及条件优化1、HBV基因组转导质粒的构建与结构优化利用慢病毒载体系统的转基因质粒pCS-CG骨架,筛选出正向插入1.3拷贝HBV基因组的pCS-HBV1.3K转基因载体质粒最适宜用作后续实验研究。2、两种HBV转基因载体质粒(pCS-HBV1.3与pAAV-HBV1.3)用于建立HBV成体转基因小鼠模型的比较分别将筛选出的pCS-HBV1.3K(以下简称pCS-HBV1.3)与前期构建的pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内,比较HBV标志物的表达,发现pCS-HBV1.3注射后,小鼠体内上述HBV标志物持续时间长,抗体出现晚,且肝组织中HBV DNA水平高,因而确定转基因载体质粒pCS-HBV1.3更适合于建立HBV持续感染动物模型。3、小鼠品系、性别、年龄及质粒注射量对建立HBV成体转基因小鼠模型的影响分别选择不同品系(C57BL/6和BALB/c)、不同剂量(5μg或10μg)、不同年龄(6周龄和18周龄)、不同性别的小鼠注射pCS-HBV1.3质粒,发现6周龄雌性C57BL/6小鼠更适合建立HBV持续感染模型。二、新型HBV颗粒样疫苗与不同佐剂或不同载体疫苗联合应用在小鼠中诱导的免疫应答特征分析1、HBV新型颗粒疫苗与重组病毒载体疫苗的制备与鉴定分别构建制备了含HBVS+PreS1、C+PreS1融合抗原的重组痘苗病毒载体疫苗,含HBV S+PreS1融合抗原的重组腺病毒载体疫苗,证实目的蛋白的表达;用电镜及免疫电镜的方法证实CHO表达的含S+PreS1融合抗原疫苗HBSS1的表达及颗粒结构。2、含HBV S+PreS1融合抗原的新型颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗联合免疫在小鼠体内的免疫效果评价比较含HBV S+PreS1融合抗原的蛋白颗粒疫苗和重组痘苗病毒的不同联合免疫策略,发现HBV新型蛋白颗粒疫苗初免、重组痘苗病毒加强后可加速抗体阳转,产生高水平的S及PreS1的特异性抗体和细胞免疫反应,同时伴有高水平的CD4+和CD8+T细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α产生,明显优于蛋白颗粒疫苗同源免疫方案及重组痘苗病毒初免、蛋白颗粒疫苗加强的联合免疫方案。3、HBV颗粒样疫苗结合不同佐剂初免与重组腺病毒载体疫苗联合免疫诱发的免疫应答特点分析HBV疫苗应用CpG和A1(OH)3佐剂可提高HBVS蛋白疫苗的抗体阳转率和抗体滴度,并且重组腺病毒加强以后,抗原特异性的细胞免疫亦有所增强;而对于含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白颗粒疫苗,CpG和PolyI:C联合铝佐剂可产生高水平的S及PreS1的特异性抗体以及抗原特异性的细胞免疫反应,HBSS1联合Poly I:C/Alum混合佐剂初免重组腺病毒加强后,同时伴有高水平的CD4+和CD8+T细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-y和IL-2产生;未观测到CNB佐剂及其联合Alum佐剂后对HBSS1抗体反应和细胞免疫应答的增强作用。三、HBV成体转基因小鼠模型应用于HBV新型疫苗免疫保护与免疫清除效果评价1、HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用在前述HBV疫苗免疫方案优化的研究基础上,首先选用含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白颗粒疫苗(HBSS1)与含S蛋白HBV颗粒疫苗(HBS)结合不同佐剂、或蛋白颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗(RVJSS1),或蛋白颗粒疫苗与重组腺病毒载体疫苗(rAdSSl)联合免疫小鼠,系统比较了其抗原特异性体液与细胞免疫应答特点;末次免疫后2周采用pCS-HBV1.3质粒攻击对照小鼠与各疫苗免疫小鼠建立HBV持续感染状态。然后比较小鼠血清HBsAg、HBeAg、 HBV DNA及肝组织DNA表达水平变化。发现在上述疫苗免疫后诱导的抗S抗体均能清除血清HBsAg;而HBSS1联合RVJSS1或rAdSSl可同时清除血清HBsAg和HBV DNA,并可显着降低血清HBeAg的表达水平。进一步采用统计学方法分析疫苗诱发的免疫应答与免疫保护的相关性,发现免疫保护除与其诱导的高滴度的S、PreS1特异性的抗体应答相关外,还与其诱发的多种抗原特异性的细胞因子密切相关。2、HBV转基因小鼠模型在HBV新型疫苗免疫清除评价中的应用选取6周龄的C57BL/6小鼠,在免疫前5天尾静脉高压注射5μgpCS-HBV1.3,建立HBV慢性感染的小鼠模型,之后接受不同方案HBV疫苗的组合免疫,如前所述,采用多种方法系统分析不同HBV疫苗免疫方案所诱导的抗原特异性免疫应答及HBV慢性感染的小鼠血与肝组织中HBV标志物,并用统计学方法分析免疫应答与HBV清除效果的相关性。结果发现:HBSS1联合重组痘苗病毒或重组腺病毒载体疫苗,可清除血清HBsAg抗原血症,显着降低血清中HBeAg及HBV DNA水平;清除效果主要与其诱导的高滴度的S、PreS1特异性的抗体应答和Thl型细胞免疫应答密切相关。本研究结果为新型HBV疫苗的进一步研发与应用奠定了基础。
潘丹珍[9](2012)在《WHV-HBV嵌合病毒复制型克隆构建及其持续复制小鼠模型的建立》文中提出目的1.用HBV基因组编码HBsAg的碱基序列替换WHV基因组中相应的同源序列,构建WHV-HBV嵌合病毒可复制性克隆。2.通过尾静脉高压水注射的方法,建立WHV-HBV嵌合病毒持续复制小鼠模型。了解WHV-HBV嵌合小鼠体内的免疫应答,探索持续复制的机制。3.研究HBsAg DNA疫苗在WHV-HBV嵌合病毒小鼠模型上的免疫保护效力。方法1.以本实验室构建的pBS-WHV1.3和pBS-HBV1.3为模板,利用分子克隆技术,用HBV基因组中编码S区”a”抗原决定簇、Major HBsAg, Middle HBsAg的碱基序列替换WHV基因组中对应的同源序列。构建成功的嵌合WHV-HBV质粒,通过体外转染Huh7、HepG2细胞,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测转染细胞上清中的HBsAg。2.采用高压尾静脉注射的方式将pBS-WHV1.3、 WHV-HBV-Sa、 WHV-HBV-SS、 WHV-HBV-MS克隆转染到BALB/c小鼠肝脏内,定期采集小鼠血清和肝脏标本,通过酶联免疫吸附实验、PCR、Southern Blot及免疫组织化学染色等方法监测小鼠体内病毒血症。尾静脉注射36周后,用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和细胞内因子染色实验,检测在HBsAg和WHcAg的H-2kd CTL表位肽、HBsAg H-2kd CD4表位肽及HBsAg、WHcAg刺激下,抗原特异性CTL和CD4细胞免疫应答。3.将pcDNA3.1-HBsAg质粒采用肌肉注射联合电击免疫小鼠,完成免疫周期后2周,尾静脉高压水注射pBS-HBV1.3、WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、WHV-HBV-MS,采集系列血清检测HBsAg、HBsAb,PCR检测血清中病毒DNA,免疫组化检测核心抗原的表达。