一、5-HT免疫组化染色观察尼莫地平于脊髓损伤中的保护作用（论文文献综述）
高强[1]（2021）在《星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究》文中进行了进一步梳理急性缺血性脑卒中（Acute Ischemic Stroke,AIS）,即急性脑梗死,中医称缺血性中风,是脑组织因局部的血流循环障碍缺血、缺氧而发生的软化、坏死。目前溶栓是治疗缺血性卒中急性期最快、最有效的方法,但由于适应证严格、时间窗短、出血和再灌注损伤风险高,其临床效果受到限制。基础与临床研究证实,中医药治疗中风独具优势。中医认为痰热腑实证是缺血性中风急性期最为常见的证型,而化痰通腑法代表方星蒌承气汤是治疗中风急性期痰热腑实证的代表性方剂。星蒌承气汤“脑病治肠”、“上病治下”的中医理论与现代医学提出的“菌-肠-脑轴”具有异曲同工之妙。诸多临床试验及系统性综述已证实星蒌承气汤治疗缺血性卒中的确切临床疗效与神经保护作用,但是其效应机制研究尚且不足。因此本文基于网络药理学及肠道微生态理论,深入探讨缺血性中风的肠道微生态机制及化痰通腑法代表方星蒌承气汤治疗中风痰热腑实证的效应机理。目的:基于中医“上病治下”理论与现代医学“菌-肠-脑轴”理论,（1）通过中药网络药理学与分子对接技术全面探讨星蒌承气汤治疗缺血性卒中的多组分、多靶点、多通路机制;（2）明确具有“化痰通腑”作用的星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠模型的神经保护作用,并验证网络药理学研究的关键靶点与通路;（3）探讨星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠模型肠道菌群的影响,探讨其治疗中风痰热腑实证“通腑”与“通便”差异的肠道微生态机制;（4）观察星蒌承气汤对伪无菌小鼠急性缺血性中风模型菌-肠-脑轴的影响,验证星蒌承气汤通过直接影响肠道菌群而改善脑卒中预后的假说。方法:（1）借助TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM及TCMID等数据库收集星蒌承气汤活性成分及作用靶点,并应用STITCH等对未找到靶点的化合物进行靶点预测。通过6个数据库挖掘缺血性卒中的靶点。通过GO和KEGG富集对交集靶点进行高级功能分析,并用cytoscape3.6.0构建PPI、化合物-靶点及药物-靶点-通路网络。最后进行分子对接验证。（2）雄性C57BL/6小鼠随机分为:假手术（Sham）组、模型（MCAO）组、星蒌承气汤（XCD）组、尼莫地平（Nim）组及舒泰清（PGE）组,通过制备高脂低纤维饮食复合线栓法的小鼠急性缺血性中风痰热腑实证模型,采用神经功能评分、除胶实验、TTC和TUNNEL染色,综合评价星蒌承气汤的神经保护作用,并运用ELISA、W estern blot等技术验证网药关键靶点与通路;（3）雄性C57BL/6小鼠随机分为:Sham组、MCAO组、XCD组、Nim组与PG E组,通过制备高脂低纤维饮食复合线栓法的小鼠急性缺血性中风痰热腑实证模型,采用高通量16srDNA基因测序、代谢组学技术、免疫组化、免疫荧光、ELISA及流式多因子技术分别对肠道菌群、短链脂肪酸（SCFAs）及其受体GPR43、神经-内分泌-免疫途径相关指标（NE及TH、血清MTL、脑IBA-1及GFAP、血清炎症因子）进行分析;（4）雄性C57BL/6小鼠在术前14天服用多种抗生素剔除肠道菌群后,随机分为:伪无菌假手术（ABX-Sham）组、伪无菌模型（ABX-MCAO）组以及伪无菌中药（ABX-XCD）组,通过神经功能评分、除胶实验、TTC染色以及高通量16srDNA基因测序、代谢组学技术、免疫组化、免疫荧光、ELISA及流式多因子技术,观察中药对伪无菌小鼠菌-肠-脑轴相关指标的影响。结果:（1）网络药理学及分子对接结果表明,星蒌承气汤包含51个活性成分及44个治疗缺血性卒中的交集靶点。高级功能分析显示星蒌承气汤抗缺血性卒中的机制与脂多糖介导的信号通路、凋亡过程的调控、炎症反应、内皮屏障的建立以及对脂肪酸的反应有关。星蒌承气汤发挥作用的有10条关键KEGG信号通路。PPI网络分析得到AKT 1,PTGS2,TNF,TP53,CASP3,IL1B等关键靶点。分子对接验证了星蒌承气汤活性成分与关键靶点具有良好的对接能力。（2）星蒌承气汤神经保护作用及对网络药理学关键靶点及通路的影响:①神经功能评分:与MCAO组相比,XCD组及Nim组术后48h及72h Longa评分降低（P<0.05）,PGE组未见变化（P>0.05）。②除胶实验:XCD组和Nim组术后48和72h的接触和去除胶带时间缩短（P<0.05）,PGE组未见变化（P>0.05）。③TTC染色:XCD组梗死面积下降（P<0.05）,Nim组及PGE组未见变化。④TUNNEL:MCAO组梗死区细胞凋亡明显增加,XCD组和Nim组TUNEL阳性染色减少（P<0.05）。⑤网络药理学验证:XCD组及Nim组TNF-α含量具有下降趋势（P>0.05）;XCD组p-AKT、PI3K及NF-κB蛋白表达具有升高趋势。AKT蛋白表达组间未见明显变化（P>0.05）。（3）星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠菌-肠-脑轴影响:①肠道菌群:与MCAO组相比,XCD组α多样性有升高趋势,Nim组及PGE组无显着变化。β多样性显示MCAO组与Sham组PCoA曲线有显着差异（P<0.05）。MCAO组拟杆与变形杆菌门显着增加,厚壁菌门显着减少;XCD组拟杆菌比例显着降低,疣微菌门显着增加,Nim组变形菌门显着增加,厚壁菌门进一步降低,PGE组菌群组成与MCAO相似,变形杆菌略降低。此外,XCD组Akkermansia比率增加,Nim组Klebsiella增加最为显着,而 PGE 组 Parabacteroides 和Escherichia/Shigella增加较为显着。②SCFAs 及GPR43:MCAO组的SCFAs含量显着降低（P<0.05）,XCD组丁酸含量增加（P<0.05）。XCD组及Nim组GPR43表达显着降低（P<0.05）。③自主神经途径:XCD组NE有下降趋势,PGE组NE有上升趋势（P>0.05）。MCAO组及PGE组TH蛋白表达上升（P<0.05）,XCD组及Nim组TH表达未见显着变化趋势（P>0.05）。④神经内分泌途径:MCAO组MTL显着升高（P<0.05）,PGE组有升高趋势（P>0.05）,XCD组及Nim组MTL显着下降（P<0.05）。⑤免疫途径:MCAO组星形胶质细胞增生、肥大,显着活化,小胶质细胞迅速从“静息态”转变为“激活态”,从梗死周边区域向病变部位募集,而XCD组星形胶质细胞及小胶质细胞活化较MCAO组降低。MCAO 组 TNF-α、IL-17A、IL-22 升高（P<0.05）,而 XCD 和 Nim 组的 IL-10显着升高（P<0.05）,TNF-α、IL-17A 和 IL-22 降低。（4）星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证伪无菌小鼠菌-肠-脑轴影响:①神经保护作用:与ABX-MCAO组相比,ABX-XCD组在Longa评分、除胶实验及TTC染色等方面未见显着变化（P>0.05）。②肠道菌群:ABX-MCAO和ABX-XCD组的α多样性低于ABX-Sham,PCoA分析显示ABX-XCD组肠道菌群的β多样性和组成与AB X-MCAO组相似。相对丰度结果显示,在ABX组中,小鼠的微生物区系均以变形杆菌为特征,这与正常小鼠有显着差异。LEfSe分析显示MCAO组富集了更多的病原体或机会性病原体,包括Bacteroidetes,EscherichiaShigella与Helicobacter,而 XCD富集了Verrucomicrobia和Akkermansia等有益菌群。条件致病菌如Streptococcus,Lact ococcus,Morganella,Klebsiella,Proteobacteria,Enterobacteriaceae 等在 ABX-XCD组富集显着增多。PGE组富集菌群主要有oSelenomonadales、cNegativicutes、gRomboutsia及fPeptostreptococcaceae。③SCFAs 及 GPR43:ABX-XCD 的丙酸显着下降（P<0.05）。ABX-MCAO 组 GPR43 表达显着上调（P<0.05）,ABX-XCD 组 G PR43表达显着降低（P<0.05）。④自主神经途径:ABX-XCD组NE含量未见显着变化（P>0.05）,TH蛋白表达未见显着变化（P>0.05）。⑤神经内分泌途径:ABX-MCAO组MTL升高趋势（P>0.05）,ABX-XCD组MTL未见显着变化（P>0.05）。⑥免疫途径:ABX-XCD组IL-22显着升高（P<0.05）,IL-17A有降低趋势（P>0.05）,余未见显着变化趋势（P>0.05）。ABX-MCAO组星形胶质细胞表达显着升高,小胶质细胞显着活化,ABX-XCD组星形胶质细胞及小胶质细胞活化较ABX-MCAO组有降低趋势。结论:星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠具有一定神经保护作用,其效应机制具有多成分、多靶点、多通路特点。其对伪无菌小鼠中风模型则未发现确切的脑保护效应,说明其脑保护的部分机制是通过改善肠道微生态实现的。其具体机制包括提高肠道短链脂肪酸,尤其是丁酸含量,增强肠道短链脂肪酸受体GPR43表达,增加血液IL10、减少TNF-α等炎性因子及MTL水平,最终减少梗死区域胶质细胞活化和神经细胞凋亡,从而达到中风脑保护的作用。本研究成果对中风病的临床治疗具有重要的指导意义——对于中风后便秘患者,仅仅“通便”治疗是不够的,需要结合患者的证候特点进行中医药“化痰通腑”治疗,才能取得好的临床效果。
胡卓瑶[2]（2021）在《基于HIF1-VEGF-Notch通路夏天无对血管性痴呆大鼠神经行为学的影响及其机制研究》文中提出目的:通过改良后双侧颈总动脉永久性结扎法（2-VO）制备血管性痴呆（vascular dementia,VD）大鼠模型,观察中药夏天无（Rhizoma Corydalis Decumbentis,RCD）对VD大鼠学习记忆能力、海马和皮质区形态学及细胞凋亡的影响,同时从HIF1-VEGF-Notch信号通路的角度出发,进一步探讨夏天无治疗VD的可能作用机制,旨在为活血化瘀药治疗VD提供实验依据。方法:1.分组、造模及给药:购入10-12周龄健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠为研究对象。造模前适应性饲养一周,随机选出14只大鼠作为假手术组（Sham）,剩余大鼠均使用改良2-VO法建立VD模型。造模完成后,按照数字表法将VD模型大鼠随机分为模型组（Model）、尼莫地平组（Nim）、低剂量夏天无组（RCD-L）、中剂量夏天无组（RCD-M）和高剂量夏天无组（RCD-H）。将夏天无及尼莫地平片配置成相应浓度的混悬液,各夏天无组依大鼠体重分别给予0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg夏天无混悬液灌胃,尼莫地平组给予0.01 g/kg尼莫地平混悬液灌胃,假手术及模型组给予等量生理盐水灌胃,连续灌胃40天。2.神经行为学检测:Morris水迷宫记录各组大鼠逃避潜伏期,目的象限停留时间、首次抵原平台象限时间、穿越平台次数及运行轨迹图,观察各组大鼠神经行为学差异。3.形态学观测:HE染色观察各组大鼠海马CA1及皮质区神经元病理学改变,尼氏（Nissl）染色观测海马CA1区及皮质区神经元数量变化、尼氏体分布情况及其突起的变化。4.细胞凋亡检测:TUNEL法原位观察各组大鼠海马CA1区及皮质区神经元的凋亡情况,Motic计数分析软件计数阳性细胞数量并评价凋亡水平。5.微血管密度（MVD）测定:免疫组化（SABC）法检测各组大鼠海马CA1区及皮质区CD34蛋白表达情况,选取3个视野运用Motic计数分析软件进行微血管计数,取平均值以评定缺血区血管新生情况。6.VEGF/VEGFR-2蛋白表达检测:采用SABC法检测各组大鼠海马CA1区及皮质区VEGF、VEGFR-2平均光密度值（AOD）,用Image pro plus图像分析系统对其进行分析。7.HIF-1α/VEGF/Notch通路蛋白表达检测:通过Western blot实验检测各组大鼠海马CA1区及皮质区中HIF-1α、VEGF及Notch蛋白的表达水平,运用Image J图像分析系统测定条带灰度值并对其进行数据分析。8.数据统计与分析:记录并统计所有数据,数据采用SPSS21.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差（±s）表示,定位航行实验采用重复测量多因素方差分析,其他实验结果采用单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义,使用Graph Pad Prism 9绘制统计图表。结果:1.夏天无对VD大鼠神经行为学的影响:定位航行实验开展次日,模型组较假手术组大鼠逃避潜伏时间显着延长（P<0.05）,后3日其潜伏时间持续维持较高水平状态（P<0.01）,且运行轨迹冗长、杂乱。空间探索实验中,模型组较假手术组大鼠穿越原平台位置的次数明显减少（P<0.01）,于目的象限停留时间明显缩短（P<0.01）,首次抵原平台时间延长（P<0.01）。与模型组比较,各治疗组逃避潜伏时间、首次抵原平台时间均相对缩短（P<0.05,P<0.01）,其中夏天无中、高剂量组及尼莫地平组差异显着（P<0.01）,且穿越原平台位置次数显着增多（P<0.01）,于目的象限停留时间明显增多（P<0.01）,运行轨迹明显简单。2.夏天无对VD大鼠海马CA1区及皮质区神经元的形态学影响:HE染色显示,假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞层次清晰,排列紧密,核仁明显;模型组海马CA1区细胞层次减少,锥体细胞发生固缩坏死,皮质区神经元深染,坏死明显;各治疗组较模型组海马CA1区及皮质区病理学改变呈不同程度减轻,其细胞层次较清晰,排列较紧密,其中以夏天无中、高剂量组及尼莫地平组较为明显。3.夏天无对VD大鼠海马CA1区及皮质区神经元数量的影响:尼氏染色显示,假手术组大鼠海马CA1区及皮质区锥体细胞突起明显,Nissl小体丰富,形态完整。与其比较,模型组CA1区及皮质区锥体细胞数量显着减少（P<0.01）,Nissl小体明显减少。