一、家禽注射途径给药有八忌（论文文献综述）
郑沁玫[1]（2021）在《NA基因位点变异对H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶功能及致病性的影响》文中研究说明新型H7N9流感病毒自2013年在我国出现以来,给家禽生产和公共卫生均造成了极大危害。其中,2016～2017年人群中的第五波流行期内,更是出现了 HA裂解位点处携带多碱性氨基酸的变异株,使得H7N9从对家禽低致病性（Lowpathogenic,LP）进化为高致病性（Highly pathogenic,HP）,并一度出现LP和HPH7N9共存的复杂局面。随着H5/H7二价疫苗在家禽中的推广使用,H7N9在禽、人中的分离率均显着降低,有效遏制了 H7N9病毒的进一步扩散流行。目前,LPH7N9已鲜有分离,仅HPH7N9偶有散发。然而,对H7N9病毒的持续监测及其变异规律的研究仍至关重要。NA作为A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）囊膜表面表达丰度仅次于HA的糖蛋白,是一种复杂的多功能蛋白,在帮助病毒脱离黏蛋白相关的诱饵受体、促进病毒从感染细胞中释放等过程中具有关键性作用。其中,NA发挥神经氨酸酶功能与宿主细胞表面受体的相互作用被认为是决定IAV感染性和传播能力的重要因素。此外,NA上还存在第二受体结合位点（Second receptor binding site,SRBS）,可通过保持底物与该位点密切接触来增强附近酶催化位点的活性,并以这种方式促进病毒颗粒的HA-NA平衡,影响病毒复制及致病能力。因此,研究H7N9亚型流感病毒NA基因的适应性氨基酸位点变异及其对病毒神经氨酸酶功能、受体结合特性和致病性的影响,对探究H7N9的进化规律并掌握其流行趋势十分必要。1.分析H7N9亚型禽流感病毒NA基因适应性变异的氨基酸位点通过全球流感共享数据库（Global Initiative on Sharing All Influenza Data,GISAID）检索下载自2013年以来禽源、人源H7N9亚型流感病毒的NA基因序列,获得人源序列1467条,禽源序列1039条。利用生物信息学方法,分别纵向比对人、禽源各年份序列,并横向比对相同年份的人、禽源序列,筛选存在适应性变异的氨基酸位点。重点关注位于神经氨酸酶催化位点和SRBS等功能区附近的位点变异。结果显示,A21T（按N9 计）、M72I/T、E73G/K、D121N、R126K、Y166H、T178A、V209Y/I、S242P、D354N、D431G这11个位点在禽源和人源H7N9病毒的NA上均呈现随年代递进的明显规律性变异。其中,D121N、R126K、S242P位于酶催化位点附近;Y166H在禽源和人源序列中的变异稳定且程度逐渐变大;T178A、V209Y/I位于骨架残基附近;D354N、D431G位于SRBS附近,且D354N可能对N-糖基化的状态造成影响,D431G紧邻SRBS的K432位点。2.H7N9亚型NA点突变重组病毒的拯救及病毒神经氨酸酶功能测定为了明确第一章筛选出的NA适应性位点变异对H7N9病毒神经氨酸酶功能的影响,选取其中的Y166H、S242P、D354N、D431G共4个位点,分别在A/chicken/Guangdong/GD15/2016 的 HP 病毒骨架 rGD15 及其 HA 基因人为缺失“KRTA”基序的LP病毒骨架△ rGD15上进行NA基因的定点突变,构建并拯救了一系列点突变H7N9重组病毒。进一步对上述救获的8株重组病毒及其母本病毒进行了不同细胞上的生长曲线和神经氨酸酶功能测定。由病毒复制动力曲线发现,rGD15-D431G在MDCK细胞上的生长状况较差,而rGD15-P242S在MDCK上的生长状况优于母本毒rGD15,LP骨架上趋势一致。在人源细胞A549上,72 h出现明显差异,rGD15-P242S的繁殖滴度显着高于母本病毒,而rGD15-H166Y、rGD15-D354N、rGD15-D431G的复制性能不及母本病毒。在禽源细胞CEF上,HP和LP骨架上的D431G突变均造成了比母本病毒更低的复制水平。神经氨酸酶活性试验显示,无论是HP还是LP病毒骨架,D431G突变病毒的酶活性均相对最低,P242S突变病毒的酶活性均相对最高。红细胞的释放试验也表明,D431G突变在HP和LP病毒骨架上均导致了相对最慢的红细胞释放速度,这与酶活性结果一致。3.NA点突变H7N9亚型重组病毒的受体结合特性、小鼠致病性首先利用固相直接结合ELISA试验探究H7N9点突变重组病毒的受体结合特性。结果显示,HP骨架上的4株点突变重组病毒的受体特性与rGD15相同,仍为双受体结合特性。接着测定在HP H7N9模式病毒上NA蛋白适应性氨基酸位点的变异对小鼠致病力的影响。结果显示,rGD15-P242S引起小鼠体重下降更明显,其在肺脏的复制能力也更强,其他病毒引起体重减轻的能力均与rGD15相似或弱于rGD15。攻毒3dpi、5dpi后肺脏中rGD15-D431G的滴度均显着低于rGD15,5dpi时脾脏中也出现同样趋势。在肾脏中,各病毒复制效率基本相似。通过对攻毒后细胞因子的检测发现,rGD15-P242S刺激宿主产生炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的应答水平显着高于rGD15,rGD15-D431G刺激宿主产生TNF-α、IL-1β、INF-γ的水平显着低于rGD15。综上所述,本研究以HP H7N9亚型禽流感病毒及其致弱病毒为骨架,测定并分析了 NA基因适应性氨基酸位点变异对神经氨酸酶功能、受体结合特性和小鼠致病性的影响。研究结果可一定程度推进对H7N9病毒进化与变异规律的理解。
黄婉月[2]（2021）在《AFB1致小鼠睾酮合成障碍的分子机制及ROS/AMPK信号通路的调控作用》文中认为AFB1是毒性最强的霉菌毒素之一,广泛存在于谷物食品和饲料中,对人类和动物健康、动植物食品安全和经济贸易发展危害巨大。研究表明,AFB1暴露可抑制睾酮（T）合成,导致雄性生殖障碍,但其机制尚未明确。AMPK信号通路是调控T的关键通路。当细胞内能量缺失或受ROS等刺激时,AMPK信号通路被激活,抑制T合成。氧化应激是AFB1的主要毒性机制,AFB1暴露可提高ROS水平,但AFB1是否通过激活ROS介导的AMPK信号通路,导致T合成障碍尚不清楚。因此,本研究以ROS、AMPK信号通路及T合成三者之间的关系为切入点,以“AFB1通过激活ROS/AMPK信号通路抑制T合成”为理论假说,拟展开以下四个方面研究。（1）首先,以雄性昆明小鼠为受试对象,分别灌胃给予0 mg/kg B.W.（对照组,CG）、0.375 mg/kg B.W.（低剂量组,LG）、0.75 mg/kg B.W.（中剂量组,MG）和1.5mg/kg B.W.（高剂量组,HG）的AFB1,试验周期30 d,建立亚慢性AFB1诱导T合成障碍的动物模型,检测小鼠生长发育（精神状态;体重）、睾丸损伤（睾丸系数及体积、睾丸显微及超微结构;精子浓度、活力及畸形率）、血清T含量、氧化应激（睾丸组织ROS和MDA含量、CAT和GSH-Px活性）、线粒体损伤（睾丸组织细胞线粒体超微结构、MMP水平及ATP含量）、AMPK信号通路（p-AMPK、t-AMPK、p53及Nur77的蛋白表达）、细胞凋亡（TUNEL染色、Bax和Bcl-2的m RNA及蛋白表达）和T合成关键酶（St AR、P450scc、3β-HSD、P450c17和17β-HSD的m RNA及蛋白表达）,旨在探究AFB1对T合成及ROS介导的AMPK信号通路的影响。