结果1.构建WHV-HBV嵌合质粒WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、 WHV-HBV-MS,测序结果显示,成功的实现了预期的基因组替换。分别转染Huh7和HepG2细胞后,转染WHV1.3和Sa的细胞上清中未能检测到HBsAg,转染SS和MS的细胞上清中均可检测到HBsAg。2.在高压尾静脉注射WHV1.3后1天,9只小鼠中有2只病毒DNA为弱阳性。注射后1018天,所有小鼠的血清病毒DNA都呈阳性,并持续到45周。肝脏中可检测到WHcAg和WHsAg, WHcAg阳性细胞数从尾注后第10天的5%逐渐下降,到98天约为2%。Sa注射小鼠中,67%小鼠的血清用HBsAg酶联免疫实验检测为阳性,并持续阳性到45周。WHVDNA在小鼠血清中持续低水平存在。肝脏中WHcAg表达与WHV1.3组相似。高压尾静脉注射SSMS的小鼠中,注射后第1天,即可检测到HBsAg。4周后陆续转为阴性值。但是,值得注意的是MS组有两只小鼠血清HBsAg持续阳性到36周。小鼠血清中病毒DNA呈低水平持续存在。在SS和MS高压尾静脉注射的小鼠肝组织中均可检测到WHcAg。在体外,通过特异性抗原和肽段刺激小鼠脾脏淋巴细胞,细胞内因子染色实验未得到阳性结果,Elispot检测仅有两只小鼠有针对HBsAg的阳性反应。3.小鼠经pcDNA3.1-HBsAg三次电击免疫后,体内产生anti-HBs。经免疫小鼠与对照小鼠,尾静脉高压水注射Sa、SS、MS、pBS-HBV1.3,经免疫的小鼠血清中的HBsAg、病毒DNA均较快被清除,对照小鼠的血清HBsAg和病毒DNA仍然持续阳性。结论1.成功构建WHV-HBV嵌合可复制性克隆WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、 WHV-HBV-MS。2.野生型和嵌合WHV基因组可以在高压尾静脉注射小鼠体内持续表达WHV和HBV蛋白。但是,复制能力低于HBV基因组。一个主要的允许WHV基因组持续的因素是缺乏针对WHV和HBV蛋白的免疫反应。3.针对HBsAg的早期免疫可以有效的阻止嵌合WHV基因组的表达和持续。本研究的创新点及意义:1.通过分子克隆技术,构建了WHV-HBV嵌合病毒可复制性克隆。2.我们的结果提示,在高压尾静脉注射小鼠模型中,除了载体和宿主遗传背景因素,病毒因素也是病毒持续的决定性因素。3.构建成功的WHV-HBV嵌合病毒,将进一步感染土拨鼠,建立WHV-HBV嵌合重组病毒感染的土拨鼠模型,使土拨鼠模型在HBV的研究中更具实际应用价值。将为揭示HBV特异性的免疫应答特征,研究HBV急、慢性感染的发病机制,筛选慢性乙肝治疗药物和各种免疫调节手段提供一个新的技术平台。
李想[10](2010)在《表达HBV病毒受体SCCAI及AnnexinV的HBV易感小鼠模型的建立》文中进行了进一步梳理乙肝病毒的主要被感染者是人类以及大猩猩等少数灵长类动物,过去对乙肝病毒的研究常受到制约是由于缺乏适宜并可行的实验动物作为模型。依据目前对乙肝病毒的研究,发现乙肝病毒的DNA只要进入寄主细胞,就不受感染组织和易感染物种的限制,这表明能够和乙肝病毒特异结合的受体与易感染者即宿主肝细胞表面结合的能力与感染范围的大小正相关。基于已有的关于乙肝病毒受体方面的研究,在若干可能的乙肝病毒受体中我们统计出最有可能的受体:乙肝病毒结合蛋白(HBV-Binding Protein)和人肝细胞结合蛋白又叫做膜连接素(AnnexinV)。根据细胞转染实验分析,结果表明,在表达了乙肝病毒受体的若干细胞中,乙肝病毒在细胞中的复制程度因为受体表达水平不同而不同。另外尚有研究人员发现某些细胞能天然的不被乙肝病毒感染,但病毒的感染和复制在转染表达受体后却发生了,且能够检测到病毒滴度。一种能够变更动物遗传信息的方法,可以使获取新的基因表达性的方法能够解决以上难题,因此出现了转基因动物。利用转基因的方法制作经济高效的动物模型为人病毒的防治与致病性研究提供了新的思路。本实验将已有的研究成果及对乙肝病毒受体的研究应用于制备AnnexinV的转基因小鼠和制备表达乙肝病毒受体BP,并尝试建立能同时表达两种基因的小鼠模型和乙肝病毒易感模型,实验方法如下:分别使用PCR方法扩增并获得Annexin V和BP的全长cDNA序列,此过程以质粒3140878和4101988为模板,将其连接到PCAGGS的真核表达载体,通过双酶切与PCR来进行筛选克隆,结果得到了两种基因的表达载体PCAGGS-BP和PCAGGS-AnnexinV。我们使用上述的两种表达载体,通过显微共注射的方法获得了44只小鼠,其中转基因小鼠有19只,基因组中整合有BP和AnnexinV的转基因小鼠的有12只。经过不断传代后利用PCR和Southern检测都证实12只转基因小鼠的基因组中的确有转入的两种基因的整合,转基因阳性率为27.2%,同时我们对鉴定了转基因小鼠系中外源性基因的表达,我们提取了转基因小鼠组织的总RNA,进行了RT-PCR的检测,结果表明两种转入的基因都能进行活跃转录,进一步的western-blot鉴定证实了两种转入基因的共表达。各个founder小鼠经过传代已建立各相应的转基因小鼠系。
二、不同引物在血液PCR筛选HBV转基因小鼠中效果评价(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同引物在血液PCR筛选HBV转基因小鼠中效果评价(论文提纲范文)
(1)靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 前言 |
1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
1.2 人工CAR的结构 |
1.2.1 胞外抗原结合区 |
1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
1.3.1 细胞因子风暴 |
1.3.2 脱靶效应 |
1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
1.3.4 转染载体的缺陷 |
1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
1.3.6 免疫抑制作用 |
1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
1.10 本研究的目的和意义 |
2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
2.1 材料与仪器 |
2.1.1 实验细胞株与质粒 |
2.1.2 主要仪器与设备 |
2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
2.2.4 病毒转导与检测 |
2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
2.2.10 统计学方法 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
2.4 本章小结 |
3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