夏天无中、高剂量组及尼莫地平组较模型组CA1区及皮质x区锥体细胞数量显着增多（P<0.01）,Nissl小体数量增多,突起较为明显。TUNEL实验结果显示,模型组较假手术组凋亡神经元数量明显增加（P<0.01）。而与模型组比较,夏天无低剂量组可减少神经元凋亡（P<0.05）,夏天无中、高剂量组及尼莫地平组阳性凋亡细胞呈极显着减少（P<0.01）。4.夏天无对VD大鼠海马CA1区及皮质区MVD的影响:与假手术组比较,模型组海马CA1区及皮质区MVD显着增加（P<0.05,P<0.01）。各治疗组较模型组海马CA1区及皮质区MVD均不同程度增加（P<0.05,P<0.01）,其中夏天无中、高剂量组及尼莫地平组MVD呈极显着增加（P<0.01）,而夏天无高剂量组较尼莫地平组皮质区MVD明显增加（P<0.05）。5.夏天无对VD大鼠VEGF/VEGFR-2蛋白AOD值的影响:结果显示,模型组较假手术组海马CA1区及皮质区中VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平极显着升高（P<0.01）;与模型组比较,夏天无低剂量组可提高VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平,差异有统计学意义（P<0.05）,夏天无中、高组及尼莫地平组可显着提高VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平（P<0.01）,而夏天无高剂量组较尼莫地平组皮质区VEGFR-2蛋白表达水平明显提高（P<0.05）。6.夏天无对VD大鼠HIF-1α/VEGF/Notch蛋白表达的影响:Western blot实验显示,与假手术组比较,模型组大鼠海马CA1区组织中HIF-1α、VEGF及Notch蛋白含量均增高（P<0.05）;低剂量夏天无组较模型组,HIF-1α、VEGF及Notch蛋白含量总体呈上升趋势（P<0.05）,夏天无中、高剂量组及尼莫地平组HIF-1α、VEGF及Notch蛋白含量显着提高,呈极显着差异（P<0.01）。结论:1.夏天无对VD大鼠学习记忆能力具有一定改善作用。2.夏天无在一定程度上可减轻脑组织的病理性损伤,减少神经元凋亡,从而发挥神经保护的作用。3.夏天无可通过增加VD大鼠脑组织内微血管密度改善其血液供应。4.夏天无对VD大鼠的神经保护作用可能与其干预HIF1-VEGF-Notch信号通路,从而诱导血管新生有关。
吴爽[3]（2020）在《血塞通对MCAO大鼠及OGD/R损伤SH-SY5Y细胞Lingo-1及EGFR/PI3K/Akt通路和BDNF的作用机制研究》文中认为研究目的:1.探究血塞通对大鼠大脑中动脉局灶性梗死术后14天的神经保护作用,以及对Lingo-1和对其下游EGFR/PI3K/Akt信号通路和BDNF的调控作用。2.探究血塞通对氧糖剥夺/再灌注损伤SH-SY5Y细胞的体外保护作用,以及对PI3K/Akt信号通路和BDNF的调节作用。研究方法:1.取SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠,通过改良Longa线栓法来建立大脑中动脉局灶性梗死（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）模型（右侧）,大鼠手术后苏醒,再使用EZ Longa评分量表进行评分,1-3分则纳入实验。将造模成功的大鼠进行随机分组,组别为模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组。假手术组大鼠不进行MCAO手术,仅沿颈正中切开皮肤,将颈总动脉、颈内和颈外动脉完全暴露后,缝合皮肤即可。TTC染色法评价MCAO模型建立的效果。2.根据前期研究和大鼠与人的体表面积等效药物剂量换算,各组大鼠的给药方式分别为:假手术组、模型组大鼠每日腹腔注射生理盐水,剂量为l mL/100g;PNS小剂量组每日腹腔注射剂量为3.6 mg/100g的血塞通;PNS大剂量组大鼠每日进行7.2 mg/100g腹腔注射血塞通;尼莫地平组大鼠每日予1.44 mg/100g尼莫地平灌胃。（1）模型建立后1-14天,每日观察记录大鼠的一般状态、神经功能学评分及体重变化。（2）造模14天后,取大鼠脑组织,进行HE染色,观察脑组织的病理形态变化。Western Blot方法检测大鼠梗死侧大脑皮质中PSD-95、SYN的蛋白表达情况,实时荧光PCR法（qRT-PCR）及免疫组织化学染色,观察BDNF表达情况。（3）通过qRT-PCR方法、免疫组织化学染色法和Western Blot法进一步探究血塞通对Lingo-1及其下游EGFR/PI3K/Akt通路的作用。3.首先对SH-SY5Y细胞进行培养并建立氧糖剥夺/再灌注损伤模型（Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R）,用CCK8法测定细胞存活率来确定最佳OGD/R时间及血塞通的最适干预浓度。（1）将培养的细胞分为正常组、模型组、PNS组,模型组和PNS组提前进行OGD/R模型的建立,qRT-PCR和Western Blot法检测BDNF表达情况。（2）将培养的细胞分为正常组、模型组、PNS组、PNS+LY294002组、LY294002组五个组。除正常组外,每组给予相应的OGD/R处理及合适的药物干预。通过qRT-PCR及Western Blot方法检测血塞通对细胞PI3K/Akt信号通路的调控作用。研究结果:1.动物实验部分实验一:TTC染色结果显示,MCAO手术组大鼠脑组织切片梗死侧（右侧）可见连续的苍白色梗死灶,左侧呈现均匀的红色,说明模型建立成功。体重指数:术前各组大鼠体重未见明显差异（P>0.05）。术后第1天、第3天、第7天和第14天,与假手术组相比,模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组大鼠的体重指数明显降低（P<0.01）。假手术组大鼠体重指数随着时间推移逐渐升高,模型组和PNS小剂量组大鼠体重指数随着时间推移逐渐降低,PNS大剂量组和尼莫地平组大鼠体重指数在第1-7天逐渐降低,7天后维持在一定水平,无明显下降。假手术组和模型组大鼠术后14天体重指数较术后第1天显着变化,假手术组显着增加（P<0.01）,模型组显着减少（P<0.05）。mNSS神经功能评分:各手术组造模后EZ Longa评分未见明显差异（P>0.05）。模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组和尼莫地平组MCAO大鼠在给药1天、3天、7天和14天的mNSS神经功能评分均较假手术组高（P<0.01）,且各组MCAO大鼠的mNSS评分随着时间推移逐渐降低。与模型组相比,PNS大剂量组给药3天后的mNSS评分显着降低（P<0.05）。模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组和尼莫地平组MCAO大鼠给药14天后,mNSS评分均较给药第1天明显降低（P<0.05,P<0.01）。PNS大剂量组第1天和第14天mNSS评分差值变化较模型组显着（P<0.05）,而PNS小剂量组和尼莫地平组较模型组相比,未见明显变化。实验二:MCAO术后14天,模型组大鼠PSD95蛋白的表达量较假手术组明显降低（P<0.05）,PNS大剂量组和尼莫地平组PSD95蛋白的表达量较模型组显着升高,具有统计学差异（P<0.05）,PNS小剂量组PSD95蛋白表达的均值较模型组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。模型组SD大鼠SYN蛋白的表达量较假手术组明显降低（P<0.05）,PNS大剂量组SYN蛋白的表达较模型组显着升高,具有统计学差异（P<0.01）,PNS小剂量组和尼莫地平组SYN蛋白表达的均值较模型组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组大鼠BDNF的mRNA表达水平较假手术组显着降低,具有统计学差异（P<0.01）。与模型组相比,PNS大剂量组大鼠BDNF的mRNA表达水平明显升高,具有统计学差异（P<0.01）。免疫组化结果显示,PNS大剂量组和尼莫地平组大鼠脑组织的免疫阳性物质较模型组的分布更为广泛。实验三:MCAO术后14天,qRT-PCR法检测大鼠脑组织梗死侧Lingo-1、EGFR、PI3K、Akt的mRNA的表达情况:模型组大鼠Lingo-1的mRNA的表达量较假手术组明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。PNS大剂量组和尼莫地平组Lingo-1的mRNA表达较模型组显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。PNS小剂量组Lingo-1的mRNA表达与模型组相比,未见明显降低（P>0.05）。模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组和尼莫地平组四个组的EGFR、PI3K、Akt的mRNA表达水平较假手术组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。Western Blot 法检测大鼠脑组织梗死侧 Lingo-1 和 p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白的表达情况:MCAO术后14天,模型组大鼠Lingo-1蛋白表达量较假手术组明显升高（P<0.01）,PNS大剂量组、尼莫地平组Lingo-1蛋白表达量较模型组显着降低（P<0.05）,PNS小剂量组Lingo-1蛋白表达量均值较模型组减少,但未见统计学差异（P>0.05）。模型组大鼠p-EGFR/EGFR表达较假手术组明显降低,具有统计学差异（P<0.05）,PNS大剂量组和尼莫地平组p-EGFR/EGFR蛋白的比值较模型组明显升高,具有统计学差异（P<0.05）,PNS小剂量组p-EGFR/EGFR蛋白比值的均值较模型组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。模型组大鼠p-PI3K/PI3K蛋白的比值较假手术组明显降低（P<0.05）,PNS小剂量组p-PI3K/PI3K蛋白的比值较模型组相比显着升高（P<0.05）,PNS大剂量组和尼莫地平组p-PI3K/PI3K的均值较模型组高,但无统计学意义（P>0.05）。模型组大鼠p-Akt/Akt蛋白的比值较假手术组明显降低（P<0.01）,PNS大剂量组和尼莫地平组p-Akt/Akt蛋白的表达较模型组显着升高,具有统计学差异（P<0.05）,PNS小剂量组p-Akt/Akt蛋白比值的均值较模型组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。免疫组织化学染色法检测大鼠脑组织中Lingo-1、p-EGFR、p-PI3K、p-Akt的表达情况:免疫阳性物质被染成深棕色,呈颗粒状或点状散在分布,表达趋势与Western Blot一致。2.细胞实验部分实验四:根据CCK8的测定结果,选择7h为最佳氧糖剥夺时间,此时SH-SY5Y细胞存活率为62.36%,细胞既受到OGD/R的损伤,又能保证大多数细胞活力。选择20 μ g/mL作为血塞通药物的干预浓度,此时SH-SY5Y细胞的存活率最高。血塞通对OGD/R的SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响:SH-SY5Y细胞OGD/R损伤后,与正常组相比,模型组的BDNF mRNA表达显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）,PNS组BDNF mRNA的表达水平较模型组显着增高,有统计学差异（P<0.01）。与正常组相比,模型组的BDNF蛋白表达显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）,PNS组的BDNF蛋白表达较模型组显着升高,具有统计学差异（P<0.01）。实验五:血塞通对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞PI3K/Akt通路的影响:将细胞分为五组,分别为正常组、模型组、PNS组、PNS+LY294002组、LY294002组。SH-SY5Y细胞OGD/R损伤后,正常组、PNS组、PNS+LY294002组、LY294002组Akt mRNA的表达与模型组之间未见差异（P>0.05）。模型组p-Akt与Akt总蛋白比值与正常组相比显着升高,具有统计学差异（P<0.05）,PNS组p-Akt/Akt蛋白表达较模型组相比显着增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,PNS+LY294002组p-Akt/Akt蛋白表达较模型组相比未见明显差异（P>0.05）,LY294002组p-Akt/Akt蛋白表达较模型组相比显着降低,具有统计学意义（P<0.01）。研究结论:1.血塞通能促进MCAO大鼠体重指数的增长、改善神经功能,提高SYN、PSD95和BDNF的表达,促进脑梗死大鼠的神经突触形成和神经功能的恢复。2.血塞通可抑制大鼠梗死侧脑组织Lingo-1的过度表达,同时激活EGFR/PI3K/Akt信号通路,提高其磷酸化水平,发挥神经保护作用。3.血塞通能提高OGD/R SH-SY5Y细胞的活力,通过激活PI3K/Akt信号通路,提高BDNF的表达,促进受损神经细胞的存活、再生,发挥神经保护作用。