（2）而后,以TM3（小鼠睾丸间质细胞系）为受试对象,分别添加0μM、2.5μM(1/30 IC50)、5μM(1/15 IC50)和10μM(2/15 IC50)的AFB1,培养24 h,建立AFB1中毒细胞模型,检测细胞损伤（细胞活力;细胞形态及超微结构）、细胞培养上清T含量、氧化应激、线粒体损伤、AMPK信号通路、细胞凋亡及T合成关键酶,确证AFB1对TM3细胞中T合成的抑制作用及ROS介导的AMPK信号通路的影响,并分析AFB1与T含量及AMPK信号通路的剂量-效应关系,筛选出后续TM3细胞干预试验中AFB1的适宜剂量。（3）再应用Compound C（AMPK抑制剂）处理AFB1暴露的TM3细胞,试验分为对照组（0μM Compound C+0μM AFB1）、AFB1中毒组（5μM AFB1）、AMPK干预组（10μM Compound C+5μM AFB1）和AMPK干预对照组（10μM Compound C）,培养24 h,检测细胞培养上清T含量、AMPK信号通路、细胞凋亡及T合成关键酶的m RNA及蛋白表达,验证AMPK信号通路在AFB1致T合成障碍中的作用。（4）最后,应用NAC（ROS清除剂）处理AFB1暴露的TM3细胞,试验分为对照组（0 m M NAC+0μM AFB1）、AFB1中毒组（5μM AFB1）、ROS干预组（5 m M NAC+5μM AFB1）和ROS干预对照组（5 m M NAC）,培养24 h,检测AMPK信号通路（p-AMPK及t-AMPK）的蛋白表达,验证AFB1所致的AMPK信号通路激活是否由ROS介导。综合分析试验结果,阐明AFB1致T合成障碍的分子机制及ROS/AMPK信号通路的调控作用,研究结果有可能筛选出AFB1致雄性生殖功能障碍的作用靶点,为发现防治AFB1生殖毒性的靶标药物或防御措施提供新思路,也可为比较医学和公共卫生安全评价提供参考依据。试验结果如下:（1）AFB1处理小鼠试验结果:1)AFB1处理组小鼠精神沉郁,反应迟缓;MG和HG中小鼠体重显着低于CG（P<0.05）,表明AFB1抑制小鼠生长发育。2)MG和HG中小鼠睾丸系数显着低于CG（P<0.05;P<0.01）;AFB1处理组中小鼠睾丸体积均显着低于CG（P<0.05;P<0.01）;AFB1处理组小鼠睾丸组织的显微及超微结构出现明显损伤;MG和HG中小鼠附睾精子密度显着低于CG（P<0.05,P<0.01）,小鼠附睾精子畸形率显着高于CG（P<0.01）;AFB1处理组中小鼠附睾精子活率均显着低于CG（P<0.05,P<0.01）,表明AFB1损伤小鼠睾丸组织的结构及功能,抑制精子发生。3)AFB1处理组小鼠血清的T含量均显着低于CG（P<0.01）,表明AFB1导致小鼠睾丸组织T合成障碍。4)AFB1处理组小鼠睾丸组织的ROS含量均显着高于CG（P<0.01）,CAT和GSH-Px活性均显着低于CG（P<0.01）;MG和HG中小鼠睾丸组织的MDA含量显着高于CG（P<0.01）,表明AFB1导致睾丸组织中ROS蓄积和氧化应激。5)AFB1处理小鼠睾丸组织中生精细胞及间质细胞线粒体超微结构受损,小鼠睾丸组织的MMP水平均显着低于CG（P<0.05,P<0.01）;MG和HG中小鼠睾丸组织的ATP含量显着低于CG（P<0.01）,表明AFB1导致睾丸组织细胞线粒体损伤。6)AFB1处理组小鼠睾丸组织中p-AMPK和p53的蛋白表达均显着高于CG（P<0.05,P<0.01）;MG和HG中小鼠睾丸组织中Nur77蛋白表达显着低于CG（P<0.05,P<0.01）,表明AFB1可激活AMPK信号通路及其下游靶蛋白。7)TUNEL染色显示,AFB1处理组小鼠睾丸组织中生精细胞及间质细胞均发生凋亡;小鼠睾丸组织中Bax m RNA表达均显着高于CG（P<0.01）,Bcl-2的m RNA及蛋白表达均显着低于CG（P<0.01）;MG和HG中Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2比值显着高于CG（P<0.01;P<0.05）,表明AFB1可导致睾丸组织细胞凋亡。8)AFB1处理组小鼠睾丸组织中St AR、P450scc,3β-HSD、P450c17和17β-HSD的m RNA表达均显着低于CG（P<0.01）;P450scc、3β-HSD、P450c17和17β-HSD的蛋白表达均显着低于CG（P<0.05,P<0.01）;MG和HG中St AR蛋白表达显着低于CG（P<0.01）,表明AFB1抑制睾丸组织T合成关键酶的表达。（2）AFB1处理TM3细胞试验结果:1)AFB1对TM3细胞的IC50为74.58μM。2)AFB1处理组TM3细胞活性均显着低于0μM组（P<0.05;P<0.01）;TM3细胞的显微及超微结构被破坏,表明AFB1导致TM3细胞损伤。3)5μM和10μM AFB1处理组TM3细胞培养上清中T含量显着低于0μM组（P<0.01）,表明AFB1引起TM3细胞T合成障碍。4)AFB1处理组TM3细胞中ROS和MDA含量均显着高于0μM组（P<0.01）;CAT和GSH-Px活性均显着低于0μM组（P<0.01）,表明AFB1导致TM3细胞中ROS蓄积和氧化应激。5)AFB1处理组TM3细胞线粒体超微结构受损,MMP水平及ATP含量均显着低于0μM组（P<0.01）,表明AFB1导致TM3细胞线粒体损伤。6)AFB1处理组TM3细胞的p-AMPK蛋白表达均显着高于0μM组（P<0.05;P<0.01）;5μM和10μM AFB1处理组TM3细胞的p53蛋白表达显着高于0μM组（P<0.01）;各AFB1处理组TM3细胞的Nur77蛋白表达均显着低于0μM组（P<0.05;P<0.01）,表明AFB1激活AMPK信号通路及其下游靶蛋白。7)AFB1处理组TM3细胞凋亡率均显着高于0μM组（P<0.05,P<0.01）;Bax的m RNA及蛋白表达均显着高于0μM组（P<0.05;P<0.01）;Bcl-2的m RNA及蛋白表达均显着低于0μM组（P<0.01）;MG和HG中Bax/Bcl-2比值显着高于CG（P<0.01）,表明AFB1导致TM3细胞凋亡。8)AFB1处理组TM3细胞中St AR、P450scc、3β-HSD、P450c17和17β-HSD的m RNA表达均显着低于0μM组（P<0.01）;St AR、P450scc、3β-HSD和P450c17的蛋白表达均显着低于0μM组（P<0.05;P<0.01）,5μM和10μM AFB1处理组中TM3细胞的中17β-HSD蛋白表达显着低于0μM组（P<0.01）,表明AFB1抑制TM3细胞中T合成关键酶的表达。（3）Compound C干预AFB1处理TM3细胞试验结果:1)10μM的Compound C可显着缓解AFB1所致的TM3细胞培养上清中T含量的降低（P<0.05;P<0.01）,表明抑制AMPK信号通路可缓解AFB1所致的T合成障碍。2)10μM的Compound C可显着缓解AFB1所致的TM3细胞中p-AMPK和p53蛋白表达的升高及Nur77蛋白表达的降低（P<0.05;P<0.01）。3)10μM的Compound C可显着缓解AFB1所致的TM3细胞凋亡率、Bax的m RNA及蛋白表达和Bax/Bcl-2比值的升高（P<0.01）,Bcl-2的m RNA及蛋白表达的降低（P<0.01）,表明抑制AMPK信号通路可缓解AFB1所致的细胞凋亡。4)10μM的Compound C可显着缓解AFB1所致的TM3细胞中T合成关键酶St AR、3β-HSD及P450c17的m RNA及蛋白表达的降低（P<0.05;P<0.01）。（4）NAC干预AFB1处理TM3细胞试验结果:1)5 m M的NAC可显着缓解AFB1所致的TM3细胞ROS的蓄积（P<0.01）。2)5 m M的NAC可显着缓解AFB1所致的TM3细胞中p-AMPK蛋白表达的升高（P<0.01）,表明干预ROS可抑制AFB1所致的AMPK信号通路的激活。综上所述,AFB1可导致睾丸组织和TM3细胞损伤,降低T含量,诱发氧化应激,损伤睾丸组织和TM3细胞线粒体,激活ROS介导的AMPK信号通路。AFB1通过激活ROS/AMPK信号通路促进睾丸间质细胞凋亡、抑制T合成关键酶表达,导致T合成障碍。