3.1 实验细胞株与材料试剂 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 细胞培养 |
3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
3.2.4 病毒转导 |
3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
3.2.8 统计学分析 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
3.4 本章小结 |
4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
4.2.4 CAR表达载体的改造 |
4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
4.2.10 体内动物实验 |
4.2.11 过氧化物酶染色法 |
4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
4.2.13 免疫印迹实验 |
4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
4.2.16 统计学数据处理分析 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
4.4 本章小结 |
5 讨论 |
5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
5.3.1 CIK细胞方案 |
5.3.2 NK-92细胞方案 |
5.3.3 脐血NK细胞方案 |
5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
结论 |
参考文献 |
攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
致谢 |
附件 |
博士学位论文修改情况确认表 |
(2)以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
关键词及缩写 |
第一章 前言 |
1.1 阿尔茨海默病 |
1.1.1 阿尔茨海默病研究发展进程 |
1.1.2 阿尔茨海默病的流行病学 |
1.1.3 阿尔茨海默病发病机制研究 |
1.1.3.1 Aβ 蛋白级联假说 |
1.1.3.2 Tau蛋白致病假说 |
1.2 阿尔茨海默病动物模型研究 |
1.2.1 转基因啮齿类动物模型 |
1.2.1.1 Aβ 病理转基因鼠 |
1.2.1.2 Tau病理转基因鼠 |
1.2.2 非人灵长类动物模型 |
1.3 阿尔茨海默病治疗现状 |
1.3.1 阿尔茨海默病治疗策略及分类 |
1.3.2 以tau为靶点的阿尔茨海默病疗法 |
1.3.2.1 主动免疫疗法 |
1.3.2.2 被动免疫疗法 |
1.3.2.3 微管稳定剂类 |
1.3.2.4 Tau聚集抑制剂类 |
1.3.2.5 调节tau磷酸化水平 |
1.4 靶向tau的免疫治疗方法的机制 |
1.5 诺如病毒P颗粒疫苗载体系统 |
1.5.1 诺如病毒 |
1.5.2 诺如病毒P颗粒 |
1.5.3 基于诺如病毒P颗粒蛋白载体的疫苗研究现状 |
1.6 研究意义与实验设计 |
1.6.1 研究意义 |
1.6.2 实验思路与设计 |
1.6.2.1 P301S模型小鼠跟踪部分 |
1.6.2.2 AD疫苗部分 |
第二章 实验材料和方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 菌种、质粒载体与细胞 |
2.1.3 多肽合成 |
2.1.4 实验设备 |
2.1.5 实验试剂与耗材 |
2.1.6 溶液配制 |
2.1.6.1 鼠尾消化液 |
2.1.6.2 TAE缓冲液 |
2.1.6.3 PBS |
2.1.6.4 变性电泳缓冲液(SDS-running buffer) |
2.1.6.5 非变性电泳缓冲液(native running buffer) |
2.1.6.6 电转缓冲液 |
2.1.6.7 考马斯亮蓝染色液 |
2.1.6.8 脱色液 |
2.1.6.9 Basal buffer |
2.1.6.10 10×DNA loading buffer |
2.1.6.11 5×蛋白loading buffer |
2.1.6.12 5×蛋白native loading buffer |
2.1.6.13 戊巴比妥钠溶液 |
2.1.6.14 4%多聚甲醛溶液 |
2.1.6.15 分化液 |
2.1.6.16 返蓝液 |
2.1.6.17 柠檬酸抗原修复液 |
2.1.6.18 TBS与TBST |
2.1.6.19 PMSF母液 |
2.1.6.20 Na F母液 |
2.1.6.21 钒酸钠母液 |
2.1.6.22 焦磷酸钠(Na2P2O4)母液 |
2.1.6.23 RAB buffer |
2.1.6.24 RIPA buffer |
2.1.6.25 Urea buffer(脑匀浆用) |
2.1.6.26 30%丙烯酰胺溶液 |
2.1.6.27 氨苄青霉素溶液 |
2.1.6.28 卡那霉素溶液 |
2.1.6.29 氯霉素溶液 |
2.1.6.30 L-阿拉伯糖溶液 |
2.1.6.31 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) |
2.1.6.32 (亲和层析)平衡液 |
2.1.6.33 (亲和层析)咪唑洗脱液 |
2.1.6.34 抗原包被液 |
2.1.6.35 连接反应用碳酸氢铵溶液 |
2.1.6.36 R10培养基 |
2.1.6.37 ACK(红细胞裂解液) |
2.1.6.38 (293T)细胞复苏液 |
2.1.6.39 (293T)细胞培养基 |
2.1.6.40 胰酶 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 动物饲养及动物伦理 |
2.2.2 P301S转基因小鼠基因型鉴定 |
2.2.3 琼脂糖凝胶电泳 |
2.2.4 小鼠行为学实验 |
2.2.4.1 握力实验 |
2.2.4.2 加速转棒实验 |
2.2.4.3 步幅长度 |
2.2.4.4 复合表型评分系统(肢体协调综合评分) |
2.2.4.5 筑巢实验 |
2.2.4.6 旷场实验 |
2.2.4.7 水迷宫实验 |
2.2.5 动物血浆及组织样本取材与保存 |
2.2.5.1 血浆样本取材与保存 |
2.2.5.2 血清样本取材与保存 |
2.2.5.3 组织样本取材与保存 |
2.2.6 组织切片与染色 |
2.2.6.1 石蜡切片的制备 |
2.2.6.2 HE染色 |
2.2.6.3 甲苯胺蓝染色 |
2.2.6.4 免疫组织化学染色(IHC) |
2.2.7 脑匀浆制备 |
2.2.8 蛋白电泳 |
2.2.8.1 SDS-PAGE(变性)电泳 |
2.2.8.2 Native PAGE(非变性)电泳 |
2.2.9 考马斯亮蓝染色 |
2.2.10 免疫印迹实验 |
2.2.10.1 Western blot |
2.2.10.2 Dot blot |
2.2.11 质粒构建 |