刘峻呈[4]（2020）在《安脑平冲汤对脑出血模型大鼠脑水肿及TRPV4、KCa3.1表达的影响》文中研究说明目的:研究安脑平冲汤对脑出血模型大鼠TRPV4、KCa3.1蛋白表达及血清TNF-α、ICAM-1浓度的影响,探讨其对脑出血大鼠脑水肿治疗作用及神经保护机制。方法:参照随机数字表法将SD大鼠分为:假手术组、模型组、安脑平冲汤低剂量组、安脑平冲汤高剂量组、尼莫地平组、HC-067047组（TRPV4抑制剂）,采用大鼠自体血尾状核注入法制作脑出血模型,每组设立6h、24h、3d、7d四个亚组,造模后各组予以相应药物进行干预,假手术组、模型组均给予同等剂量的蒸馏水。各实验组大鼠在相应时间点进行神经功能缺损评分,然后将大鼠断头取出脑组织、抽取腹主动脉血液,进行脑含水量、HE染色、酶联免疫吸附法检测血清TNF-α、ICAM-1浓度,免疫组化法和蛋白免疫印迹法检测第3d血肿周围脑组织TRPV4和KCa3.1蛋白表达。结果:1.神经功能缺损评分:与假手术组比较,脑出血造模各组在不同时间点的神经功能缺损评分均明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各药物组在脑出血后第24h、3d、7d的神经功能缺损评分均低于模型组（P<0.05）;与HC-067047组比较,安脑平冲汤低剂量组、安脑平冲汤高剂量组、尼莫地平组在脑出血第7d的神经功能缺损评分均明显降低（P<0.05）;与安脑平冲汤低剂量组、尼莫地平组比较,安脑平冲汤高剂量组在脑出血后第7d的神经功能缺损评分均明显降低（P<0.05）。2.脑组织含水量:与假手术组比较,脑出血造模各组在不同时间点的脑组织含水量均明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各药物组在脑出血后第24h、3d、7d的脑组织含水量均低于模型组（P<0.05）;与安脑平冲汤低剂量组、尼莫地平组、HC-067047组比较,安脑平冲汤高剂量组在脑出血后第7d的脑水肿程度均明显降低（P<0.05）。3.HE染色:模型组、安脑平冲汤组、尼莫地平组、HC-067047组在脑出血后6h的脑组织损伤情况基本一致。与模型组比较,安脑平冲汤组、尼莫地平组、HC-067047组均能有效改善脑出血后24h、3d、7d的脑组织损伤。4.酶联免疫吸附法检测:（1）TNF-α:与假手术组比较,脑出血造模各组在不同时间点的TNF-α浓度均明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各药物组在脑出血后第24h、3d、7d的TNF-α浓度均低于模型组（P<0.05）;与安脑平冲汤低剂量组、尼莫地平组、HC-067047组比较,安脑平冲汤高剂量组在脑出血第3d、7d的TNF-α浓度均明显降低（P<0.05）。（2）ICAM-1:与假手术组比较,脑出血造模各组在不同时间点的ICAM-1浓度均明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各药物组在造模成功后第24h、3d、7d的ICAM-1浓度均低于模型组（P<0.05）;与安脑平冲汤低剂量组、尼莫地平组、HC-067047组比较,安脑平冲汤高剂量组在脑出血后第3d、7d的ICAM-1浓度均明显降低（P<0.05）。5.免疫组化检测:大鼠第3d血肿周围脑组织TRPV4、KCa3.1结果显示:与假手术组比较,脑出血模型各组的TRPV4、KCa3.1表达均明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各药物组的TRPV4、KCa3.1表达均低于模型组（P<0.05）;与安脑平冲汤低剂量组比较,安脑平冲汤高剂量组、尼莫地平组、HC-067047组的TRPV4、KCa3.1表达均明显降低（P<0.05）。6.蛋白免疫印迹检测:（1）各实验组大鼠第3d血肿周围脑组织TRPV4结果显示:与假手术组比较,模型组的TRPV4蛋白表达明显上调,安脑平冲汤高剂量组、尼莫地平组、HC-067047组的TRPV4蛋白表达均明显降低（P<0.05）;与模型组比较,各药物干预组的TRPV4蛋白表达均降低（P<0.05）;与安脑平冲汤低剂量组比较,安脑平冲汤高剂量组、尼莫地平组、HC-067047组的TRPV4表达均明显降低（P<0.05）;与安脑平冲汤高剂量组比较,尼莫地平组、HC-067047组的TRPV4表达均明显降低（P<0.05）。（2）各实验组大鼠第3d血肿周围脑组织KCa3.1结果显示:与假手术组比较,模型组、安脑平冲汤低剂量组的KCa3.1蛋白表达均明显上调,尼莫地平组、HC-067047组的KCa3.1蛋白表达均明显降低（P<0.05）;与模型组比较,各药物干预组的KCa3.1蛋白表达均降低（P<0.05）;与安脑平冲汤低剂量组比较,安脑平冲汤高剂量组、尼莫地平组、HC-067047组的KCa3.1表达均明显降低（P<0.05）;与安脑平冲汤高剂量组比较,尼莫地平组、HC-067047组的KCa3.1表达均明显降低（P<0.05）。结论:1.脑出血模型大鼠血肿周围脑组织TRPV4、KCa3.1表达增加,血清TNF-α、ICAM-1浓度升高。2.安脑平冲汤能有效地改善脑出血模型大鼠神经功能缺损评分,减轻脑水肿,抑制炎症反应,从而发挥对脑出血的治疗作用,且其治疗作用具有一定的量效关系。3.可能机制:下调TRPV4、KCa3.1的表达,减轻细胞内钙离子超载,抑制神经小胶质细胞活化,减少血清TNF-α、ICAM-1的浓度,抑制炎症反应,从而减轻脑水肿,发挥神经功能保护的作用。
张睿[5]（2020）在《缺血后适应干预大鼠脊髓再灌注损伤时对CaSR和Caspase-12的影响》文中研究表明目的:验证缺血后适应（Ischemic post-conditioning,IPC）对大鼠脊髓缺血再灌注损伤（Spinal cord ischemia reperfusion injury,SCIRI）的保护作用并检测其对钙敏感受体（Calcium-sensing receptor,CaSR）及内质网应激相关标志物Caspase-12表达的影响。方法:五十只SD大鼠被完全随机化等分为5个组（为充分避免因不同动物个体之间的差异而产生随机误差）:假手术组（Sham组）,缺血再灌注模型组（IR组）,IR模型+缺血后适应组（IPC组）,IPC组+激动剂（IPC-GdCl3组）和IR模型+抑制剂组（NPS2390组）。Sham组在手术中只需显露大鼠腹主动脉的一段而不用动脉夹阻断血流,其余各组阻断腹主动脉25分钟左右后再松开,构建脊髓IR模型;IPC组于恢复血流3-4分钟后给予三个周期的缺血后适应操作;IPC-GdCl3组在连续2天尾静脉注射CaSR激动剂GdCl3后行IPC组操作;对于NPS2390组我们采取的干预方法是提前2天,每天通过尾静脉注射一定量的NPS2390,随后建立IR模型。通过3B评分法对大鼠后肢运动功能进行评价来推测脊髓再灌注损伤的程度区别,我们选用TUNEL法检测脊髓组织中细胞凋亡数目并通过蛋白质免疫印迹技术及免疫组织化学定量检测CaSR及Caspase-12表达后记录数据予以分析。结果:1.除Sham组以外其余4组大鼠3B评分均少于Sham组（P<0.05）,对于IPC组及NPS2390组,分数则分别多于IR组和IPC-GdCl3组（P<0.05）。2.TUNEL法阅片记录显示,假手术组仅能看到零星的阳性反应;IR组和IPC-GdCl3组阳性细胞数目多于IPC组及NPS2390组（P<0.05）。3.蛋白免疫印迹检测结果可见,建模各组CaSR及Caspase-12蛋白印迹表达量显着高于假手术组（P<0.05）;IR组及IPC-GdCl3组的CaSR及Caspase-12表达量分别高于IPC组及NPS2390组（P<0.05）。4.免疫组织化学结果可见,除Sham组以外的其余建模各组CaSR及Caspase-12蛋白表达高于假手术组（P<0.05）;IR组及IPC-GdCl3组的CaSR及Caspase-12表达量分别高于IPC组及NPS2390组（P<0.05）。结论:1.缺血后适应能够对大鼠脊髓缺血再灌注损伤起到一定程度的恢复作用并改善相关功能损害;2.缺血后适应在保护过程中可抑制脊髓组织中CaSR及Caspase-12的表达。
周哲屹[6]（2019）在《瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究》文中研究说明目的:本实验主要分为三个部分,第一个实验主要探讨瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护的作用,观察MCAO术后,在6h、24h、72h、7d、14d较长时间段神经功能缺损的情况及瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑梗塞体积及脑组织细胞形态学的影响,同时与经典的艾灸治疗,以及NK-κ B抑制剂NAC及NAC联合神火灸做对比;第二部分观察瑶医神火灸对氧化应激、炎症、细胞凋亡相关指标的影响;第三部分探讨瑶医神火灸是否通过介导NF-κ B炎症通路起神经保护作用及相关机制研究。方法:对于整体的动物实验方案:（1）使用线栓法进行阻塞大脑中动脉（MCAO法）建立实验大鼠缺血再灌注损伤动物模型,缺血2h,再灌注24h,观察大鼠行为学,使用Zea-longa评分法观察大鼠神经功能缺损评分情况,评价造模是否成功。将实验大鼠采用随机数字法分为六组:假手术组、模型组、神火灸治疗组、艾灸治疗组、NAC组、神火灸+NAC组;治疗组采用神火灸、艾灸治疗,NAC采用脑室注入方法干预,（1）观察不同时段（6h、24h、72h、7d、14d）神经功能评分;（2）TTC法检测脑梗塞体积;（3）HE染色观察脑组织切片的形态学变化;（4）尼氏染色观察神经元损伤情况;（5）氧化应激相关生化指标的检测:于14d采集大鼠外周血,取血分离血清,ELISA法观察血清中MDA、SOD活性情况;（6）于14d采集大鼠外周血,取血分离血清,ELISA法观察血清炎症因子TNF-α、IL-1、IL-10的表达情况;（7）观察各组TUNNEL细胞凋亡情况;（8）采用免疫组化法、Western Blotting法、qPCR法测各组NF-κ B通路相关蛋白（Cox-2、iNOS、NF-κ B/p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3）,确定瑶医神火灸治疗对相关通路蛋白和下游凋亡因子的影响。结果:1、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经功能缺损的影响Sham（假手术组）大鼠行为、肢体功能无异常表现,评分:0分。而模型组出现向对侧转圈或者倾倒等神经功能缺失,和假手术组比较模型组神经功能缺损评分具有显着性差异。各治疗组在缺血再灌注6h、24h、72h时神经功能缺损评分无显着性差异（P>0.05）,在I/R后72h时,神火灸治疗组和艾灸治疗组与模型组相比,神经功能缺损并未出现显着改善（P>0.05）,而在治疗7d时,神火灸治疗组神经功能缺损较模型组有降低（P<0.05）,效果持续至14天更明显（P<0.01）。艾灸组与模型组比较对神经功能缺损的影响并不明显（P>0.05）。而NAC组作为一种抗氧化剂,在使用7d、14d明显起效,显着改善I/R大鼠神经功能缺陷,与模型组比较具有显着性差异（P<0.01）,与神火灸组疗效相当（P>0.05）;和模型组比较,NAC+神火灸在7d、14d出现神经功能缺损评分降低（P<0.01）。14d时,神火灸+NAC联用神经功能缺损评分数值下降,但和单用神火灸比较差异并不显着。2、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑损伤体积的影响通过图像分析软件分析及计算,与假手术组比较,TTC染色后MCAO术后大鼠冠状脑组织切片可见明显脑梗塞病灶（P<0.01）,在治疗开始的24h时,梗塞体积未见明显差异,说明各治疗组在24h内均未对I/R大鼠脑梗死体积产生影响;14d时,艾灸组脑梗死体积与模型组比较具有统计学差异（P<0.05）;神火灸组、NAC组和NAC+神火灸治疗组与模型组比较,大鼠梗死体积下降明显,统计具有显着差异（P<0.01）,说明神火灸对脑梗死体积的神经保护作用较明显,NAC也具有神经保护的作用,其保护作用神火灸和NAC 比较对脑梗塞体积的影响未见明显差异,神火灸和NAC联用梗死体积数值下降,但和单用神火灸比较差异并不显着（P>0.05）。3、神火灸对动物大鼠的缺血再灌注损伤缺血脑组织相关病理学影响HE染色结果提示,假手术组（sham）大鼠脑组织细胞形态学基本正常,而模型组大鼠出现缺血中心神经细胞坏死,组织结构排列紊乱,细胞间隙增宽,细胞肿胀,核固缩,结构严重破坏;而神火灸治疗可改善神经元细胞死亡率,减轻缺血再灌注损伤,相对于模型组,其神经细胞异常相对较轻,核膜完整、染色质均匀一致、细胞器破坏较少;艾灸组其形态学改变和神火灸组基本一致;而NAC和NAC+神火灸治疗组大鼠缺血脑组织于镜下可见神经肿胀较轻,较模型组坏死细胞的数量显着减少,说明NAC作为抗氧化剂保护作用明确,和神火灸联用时炎症细胞浸润减少,细胞坏死、核固缩情况明显减轻。4、Nissl染色法观察缺血脑组织神经元数目Nissl染色结果显示,与模型组相比,神火灸和艾灸治疗组Nissl小体的数量增多,细胞形态较为正常,结构较为完整,提示灸治疗可减少I/R后神经元的损伤;而NAC组和NAC+神火灸治疗组Nissl小体的数量更多,大部分细胞形态正常,结构完整,说明NAC和NAC+神火灸治疗明显促进了脑缺血组织神经元存活。5、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠MDA、SOD表达情况的影响本实验显示,脑缺血再灌注造模后,与假手术组比,模型组MDA水平明显上升（P<0.01）,SOD活化明显降低（P<0.01）,表明氧化应激损伤明显,SOD活性受到明显抑制,抗氧化能力减低。使用艾灸干预时,MDA水平下降,与模型组相比具有统计学差异（P<0.05）,SOD活性上升（P<0.05）;神火灸干预后,MDA水平明显下降（P<0.01）,SOD活性明显上升（P<0.01）,说明神火灸治疗能够显着提高SOD的活化能力,增强I/R损伤大鼠脑组织抗氧化应激的能力,减轻氧化应激相关损伤,并通过抗脂质过氧化相关反应对I/R损伤起保护作用。而在给予NAC侧脑室注射及NAC联合神火灸治疗时,缺血再灌注大鼠脑组织的SOD活力明显升高（P<0.01）,MDA含量明显降低（P<0.01）,其抗氧化效果优于单用神火灸（P<0.05）,提示NAC可调节缺血再灌注损伤引起的机体氧自由基释放、氧化还原应激失衡状态,减轻机体的氧化应激损伤,在与瑶医神火灸联合使用时,对SOD活性的激活和降低MDA含量方面明显优于单独使用神火灸（P<0.01）。6、瑶医神火灸对炎症因子表达情况的影响（TNF-α、IL-1、IL-10）研究结果显示,14d时,与Sham组比较,模型组TNF-α、IL-1 β、IL-10水平显着上升（P<0.01）;与模型组比较,神火灸组和艾灸治疗组干预后TNF-α、IL-10、IL-1 β水平下降具有显着性差异（P<0.01）;NAC组和NAC+神火灸治疗组TNF-α、IL-1 β、IL-10水平与神火灸治疗组具有相同变化趋势,与模型组比较水平下降明显（P<0.01）。而与神火灸组比较,NAC+神火灸联用TNF-α、IL-1 β水平明显下降（P<0.01）,IL-10也有所下降（P<0.05）,说明NAC和神火灸联用对炎症因子的降低作用更明显。7、瑶医神火灸对细胞凋亡的影响本实验显示,脑缺血再灌注造模后,与假手术组相比,模型组Tunel阳性细胞明显增加,表明细胞凋亡显着增加。