姚舜禹[3]（2020）在《表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价》文中研究表明新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）是1927年在英国纽卡斯尔首次出现的一种禽类病毒,主要伤害病禽的消化系统和呼吸系统,甚至导致死亡,是严重威胁全球家禽养殖业的病原之一。应用疫苗是防控新城疫病毒感染的有效手段,现有NDV疫苗所用毒株大多为上世纪50年代开发的毒株所构建,与目前导致新城疫疫情的毒株间已有较大的遗传差距,因此需要开发新的新城疫疫苗。本研究构建了锚定型表达包含NDV融合蛋白（fusion glycoprotein,F）与血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase,HN）截短体蛋白的重组酿酒酵母菌株,研究了其表达特性,并通过对动物免疫初步评价了重组酵母菌株作为候选疫苗的免疫效力。主要结果如下:1.NDV F和HN基因的扩增与转录单位构建:根据抗原表位分析,并结合他人的研究成果,选择新城疫F基因第241位碱基至888位碱基以及HN基因的第25位碱基至528位碱基序列,应用生物信息学技术分析这部分片段的一,二,三级结构组成和特点,确定其氨基酸序列,等电点和亲疏水性等理化性质,构建系统进化树,并连接到酿酒酵母表达载体（POT）中,构建带有抗原表位的转录单位。2.NDV F与HN蛋白在酿酒酵母表面的表达及鉴定:采用Yeast Fab Assembly的技术,通过II型内切酶的识别位点与其切割位点不同的特点将转录单位与同源臂和Leu营养筛选标记串联,利用Li Ac转化法将其整合到ST1814-G酵母基因组。经营养缺陷型筛选、PCR基因型验证、Western Blot分析,免疫荧光鉴定,证实成功构建了NDV F与HN蛋白串联展示于酵母细胞表面的菌株,通过生长曲线检测,结合Western Blot灰度分析结果,证实重组蛋白在36小时表达量最高。与阴性对照组相比,外源蛋白F与HN的表达对宿主菌的酵母菌生长影响不大。3.重组酵母菌的免疫效果评价:构建HN蛋白的原核表达载体,并表达纯化HN原核蛋白,以其来检测动物实验鸡血清的Ig G含量,ELISA实验结果证明重组酵母免疫后的鸡血清中的Ig G含量明显高于喂食原始酵母菌（ST1814G）的阴性对照组,表明重组酵母有一定的免疫原性。综上所述,本研究构建的串联表达新城疫病毒F和HN蛋白的重组酿酒酵母菌株,动物免疫结果证实该菌株可诱导产生特异性抗体,表明重组菌具有免疫保护性,可作为NDV预防的潜在候选疫苗进行工业开发。
王爽[4]（2020）在《大肠杆菌氨苄西林耐药性对其噬菌体裂解作用的影响及机制研究》文中认为抗生素耐药性细菌是威胁人类和动物健康的普遍问题。大肠杆菌作为重要的食源性机会致病菌,其抗生素耐药性带来的治疗失败逐年增加,世界卫生组织2017年发布的抗生素研发重点病原菌名单中,前三名是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌。由于细菌抗生素耐药性发生发展速度远超新型抗生素的研发速度,因此迫切需要开发替代疗法。噬菌体由于其宿主特异性,对治疗的患者细胞和正常菌群无作用且能够不断进化以对抗细菌产生的抗性,因此获得了新的关注。尽管已经开展了大量的噬菌体单一或联合疗法的研究,目前仍不明确噬菌体对细菌的裂解效果是否会受到迅速增加的抗生素耐药性的影响。本研究以实验室保存的肌尾噬菌体科噬菌体vBEcoM-ep3和大肠杆菌CVCC1418为主要研究对象,寻找氨苄西林耐药性影响噬菌体裂解大肠杆菌的分子机制。首先,我们发现多重耐药性大肠杆菌菌株O78-6对噬菌体vBEcoM-ep3的敏感性显着高于同属于O78血清组的菌株CVCC1418。通过抗生素驯化获得自发突变氨苄西林耐药菌株CVCC1418AmpR和环丙沙星耐药突变株CVCC1418CipR,检测噬菌体vBEcoM-ep3的裂解效果,结果显示与亲本菌株CVCC1418相比,氨苄西林耐药突变株CVCC1418AmpR的噬菌体敏感性增加,而环丙沙星耐药突变株CVCC1418CipR的噬菌体敏感性没有显着变化。检测氨苄西林对实验室保存的大量大肠杆菌临床分离株的最小抑菌浓度,根据MIC选取其中的34株大肠杆菌,将其分为氨苄西林低耐药组（MIC≤25 mg/L,共15株）和氨苄西林高耐药组（MIC≥800 mg/L,共19株）,用这些菌株作为宿主菌共分离到81株噬菌体,检测这些噬菌体对34株大肠杆菌的裂解范围,并分析噬菌体裂解效率与氨苄西林对其宿主菌最小抑菌浓度的关系,结果表明氨苄西林耐药性的增加与大肠杆菌噬菌体敏感性的升高具有密切关联,且这一现象在O78血清组菌株中较为明显,提示这些分离株可能具有相同的参与噬菌体的结合的LPS。但是,并非所有O78来源的噬菌体都能够感染所有O78血清组菌株,这表明可能涉及其他噬菌体受体,这些噬菌体受体在这些分离株中的表达和/或可及性有所不同。为了探索氨苄西林耐药性促进噬菌体裂解大肠杆菌这一现象的机制,本研究利用iTRAQ技术分析亲本菌株CVCC1418和氨苄西林耐药突变菌株CVCC1418AmpR蛋白组学差异。iTRAQ蛋白组学实验共鉴定到54个CVCC1418AmpR的差异表达蛋白,其中31个蛋白表达上调,23个蛋白表达下调。与CVCC1418相比,CVCC1418AmpR中大量代谢通路相关蛋白发生变化;细菌的趋化、信号转导、鞭毛合成相关的多个蛋白表达改变,以便细菌及时响应外界刺激;多个外膜孔蛋白表达差异显着,以加速抗生素外排并减少抗生素摄取;β-内酰胺酶显着上调,以促进氨苄西林的水解,从根本上抵抗氨苄西林的杀菌作用。由蛋白组学结果可以看出,细菌启动多种机制以抵御抗生素的杀伤。同时我们使用转座子随机插入系统构建菌株CVCC1418AmpR转座子随机插入突变库,筛选到67个噬菌体vBEcoM-ep3裂解效率下降的突变株,并鉴定这些菌株的转座子插入位点为ampC或ampR。由于iTRAQ蛋白组学结果中AmpC在菌株CVCC1418AmpR表达显着上调,因此选择AmpC作为后续研究的主要对象,荧光定量PCR证实14和53号突变株转座子插入位点确为ampC,且与CVCC1418AmpR相比,两个突变株对氨苄西林的敏感性均显着增加。为了进一步确定AmpC对噬菌体裂解大肠杆菌的影响,我们构建了AmpC过表达菌株CVCC1418pAmpC,与亲本菌株CVCC1418对比,CVCC1418pAmpC的噬菌体裂解效率和吸附效率显着增加。接着我们尝试构建了ampC敲除菌株,在CVCC1418AmpR中多次尝试未果,但在K12 MG1655中的成功敲除ampC获得菌株K12ΔAmpC,并构建了回补菌株K12ΔAmpCpAmpC,对比噬菌体的裂解效果,结果表明敲除ampC基因显着抑制噬菌体的裂解效率和吸附效率,回补ampC后噬菌体的裂解效率有所回升。由于大肠杆菌中直接影响噬菌体吸附的主要是外膜蛋白,因此我们检测了产量受AmpC表达变化影响的外膜蛋白,外膜蛋白OmpA转录水平随AmpC表达增强而增加。而已有OmpA作为噬菌体受体相关报道,因此我们推测AmpC可能通过调节OmpA的表达影响噬菌体裂解作用。为了确定OmpA是否为噬菌体vBEcoM-ep3在宿主菌表面的受体,我们进行了pull-down试验,并利用质谱鉴定可能与噬菌体vBEcoM-ep3受体结合蛋白Dpo41相互作用的大肠杆菌表面的受体,共鉴定到三个假定噬菌体受体:脂蛋白LPP、外膜蛋白OmpA和烯醇化酶Eno。为了进一步确定噬菌体受体,我们原核表达并纯化鉴定到的蛋白,并利用免疫共沉淀检测其与Dpo41是否结合,结果显示OmpA确为Dpo41在菌体表面的受体。因此AmpC在菌株CVCC1418中的上调促进噬菌体受体OmpA的表达,细菌表面增加的噬菌体受体为噬菌体提供了更多结合宿主的机会,从而导致噬菌体裂解效率的提高。我们的研究证明即使针对于抗生素耐药性迅速增加的大肠杆菌,噬菌体仍然可以有效的发挥杀菌作用,从一定程度解释了噬菌体-抗生素联合应用能够显着抑制抗生素耐药性产生这一现象的机制。为噬菌体-抗生素在感染性疾病中联合应用的协同作用提供了理论和实验依据。