2.2.11.1 pCold Ⅳ-PP-3C质粒构建 |
2.2.11.2 pET20b-Tau质粒构建 |
2.2.11.3 pCDNA3.1-YFP /pCDNA3.1-CFP质粒构建 |
2.2.11.4 pCDNA3.1-RD(WT)-(HA)质粒构建 |
2.2.11.5 pCDNA3.1-LM-(HA)/pCDNA3.1-△K-(HA)质粒构建 |
2.2.11.6 pCDNA3.1-△K-YFP /pCDNA3.1-△K-CFP质粒构建 |
2.2.12 蛋白原核表达与纯化 |
2.2.12.1 PP-3C蛋白纯化 |
2.2.12.2 Tau蛋白的纯化 |
2.2.13 疫苗制备 |
2.2.13.1 多肽疫苗的制备 |
2.2.13.2 PP-pTau31疫苗的制备 |
2.2.13.3 佐剂使用 |
2.2.14 ELISA |
2.2.14.1 血浆/脑匀浆tau含量测定 |
2.2.14.2 血清抗体含量测定 |
2.2.14.3 血清抗体分型实验 |
2.2.15 硫酸铵沉淀法纯化血清蛋白 |
2.2.16 ELISPOT |
2.2.17 细胞培养 |
2.2.18 质粒转染 |
2.2.19 FRET实验 |
2.2.20 统计学方法 |
第三章 实验结果与讨论:P301S转基因小鼠行为学、病理学及血清学跟踪研究 |
3.1 行为学研究 |
3.1.1 体重 |
3.1.2 生存期 |
3.1.3 握力实验 |
3.1.4 加速转棒实验 |
3.1.5 步幅长度 |
3.1.6 复合表型评分系统(肢体协调综合评分) |
3.1.7 水迷宫实验 |
3.1.8 旷场实验 |
3.1.9 筑巢实验 |
3.1.10 小结 |
3.2 病理学研究 |
3.2.1 免疫印迹实验(western blot) |
3.2.2 免疫组织化学染色(IHC) |
3.2.3 脏器变化 |
3.2.4 小结 |
3.3 血清学研究 |
3.3.1 血浆中人源tau蛋白变化 |
3.3.2 血浆炎症因子和趋化因子变化 |
3.3.3 脑匀浆炎症因子和趋化因子变化 |
3.3.4 小结 |
3.4 检测因子相关性分析 |
3.5 讨论 |
3.6 结论 |
第四章 实验结果与讨论:以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗对AD治疗效果和作用机制研究 |
4.1 磷酸化tau表位疫苗磷酸化表位筛选 |
4.1.1 候选重组磷酸化tau多肽的设计 |
4.1.2 候选重组磷酸化tau多肽的免疫原性分析 |
4.1.3 优选重组磷酸化tau多肽表位pTau31的安全性分析 |
4.1.4 小结 |
4.2 以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗的制备与表征 |
4.2.1 PP-pTau31表位疫苗的设计 |
4.2.2 诺如病毒P颗粒蛋白基因突变与构建 |
4.2.3 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C的表达与纯化 |
4.2.4 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C理化性质分析 |
4.2.4.1 PP-3C蛋白分子量及聚体形式分析 |
4.2.4.2 透射电镜(TEM)对重组诺如病毒P蛋白形态分析 |
4.2.5 重组诺如病毒P颗粒蛋白与pTau31多肽连接工艺与连接效率研究 |
4.2.6 小结 |
4.3 磷酸化tau表位疫苗PP-pTau31的免疫原性与优选佐剂研究 |
4.3.1 PP-pTau31的免疫原性评价 |
4.3.1.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计 |
4.3.1.2 PP-pTau31免疫原性评价 |
4.3.2 优选疫苗佐剂筛选 |
4.3.2.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计 |
4.3.2.2 免疫原性评价 |
4.3.3 PP-pTau31疫苗诱导的T细胞免疫反应分析 |
4.3.4 小结 |
4.4 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫效果研究 |
4.4.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫方案设计 |
4.4.2 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫原性分析 |
4.4.3 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后的行为学变化研究 |
4.4.3.1 P301S转基因鼠体重变化 |
4.4.3.2 P301S转基因鼠生存期变化 |
4.4.3.3 P301S转基因鼠运动相关行为学变化 |
4.4.3.4 P301S转基因鼠认知行为学变化 |
4.4.4 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后脑中蛋白水平变化研究 |
4.4.4.1 P301S转基因鼠脑匀浆中tau蛋白水平变化 |
4.4.4.2 P301S转基因鼠脑海马区tau蛋白水平变化 |
4.4.4.3 P301S转基因鼠脑海马区胶质细胞水平变化 |
4.4.5 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中治疗的安全性分析 |
4.4.5.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中诱导的T细胞免疫反应分析 |
4.4.5.2 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠血清中细胞因子的变化 |
4.4.5.3 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的脑匀浆细胞因子变化 |
4.4.5.4 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的组织病理变化 |
4.4.6 小结 |
4.5 PP-pTau31疫苗的免疫作用机制研究 |
4.5.1 免疫治疗后P301S转基因鼠血浆tau蛋白水平变化 |
4.5.2 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性分析 |
4.5.2.1 FRET检测游离tau蛋白活性方法建立 |
4.5.2.1.1 质粒构建 |
4.5.2.1.2 质粒表达验证 |
4.5.2.1.3 FRET检测方法适用性评估 |
4.5.2.3 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性检测 |
4.5.3 PP-pTau31疫苗诱导的抗体性质分析 |
4.5.3.1 血清抗体结合NFT效果研究 |
4.5.3.2 血清抗体对脑匀浆中tau蛋白传播活性的抑制效果研究 |
4.5.4 小结 |
4.6 讨论 |
4.7 结论 |
展望 |
参考文献 |
作者简历及攻读博士学位期间科研成果 |
致谢 |