使用艾灸和神火灸干预后,Tunel阳性细胞明显减少,与模型组相比,具有明显统计学差异（P<0.01）,说明神火灸治疗能够一定程度上减少缺血脑组织细胞的凋亡,对I/R损伤起保护作用。而在给予NAC侧脑室注射及NAC联合神火灸治疗时,缺血再灌注大鼠脑组织的细胞凋亡较模型组明显降低（P<0.01）,提示NAC可明显减轻缺血脑组织细胞凋亡。与神火灸组比较,NAC及NAC联合神火灸使用对细胞凋亡率的影响差异不显着（P>0.05）。8、瑶医神火灸对NF-κ B通路相关蛋白及下游凋亡因子的影响（Cox-2、iNOS、NF-κ B/p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3）8.1脑组织中Cox-2、iNOS表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）研究结果提示,在缺血再灌注损伤后,和Sham组相比,免疫组化法显示模型组大鼠脑组织中Cox-2、iNOS阳性表达细胞增加（P<0.01）,脑组织中Cox-2和iNOS蛋白含量增加（P<0.01）,Cox-2 mRNA 和 iNOS mRNA 含量升高（P<0.01）,提示 Cox-2、iNOS参与了缺血再灌注损伤的过程;与模型组相比,艾灸组Cox-2免疫组化阳性细胞表达、Cox-2蛋白表达显着减少（P<0.01）,Cox-2mRNA含量减少（P<0.05）,iNOS 阳性细胞表达减少（P<0.05）,iNOS蛋白表达、iNOSmRNA含量显着减少（P<0.01）。与模型组比较,神火灸治疗可以明显降低Cox-2、iNOS阳性细胞表达,降低脑内Cox-2、iNOS蛋白的表达和脑内Cox-2、iNOSmRNA含量,结果具有显着统计学差异（P<0.01）,提示神火灸和艾灸一样,具有抑制Cox-2和iNOS保护脑组织的作用,并且与神火灸组相比,艾灸对iNOS 阳性细胞的表达明显升高（P<0.01）,iNOS蛋白表达增加（P<0.05）,提示神火灸抑制iNOS表达的作用优于艾灸组。而对于NAC组和NAC+瑶医神火灸治疗组,Cox-2、iNOS 阳性表达细胞减少,脑组织中Cox-2和iNOS蛋白含量减少,Cox-2 mRNA和iNOS mRNA含量减少较模型组更明显（P<0.01）,说明NF-κ B的抑制剂NAC可以明显减少Cox-2、iNOS的阳性表达,逆转脑组织缺血后的损伤,促进神经功能修复。与神火灸组比较,NAC+神火灸联用对Cox-2阳性细胞的表达、Cox-2、iNOS蛋白含量和Cox-2、iNOS mRNA的表达水平下降更为明显（P<0.01）,提示联合应用对Cox-2、iNOS的影响明显优于单独使用神火灸。8.2脑组织中NF-κ B/p65表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）本研究结果提示,在脑缺血再灌注14d后,免疫组化结果显示,与Sham组比较,模型组缺血脑组织NF-κ B p65阳性表达增多（P<0.01）,说明NF-κ B p65被激活,同时NF-κ B p65移位到胞核内的阳性细胞数增多,同时WB提示NF-κ B p65蛋白的表达增加（P<0.01）,qPCR 提示 NF-κ B p65 mRNA 上调（P<0.01）,说明 NF-κ B p65通路被激活。与模型组比较可以看出,艾灸治疗可以减少缺血脑组织NF-κ B/p65阳性细胞表达（P<0.05）、降低脑内NF-κ B/p65蛋白表达（P<0.05）,显着减少脑内NF-κB/p65mRNA表达（P<0.01）,而神火灸减少NF-κ B/p65阳性细胞表达、蛋白表达及脑内NF-κ B/p65mRNA表达更明显（P<0.01）,提示神火灸和艾灸治疗可能是通过抑制缺血脑组织NF-κ B/p65表达起到减轻MACO大鼠I/R脑损伤作用。而在降低脑内NF-κ B/p65蛋白表达方面,神火灸组优于艾灸组（P<0.05）。而NAC和NAC+神火灸可以显着减少NF-κ B/p65阳性细胞表达、蛋白表达及脑内NF-κ B/p65mRNA表达（P<0.01）,效果显着,并且NAC和神火灸联用对NF-κ B/p65的作用显着优于单一的神火灸治疗（P<0.01）。8.3脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）本实验通过对I/R大鼠的免疫组化、Western blot及qPCR检测发现,与Sham组相比MCAO组Bax、caspase-3明显升高（P<0.01）,Bcl-2水平明显降低（P<0.01）。与模型组比较,艾灸治疗组Bax阳性细胞表达明显减少（PP<0.01）,Bcl-2阳性细胞增加、caspase-3 阳性细胞表达减少无统计学意义（P>0.05）,脑内Bax、caspase-3蛋白表达下降（P<0.01）,脑内Bax mRNA表达减少（P<0.05）、Caspase-3 mRNA表达显着减低（P<0.01）;脑内Bcl-2蛋白增加无显着意义（P>0.05）,Bcl-2 mRNA水平增加（P<0.05）;说明艾灸对于Bax、caspase-3、Bcl-2的调节具有一定作用,但是作用不稳定,各种检测结果存在差异。而与模型组相比,神火灸组Bax、caspase-3阳性细胞表达减少（P<0.01）,Bcl-2阳性细胞表达升高（P<0.05）;Bax、caspase-3蛋白表达下降（P<0.01）,Bcl-2 蛋白表达上升（P<0.01）,脑内 Bax mRNA、caspase-3 mRNA表达下降明显（P<0.01）,及脑内Bcl-2mRNA表达上升（P<0.01）,说明神火灸治疗可以通过影响细胞内Bcl-2、Bax、caspase-3等相关凋亡因子的水平从而影响细胞凋亡,并且和艾灸组比较,神火灸对降低Bax、Caspase-3蛋白表达的作用优于艾灸（P<0.01）。对于NAC组及神火灸+NAC组,caspase-3、Bax阳性细胞表达、脑内蛋白水平和mRNA水平下降更为明显（P<0.01）,Bcl-2阳性细胞表达、脑内蛋白水平和mRNA水平明显上升（P<0.01）,提示NAC具有影响相关凋亡因子抗凋亡的作用,联合神火灸使用对于细胞凋亡途径的影响作用更强,和神火灸单一治疗比较差异具有显着统计学意义（P<0.01）,联合治疗可以起到较强抗凋亡的神经保护作用。结论:1.神火灸改善了脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损情况,减轻了缺血脑组织形态和病理学改变,对缺血再灌注大鼠具有神经保护的作用。2.瑶医神火灸对脑缺血再灌注大鼠损伤的神经保护作用与抗炎、抗氧化、抗凋亡的机制可能相关;3.瑶医神火灸对神经保护的作用机制可能是通过抑制NF-κ B炎症通路发挥抗炎、抗凋亡的作用。
刘媛媛[7]（2019）在《五味子治疗阿尔兹海默症活性组分的筛选及作用机制的代谢组学研究》文中指出阿尔兹海默症（Alzheimer’s diseases,AD）是一种起病隐匿的中枢神经系统退行性疾病,临床上以记忆丢失、认知功能障碍、语言障碍及情绪控制失常等全面性痴呆表现为特征,是老年痴呆中最常见的一种。由于AD发病机制复杂,发病过程涉及的环节较多,目前尚缺乏疗效满意的治疗药物。因此,针对AD的发病机制,寻找高活性且毒副作用小的预防和治疗药物,是十分必要和迫切的。五味子是木兰科植物,其干燥成熟果实是五味子的药材主要来源。长期实践证明,五味子具有益气生津、补肾益心、镇惊安神和收敛固涩等作用。虽然药理学研究已经证明了五味子具有治疗AD的作用,但其药效组分及作用机制还不十分清楚。本文将根据AD的发病机制,探讨五味子治疗AD的药效物质基础及作用机制。主要研究内容包括以下几个方面:1.五味子中各组分的制备及成分分析利用现代提取纯化方法,成功分离制备了五味子多糖、木脂素、挥发油和有机酸组分,并对各组分进行成分分析。（1）五味子中多糖组分的制备及成分分析。首先,利用水提醇沉法提取五味子多糖组分,按照L9（33）正交表设计实验优化提取条件,最终确定提取条件为:料液比1:30（w/v）,水提2次,每次时间90 min,70%乙醇沉淀。在此条件下获得的五味子多糖组分中多糖的含量为58.65%,提取产率为7.079%。之后,将获得的多糖组分进行酸水解及衍生化,利用气相色谱质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）分析其单糖组成。结果表明,五味子多糖组分由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖和岩藻糖等多种单糖组成。最后,运用膜透析法将五味子多糖按分子量大小分为6个级别,分子量范围分别为<5×103、5×1031×104、1×1041×105、1×1055×105、5×1051×106和>1×106 Da,含量测定结果显示,五味子多糖组分相对分子质量主要分布在<5×103和>1×105 Da范围,分别占总多糖的24.96%和23.76%。（2）五味子中木脂素组分的提取纯化及含量测定。以体积分数为80%的乙醇为提取溶剂,利用闪式提取法对五味子水提后药渣中木脂素进行初步提取,然后利用AB-8大孔树脂对提取液进一步纯化,得到木脂素组分,其中木脂素的含量为87.11%。（3）五味子中挥发油组分的制备及成分鉴定。采用蒸馏法提取了五味子中挥发油组分,所得挥发油组分提取率为1.392%。采用GC-MS技术分析鉴定其成分,共鉴定了48个化合物,其中萜类化合物27种,芳香族化合物4种（芳香醚2种,芳香烃2种）,脂肪族类化合物10种（脂肪醇9种,脂肪醚1种）,酯类化合物4种及酮类化合物3种。（4）五味子中有机酸组分的制备及含量测定。在10oC条件下,加入30倍体积的蒸馏水,提取90 min,共提取2次,收集上清液并浓缩,醇沉过夜,离心取上清,浓缩后冻干得到有机酸组分。利用电位滴定法测得五味子有机酸组分中有机酸的含量为58.83%,提取产率为27.61%。上述实验结果为后续五味子治疗阿尔兹海默症活性组分的筛选及作用机制研究提供了药效物质基础。2.五味子治疗阿尔兹海默症的活性组分筛选结合体内及体外研究对五味子抗AD的活性组分进行筛选。首先,以Al Cl3和D-半乳糖联合诱导建立AD小鼠模型,通过跳台行为学实验、HE染色和免疫组化实验评价五味子各组分对AD小鼠记忆获得和巩固能力、神经细胞保护作用、Aβ沉积和tau蛋白磷酸化的影响。其次,利用Aβ2535诱导的PC12细胞凋亡模型,对五味子活性组分进行进一步筛选及评价,利用MTT法检测各组分对Aβ2535诱导的PC12细胞的保护作用,倒置显微镜下观察各组分对Aβ2535诱导的PC12细胞形态变化的影响,Western Blot法检测各组分对Aβ2535诱导的PC12细胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。结果表明,五味子多糖组分和木脂素组分能较好地改善AD模型小鼠的认知能力,并能提高Aβ诱导的PC12细胞活力,表现出显着的抗AD作用。我们确定多糖和木脂素是五味子治疗阿尔兹海默症的活性组分。本文首次发现五味子多糖组分具有显着的抗AD的药效特性,因此,我们着重以五味子多糖为研究对象,深入展开了五味子治疗AD作用机制的研究。3.Aβ2535所致AD大鼠模型的建立、评价及基于UHPLC-Q-TOF-MS的尿液代谢轮廓研究β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）是一种由淀粉样前体蛋白经蛋白酶水解生成的多肽,被认为是多种原因导致痴呆的共同通路。因而,给予实验动物注射Aβ造成的脑损伤模型与人类老年痴呆更为接近。为了深入开展五味子多糖治疗AD的作用机制研究,本文采用在实验大鼠双侧海马注射Aβ2535的方法建立AD模型,利用行为学、病理学和免疫组化实验对其进行评价,同时,基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry,UHPLC-Q-TOF-MS）对手术后第2、4和8周尿液代谢轮廓展开了研究。结果显示,AD大鼠模型可在术后8周成功复制,并确定了45种内源性生物标记物与AD相关。相关代谢途径的分析表明,在Aβ2535诱导的AD模型大鼠中,苯丙氨酸和酪氨酸、色氨酸、精氨酸和脯氨酸、柠檬酸循环、维生素B6、脂肪酸和甘油磷脂、牛磺酸和亚牛磺酸、嘌呤及嘧啶代谢通路受到干扰。利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用（ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry,UHPLC-TQ-MS）技术对上述8个代谢途径中具有代表性的8个潜在生物标志物进行定量分析。结果表明,定量代谢物含量的变化趋势与非靶向代谢组学的结果一致,说明非靶向代谢组学所得内源性标记物结果是可靠的。进一步对代谢轮廓的生物学意义进行分析,结果发现,AD的发病机制主要是与氨基酸的代谢异常、肠道微生物群失调引起的中枢神经系统与胃肠道双向通讯系统的变化、能量代谢抑制、氧化应激损伤和神经保护物质的缺失有关。上述研究为揭示AD的发病机制提供了科学依据,同时也为五味子多糖治疗AD机制研究奠定了基础。4.五味子多糖对Aβ2535所致AD模型大鼠海马中神经递质的影响首先,利用上述Aβ2535所致AD模型,通过Morris水迷宫行为学实验,评价五味子多糖对Aβ2535所致AD模型大鼠认知能力的改善情况。其次,通过组织病理学HE染色和免疫组化实验对五味子多糖治疗情况静息考察,并利用ELISA试剂盒检测糖原合成激酶3β（GSK3β）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）和乙酰胆碱酯酶（Ach E）的活性。最后,利用UHPLC-TQ-MS技术测定了各组大鼠大脑海马区神经递质含量。结果显示,五味子多糖能显着改善Aβ2535所致AD模型大鼠记忆获得和记忆巩固能力障碍,减少Aβ在脑内沉积以及磷酸化tau蛋白的表达,抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化,降低AD模型大鼠脑中Ach E,GSK-3β和NOS的水平,提高SOD活性。Aβ2535所致AD大鼠海马中的5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、乙酰胆碱（Ach）、牛磺酸（Tau）、γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸（Gly）的含量显着降低,谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的含量显着升高,五味子多糖可以使9种神经递质的水平均向正常水平调节。结果说明,五味子多糖能够通过调节AD大鼠海马中神经递质的水平来保护中枢神经系统,从而发挥治疗AD的作用。5.基于代谢组学研究五味子多糖治疗阿尔兹海默症的作用机制采用UHPLC-Q-TOF-MS结合多元统计学分析,进行五味子多糖治疗Aβ2535所致AD模型大鼠尿液代谢组学研究。从代谢组学的角度,探讨五味子多糖治疗AD的作用机制。最终共有38种代谢物被鉴定为五味子多糖治疗AD模型大鼠的潜在生物标志物。正离子模式下鉴定了17种化合物,负离子模式下鉴定了11种化合物。这些生物标记物主要影响色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、牛磺酸和亚牛磺酸、精氨酸和脯氨酸、嘌呤和嘧啶、烟酸和烟酰胺以及赖氨酸代谢途径。通过对这38种代谢生物标志物进行生物学功能分析,推断五味子多糖可能通过提高中枢神经系统的稳定性、调节肠道微生物群代谢、加速能量代谢供应和提高机体抗氧化能力等途径发挥治疗AD的作用。综上所述,本文采用现代分离提取纯化技术制备了五味子多糖、木脂素、挥发油和有机酸组分,并利用质谱等技术进行了成分分析;通过体内和体外实验筛选出治疗AD作用显着的活性组分;利用UHPLC-TQ-MS和UHPLC-Q-TOF-MS等技术,从代谢组学角度对AD的发病机制及五味子多糖治疗AD的作用机理进行了深入系统的研究,为进一步阐明五味子治疗AD的药效物质基础和作用机制提供理论依据,同时也为五味子治疗AD新药开发奠定了基础。