任妍[5]（2020）在《硒对镉诱导神经元损伤的干预作用及机制研究》文中研究说明重金属镉是地壳中天然存在的元素,广泛应用于工业中,造成环境、生物、食品污染。对于一般人群,饮食是接触镉的主要来源。职业性的镉接触主要通过吸入发生,还可能偶然通过受污染的手和食物摄入。镉是一种强毒性金属,对多种组织器官均会产生毒性损伤。镉在中枢神经系统富集,进而导致神经元的损伤,但其干预的方式以及可能作用机制研究较少。硒是人体必需的微量元素,硒也是硫氧还蛋白还原酶1的核心金属离子。硫氧还蛋白还原酶1是硫氧还蛋白系统的重要组成成分,在体内的氧化还原中起重要的作用。硒可通过硒蛋白维持体内正常的生理机能,参与氧化应激调节,神经元保护等作用。目前在临床硒被认为是一种抗氧化剂,可以通过介导硫氧还蛋白还原酶1起到抗氧化的作用,在许多疾病中作为补充治疗而广泛使用。本项目为明确在体外水平,硒干预镉诱导神经元损伤的作用与机制,拟通过两部分内容开展。第一部分,为明确在中枢神经系统中镉的损伤作用与机制。选取人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y作为研究对象,进行氯化镉浓度梯度与时间梯度的处理,检测细胞形态及活力、活性氧含量、硫氧还蛋白还原酶1水平,明确镉通过下调硫氧还蛋白还原酶1上调了活性氧水平,导致了细胞的损伤。第二部分为探索硒干预镉的毒性作用以及可能机制,我们构建了镉暴露的SH-SY5Y细胞模型,加入亚硒酸钠,通过MTT、成像检测细胞活力及形态,进一步检测了活性氧含量、硫氧还蛋白还原酶1水平,同时利用流式细胞仪检测神经元凋亡,明确了硒对镉诱导神经元损伤具有保护作用,阐明其作用机制为硒上调硫氧还蛋白还原酶1的水平,降低了活性氧水平,抑制神经元凋亡。通过本研究明确了镉导致神经元损伤的新机制,阐明了硒干预镉诱导的神经元损伤的作用与机理,为镉毒性作用与防治提供了新的思路,为硒的抗氧化作用提供了新的理论基础。
李俊鑫[6]（2019）在《中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究》文中认为H7N9禽流感病毒是一种甲型流感病毒,可以通过禽类感染人。人感染H7N9禽流感是一种急性呼吸道传染病,可以迅速发展为重症肺炎和急性呼吸窘迫综合征,死亡率高达40%,至今仍然缺乏有效的药物和疫苗。目前,高致病性H7N9禽流感病毒的出现已经对家禽养殖业、畜牧业以及人类健康构成严重的威胁,亟需卫生部门采取有效的控制措施。全人源单克隆抗体能够中和和清除禽流感病毒,在防治禽流感上具有显着的疗效,因此,快速筛选靶向病毒保守中和表位的人源抗体对控制H7N9禽流感疫情具有重大意义。在本研究中,我们利用单个记忆B细胞PCR技术和微量中和H7N9病毒实验,两周内快速地从康复病人的可转化记忆B细胞（switched memory B cells）中鉴定和克隆全人源单克隆抗体3L11和5J13,并分别研究两种全新的人源抗体的抗病毒机制。3L11抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别由罕见的VH1-8*01/D2-15*01/JH5*02和VL2-13*01/JL3*02家族基因组成,而且分别带有8.87%和5.55%的体细胞突变,使3L11抗体能够结合H7N9病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）,亲和力KD为5.32×10-9M。我们构建的稳转CHO细胞能够生产250.12mg/L的3L11,抗体纯度达99%。在体外,3L11能够广谱中和A/Anhui/1/2013（AH1）、A/Shanghai/2/2013（SH2）、A/Shenzhen/Th004/2017（SZ4）、A/Shanghai/1/2013（SH1）等H7N9禽流感病毒,也可以介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）清除感染病毒的细胞。对3L11的H7N9逃逸病毒株测序发现,病毒的HA蛋白发生了G151R(Gly151→Arg151)和S152P(Ser152→Pro152)的氨基酸替换,这表明3L11的中和表位是在HA头部受体结合位点（receptor binding site,RBS）附近的抗原位点A（RRSGSS）。而且通过序列比对的结果发现,流行的H7N9野生型病毒都没有这两个氨基酸突变。因此,3L11有极大潜力能够中和所有出现过的H7N9流行毒株。更重要的是,无论是预防实验还是治疗实验,3L11都可以完全地保护小鼠免受H7N9病毒的致命攻击。5J13抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别由VH3-30*03/D2-2*01/JH6*02和Vκ4-1*01/Jκ4*01组成,并且分别带有15.25%和4.42%的体细胞突变。5J13特异地高亲和力结合H7N9病毒的HA蛋白,KD值为1.95×10-10M。稳转5J13抗体基因的CHO细胞能够生产84.48mg/L的5J13,抗体纯度达99%。在体外,5J13能够抑制病毒的血凝作用和膜融合作用,从而高效地中和了H7N9病毒;在体内,5J13能够预防和治疗致命的H7N9病毒感染小鼠。更重要的是,通过氢氘交换质谱、逃逸病毒株测序和竞争结合实验等结果发现,5J13的表位在HA蛋白头部RBS的对面,是一个之前国内外从未报道过的全新的中和表位,其中一个氨基酸E89K(Glu89→Lys89)的突变能够导致5J13失去结合病毒的活性。我们把这个全新的中和表位命名为抗原位点J。综上所述,本项研究工作证明了记忆B细胞PCR技术快速鉴定、克隆抗流感病毒人源抗体的可行性,对迅速控制严峻的特别是未来新出现的流感疫情具有重大的指导意义。我们获得了两个新的中和H7N9病毒的人源抗体,为预防和治疗H7N9禽流感提供了优质的候选抗体药物。另外,两个人源抗体的抗病毒机制以及全新中和表位的发现,将有力地促进通用型禽流感疫苗及广谱性中和抗体的研究和发展。