(3)羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备及其抗肝细胞癌研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
前言 |
第一章 处方前研究 |
1 实验材料 |
1.1 药品及试剂 |
1.2 实验仪器 |
2 实验方法 |
2.1 脂质体中羽扇豆醇含量测定方法的建立 |
2.2 羽扇豆醇脂质体包封率测定方法及制备方法的考察 |
2.3 羽扇豆醇溶解度的测定 |
2.4 羽扇豆醇普通脂质体影响因素考察 |
3 实验结果 |
3.1 羽扇豆醇含量测定方法的建立 |
3.2 羽扇豆醇包封率及制备方法的考察结果 |
3.3 羽扇豆醇溶解度测定结果 |
3.4 羽扇豆醇普通脂质体影响因素考察结果 |
4 小结与讨论 |
第二章 羽扇豆醇肝靶向脂质体制备工艺及表征 |
1 实验材料 |
1.1 药品及试剂 |
1.2 实验仪器 |
2 实验方法 |
2.1 正交试验法优化羽扇豆醇肝靶向脂质体处方 |
2.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体冻干工艺的考察 |
2.3 羽扇豆醇肝靶向脂质体理化性质的考察 |
2.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体稳定性的考察 |
3 实验结果 |
3.1 羽扇豆醇肝靶向脂质体制备工艺的考察结果 |
3.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体冻干保护剂考察结果 |
3.3 羽扇豆醇肝靶向脂质体理化性质的考察结果 |
3.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体制剂稳定性考察结果 |
4 小结与讨论 |
第三章 羽扇豆醇肝靶向脂质体体内和体外靶向性研究 |
1 实验材料 |
1.1 药品及试剂 |
1.2 实验仪器 |
2 实验方法 |
2.1 羽扇豆醇肝靶向脂质体体外靶向性研究 |
2.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体体内靶向性研究 |
3 实验结果 |
3.1 羽扇豆醇肝靶向脂质体体外靶向性研究结果 |
3.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体体内靶向性研究结果 |
4 小结与讨论 |
第四章 羽扇豆醇肝靶向脂质体药代动力学研究 |
1 实验材料 |
1.1 药品及试剂 |
1.2 实验仪器 |
2 实验方法 |
2.1 羽扇豆醇标准溶液的配制 |
2.2 血浆样品的处理 |
2.3 羽扇豆醇体内分析方法的考察 |
2.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体在大鼠体内药代动力学研究 |
3 实验结果 |
3.1 羽扇豆醇体内分析方法的建立 |
3.2 血药浓度测定结果 |
3.3 平均血药浓度-时间曲线 |
3.4 统计矩拟合分析 |
4 小结与讨论 |
第五章 羽扇豆醇肝靶向脂质体对HepG2 细胞行为学研究 |
1 实验材料 |
1.1 药品及试剂 |
1.2 抗体 |
1.3 实验仪器 |
2 实验方法 |
2.1 细胞复苏 |
2.2 细胞培养 |
2.3 细胞冻存 |
2.4 工作液的配制 |
2.5 细胞增殖抑制实验 |
2.6 细胞凋亡实验 |
2.7 细胞周期实验 |
2.8 羽扇豆醇肝靶向脂质体促细胞凋亡分子机制研究 |
3 实验结果 |
3.1 细胞增殖抑制实验结果 |
3.2 细胞凋亡实验结果 |
3.3 细胞周期实验结果 |
3.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体促细胞凋亡分子机制研究结果 |
4 小结与讨论 |
第六章 羽扇豆醇肝靶向脂质体体内药效学研究 |
1 实验材料 |
1.1 药品及试剂 |
1.2 抗体 |
1.3 实验仪器 |
2 实验方法 |
2.1 质粒的提取及鉴定 |
2.2 质粒溶液的配制 |
2.3 高压尾静脉转染造模 |
2.4 分组与给药 |
2.5 小鼠肿瘤检测 |
2.6 苏木精-伊红(HE)染色 |
2.7 肝组织中RNA的提取和q RT-PCR(即时聚合酶链式反应)检测 |
2.8 羽扇豆醇靶向脂质体抗AKT/c-MET诱导HCC分子机制研究 |
3 实验结果 |
3.1 质粒酶切实验结果 |
3.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导FVB小鼠肿瘤生长的影响 |
3.3 羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导小鼠肝脏病理学变化的影响 |
3.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导小鼠的肝脏肝细胞癌标志物表达水平的影响 |
3.5 羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠肝脏的AKT/mTOR以及Ras/MAPK相关蛋白的影响 |
4 小结与讨论 |
参考文献 |
结语 |
附录1 文献综述 |
参考文献 |
附录2 在读博士期间发表的论文 |
致谢 |
(4)高效持久清除乙肝病毒的新型抗体研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 前言 |
1 治疗性抗体药物的研究历史 |
2 抗体的结构与功能 |
3 再循环抗体的工程改造 |
3.1 再循环抗体的作用机制 |
3.2 再循环抗体的研究进展 |
3.3 再循环抗体的进一步改造 |
4 FcRn的结构与功能 |
5 乙型肝炎病毒及治疗现状 |
6 噬菌体展示技术 |
6.1 丝状噬菌体特征 |
6.2 噬菌体抗体库筛选流程 |
7 本研究的思路、目的和意义 |
第二章 材料与方法 |
1 材料 |
1.1 主要仪器 |
1.2 主要试剂与材料 |
1.3 常用溶液及培养基配制 |
2 方法 |
2.1 分子克隆常规操作 |
2.2 细胞实验常规操作 |
2.3 蛋白水平相关常规操作 |
2.4 pH依赖抗原结合抗体库的构建、筛选及检测 |
2.5 真核表达载体的构建、抗体表达、纯化及质控 |
2.6 HBV转基因鼠体内半衰期及抗原清除效果评估 |
2.7 清道夫抗体的表达纯化及质控 |
2.8 hFcRn转基因鼠体内半衰期及抗原清除效果评估 |
2.9 常用分析软件及工具 |
第三章 结果与分析 |
1 pH依赖抗原结合抗体库的构建、筛选及检测 |
1.1 pH依赖抗体改造突变位点的确定 |
1.2 pH依赖抗原结合抗体库的筛选 |
1.3 pH依赖抗原结合抗体库的检测 |
1.4 本节小结 |
2 候选分子真核表达纯化、质控及评估 |
2.1 候选分子真核表达纯化和质控 |
2.2 HBV转基因鼠体内半衰期及抗原清除效果评估 |
2.3 本节小结 |
3 清道夫抗体的表达纯化、质控及功能评估 |
3.1 结合hFcRn的清道夫抗体 |
3.2 结合mFcγR Ⅱ的清道夫抗体 |
3.3 本节小结 |
第四章 讨论 |
1. A31-73与HBsAg的pH依赖结合作用机制探讨 |
2. A41-8半衰期长的的可能原因 |