代海滨[8]（2019）在《基于冷休克蛋白低温对蛛网膜下腔出血早期和延迟继发性脑损伤的保护及机制研究》文中提出背景:蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage,SAH）是由于脑部的血管破裂出血,血液侵入蛛网膜下腔所致的一类高死亡率和高致残率的疾病,分原发性和继发性SAH。,近十几年来临床上对于SAH后血管痉挛的治疗已经有了很大的进步,但是对于SAH的预后改善尚无明显进展,常引起严重的神经功能损伤,包括脑炎性反应等引起的继发性脑损伤会直接影响到SAH患者的生活质量和生存率。SAH发生后72小时内出现的全脑直接损伤（即早期脑损伤）包括早期脑水肿、氧化应激性损害、神经细胞凋亡以及脑梗死。因此,本研究针对早期脑损伤相关的因子CIRP、及抑制剂C23蛋白、延迟继发性脑损伤相关的因子RBM3在神经细胞中的表达反应,以及如何调节此类反应因子和减轻神经元损伤的机制进行研究。方法:本课题首先从C57BL/6小鼠上获取神经元细胞,通过培养建立稳定的神经元细胞培养系,建立细胞SAH模型。通过视交叉池注血法,建立大鼠SAH模型。通过大鼠SAH模型,观察脑部颞叶皮层神经细胞的免疫荧光染色,确定CIRP和RBM3在脑内神经细胞的分布特点,使用real-time PCR和Western Blot法检测神经元细胞在SAH后不同时间点的mRNA相对表达和蛋白表达水平。利用CIRP功能抑制剂C23蛋白抑制大鼠脑内CIRP的功能,应用免疫组化、尼氏染色法、TUNEL细胞凋亡法和大鼠转棒实验,评估大鼠神经功能的损伤和恢复,观察SAH后凋亡相关蛋白、神经元凋亡和运动功能等指标的变化,探讨低温对SAH后神经细胞中CIRP和RBM3因子表达的影响和神经功能的保护作用。结果:大鼠SAH后颞叶皮层脑组织CIRP在建模后12h、1d mRNA和蛋白呈高表达,RBM3在建模后3d和7d mRNA和蛋白呈高表达,与细胞凋亡相关的Bcl-2蛋白呈低表达,Bax,caspase-3,caspase-9蛋白以及细胞色素c呈高表达。经过低温治疗后SAH大鼠都可在7天后,上述指标恢复到对照组（sham组）水平,而低温本身对正常Sham组大鼠,具有提高神经元细胞凋亡率、增加脑部组织损伤的作用。但是,SAH组的低温处理,反而抑制了神经细胞凋亡与脑组织损伤。通过免疫荧光染色,我们发现CIRP、RBM3主要在神经元细胞中表达,而星形胶质细胞只有小部分表达。因此,大鼠神经元细胞是CIRP的主要表达细胞。低温治疗过的SAH大鼠神经元细胞凋亡率明显减少,免疫组化DAB染色显示SAH+低温组的CIRP表达明显减少,尼氏染色和电镜检查都表明低温对SAH大鼠具有降低神经元细胞凋亡和恢复线粒体功能,以及提高转棒功能的作用。同时,我们发现CIRP的拮抗剂C23蛋白对于CIRP与细胞表面受体结合具有抑制作用,此抑制作用可以有效降低SAH引起的脑部神经元凋亡、减轻炎性反应,有助于恢复大鼠的运动功能。并且,从C23不同剂量组的实验结果,我们发现SAH后给予C23蛋白的最高剂量,对CIRP的抑制效果最好。结论:脑组织神经细胞内的CIRP和RBM3分别在SAH后早期和延迟继发性脑损伤时表达升高,并引起凋亡相关蛋白表达变化,诱导了神经元凋亡。低温可减少脑组织CIRP和RBM3表达,并减少凋亡相关蛋白表达,抑制神经元凋亡。在大鼠SAH模型,高剂量的C23可以减轻CIRP诱导的脑组织炎性反应,减少细胞凋亡,改善运动功能。
杨田田[9]（2018）在《三七总皂苷对MCAO大鼠和SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT通路的调节作用》文中研究指明研究目的1探索三七总皂苷对MCAO大鼠术后7天的神经保护作用和对Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的调节作用。2探索三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤的保护作用和对Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的调节作用。研究方法1动物实验部分实验一:将大鼠随机分为假手术组和手术组。手术组采用改良Longa方法,制备大鼠大脑中动脉局灶梗死模型,约术后2h,进行EZ Longa评分,1-3分纳入,0分和4分剔除。将纳入大鼠随机分为模型组、PNS大剂量组、PNS小剂量组、尼莫地平组。假手术组大鼠仅切开颈正中皮肤,暴露颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉,然后缝合皮肤。按照大鼠与人的体表面积等效剂量折算,给药剂量及给药方式为:PNS大剂量组为每日7.2mg/100g腹腔注射;PNS小剂量组每日3.6mg/100g腹腔注射;尼莫地平组每日1.44mg/100g灌胃;假手术组和模型组每日分别生理盐水1mL/100g腹腔注射。术后1-7天,每天进行大鼠神经功能评分,计算体重指数。实验二:通过Western Blot法检测梗死侧皮质SYN和PSD95蛋白表达量,探索PNS的神经保护作用。实验三:通过实时荧光PCR、免疫组化、Western Blot方法进一步探究三七总皂苷对MCAO大鼠术后7天大脑梗死侧皮质中Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响。2细胞实验部分实验四:SH-SY5Y细胞培养及缺氧时间摸索、药物浓度摸索。通过CCK8检测细胞存活率的方法确定细胞缺氧缺糖时间和PNS浓度。设置分组:正常组、模型组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组。按照分组给予相应的药物处理和缺氧处理,CCK8法检测细胞存活率、AnnexinV-FITC/PI双染法测凋亡、微板法测定乳酸脱氢酶活性。实验五:通过实时荧光PCR方法和Western Blot方法探索三七总皂苷对缺氧缺糖SH-SY5Y细胞中Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响。研究结果1动物实验部分实验一:TTC染色:模型组大鼠大脑切片右侧可见连续白色梗死区,结果显示造模成功。体重指数评价:术后1天,假手术组大鼠体重指数略有升高,各手术组大鼠体重指数下降明显,模型组与假手术组相比,下降明显（P<0.01）;术后第2、3天,各手术组大鼠体重指数持续下降;术后第4天,PNS小剂量组（P<0.05）、PNS大剂量组（P<0.01）、尼莫地平组（P<0.01）体重指数明显高于模型组,结果有统计学差异;术后第6天,PNS小剂量组体重指数与模型组相比具有显着差异（P<0.01）;术后第7天,PNS大剂量组大鼠体重指数开始止降回升。mNSS神经功能评分评价:假手术组在1-7天内,没有出现神经功能缺失症状。术后1天,手术组大鼠均出现严重的神经功能缺失症状;术后1-3天,各手术组大鼠mNSS神经功能评分逐渐下降,用药各组与模型组相比未见差异（P>0.05）;术后第4天,尼莫地平组（P<0.05）、PNS大剂量组（P<0.01）评分明显低于模型组;术后第5天,PNS小剂量组评分开始低于模型组（P<0.05）;尼莫地平组评分明显低于模型组（P<0.01）。实验二:SD大鼠脑梗死7天,梗死侧皮质中SYN和PSD95蛋白表达量均明显下降;PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组大鼠梗死侧皮质SYN、PSD95蛋白表达量明显高于模型组,具有统计学差异（P<0.01）。实验三:qRT-PCR检测MCAO大鼠7天后梗死侧皮质Lingo-1、EGFR、PI3K、AKT mRNA的表达:SD大鼠MCAO术后7天,模型组大鼠Lingo-1的mRNA表达量明显高于假手术组,有统计学差异（P<0.01）;PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组Lingo-1 mRNA的表达量较模型组显着下降,有统计学差异（P<0.01）;SD大鼠MCAO术后7天,各手术组大鼠EGFR、PI3K、AKT mRNA表达量略有升高,但无统计学差异（P>0.05）。Western Blot 法检测 MCAO 大鼠脑组织中 Lingo-1 及 p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白的表达:SD大鼠MCAO术后7天,与假手术组相比,模型组Lingo-1蛋白表达明显升高,具有统计学差异（P<0.01）;PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组Lingo-1蛋白表达较模型组明显降低。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-EGFR/EGFR蛋白比值与假手术组比明显升高,具有统计学差异（P<0.01）;PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-EGFR/EGFR蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-EGFR/EGFR蛋白表比值均值大于PNS小剂量组。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-PI3K/PI3K蛋白比值与假手术组相比明显升高（P<0.01）;PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-PI3K/PI3K蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-PI3K/PI3K蛋白比值均值大于PNS小剂量组。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-AKT/AKT蛋白比值与假手术组相比明显升高（P<0.01）;PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-AKT/AKT蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-AKT/AKT蛋白比值均值大于PNS小剂量组。免疫组化法测MCAO大鼠术后7天脑组织中Lingo-1、p-EGFR、p-AKT、p-PI3K的表达:免疫阳性物质被染成深棕色颗粒,结果与Western Blot趋势一致。2细胞实验部分实验四:选取16h作为最佳缺氧时间,既可以造成缺氧缺糖损伤,又可以保证大部分细胞的存活率。采用PNS浓度为640mg/L为造模药物浓度,此时细胞存活率最高。设置实验分组:正常组、模型组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组。CCK8结果:缺氧缺糖损伤对SH-SY5Y细胞造成了严重的损伤,PNS可提高存活率,与模型组相比,有统计学差异（P<0.01）。当PNS组细胞加入AG1478后,PNS的保护作用减弱。单用AG1478时,与模型组相比,细胞存活率显着降低（P<0.01）。PNS对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖处理后细胞凋亡的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,凋亡率明显升高。PNS可明显降低细胞的凋亡率（P<0.01）。当PNS组细胞培养基中加入AG1478后,明显抑制PNS的抗凋亡作用。LDH活性检测结果:缺氧缺糖损伤对SH-SY5Y细胞造成了严重的损伤,使培养基中LDH活性明显增高（P<0.01）。PNS可有效保护SH-SY5Y细胞,降低LDH活性,与模型组相比,有统计学差异（P<0.01）。AG1478可减弱PNS对的保护作用。AG1478组与模型组相比,LDH活性明显增高,结果有统计学差异（P<0.01）。实验五:三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT mRNA表达的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,与正常组组相比,模型组Lingo-1 mRNA 表达明显升高（P<0.01）;PNS 组和 PNS+AG1478 组 SH-SY5Y细胞 Lingo-1 mRNA表达水平较模型组明显降低（P<0.01）。AG1478组Lingo-1 mRNA表达与模型组无差异。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,正常组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组细胞EGFR、PI3K、AKTmRNA的表达与模型组之间无差异。