颜雯[7]（2019）在《刺五加苷B1抗流感病毒作用及其调控机制研究》文中提出流感病毒可造成严重呼吸系统疾病,具有多宿主性,且遗传物质易突变、易发生重组,适应性强,容易在动物与人之间、人与人之间传播而引起大流行,增加了防控的难度,严重威胁人类健康。中医药防治呼吸系统疾历史悠久,且具有较为完善的理论体系和用药经验。中药肿节风及其提取物,具有抗菌抗病毒作用,可以控制呼吸道感染,缓解患者的临床症状。然而,肿节风有效化合物活性成分及其抗流感作用机制尚不清楚。基于此,本研究对肿节风中14个主要单体成分进行抗流感病毒药效初筛,发现单体成分刺五加苷B1具有高抗病毒活性。进一步选择刺五加苷B1（刺木骨苷B1）为目标单体,通过系统研究发现刺五加苷B1可以通过调控宿主细胞POLR2A表达进而影响流感病毒的增殖,产生抗流感病毒作用,并进一步揭示了其作用机制,为临床用药提供科学依据。第一部分 肿节风主要单体成分抗流感病毒药效研究目的:1.从14个肿节风主要单体成分中筛选出抗流感病毒活性单体,确定后续研究目标单体。2.研究并确定目标单体抑制流感病毒复制的药效模式、作用时相及关键环节等具体药效机制。方法:1.首先对肿节风中14个主要单体成分进行药效初筛,这些单体分别为落新妇苷、新落新妇苷、异秦皮啶、刺五加苷B1、原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸、金粟兰内酯E、5-0-咖啡酰莽草酸、草珊瑚宝酯、白蜡树苷、七叶亭、秦皮素和蒿属香豆精。采用药物细胞毒性试验（MTT法）,检测各单体成分对MDCK细胞（Madin Darby Canine Kidney,狗肾传代细胞系）的半数有毒浓度（TC50）,以确定后续实验给药浓度;采用细胞病变效应抑制试验（CPE）,检测各单体成分在MDCK细胞模型中对甲型流感病毒A/PR/8/34株的抑制作用,并用Reed-Mench法计算半抑制浓度（IC50）及选择指数SI（SI=TC50/IC50）,评估单体抗病毒效果,筛选最优抗流感病毒作用的目标单体,并进行目标单体的制备。2.采用CPE法,检测目标单体对A/Aichi/68,H3N2等亚型流感病毒的抑制作用,进行抗流感病毒谱筛查;采用预防、治疗和直接作用的三个药效作用模式试验,明确目标单体是直接作用于甲型流感病毒A/PR/8/34株本身,还是通过调节宿主细胞来发挥抗流感病毒作用。采用药物作用时相实验和免疫荧光试验,检测目标单体在甲型流感病毒A/PR/8/34株单个复制周期中的作用时相和环节:在甲型流感病毒A/PR/8/34株感染的MDCK细胞上,取流感病毒感染-2h、Oh、2h、4h、6h和8h的六个时间点,给予刺五加苷B1干预24h后进行病毒滴度和免疫荧光检测。3.利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术,检测刺五加苷B1对流感病毒8个基因片段mRNA表达水平的调控作用。实验分组:甲型流感病毒A/PR/8/34株感染的A549细胞（人非小细胞肺癌细胞系）为病毒感染模型组,流感病毒感染后给予不同剂量刺五加苷B1（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）处理为刺五加苷B1干预组,非病毒感染A549细胞加入刺五加苷B1（100μg/mL）为刺五加苷B1对照组,各实验组给予相应干预24h,收集细胞并提取RNA进行检测。利用脂质体转染技术将荧光素酶标记的流感病毒聚合酶（RNP）相关基因,转染到293T细胞（人肾上皮细胞系）24h后收集细胞上清液。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒,检测各组荧光素酶活性,观察刺五加苷B1对流感病毒聚合酶的影响。采用实时荧光定量PCR技术,检测各组TNF、IL27、IL1B、NFκ B1、IL-6、CXCL8、CCL-2和IFNG等细胞炎症因子mRNA的表达水平的差异。结果:1.MTT实验结果显示:肿节风14种主要单体成分落新妇苷、新落新妇苷、异秦皮啶、刺五加苷B1、原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸、金粟兰内酯E、5-0-咖啡酰莽草酸、草珊瑚宝酯、白蜡树苷、七叶亭、秦皮素和蒿属香豆精,作用于MDCK细胞的体外半数毒性浓度（TC50）分别为:0.455mg/mL、0.783mg/mL、0.252mg/mL、4.127mg/mL、0.196mg/mL、0.56mg/mL、0.126mg/mL、2.004mg/mL、0.128mg/mL、>2.300mg/mL、>1mg/mL、>0.015mg/mL、>0.063mg/mL 和>0.25mg/mL,本研究将以此浓度为最大给药浓度进行后续实验。CPE实验结果表明:落新妇苷和刺五加苷B1具有抗流感病毒活性,其IC50分别为0.455mg/mL和4.127mg/mL,SI指数分别为1.74和11.79,其中落新妇苷为低效,刺五加苷B1为高效低毒,抗病毒活性较强;其他12个单体SI指数小于1,无抗病毒效果。因此,选择刺五加苷B1为后续研究的目标单体。刺五加苷B1的制备及结构鉴定:提取后续实验所需的刺五加苷B1样品后,鉴定其分子量为384,分子式为C17H2409,结构类型为香豆素糖苷。2.刺五加苷B1抗流感病毒谱筛选结果显示:在A/Guangzhou/GIRD07/09（H1N1）、A/Aihi/68（H3N2）、A/Duck/Guangdong/2009,（H6N2）、A/Duck/Guangdong/1994（H7N3）和 A/Chicken/Guangdong/1996（H9N2）等流感病毒株中,刺五加苷B1对A/Guangzhou/GIRD07/09,H1N1、A/Aichi/68,H3N2 流感病毒株具有抑制作用,其 IC50分别为0.064mg/mL、0.125mg/mL,SI指数分别为3.91、2;刺五加苷B1对其他亚型流感病毒没有抑制效果,SI指数小于1。药效作用模式试验结果显示:在治疗模式中,刺五加苷B1对甲型流感病毒A/PR/8/34株有抑制作用,IC50为0.04mg/mL,SI指数为3.625;在预防和直接模式下,刺五加苷B1对甲型流感病毒A/PR/8/34株没有抑制作用,SI指数<1。结果证明,刺五加苷B1对流感病毒粒子本身没有作用,是通过调控宿主细胞来达到抗流感病毒效果。因此,进一步探索刺五加苷B1抗流感病毒药效机制后,将研究它在抗流感病毒中对宿主细胞的调控机制。药物作用时相实验结果表明:与病毒感染模型组相比,病毒复制的早期阶段（0-6 h）加入刺五加苷B1（100μg/mL）,病毒滴度显着降低（P<0.05）;在病毒感染（-2h或者8h）加入刺五加苷B1（100μg/mL）,病毒滴度没有变化（P>0.05）。结果提示,刺五加苷B1主要在流感病毒复制早期起作用。免疫荧光试验结果显示:依次在病毒感染Oh、2h、4h、6h、8h加入刺五加苷B1（100μg/mL）,病毒合成的NP蛋白明显减少,但是NP蛋白并没有被限制在细胞核内,在细胞质中仍能观察到NP蛋白;而在病毒感染-2h加入刺五加苷B1（100μg/mL）,病毒合成的NP蛋白没有变化,也没有被限制在细胞核内。3.实时荧光定量PCR结果显示:与病毒感染模型组相比,刺五加苷B1（100μg/mL）能够降低病毒基因PB1、PB2、PA、HA、NA、NP和NS mRNA的表达（P<0.05）;对病毒基因M mRNA的表达无影响（P>0.05）。流感病毒RNA聚合酶（RNP）活性抑制试验结果表明:与RNP对照组相比,刺五加苷B1（200μg/mL）对流感病毒RNA聚合酶（RNP）具有抑制作用（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果表明:与病毒感染模型组相比,刺五加苷B1（100μg/mL）能显着降低流感病毒诱导的宿主细胞炎症因子TNF、IL27、IL1B、NFκ B1、IL-6、CXCL8、CCL-2 和 IFNG mRNA 的表达（P<0.05）。结论:成功筛选到具有抗病毒活性的目标单体:刺五加苷B1。首次证明,刺五加苷B1主要在流感病毒复制早期起作用,影响流感病毒NP蛋白表达,降低病毒基因表达,抑制流感病毒RNA聚合酶（RNP）活性和流感病毒诱导的宿主细胞炎症因子表达。