3. 动物模型的选择 |
4. HBV清道夫抗体可研发成为备选的HBV治疗性抗体药物 |
第五章 小结与展望 |
1. 小结 |
2. 展望 |
研究生期间科研成果 |
参考文献 |
致谢 |
(5)胞外囊泡作为纳米载体用于靶向给药的初步研究与应用(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 绪论 |
1.1 胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs) |
1.2 胞外囊泡(Extracellular vesicles)与细胞的相互作用 |
1.3 胞外囊泡(Extracellular vesicles)在生理和病理过程中的作用 |
1.3.1 EVs作为神经元、免疫和炎症过程的调节因子 |
1.3.2 胞外囊泡与癌症 |
1.4 胞外囊泡(Extracellular vesicles)的分离纯化 |
1.5 胞外囊泡的药物装载 |
1.5.1 胞外囊泡分离前装载药物 |
1.5.2 胞外囊泡分离后装载药物 |
1.6 分子影像技术在研究胞外囊泡生物分布中的应用 |
1.6.1 细胞外囊泡的成像方法 |
1.6.2 细胞外囊泡的体内生物分布 |
1.7 细胞外囊泡的特异性靶向 |
1.8 基于细胞外囊泡的临床应用 |
1.8.1 EVs作为疾病的生物标记物 |
1.8.2 EVs作为疾病的治疗药物 |
1.9 本论文的选题依据及研究内容 |
1.10 参考文献 |
第二章 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 主要仪器 |
2.1.2. 主要试剂和材料 |
2.1.3. 引物合成 |
2.1.4. 其他试剂 |
2.2. 方法 |
2.2.1. 常用溶液和培养基的配制 |
2.2.2. 分子克隆 |
2.2.3. 细胞培养 |
2.2.4. 腺病毒操作 |
2.2.5. 胞外囊泡(EVs)的制备 |
2.2.6. ELISA检测 |
2.2.7. BCA法检测蛋白含量 |
2.2.8 SDS-PAGE鉴定 |
2.2.9 Western blotting鉴定 |
第三章 细胞外囊泡来源蛋白冠的蛋白质组分析 |
3.1 引言 |
3.2 实验部分 |
3.2.1 主要试剂和材料 |
3.2.2 技术路线 |
3.2.3 实验方法 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 ~(99)Tc-Liposome和~(99)Tc-EVs的生物分布 |
3.3.2 ~9Tc-Liposome和~(99)Tc-EVs的血液代谢动力学评价 |
3.3.3 EVs吸附血清蛋白的评价 |
3.3.4 血清蛋白质吸附对粒度和电位的影响评价 |
3.3.5 用LC-MS/MS进行蛋白质鉴定 |
3.3.6 EVs蛋白质冠蛋白的鉴定 |
3.3.7 蛋白质冠的韦恩图比较 |
3.3.8 蛋白质冠成分的分类和结构比较 |
3.3.9 GO(Gene ontology)富集分析 |
3.3.10 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析 |
3.3.11 4T1细胞来源的囊泡蛋白质冠关键蛋白筛选 |
3.3.12 蛋白-蛋白互作网络(PPI)分析 |
3.3.13 Plasminogen在囊泡表面的沉积 |
3.3.14 补体系统激活的关键成分C3b在囊泡表面的沉积 |
3.3.15 PLG对C3b脂膜表面沉积的影响 |
3.3.16 TMT标记定量质谱分析PLG在血清里的含量检测 |
3.3.17 LC-MS/MS检测与PLG结合的细胞膜蛋白 |
3.3.18 癌源性免疫球蛋白与PLG的相互作用 |
3.3.19 4T1细胞癌源性免疫球蛋白IGHM表达的干扰 |
3.3.20 免疫球蛋白表达的干扰对EVs表面补体沉积的影响 |
3.3.21 ~(99)Tc-EVs和~(99)Tc-EVs~(ighm ko)的生物分布 |
3.3.22 ~(99)Tc-EVs和~(99)Tc-EVs~(ighm ko)的血液代谢动力学评价 |
3.3.23 免疫球蛋白对四氧化三铁(SPIO)纳米粒子生物分布的影响 |
3.4 本章小结 |
3.5 参考文献 |
第四章 胞外囊泡包裹溶瘤腺病毒用于癌症病毒疗法 |
4.1 引言 |
4.2 实验部分 |
4.2.0 质粒构建 |
4.2.1 细胞培养 |
4.2.2 稳转细胞株的筛选 |
4.2.3 腺病毒的制备 |
4.2.4 NGR转基因小鼠的构建 |
4.2.5 OA@BCMNs的制备 |
4.2.6 OA@BCMNs的表征 |
4.2.7 斑点杂交 |
4.2.8 MTT细胞毒性检测 |
4.2.9 体外细胞结合能力的检测 |
4.2.10 实时聚合酶链反应分析(qPCR) |
4.2.11 抗病毒中和反应 |
4.2.12 OA@BCMNs的体内分布和溶瘤病毒复制检测 |
4.2.13 毒性反应和免疫反应的评价 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 PreS1基因的细胞共定位 |
4.3.2 PreS1基因的验证 |
4.3.3 PreS1蛋白的胞外囊泡膜定位 |
4.3.4 BCMNs的体外靶向能力研究 |
4.3.5 OA@BCMNs的形貌 |
4.3.6 OA@BCMNs的粒度Zeta点位 |
4.3.7 OA@BCMNs的结构完整性验证 |
4.3.8 OA@BCMNs的存储稳定性验证 |
4.3.9 OA@BCMNs的包封率研究 |
4.3.10 OA@BCMNs的活性研究 |
4.3.11 OA@BCMNs的细胞毒性研究 |
4.3.12 OA@BCMNs的抗中和作用研究 |
4.3.13 OA@BCMNs相关的免疫反应研究 |
4.3.14 中和抗体与OA@BCMNs的抗肿瘤活性 |
4.3.15 OA@BCMNs-preS1的体内分布 |
4.3.16 OA@BCMNs-preS1的体内抗肿瘤治疗效果 |
4.3.17 OA@BCMNs-NGR的构建和表征 |
4.3.18 OA@BCMNs-NGR的体内分布 |
4.3.19 OA@BCMNs-NGR的体内抗肿瘤治疗效果 |
4.4 本章小结 |
4.5 参考文献 |
第五章 结论与展望 |
5.1 结论 |
5.2 展望 |
博士期间取得研究成果情况 |
致谢 |
(6)补肾清毒法对HBV转基因小鼠先天免疫的作用观察(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 先天免疫系统在乙肝病毒感染的作用 |
1.1 肝脏组织学 |
1.2 模式识别受体 |
1.2.1 Toll样受体介导信号通路 |
1.2.2 RIG-I样受体介导的信号通路 |
1.3 先天免疫系统细胞 |
1.3.1 自然杀伤细胞 |
1.3.2 自然杀伤T细胞和MAIT |
1.3.3 单核细胞以及Kupffer细胞 |
1.3.4 髓系来源抑制细胞 |
1.4 HBV转基因小鼠 |
1.5 乙肝病毒的先天免疫的逃逸机制 |
1.6 小结 |
第二章 以伏气温病理论研究补肾清毒法治疗慢性乙型肝炎的概述 |
2.1 伏气温病的由来 |
2.2 伏气温病与慢性乙型肝炎的关系 |
2.3 补肾清毒法的确立 |
2.4 补肾清毒汤的临床应用 |