三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤Lingo-1及p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组Lingo-1蛋白的表达与正常组相比明显升高（P<0.01）;PNS组SH-SY5Y细胞Lingo-1蛋白表达水平较模型组明显降低（P<0.01）;PNS+AG1478组SH-SY5Y细胞Lingo-1蛋白表达水平较模型组降低,具有统计学差异（P<0.05）;AG1478组Lingo-1蛋白表达与模型组无差异。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与正常组相比明显升高,具有统计学差异（P<0.01）;PNS组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组相比,比值升高明显,具有统计学差异（P<0.01）;PNS+AG1478组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组无差异（P>0.05）;AG1478组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组相比,比值降低明显（P<0.01）。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与正常组相比明显升高,有统计学差异（P<0.01）;PNS组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与模型组相比明显升高,有统计学差异（P<0.01）;PNS+AG1478组和AG1478组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与模型组相比无统计学差异（P>0.05）。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与正常组相比明显升高（P<0.01）;PNS组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比明显升高（P<0.05）;PNS+AG1478组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比无统计学差异（P>0.05）。AG1478组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比明显降低（P<0.01）。研究结论三七总皂苷对MCAO大鼠和缺氧缺糖SH-SY5Y细胞起到神经保护的作用:三七总皂苷可以促进MCAO大鼠体重指数的增长、神经功能的恢复,提高梗死侧皮质SYN、PSD95蛋白的表达;可以提高缺氧缺糖SH-SY5Y细胞存活率、抑制细胞凋亡、降低乳酸脱氢酶活性。三七总皂苷可以通过降低神经系统受损后Lingo-1的高表达表达及促进EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活发挥神经保护作用。
刘宇[10]（2017）在《活血养血汤对兔脊髓缺血再灌注损伤Cytc—Caspase-3介导的细胞凋亡通路的影响》文中研究表明目的本实验应用兔SCⅡ模型研究活血养血汤对兔SCⅡ脊髓组织水肿情况和Ca2+浓度的影响,以及对脊髓组织Cytc、Hsp70、Bcl-2、Bax、Caspase-3的调节作用,探讨活血养血汤防治SCⅡ模型Cytc—Caspase-3介导的细胞凋亡通路的作用机制,为活血养血汤的临床应用奠定实验基础。方法1.SCⅡ动物模型的研究参照Kwun的造模方法,以阻断兔第3-6腰动脉30min后再灌注1h的方法建立SCⅡ模型,并通过数字减影技术观察血供情况,以明确缺血前、动脉阻断后缺血情况及再灌注后血流恢复情况,病理切片观察脊髓组织神经元损伤情况,以鉴定此种造模方法的可行性。2.活血养血汤对兔SCⅡ水肿、Ca2+含量的影响活血养血汤干预兔SCⅡ模型,对比桃红四物汤,通过计算脊髓组织含水量的方法观察活血养血汤对兔SCⅡ模型水肿的影响,通过采用组织钙离子浓度荧光定量检测的方法测定脊髓组织Ca2+浓度探讨活血养血汤对兔SCⅡ模型Ca2+浓度的影响。3.活血养血汤对兔SCⅡ模型Cytc—Caspase-3介导的细胞凋亡通路的影响活血养血汤干预兔SCⅡ模型,对比桃红四物汤,通过免疫组化、酶联免疫、原位凋亡检测技术及RT-PCR等方法检测Cytc、HSP70、Bcl-2、Bax、Caspase-3含量的变化和神经元凋亡情况,观察活血养血汤对兔SCⅡ模型Cytc—Caspase-3介导的细胞凋亡通路的影响。结果1.数字减影技术观察结果见阻断腰动脉时,造影剂到达阻断部位以后不能通过夹闭部位,当去除血管夹时,造影剂能再次进入被阻断后的血管。HE染色见,空白组脊髓神经元细胞基本无异常,单纯缺血组见神经元周围空泡形成,细胞核位置偏离中心,核仁不清。缺血再灌注组脊髓神经元细胞多呈梭形改变,细胞核固缩,核仁消失。尼氏染色见,空白组可见较多尼氏小体,形态完整,染色呈蓝色,细胞核圆形,核仁清晰;单纯缺血组尼氏小体明显减少,神经元细胞肿胀,轮廓不清,细胞核固缩,缺血再灌注组见尼氏小体减少,大量溶解,周围出现水肿,细胞核固缩,核仁不清。神经元计数结果见,单纯缺血组、缺血再灌注与空白组相比,神经元数目均减少,差异具有统计学意义（P<0.01）,缺血再灌注组与单纯缺血组比较差异有统计学意义（P<0.05）。2.含水量检测见活血养血汤组及桃红四物汤组脊髓含水量有所下降,与生理盐水组相比差异有统计学意义（P<0.05）,活血养血汤组与桃红四物汤组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。Ca2+含量检测见桃红四物汤组及活血养血汤组与生理盐水组相比细胞内Ca2+有所下降（P<0.05）,活血养血汤组与桃红四物汤组相比有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）。3.检测药物干预后Cytc、HSP70、Bcl-2、Bax3、Caspase-3的变化,免疫组化结果见,桃红四物汤组、活血养血汤组与生理盐水组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）,活血养血汤组和桃红四物汤组比较,Cytc无明显差异（P>0.05）,余差异均有统计学意义（P<0.05）。酶联免疫结果见,桃红四物汤组、活血养血汤组和生理盐水组相比,差异均有统计学意义（P<0.01,P<0.05）),活血养血汤组与桃红四物汤组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。原位凋亡检测结果见,桃红四物汤组、活血养血汤组和生理盐水组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）,活血养血汤组与桃红四物汤组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR检测Caspase-3的变化,桃红四物汤组、活血养血汤组与生理盐水组相比,活血养血汤组与桃红四物汤组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论1.采用夹闭兔第3-6腰动脉30min后再灌注1h的方法可以造成腰段脊髓的损伤,模型制备成功。2.活血养血汤可减轻兔SCⅡ模型水肿,改善兔SCⅡ模型Ca2+超载,从而达到对SCⅡ的防治作用,且作用优于桃红四物汤。3.活血养血汤可降低SCⅡ模型Cytc、Bax、Caspase-3的表达,升高HSP70、Bcl-2的表达,减少细胞凋亡,从而从整体上抑制Cytc—Caspase-3介导的细胞凋亡,达到防治SCⅡ的作用,且作用优于桃红四物汤。
二、5-HT免疫组化染色观察尼莫地平于脊髓损伤中的保护作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、5-HT免疫组化染色观察尼莫地平于脊髓损伤中的保护作用（论文提纲范文）
（1）星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 星蒌承气汤药效物质基础及对缺血性卒中神经保护机制研究进展 |
| 1 大黄 |
| 1.1 中医认识 |
| 1.2 化学成分及神经保护作用 |
| 2 胆南星 |
| 2.1 中医认识 |
| 2.2 化学成分及神经保护作用 |
| 3 瓜蒌 |
| 3.1 中医认识 |
| 3.2 化学成分及神经保护作用 |
| 4 羌活 |
| 4.1 中医认识 |
| 4.2 化学成分及神经保护作用 |
| 5 芒硝 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于肠道微生态理论的缺血性卒中病因与发病机制研究进展 |
| 1 肠道微生态与肠道微生态失调 |
| 2 菌-肠-脑轴 |
| 3 从肠到脑的上行通路 |
| 4 从脑到肠的下行通路 |
| 5 脑卒中相关危险因素与肠道菌群 |
| 6 卒中并发症的肠道微生态机制 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 基于网络药理学与分子对接的星蒌承气汤治疗缺血性卒中的机制研究 |
| 1 研究资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 星蒌承气汤化学活性成分的检索与筛选 |
| 2.2 星蒌承气汤化学成分及缺血性卒中靶点筛选 |
| 2.3 交集基因蛋白互作网络(PPI)分析 |
| 2.4 基因本体论(Gene ontology,GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 |
| 2.5 可视化网络构建与分析 |
| 2.6 分子对接 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 星蒌承气汤潜在化学活性成分的检索与筛选结果 |
| 3.2 星蒌承气汤活性成分靶点及缺血性卒中靶点预测结果 |
| 3.3 GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析结果 |
| 3.4 可视化网络构建与分析 |
| 3.5 分子对接 |
| 4 讨论 |
| 4.1 网络药理学在中医药现代化研究中的应用 |
| 4.2 基于网络药理学方法探讨星蒌承气汤活性成分 |
| 4.3 基于网络药理学方法探讨星蒌承气汤效应机制 |
| 5 小结 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠神经保护作用及网络药理学关键靶点及通路实验验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 神经功能评分 |
| 2.4 除胶实验 |
| 2.5 TTC染色 |
| 2.6 取材及处理 |
| 2.7 TUNEL法检测皮层梗死周围细胞凋亡情况 |
| 2.8 脑组织ELISA |
| 2.9 脑组织Western blot |
| 2.10 统计分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 神经功能评分 |
| 3.2 除胶实验 |
| 3.3 脑梗死体积评价 |
| 3.4 对缺血侧脑组织细胞凋亡的影响 |
| 3.5 星蒌承气汤对缺血侧脑组织TNF-α的影响 |
| 3.6 星蒌承气汤对缺血侧脑组织AKT、p-AKt、PI3K及NF-κB蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 星萎承气汤是治疗中风病急性期痰热腑实证的具有确切临床疗效的代表方剂 |
| 4.2 化痰通腑法代表方星蒌承气汤脑保护作用及中医理论探讨 |
| 4.3 卒中模型神经功能评分探讨 |
| 4.4 卒中模型行为学选择 |
| 4.5 星蒌承气汤与细胞凋亡 |
| 4.6 网络药理学关键靼点及通路实验验证 |
| 5 小结 |
| 实验二 星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠菌-肠-脑轴影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 取材及处理 |
| 2.4 免疫组化 |
| 2.5 免疫荧光 |
| 2.6 ELISA检测 |
| 2.8 肠道菌群分析 |
| 2.9 盲肠内容物短链脂肪酸(SCFAs)检测 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 星蒌承气汤对中风痰热腑实证小鼠肠道菌群的影响 |
| 3.2 星蒌承气汤对中风痰热腑实证小鼠肠道菌群代谢产物短链脂肪酸及短链脂肪酸受体的影响 |
| 3.3 星蒌承气对菌-肠-脑轴神经-内分泌-免疫途径相关指标影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于脑肠互动理论探讨化痰通腑法治疗中风病的理论基础 |
| 4.2 星蒌承气汤对短链脂肪酸影响 |
| 4.3 星萎承气汤对菌-肠-脑轴自主神经途径影响 |
| 4.4 星蒌承气汤对菌-肠-脑轴神经内分泌途径影响 |
| 4.5 星萎承气汤对菌-肠-脑轴免疫途径影响 |
| 5 小结 |
| 实验三 星萎承气汤对中风急性期痰热腑实证伪无菌小鼠菌-肠-脑轴影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 神经功能评分 |
| 2.4 除胶实验 |
| 2.5 TTC染色 |
| 2.6 取材及处理 |
| 2.7 免疫组化、免疫荧光 |
| 2.8 ELISA检测 |
| 2.9 肠道菌群分析 |
| 2.10 盲肠内容物SCFAs分析 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经功能评分 |
| 3.2 除胶实验 |
| 3.3 脑梗死体积评价 |
| 3.4 肠道菌群 |
| 3.5 短链脂肪酸 |
| 3.6 星蒌承气汤对伪无菌小鼠菌-肠-脑轴神经-内分泌-免疫途径相关指标影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 伪无菌模型建立及评价 |
| 4.2 肠道菌群是星蒌承气汤发挥作用的重要靶点 |
| 4.3 星蒌承气汤治疗急性期缺血性卒中机制的初步探讨 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）基于HIF1-VEGF-Notch通路夏天无对血管性痴呆大鼠神经行为学的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照表 |