第二部分 刺五加苷B1在抗流感病毒活性中诱导的宿主细胞基因差异表达研究目的:1.在抗流感病毒作用中,刺五加苷B1诱导宿主细胞基因差异表达情况。2.多步骤验证刺五加苷B1诱导的宿主细胞差异表达基因,筛选潜在作用靶点。方法:1.RNA高通量测序及分析:以A549细胞为空白细胞组（A549）,甲型流感病毒A/PR/8/34株感染A549细胞为病毒感染模型细胞组（PR8）,病毒感染后加入刺五加苷B1（100μg/mL）为刺五加苷B1干预细胞组（PR8+eleu）,分别给予相应干预24h后,收集细胞,提取RNA进行高通量测序;得到测序数据后,采用R语言,对各实验组之间编码RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA）差异表达水平进行分析,并结合数据库进行功能富集和聚类分析。采用的数据库包括:基因本体论（GO,Gene Ontology）和京都基因与基因组百科全书（KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）。2.分析PR8+eleu/PR8之间以及PR8/A549之间的显着差异表达mRNAs/ncRNAs,得到两组间相同的显着差异表达mRNAs/ncRNAs并进行功能富集,筛选与流感病毒感染相关的mRNAs/ncRNAs用于下一步验证。采用实时荧光定量PCR技术对所筛选基因进行检测,得到mRNA表达有显着差异且与RNA高通量测序结果一致的基因;采用ChemDraw ultra 8.0和SYBYL-X2.1.1软件,进行分子对接模拟试验,分析上述基因空间构像之间的相互作用,进一步缩小差异表达基因范围。结果:1.RNA高通量测序中差异表达的mRNAs分析结果表明:在PR8+eleu/PR8之间,有 1871 个显着差异表达 mRNAs（Fold change>2,Pvalue<0.05）,其中 958 个上调,913个下调,其中有846个mRNAs与PR8/A549之间显着差异表达mRNAs相同;对上述差异表达mRNAs进行基因功能富集发现上述基因涉及各种类型的N-聚糖生物合成、趋化因子信号传导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用和RNA聚合酶等通路。RNA高通量测序中差异表达的ncRNAs分析结果表明:PR8+eleu/PR8之间,有8个具有显着差异表达的ncRNAs（Fold change>2,Pvalue<0.05）,上调的有5个,下调的有3个,其中只有NEAT1与PR8/A549之间显着差异表达ncRNAs相同;基因功能富集结果显示,上述显着差异表达ncRNAs涉及氧化磷酸化、甲型流感、同种异体移植物排斥、自身免疫性甲状腺疾病、I型糖尿病、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。2.筛选显着差异表达mRNAs/ncRNAs:通过基因功能富集初步筛选与各种类型N-聚糖生物合成、趋化因子信号传导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路密切相关的46个差异表达mRNAs,包含RNA高通量测序结果中下调最为显着的基因POLR2A（DNA-directed RNA polymerase Ⅱ subunit RPB1,DNA 定向 RNA 聚合酶Ⅱ亚单位）,加上显着差异表达ncRNA（NEAT1）共47个显着差异表达mRNAs/ncRNAs,对其进行实时荧光定量PCR验证。实时荧光定量PCR结果显示:与病毒感染模型细胞组相比,刺五加苷B1（100μg/mL）干预细胞组中,上述初步筛选的47个差异表达mRNAs/ncRNAs中只有POLR2A、ALG1、ALG9和IL1RAP的表达被下调（P<0.05）,且与RNA高通量测序结果一致,其它所筛选基因表达没有统计学差异（P>0.05）。分子对接结果显示:与宿主基因POLR2A、ALG1、ALG9和IL1RAP进行结构匹配度分数评估中,刺五加苷B1与POLR2A的对接分数为9.0133,排名第一。结论:在抗流感病毒作用中,刺五加苷B1调控宿主细胞多个基因的表达,涉及各种类型N-聚糖生物合成、趋化因子信号传导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用和RNA聚合酶等通路。其中POLR2A可能为刺五加苷B1调控宿主细胞进而发挥抗流感病毒作用的靶点基因。第三部分 刺五加苷B1对宿主细胞POLR2A基因调控作用机制研究目的:1.验证POLR2A在刺五加苷B1抗流感病毒作用中的关键调控作用。2.初步探究刺五加苷B1对POLR2A的调控机制。方法:1.POLR2A基因过表达/敲除稳定细胞模型的构建及验证:构建携带POLR2A基因的慢病毒颗粒后感染MDCK细胞,通过嘌呤毒素筛选表达POLR2A基因单克隆细胞,并进行细胞扩大培养,构建得到POLR2A过表达细胞模型;采用规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR-Cas9）技术,利用Cas9质粒转染MDCK细胞,得到POLR2A基因敲除细胞模型。收集上述构建模型细胞样品,进行蛋白印迹试验,检测POLR2A蛋白表达情况以确认模型是否成功构建。绿色荧光流感病毒的构建及验证:构建标记有绿色荧光蛋白（GFP）的非结构蛋白（NS）重组质粒后,与携带有PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M片段的7个质粒,用脂质体共转染到293T细胞中,得到重组绿色荧光流感病毒,利用细胞和鸡胚进行病毒滴度扩增。通过荧光显微镜观察、病毒血凝实验和透射电镜观察,确认绿色荧光流感病毒构建成功。POLR2A在刺五加苷B1抗流感病毒中关键调控作用的验证:用绿色荧光流感病毒,感染POLR2A基因过表达/敲除稳定细胞模型,确认流感病毒可以在此细胞模型上进行复制后,荧光显微镜下观察不同实验组（病毒感染模型组和病毒感染后刺五加苷B1100μg/mL干预组）NS基因上携带的GFP表达差异;采用细胞病变效应抑制试验,检测刺五加苷B1在POLR2A过表达/敲除稳定细胞模型中,对甲型流感病毒A/PR/8/34株的抑制效果。2.采用启动子活性抑制试验,检测刺五加苷B1对POLR2A启动子活性的影响:首先构建有荧光素酶标签的POLR2A启动子稳定细胞株,进行实验分组:甲型流感病毒A/PR/8/34株感染的A549细胞（人非小细胞肺癌细胞系）为病毒感染模型组,流感病毒感染后给予不同剂量刺五加苷B1（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）处理为刺五加苷B1干预组,非病毒感染A549细胞加入刺五加苷B1（100μg/mL）为刺五加苷B1对照组。按照分组给予相应干预24h后,用荧光素酶检测试剂盒检测各组荧光素酶的表达情况。采用亚硫酸氢钠测序法检测甲型流感病毒A/PR/8/34株感染A549细胞后,刺五加苷B1干预引起的POLR2A CpG岛各位点的甲基化情况。采用蛋白印迹试验,检测各组POLR2A蛋白的表达情况。结果:1.蛋白质印迹试验结果显示:POLR2A过表达细胞模型中,POLR2A蛋白的表达水平高于正常MDCK细胞组（P<0.05）,证明POLR2A过表达细胞模型成功构建;POLR2A基因敲除细胞模型中,POLR2A蛋白表达量与正常MDCK细胞相比无显着差异（P>0.05）。因此,选择POLR2A过表达细胞模型用于后续研究。绿色荧光流感病毒拯救结果:荧光显微镜下观察,绿色荧光流感病毒感染MDCK细胞后,能够表达绿色荧光蛋白;病毒血凝实验结果确认其有血凝活性;电镜观察到拯救的流感病毒颗粒,表明绿色荧光流感病毒拯救成功。