2.5 补肾清毒汤的基础研究 |
第三章 实验研究 |
3.1 材料和方法 |
3.1.1 实验材料 |
3.1.2 主要试剂和设备 |
3.1.3 实验方法 |
3.1.4 统计学处理 |
3.2 实验结果 |
3.2.1 扩增曲线和溶解曲线 |
3.2.2 HBV转基因小鼠肝脏Toll样蛋白受体mRNA表达变化 |
3.2.3 补肾清毒汤对HBV转基因小鼠肝脏Toll样蛋白受体mRNA的影响 |
3.2.4 HBV转基因小鼠肝脏RIG-I样受体介导信号通路表达情况 |
3.2.5 补肾清毒汤对HBV转基因小鼠肝脏效应因子表达的影响 |
3.3 讨论 |
3.3.1 HBV转基因小鼠先天免疫系统 |
3.3.2 补肾清毒汤对HBV转基因小鼠肝脏先天免疫的影响 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
在校期间发表论文情况 |
统计学审核证明 |
致谢 |
(7)人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第一章 文献综述 |
1 乙型肝炎病毒与乙肝流行病学研究进展 |
1.1 乙型肝炎概述 |
1.2 HBV的发现 |
1.3 HBV分类 |
1.4 HBV的形态特点 |
1.5 HBV的复制周期 |
1.6 HBV的发病机理 |
1.7 HBV的基因型和分布 |
1.8 HBV在动物中的流行 |
1.9 HBV受体研究进展 |
2 HBV感染模型和动物模型研究进展 |
2.1 HBV感染的细胞模型 |
2.2 HBV感染的动物模型 |
3 HBV与细胞凋亡 |
4 HBV与内质网应激(ERS) |
5 本研究的目的和意义 |
第二章 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病原学研究 |
试验一 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的PCR和血清学检测 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
3 结果与分析 |
3.1 人源HBV阳性血清DNA含量测定结果 |
3.2 沙鼠和C57BL/6小鼠血清、组织和粪便中HBV DNA的PCR检测 |
3.3 感染鼠肝脏中HBV DNA含量Real-time PCR测定结果 |
3.4 感染沙鼠和C57BL/6小鼠血清ELISA检测结果 |
4 讨论与小结 |
试验二 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠后HBV相关抗原的检测 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
3 结果与分析 |
3.1 沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏中HBV相关抗原免疫组化检测结果 |
3.2 Western blot检测肝脏中HBV抗原 |
4 讨论与小结 |
试验三 人源HBV体外与沙鼠和C57BL/6小鼠血液共培养试验 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
3 结果 |
3.1 沙鼠和C57BL/6小鼠血液体外与HBV混合培养后DNA的PCR检测 |
3.2 PCR扩增序列比对 |
4 讨论和小结 |
第三章 人源HBV感染致沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏损伤机制的研究 |
试验一 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学变化观察 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
3 结果与分析 |
3.1 HBV感染对肝脏脏器指数及血清AST、ALT的影响 |
3.2 HBV感染沙鼠的病理学变化观察 |
3.3 HBV感染C57BL/6小鼠的病理学变化观察 |
4 讨论与小结 |
试验二 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织PCNA及HSP70表达的影响 |
1 前言 |
2 材料和方法 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
3 结果 |
3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中PCNA的表达情况 |
3.2 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中HSP70的表达情况 |
4 讨论与小结 |
试验三 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
1 前言 |
2 材料和方法 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
3 结果 |
3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Bax和Bcl-2的表达情况 |
3.2 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Fas和FasL的表达情况 |
3.3 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Caspase 3的表达情况 |
4 讨论与小结 |
试验四 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织ERS相关分子表达的影响 |
1 前言 |
2 材料和方法 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
3 结果 |
3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏中内质网应激相关分子的蛋白量变化 |
3.2 Western blot检测HBV感染后肝脏中内质网应激相关分子蛋白量变化 |
4 讨论与小结 |
试验五 人源HBV感染沙鼠线粒体DNA基因变化的观察 |
1 前言 |
2 材料和方法 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
3 结果 |
3.1 沙鼠线粒体D-loop基因的扩增结果 |
3.2 沙鼠线粒体CytC基因的扩增结果 |
3.3 沙鼠线粒体CytB基因的扩增结果 |
4 讨论与小结 |
结论 |
本研究创新点 |
参考文献 |
图版与说明 |
附录 |
致谢 |
个人简历 |
(8)乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩略词 |
图表目录 |
前言 |
第一章 乙肝成体转基因小鼠模型的建立及条件优化 |
材料和方法 |
结果 |
1 乙肝成体转基因小鼠模型质粒的建立及优化 |
2 两种HBV转基因载体pCS-HBV1.3-与pAAV-HBV1.3建立HBV小鼠模型的比较 |
3 乙型肝炎病毒成体转基因小鼠模型的制备条件优化 |