| 引言 |
| 第一章 夏天无对VD模型大鼠神经行为学及脑组织形态学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要实验设备及仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型制备及分组 |
| 2.2 药物干预 |
| 2.3 Morris水迷宫实验 |
| 2.4 脑组织取材 |
| 2.5 脑组织包埋 |
| 2.6 脑组织切片制备 |
| 2.7 HE染色 |
| 2.8 尼氏染色 |
| 2.9 一步法TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.10 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 夏天无对VD模型大鼠学习记忆能力有一定改善作用 |
| 3.2 夏天无对VD模型大鼠脑组织内神经元有一定保护作用 |
| 4.小结 |
| 第二章 夏天无对VD模型大鼠脑组织微血管及相关蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验设备及仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫组织化学 |
| 2.2 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 夏天无对VD模型大鼠脑组织内微血管密度的影响 |
| 3.2 夏天无对VD模型大鼠脑组织内VEGF蛋白表达的影响 |
| 3.3 夏天无对VD模型大鼠脑组织内VEGFR-2 蛋白表达的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 夏天无对VD模型大鼠HIF1-VEGF-Notch信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验设备及器材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 组织蛋白的提取 |
| 2.2 蛋白浓度测定(96 孔板法) |
| 2.3 蛋白变性 |
| 2.4 Western bloting |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 夏天无对VD模型大鼠脑组织中HIF1/VEGF/Notch蛋白表达的影响 |
| 4.小结 |
| 第四章 讨论 |
| 1 动物模型的制备 |
| 2 实验药物的选择 |
| 3 夏天无对VD模型大鼠神经行为学的影响 |
| 4 夏天无对VD模型大鼠脑组织内神经元形态学的影响 |
| 5 夏天无对VD模型大鼠微血管及HIF1-VEGF-Notch通路的影响 |
| 5.1 HIF1与VEGF/VEGFR2 信号通路 |
| 5.2 VEGF—Notch途径与血管生成的关联 |
| 5.3 夏天无对VD模型大鼠脑组织内微血管新生的影响 |
| 6 结论 |
| 7 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 基于现代医学临床分型及中医证型的血管性痴呆动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（3）血塞通对MCAO大鼠及OGD/R损伤SH-SY5Y细胞Lingo-1及EGFR/PI3K/Akt通路和BDNF的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 缺血性中风的中医理论渊源和Lingo-1及其下游信号通路的研究现状 |
| 1 中医学对缺血性中风的认识 |
| 2 中医药在缺血性中风治疗中的优势 |
| 3 缺血性中风的研究现状 |
| 4 Lingo-1及其下游信号通路的研究进展 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药材三七及三七皂苷R_1的研究进展 |
| 1 中药材三七及其主要活性成分简述 |
| 2 三七皂苷R_1及研究现状 |
| 3 名贵中药三七及制剂的应用及前景 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 动物实验研究 |
| 实验一 血塞通对MCAO大鼠神经功能恢复的作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验步骤 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 血塞通对MCAO大鼠术后神经可塑性的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 血塞通对MCAO大鼠Lingo-1及其下游EGFR/PI3K/Akt信号通路的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞实验研究 |
| 实验四 血塞通对氧糖剥夺/再灌注损伤SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 血塞通对氧糖剥夺/再灌注损伤SH-SY5Y细胞PI3K/Akt信号通路的作用 |
| 1 实验材料及方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 EZ Longa评分表 |
| 附录2 mNSS评分量表 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）安脑平冲汤对脑出血模型大鼠脑水肿及TRPV4、KCa3.1表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 实验材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药物和试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物分组 |
| 2.2 动物模型建立、给药及取材 |
| 2.3 观察指标及检测方法 |
| 2.4 统计分析 |
| 第二部分 实验结果 |
| 1.各组实验大鼠神经功能缺损评分 |
| 2.各组实验大鼠脑组织含水量比较 |
| 3.各组实验大鼠脑组织HE染色 |
| 4.各组实验大鼠血清中TNF-α、ICAM-1 的浓度 |
| 5.各组实验大鼠第3d血肿周围脑组织TRPV4、KCa3.1 表达 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.大鼠ICH模型建立的探讨 |
| 2.阳性对照药物选择 |
| 3.安脑平冲汤的立方思想及组方分析 |
| 3.1 立方思想 |
| 3.2 组方分析 |
| 4.安脑平冲汤现代药理研究 |
| 5.安脑平冲汤对神经功能缺损评分、脑水肿的影响 |
| 6.安脑平冲汤对脑组织TRPV4、KCa3.1 的影响 |
| 7.安脑平冲汤对血清TNF-α、ICAM-1 的影响 |
| 8.问题和展望 |
| 第四部分 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 :图表 |
| 综述二:综述 TRPV4、 KCa3.1 对脑水肿影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录三 :攻读硕士学位期间的主要科研成果及发表论文 |
（5）缺血后适应干预大鼠脊髓再灌注损伤时对CaSR和Caspase-12的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验目的 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验内容 |
| 1.5 实验流程图 |
| 第二章 大鼠术后的行为学变化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验前准备 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂及手术器材 |
| 2.3 建模方法 |
| 2.4 行为学评分(Basso-Beattie-Bresnahan,BBB) |
| 2.5 统计学分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.7 讨论 |
| 第三章 缺血后适应对CaSR及 Caspase-12 表达的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 试剂配制 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 蛋白质免疫印迹试验 |
| 3.4.2 免疫组织化学 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 蛋白质免疫印迹试验 |
| 3.5.2 免疫组织化学 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 大鼠脊髓组织中细胞凋亡的表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及方法 |
| 4.2.1 石蜡切片预处理 |
| 4.2.2 标记和显色反应 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
（6）瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 瑶医源流及诊治法简述 |
| 1.1.1 瑶医药的形成和起源背景 |
| 1.1.2 瑶医药总体的特点 |
| 1.1.3 瑶医药的理论体系 |
| 1.1.4 瑶医诊治法简述 |
| 1.1.5 瑶医诊疗特色 |
| 1.1.6 瑶医药发展现状及存在问题 |
| 1.1.7 应对措施和建议 |
| 1.1.8 总结和展望 |
| 1.2 瑶医神火灸介绍及其临床应用 |
| 1.2.1 瑶医神火灸简介及作用原理 |
| 1.2.2 瑶医神火灸的作用及主治 |
| 1.2.3 神火灸的制备方法 |
| 1.2.4 瑶医神火灸药枝常用药物及功效[27] |
| 1.2.5 操作方法 |
| 1.2.6 神火灸与其他灸法的异同之处 |
| 1.2.7 临床应用举偶 |
| 1.2.8 瑶医神火灸治疗脑卒中及其并发症 |
| 1.2.9 总结 |
| 第二章 实验部分 |
| 实验一 瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑保护作用的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 实验二 瑶医神火灸对脑缺血再灌注大鼠氧化应激、炎症因子及细胞凋亡的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 实验三 瑶医神火灸介导NF-κB通路对缺血再灌注大鼠保护作用的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）五味子治疗阿尔兹海默症活性组分的筛选及作用机制的代谢组学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 阿尔兹海默症 |
| 1.1.1 阿尔兹海默症概述 |
| 1.1.2 阿尔兹海默症发病机制 |
| 1.1.3 阿尔兹海默症常用药物 |
| 1.2 五味子主要化学组分及药理作用的研究 |
| 1.2.1 多糖及药理作用 |
| 1.2.2 木脂素及药理作用 |
| 1.2.3 挥发油及药理作用 |
| 1.2.4 有机酸及药理作用 |
| 1.3 代谢组学 |
| 1.3.1 代谢组学概述 |
| 1.3.2 代谢组学研究方法 |
| 1.3.3 代谢组学在AD研究中的应用 |
| 1.4 UPLC-Q-TOF-MS、UPLC-TQ-MS和GC-MS简介 |
| 1.4.1 UPLC-TQ-MS |
| 1.4.2 UPLC-Q-TOF-MS |
| 1.4.3 GC-MS |
| 1.5 本论文的研究思路 |
| 第2章 五味子中各组分的制备及成分分析 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 药品、试剂与仪器 |
| 2.1.2 五味子多糖组分的制备及成分分析 |
| 2.1.3 五味子木脂素组分的制备及含量测定 |
| 2.1.4 五味子挥发油组分的制备及成分鉴定 |
| 2.1.5 五味子有机酸组分的制备及含量测定 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 五味子多糖组分的提取分级及单糖组成分析 |
| 2.2.2 五味子木脂素组分含量的测定 |
| 2.2.3 五味子挥发油组分含量的测定及成分鉴定 |
| 2.2.4 五味子有机酸组分含量的测定 |
| 2.3 小结 |
| 第3章 五味子治疗阿尔兹海默症的活性组分筛选 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 细胞及实验动物 |
| 3.1.2 药品、试剂及仪器 |
| 3.1.3 样本的制备及溶液的配制 |
| 3.1.4 Aβ25~35 诱导PC12细胞凋亡模型体外筛选实验 |
| 3.1.5 Al Cl3和D-半乳糖联合诱导AD小鼠体内筛选实验 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 Aβ25~35 诱导PC12细胞凋亡体外筛选实验结果 |
| 3.2.2 Al Cl3和D-半乳糖联合诱导AD模型小鼠体内筛选实验结果 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 Aβ25~35 所致AD大鼠模型的建立、评价及基于UHPLC-Q-TOF-MS的尿液代谢轮廓研究 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 药品、试剂及仪器 |
| 4.1.2 Aβ25~35 所致AD大鼠模型建立 |
| 4.1.3 Morris水迷宫行为学实验 |
| 4.1.4 组织病理学检查 |