荧光显微镜下观察显示:在POLR2A过表达细胞模型中,刺五加苷B1不能抑制绿色荧光流感病毒的复制,与病毒感染模型组的荧光表达情况相比无显着差异。CPE法结果显示:在POLR2A过表达细胞模型中,刺五加苷B1对甲型流感病毒A/PR/8/34株没有抑制作用,SI指数<1。2.启动子活性检测结果表明:与病毒感染模型组相比,刺五加苷B1在100μg/mL剂量下,抑制POLR2A启动子活性（P<0.05）,但是在25μg/mL和50μg/mL剂量下,没有抑制效果（P>0.05）。亚硫酸氢盐测序（BSP）结果显示:与病毒感染模型组比较,病毒感染后刺五加苷B1（100μg/mL）干预组中POLR2A在-222-72 bp区间CpG甲基化水平比例增加（P<0.05）,而在-606-268 bp、-183-476 bp区间甲基化水平没有变化（P>0.05）。蛋白质印迹试验结果显示,与病毒感染模型组比较,病毒感染后刺五加苷B1不同剂量（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）干预组中POLR2A蛋白的表达无显着差异（P>0.05）。结论:刺五加苷B1可能通过影响POLR2A启动子的活性和CpG甲基化水平,来调控POLR2A基因的表达,进而发挥抗流感病毒作用。
王强[8]（2019）在《鸡大肠杆菌病模型建立与辨证分型》文中研究指明鸡大肠杆菌病是目前家禽养殖业中最常见的多发病。环境、应激反应或继发病等多种因素均可以导致发病,临床上治疗多采用抗生素,导致耐药菌株的产生,疗效大不如前,同时对人类身体健康和生存环境造成恶劣影响。目前众多临床实践和现代中药药理学研究证实,许多中药在治疗细菌性传染病当中发挥了积极的作用。然而,市场上的中兽药种类繁多,部分中兽药制剂的方剂缺乏中兽医辨证理论依据。因此,本试验通过不同途径感染大肠杆菌的模型来观察症状体征与中兽医证候特点比较分析,建立鸡大肠杆菌病的辨证标准,为防治鸡大肠杆菌病的中兽药研发与临床推广提供理论依据。试验一喉头气管接种鸡大肠杆菌模型的建立与观察通过预试验发现喉头气管接种攻毒剂量为0.54×109 CFU/mL菌液0.5mL/只时,发病率能达到100%,死亡率为40%,症状病变与临床自然发病基本一致,因此选用该剂量通过喉头气管接种进行模型建立。攻毒后,观察临床症状和体温变化,同时对血生化、组织病理切片和炎性因子相关指标进行检测。结果:随病情的发展,症状及组织器官病变也在不断发生变化。在攻毒后12 h,以发热症状为主,占存活鸡群总数的100%,攻毒后36 h,有90%的存活鸡表现出典型拉稀症状,攻毒后72 h,鸡群体温开始出现下降;剖检发现攻毒后24 h病死鸡出现渗出性心包炎;攻毒后48 h肝脏出现病变,边缘充血坏死,攻毒后96 h后心包炎和肝周炎等典型病变检出率达到100%,个别鸡出现肾脏、脾脏肿大等病变;病理学观察发现,攻毒后12 h,肺部率先出现病变,进而侵害心、肠、肝等组织器官;表明细菌由呼吸道侵入机体后,通过肺部进入血液,进而逐渐侵害机体的其他组织器官。血生化指标发现ALT、AST和TBIL在24 h-36h出现显着和极显着升高（P<0.05,P<0.01）,其中AST在攻毒后72 h开始降低;炎性指标检测发现血清中IL-1β表达量在攻毒后24 h出现升高,24h、36h、48h和72h差异显着（P<0.05）,攻毒后72h恢复正常,TNF-α表达量在攻毒前期无明显变化,在攻毒后96 h出现显着升高（P<0.05）,表明在疾病发展的炎性反应不断加剧,肝功能受损严重。以上结果表明,通过喉头气管接种鸡大肠杆菌,模拟自然感染途径,可成功建立人工疾病模型,为人工建立鸡大肠杆菌病模型和治疗鸡大肠病的中药筛选提供参考。试验二肌注模型的建立与观察通过预试验发现胸肌注射攻毒剂量为0.30×109 CFU/mL菌液0.5mL/只时,发病率达到100%,死亡率50%-70%左右,症状病变与临床自然发病基本一致。攻毒后同上进行相关指标观察,同时进行血常规、菌血症和肝脏触片相关指标检测。结果:本模型症状和病变出现的时间点,均比喉头气管接种模型提前且更加严重。在攻毒后12 h出现发热症状,24 h后发热症状消失,持续时间比喉头气管接种模型减少12 h,部分鸡体温开始下降,比喉头气管接种模型提前36 h出现;拉稀症状在攻毒后24 h出现,比喉头气管接种模型提前12 h出现,占存活鸡群的比例高达85%;剖检出现心包炎和肝周炎病变的时间点均比喉头气管接种模型提前12 h出现,并在60 h,检出率达到100%;组织切片观察发现心、肝的病理变化出现的时间点也提前24 h。血常规检查发现攻毒组的WBC总数在36 h显着高于对照组（P<0.05）;在60 h、72 h、96 h、120 h和144 h极显着高于对照组（P<0.01）;中性粒细胞（NEUT）数在攻毒后72 h出现升高,极显着高于对照组（P<0.01）;血生化指标和炎性因子检测与喉头气管接种模型无显着差异,以上指标均反应出细菌在侵入机体后,炎症反应在不断加剧。试验鸡菌血症检测攻毒后在12 h检出率最高达到87.5%;各时间段病死鸡取肝脏组织触片,均可观察到致病菌,表明通过肌注途径进行攻毒,细菌可迅速进入血液,引发菌血症,大幅减少临床的感染和发病周期。以上结果表明,肌注模型具有发病快、致病性强、所需剂量小且死亡率高等特点,缺乏临床上自然感染发病的典型病程。试验三鸡大肠杆菌病最佳辨证方法为六经辨证和卫气营血辨证。喉头气管接种模型的鸡大肠杆菌病程按六经辨证分析:在攻毒后6 h-18h,病鸡主要表现为恶寒（扎堆、羽毛蓬松等）、高热（80%以上病鸡体温升高℃以上,精神极度沉郁等）,这与太阳-少阴病证相符;攻毒后18 h-24h,发热症状鸡仅占存活鸡的33%,这与阳明病证向少阳病证传变的主证微热不退、寒热往来相符;攻毒后24 h-36h,病鸡群主要表现发热鸡逐渐减少,体温下降鸡逐渐增多,且有90%的病鸡出现拉稀症状,这与太阴病证基本相符;攻毒后36 h-72h,与少阴主证恶寒、嗜睡和神昏相符,此时病在心肾;72 h以后与厥阴主证寒热错杂、神昏衰竭相符。按卫气营血辨证分析:攻毒后6 h-24h,与卫分阶段主证发热相符,病在卫分;攻毒后24 h-48h,与营分阶段病邪入血,与营分阶段主证神昏相符,病在营分;攻毒后48 h-72h,个别鸡脾脏、肾脏肿大,血象分析中,肝功能严重下降,而血分病以神昏、肝肾病变为主,病在血分。肌注模型组鸡病程按六经辨证分析:攻毒后6 h-12h,与太阳和阳明阶段主证相符,病位为太阳传入阳明;攻毒后12 h-24h,发热症状鸡仅占存活鸡总数的8%,同时拉稀症状鸡比例达到85%,因此病位辨为少阳传入太阴病证;攻毒后24 h-72h,与少阴主证恶寒、嗜睡和神昏相符;攻毒后72 h,鸡群体温出现显着下降,神昏衰竭且肝肾出现病变,病位在厥阴。按卫气营血辨证分析:攻毒后6 h-12h,与卫分阶段主证发热相符,病在卫分;攻毒后12 h-24h,营分阶段病邪入血,主证神昏相符,病在营分;攻毒后24 h-72h,症状以体温下降和嗜睡为主,占存活鸡总数的80%以上,剖检可见典型纤维素性心包炎和肝周炎,检出率为100%,个别鸡变现出脾肾肿大病变,而血分病以神昏、肝肾病变为主,病入血分。本研究通过喉头气管接种和肌肉注射两种途径建立了鸡大肠杆菌的人工模型,对两种模型进行了较为深入的对比分析,并通过六经辨证和卫气营血辨证方法加以辨证,初步建立鸡大肠杆菌病的人工疾病模型和辨证标准。