3.1 小鼠品系和注射质粒的量对建立HBV小鼠模型的影响 |
3.2 小鼠性别对建立HBV小鼠模型的影响 |
3.3 小鼠年龄对建立HBV小鼠模型的影响 |
讨论 |
本章小结 |
第二章 新型HBV颗粒样疫苗与不同佐剂或不同载体疫苗联合应用在小鼠体内诱发的免疫应答特征分析 |
材料和方法 |
结果 |
第一部分 HBV新型颗粒疫苗与重组病毒载体疫苗的制备和鉴定 |
1 重组痘苗病毒的制备与鉴定 |
2 重组腺病毒载体疫苗的制备与鉴定 |
3 CHO表达的含S+PreS1融合抗原的颗粒疫苗HBSS1鉴定 |
4 小结 |
第二部分 含HBV S+PreS1融合抗原的颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗联合免疫在小鼠体内的免疫效果评价 |
1 免疫分组和免疫程序 |
2 体液免疫应答检测 |
2.1 各免疫小鼠特异性抗体阳转率分析 |
2.2 各免疫组小鼠总IgG抗体滴度变化 |
2.3 各免疫组IgG抗体分型分析 |
3 细胞免疫应答检测 |
3.1 ELISpot检测不同联合免疫方案小鼠细胞免疫应答 |
3.2 ICS检测各联合免疫组小鼠细胞因子产生情况 |
4 小结 |
第三部分 结合不同佐剂的HBV颗粒疫苗初免重组腺病毒载体疫苗加强所诱发的免疫应答 |
1 免疫分组和免疫程序 |
2 CHO表达的HBV S蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫特点 |
3 HBSS1结合alum、CpG和Poly I:C佐剂初免免疫应答特点分析 |
4 HBSS1结合alum、CNB佐剂初免免疫应答特点分析 |
5 小结 |
讨论 |
本章小结 |
第三章 HBV成体转基因小鼠模型应用于HBV新型疫苗免疫保护和免疫清除效果评价 |
材料和方法 |
结果 |
第一部分 HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用 |
一 HBV蛋白颗粒疫苗联合不同佐剂同源免疫保护效果评价 |
二 HBV重组腺病毒载体疫苗联合蛋白颗粒疫苗免疫保护作用分析 |
三 HBV蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫保护作用分析 |
第二部分 HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用 |
一 HBV蛋白颗粒疫苗联合不同佐剂同源免疫清除效果评价 |
二 HBV重组腺病毒载体疫苗联合蛋白颗粒疫苗免疫清除作用分析 |
三 HBV蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫清除作用分析 |
讨论 |
本章小结 |
全文总结 |
参考文献 |
附录 |
综述 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(9)WHV-HBV嵌合病毒复制型克隆构建及其持续复制小鼠模型的建立(论文提纲范文)
英文缩略词表 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 构建WHV-HBV嵌合病毒复制性克隆 |
1 材料 |
2 方法 |
3. WHV-HBV嵌合质粒体外细胞转染 |
结果 |
小结 |
讨论 |
第二部分 建立WHV-HBV嵌合病毒尾静脉高压水注射持续复制小鼠模型 |
1 材料 |
2 方法 |
结果 |
小结 |
讨论 |
第三部分 HBsAg DNA疫苗对嵌合病毒基因组的清除作用 |
材料与方法 |
结果 |
小结 |
讨论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
致谢 |
(10)表达HBV病毒受体SCCAI及AnnexinV的HBV易感小鼠模型的建立(论文提纲范文)
缩略词表 |
摘要 |
Abstract |
前言 |
第1章 HBV受体BP及AnnexinV基因的克隆与表达载体的构建 |
1.材料 |
1.1 菌株和载体 |
1.2 生化与分子生物学试剂 |
1.3 主要仪器 |
2.方法 |
2.1 质粒提取 |
2.2 扩增和鉴定BP和AnnexinV基因用PCR引物的合成与基因测序 |
2.3 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物的回收与纯化 |
2.4 显微注射用转基因载体的构建 |
第2章 表达AnnexinV和BP易感小鼠模型的建立 |
1.材料 |
1.1 表达基因载体质粒 |
1.2 限制性内切酶等相关试剂 |
1.3 主要溶液 |
1.4 实验动物 |
1.5 实验用仪器 |
2.方法 |
2.1 制作显微注射片断 |
2.2 显微注射转基因小鼠 |
2.3 小鼠鼠尾基因组DNA的制备 |
2.4 转基因小鼠的各种鉴定 |
2.5 PCAGGS-AnnexinV+BP转基因小鼠的Southern杂交分析 |
2.6 小鼠组织总RNA的提取 |
2.7 RNA中微量DNA的去除 |
2.8 RT—PCR检测转基因小鼠体内AnnexinV和BP的转录 |
2.9 在蛋白水平上检测AnnexinV和BP转基因小鼠肝组织中的表达 |
3.结果 |
3.1 转基因载体注射片断的准备 |
3.2 转基因载体的显微注射 |
3.3 转基因小鼠的基因型鉴定 |
3.4 RT—PCR检测转录情况 |
4.总结 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间研究成果 |
四、不同引物在血液PCR筛选HBV转基因小鼠中效果评价(论文参考文献)
- [1]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [2]以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究[D]. 孙瑶. 吉林大学, 2020(08)
- [3]羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备及其抗肝细胞癌研究[D]. 张骏. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [4]高效持久清除乙肝病毒的新型抗体研究[D]. 温灿. 厦门大学, 2019(09)
- [5]胞外囊泡作为纳米载体用于靶向给药的初步研究与应用[D]. 吕鹏. 厦门大学, 2019(08)
- [6]补肾清毒法对HBV转基因小鼠先天免疫的作用观察[D]. 涂淮. 广州中医药大学, 2017(01)
- [7]人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究[D]. 赵月. 中国农业大学, 2014(03)
- [8]乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用[D]. 揣侠. 中国疾病预防控制中心, 2012(12)
- [9]WHV-HBV嵌合病毒复制型克隆构建及其持续复制小鼠模型的建立[D]. 潘丹珍. 华中科技大学, 2012(12)
- [10]表达HBV病毒受体SCCAI及AnnexinV的HBV易感小鼠模型的建立[D]. 李想. 陕西师范大学, 2010(03)