| 4.1.5 尿样的采集与处理 |
| 4.1.6 非靶向尿液代谢组学UHPLC-Q-TOF-MS条件 |
| 4.1.7 尿液中相关标志物定量分析的UHPLC-TQ-MS条件 |
| 4.1.8 尿液中相关标志物定量分析的方法学考察 |
| 4.1.9 数据分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 水迷宫实验行为学实验 |
| 4.2.2 HE染色 |
| 4.2.3 免疫组化检测 |
| 4.2.4 非靶向尿液代谢组学UHPLC-Q-TOF-MS方法验证 |
| 4.2.5 非靶向代谢组学尿液代谢轮廓分析 |
| 4.2.6 非靶向尿液代谢组学潜在生物标志物的鉴定 |
| 4.2.7 尿液中相关标志物的定量分析 |
| 4.2.8 Aβ25~35 所致AD模型大鼠所扰乱的代谢途径分析 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 五味子多糖对Aβ25~35 所致AD模型大鼠海马中神经递质的影响 |
| 5.1 实验部分 |
| 5.1.1 样品、试剂及仪器 |
| 5.1.2 实验分组、造模及给药 |
| 5.1.3 样品采集及处理 |
| 5.1.4 行为学实验 |
| 5.1.5 海马组织病理学检查 |
| 5.1.6 海马组织生化指标的检测 |
| 5.1.7 基于UHPLC-TQ-MS不同组别大鼠海马中神经递质的测定 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 五味子多糖对AD模型大鼠行为学功能的影响 |
| 5.2.2 五味子多糖对AD模型大鼠海马组织病理学的影响 |
| 5.2.3 五味子多糖对Aβ、p-tau、Iba1及GFAP表达的影响 |
| 5.2.4 五味子多糖对AD模型大鼠海马生化指标水平的影响 |
| 5.2.5 五味子多糖对AD模型大鼠海马中9种神经递质水平的影响 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 基于代谢组学研究五味子多糖治疗阿尔兹海默症的作用机制 |
| 6.1 实验部分 |
| 6.1.1 样品、试剂及仪器 |
| 6.1.2 多糖提取与制备 |
| 6.1.3 实验动物分组、造模及给药 |
| 6.1.4 样品收集及前处理 |
| 6.1.5 尿液代谢组学UHPLC-Q-TOF-MS条件 |
| 6.1.6 数据分析 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 尿液代谢组学UHPLC-Q-TOF-MS方法的验证 |
| 6.2.2 尿液中潜在生物标志物的鉴定 |
| 6.2.3 五味子多糖对Aβ25~35 所致AD模型大鼠尿液代谢轮廓的影响 |
| 6.3 小结 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）基于冷休克蛋白低温对蛛网膜下腔出血早期和延迟继发性脑损伤的保护及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 蛛网膜下腔出血早期脑损伤的临床特征和治疗现状 |
| 1.1.1 蛛网膜下腔出血发病特征,病因和发病率 |
| 1.1.2 蛛网膜下腔出血早期脑损伤治疗现状 |
| 1.1.3 蛛网膜下腔出血并发症及治疗 |
| 第二节 蛛网膜下腔出血后血脑屏障破坏机制和治疗靶点 |
| 1.2.1 蛛网膜下腔出血后血脑屏障破坏的特点 |
| 1.2.2 蛛网膜下腔出血后血脑屏障破坏的机制 |
| 1.2.3 内皮细胞功能障碍或细胞凋亡作为潜在目标 |
| 1.2.4 破坏紧密连接 |
| 第三节 蛛网膜下腔出血早期脑损伤低温保护机制和出血后继发脑损伤炎性反应抑制在临床上的作用 |
| 1.3.1 低温在蛛网膜下腔出血中的脑损伤治疗进展 |
| 1.3.2 CIRP在中枢神经系统疾病的研究进展 |
| 1.3.3 RBM3在中枢神经系统疾病的研究进展 |
| 1.3.4 C23在疾病治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 低温影响CIRP表达在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的保护作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制方法 |
| 2.2.4 主要实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大鼠分组建模后死亡率及脑组织形态 |
| 2.3.2 大鼠颞叶皮层CIRP mRNA和蛋白的表达 |
| 2.3.3 大鼠颞叶皮层凋亡相关蛋白的表达(线粒体凋亡途径) |
| 2.3.4 CIRP主要表达在神经元细胞,在星形胶质细胞中只有少部分表达 |
| 2.3.5 凋亡染色(四组大鼠建模后1d,冰冻切片TUNEL染色) |
| 2.3.6 免疫组化DAB染色(四组大鼠建模后1d,石蜡切片) |
| 2.3.7 尼氏染色(四组大鼠建模后3d,石蜡切片Nissl染色) |
| 2.3.8 电镜结果(四组大鼠建模后1d,电镜超薄切片) |
| 2.3.9 转棒实验 |
| 2.3.10 神经元的体外实验中Western blot检测CIRP和Caspase3的表达 |
| 2.3.11 原代培养神经元细胞的凋亡染色 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 治疗性低温对正常大鼠产生强烈的应激损伤,运动功能下降 |
| 2.4.2 治疗性低温减轻了SAH大鼠线粒体途径的细胞凋亡,改善了运动功能 |
| 2.4.3 CIRP是新发现的重要促炎因子,治疗性低温降低了SAH大鼠脑部皮层CIRP的表达,减轻了早期脑损伤 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 低温影响RBM3表达在蛛网膜下腔出血继发性脑损伤中的保护作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 主要试剂的配制方法 |
| 3.2.4 主要实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 四组大鼠颞叶皮层RBM3蛋白和mRNA的表达 |
| 3.3.2 大鼠(建模三天后)脑组织中RBM3蛋白在神经元细胞和星形胶质细胞的表达 |
| 3.3.3 大鼠(建模三天后)脑组织切片RBM3免疫组化染色 |
| 3.3.4 四组大鼠颞叶皮层凋亡相关蛋白的表达(线粒体凋亡途径) |
| 3.3.5 大鼠(建模三天后)脑组织的细胞凋亡染色 |
| 3.3.6 大鼠(建模七天后)脑组织石蜡切片尼氏染色 |
| 3.3.7 四组大鼠的转棒实验 |
| 3.3.8 神经元细胞的体外培养及实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 C23在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中保护作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要试剂的配制方法 |
| 4.2.4 主要实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 大鼠颞叶皮层CIRP的表达(WB检测,建模后1d) |
| 4.3.2 大鼠颞叶皮层凋亡相关蛋白的表达(线粒体凋亡途径,建模后1d) |
| 4.3.3 大鼠脑组织中IL-6、IL-1β、TNF-a的表达水平(建模后1d) |
| 4.3.4 凋亡染色结果(建模后1d) |
| 4.3.5 免疫组化染色结果(建模后1d) |
| 4.3.6 尼氏染色结果(建模后1d) |
| 4.3.7 转棒实验结果(建模后1d) |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）三七总皂苷对MCAO大鼠和SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT通路的调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药三七及其制剂治疗神经系统疾病的研究进展 |
| 1 道地药材三七及其主要成分研究 |
| 2 三七及其制剂治疗神经系统疾病作用机制及研究进展 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路在脑梗死后神经重塑中的作用及机制研究 |
| 1 脑梗死恢复期神经再生和重塑 |
| 2 Lingo-1 |
| 3 EGFR/PI3K/AKT信号通路 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 动物实验研究 |
| 实验一 三七总皂苷对MCAO大鼠造模7天后神经功能恢复评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 三七总皂苷对MCAO大鼠神经再生重塑的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 三七总皂苷对MCAO大鼠Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞实验研究 |
| 实验四 三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）活血养血汤对兔脊髓缺血再灌注损伤Cytc—Caspase-3介导的细胞凋亡通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 SCⅡ动物模型的研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 实验动物分组 |
| 3.2 建立动物模型 |
| 3.3 取材 |
| 3.4 数字减影技术鉴定模型 |
| 3.5 病理切片鉴定模型 |
| 3.6 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 数字减影技术鉴定动物模型 |
| 4.2 病理学观察 |
| 4.3 正常神经元计数 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分 活血养血汤干预对兔SCⅡ水肿、Ca~(2+)浓度的影响 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 药物制备 |
| 3.2 动物分组与给药 |
| 3.3 动物模型建立及取材 |
| 3.4 脊髓组织标本中水含量的测定 |
| 3.5 脊髓组织标本中Ca~(2+)的检测 |
| 3.6 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 脊髓组织标本中水含量 |
| 4.2 脊髓组织标本中Ca~(2+)浓度 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三部分 活血养血汤干预对兔SCⅡ模型cytc-caspase-3介导的细胞凋亡通路的影响 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 药物制备、动物分组给药、造模 |
| 3.2 取材 |
| 3.3 免疫组化法测定组织标本中Cytc、HSP70、Bcl-2、Bax |
| 3.4 酶联免疫法检测组织标本中HSP70、Bcl-2、Bax的含量 |
| 3.5 TUNEL法对脊髓神经细胞凋亡形态学研究 |
| 3.6 反转录PCR法检测脊髓组织标本Caspase-3 |
| 3.7 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 造模情况 |
| 4.2 免疫组化法检测脊髓组织标本Cytc、HSP70、Bcl-2、Bax |
| 4.3 酶联免疫法测定脊髓组织标本中HSP70、Bcl-2、Bax的含量 |
| 4.4 TUNEL法检测脊髓神经细胞凋亡 |
| 4.5 RT-PCR对脊髓组织标本中Caspase-3的检测 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、5-HT免疫组化染色观察尼莫地平于脊髓损伤中的保护作用（论文参考文献）
- [1]星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究[D]. 高强. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]基于HIF1-VEGF-Notch通路夏天无对血管性痴呆大鼠神经行为学的影响及其机制研究[D]. 胡卓瑶. 江西中医药大学, 2021(01)
- [3]血塞通对MCAO大鼠及OGD/R损伤SH-SY5Y细胞Lingo-1及EGFR/PI3K/Akt通路和BDNF的作用机制研究[D]. 吴爽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]安脑平冲汤对脑出血模型大鼠脑水肿及TRPV4、KCa3.1表达的影响[D]. 刘峻呈. 湖南中医药大学, 2020(03)
- [5]缺血后适应干预大鼠脊髓再灌注损伤时对CaSR和Caspase-12的影响[D]. 张睿. 江苏大学, 2020(02)
- [6]瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究[D]. 周哲屹. 广州中医药大学, 2019(08)
- [7]五味子治疗阿尔兹海默症活性组分的筛选及作用机制的代谢组学研究[D]. 刘媛媛. 吉林大学, 2019(10)
- [8]基于冷休克蛋白低温对蛛网膜下腔出血早期和延迟继发性脑损伤的保护及机制研究[D]. 代海滨. 南京大学, 2019(01)
- [9]三七总皂苷对MCAO大鼠和SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT通路的调节作用[D]. 杨田田. 北京中医药大学, 2018(08)
- [10]活血养血汤对兔脊髓缺血再灌注损伤Cytc—Caspase-3介导的细胞凋亡通路的影响[D]. 刘宇. 福建中医药大学, 2017(08)