杨雨齐[9]（2019）在《猪源大肠杆菌对达氟沙星敏感性临界值及其耐药机制研究》文中研究表明大肠杆菌属于肠杆菌科的一种革兰氏阴性细菌,存在于人类和动物的胃肠道。大肠杆菌为条件性致病菌,有些血清型具有致病性,可引起畜禽严重的肠道感染和全身感染等,给养殖业造成了巨大经济损失。通过食物链或环境,大肠杆菌对人类的健康和公共卫生也会产生严重的危害。达氟沙星属于氟喹诺酮类抗菌药物成员之一,属于畜禽专用抗菌药物,在控制畜禽大肠杆菌等敏感细菌引起的感染性疾病方面发挥了重要的作用。最初认为氟喹诺酮类药物抗菌机制独特细菌很少产生耐药性,但随着长期使用以及不合理的滥用,包括大肠杆菌在内的革兰氏阴性菌对达氟沙星的耐药现象越来越严重,且与其他氟喹诺酮类药物成员之间存在严重的交叉耐药现象。因此,有效监测大肠杆菌对达氟沙星的耐药性以及制定科学合理的给药方案对耐药大肠杆菌的防控与有效治疗具有重要的理论与临床指导意义。而临界值是进行细菌耐药性监测重要的技术依据。迄今为止,全球建立敏感性判定标准最权威的两个机构欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和美国临床及实验室标准学会（CLSI）尚未建立大肠杆菌对达氟沙星的敏感性判定标准,国内外关于大肠杆菌对达氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药物的分子耐药机制的系统研究报道也较少。因此,本论文旨在建立达氟沙星对大肠杆菌流行病学临界值和药效学临界值;研究猪源大肠杆菌对达氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药物的分子耐药机制;采用PK/PD同步模型优化达氟沙星治疗猪大肠杆菌病的给药方案。研究结果对达氟沙星耐药大肠杆菌的监测以及猪大肠杆菌病的有效治疗提供理论依据,在保证药物达到治疗效果的同时,最大程度减少细菌耐药性产生的机会。（1）建立达氟沙星对大肠杆菌的流行病学临界值和药效学临界值参考CLSI发布的M07-A9号文件的指导原则,采用微量稀释肉汤法测定了达氟沙星对1233株猪源大肠杆菌临床分离株的最小抑菌浓度（MIC）。用软件SPSS 22.0对MIC分布和Graphpad 6.0中的非线性最小二乘法回归对流行病学临界值（ECV）进行统计分析。本研究用仔猪血浆药物浓度数据建立猪药代动力学（PK）数据结合体外MIC值,使用Crystal Ball软件中的蒙特卡罗模拟方法建立药效学临界值(COPD)。研究结果表明:达氟沙星对大肠杆菌的MIC分布范围是0.008128μg/mL。每个MIC（0.008,0.016,0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,16,32,64和128μg/mL）菌株数量所占的百分比分别是0.73%,3.97%,2.35%,0.73%,3.16%,7.38%,13.22%,10.62%,6.16%,5.43%,7.54%,12.98%,7.62%,8.76%和9.33%。MIC50和MIC90分别是4μg/mL和128μg/mL。MIC分布统计符合正态分布,因为偏度系数（skewness=-0.321）和峰度系数（kurtosis=-0.731）均小于1。通过统计学分析,流行病学临界值（ECV）被设定为8μg/mL。蒙特卡洛模拟结果表明当MIC=0.03μg/mL时,达氟沙星达到AUC:MIC比值至少为125的概率为92.25%。因此,COPD被定义为0.03μg/mL。（2）猪源大肠杆菌对达氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药物的耐药机制研究分别选取来自中国7个省份的479株猪源大肠杆菌临床分离株,研究其对诺氟沙星,环丙沙星,氧氟沙星和左氧氟沙星的敏感性,这些菌株覆盖达氟沙星对大肠杆菌各个MIC分布范围（0.0075>128μg/mL）。根据敏感性的研究结果,选择来自不同省份74株对以上四种氟喹诺酮类药物均耐药的大肠杆菌进行耐药基因型研究,系统地分析了由大肠杆菌染色体突变引起的耐药机制及由质粒介导的氟喹诺酮类药物耐药机制。研究结果表明:猪源大肠杆菌对人医常用四种氟喹诺酮抗菌药物的耐药百分比与对达氟沙星耐药程度呈正相关,且这种相关性不存在地域差异。染色体上gyrA,parC,parE,marR和acrR基因发生双突变或单突变是导致大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的主要机制之一。在74株大肠杆菌临床分离株中,gyrB均未发现突变;39株细菌在gyrA发生单突变或双突变,这些是位于83位置的突变S83L和87位置的突变D87到N,Y,G或H;21株细菌的parC发生单突变或双突变,分别是S80I和E84K;有两株细菌parE发生I355T和L416F双突变,且这两株细菌gyrA发生双突变和parC发生单突变;26株细菌marR发生突变,其中25株细菌发生G123S单突变,1株发生D87N和G123S双突变;有2株细菌acrR发生了单突变,分别是V33G和S60-,这两株细菌gyrA均未发生突变。质粒上捕获的介导氟喹诺酮类药物耐药的基因包括qnrS,oqxAB和aac（6’）-Ib-cr。其中7株细菌携带qnrS基因,29株细菌携带oqxAB基因,9株细菌携带aac（6’）-Ib-cr基因,而qnrA,qnrB,qnrC,qnrD和qepA的检出率均为0。gyrA发生双突变的菌株能介导对氟喹诺酮类药物的高水平耐药,而细菌质粒上携带了qnrS,oqxAB和aac（6’）-Ib-cr基因则提升了对氟喹诺酮类药物的耐药水平。（3）达氟沙星对猪大肠杆菌的PK/PD同步模型研究在本研究的1233株大肠杆菌临床分离菌株中,在达氟沙星MIC=0.5μg/mL的菌株分布最多,随机选择其中69株大肠杆菌进行血清型测定,并通过致病性测试,选择一株细菌HP501(O158)进行后续的PD和PK/PD同步模型研究。在麻醉剂的辅助下,成功地将超滤探针植入仔猪回肠用于收集回肠超滤液。六头仔猪按经2.5 mg/kg剂量肌肉注射达氟沙星后,在不同时间点采集血浆和回肠超滤液,采用高效液相色谱法测定不同时间点血浆和回肠超滤液中的药物浓度,计算血浆和回肠超滤液的药代动力学（PK）参数。参考CLSI推荐的方法测定MH肉汤、给药前对照血浆和给药前对照回肠超滤液中达氟沙星对HP501的MIC和最小杀菌浓度（MBC）;测定MH肉汤中达氟沙星对HP501最小防突变浓度（MPC）和抗菌后效应（PAE）。分别测定MH肉汤和回肠超滤液中的达氟沙星对HP501的体外杀菌效果和半体内杀菌效果,并绘制相应的杀菌曲线。建立回肠超滤液中AUC24h/MIC和Cmax/MIC分别与log10（细菌与回肠超滤液共培养24 h后细菌数-初始细菌数,CFU/mL）的关系。分别计算回肠超滤液中达氟沙星实现抑菌、杀菌和根除细菌所需的PK/PD参数值AUC24h/MIC或Cmax/MIC,并计算相应的给药剂量及优化给药方案。将十二头健康去势仔猪连续3天每天灌胃50 mL 1010 CFU/mL HP501菌液建立大肠杆菌感染模型。将所有感染的仔猪随机分成两组。试验组（n=6）按本研究优化的剂量方案（2.42 mg/kg每12 h给药一次治疗3 d）肌肉注射给药,对照组（n=6）按临床常规推荐剂量方案（2.5 mg/kg每24 h给药一次治疗3天）肌肉注射给药。研究结果表明:仔猪按2.5 mg/kg剂量单次肌肉注射达氟沙星后,血浆和回肠超滤液中的Tmax分别是1.1 h和6.0 h;回肠的平均Cmax是血浆的13.59倍;回肠超滤液中的消除半衰期（6.84 h）高于血浆（4.94 h）。MH肉汤,给药前对照血浆和给药前对照回肠超滤液中达氟沙星对菌株HP501的MIC均为0.5μg/mL,其相应的MBC值分别为0.5、1和1μg/mL,MH肉汤中达氟沙星对HP501的MPC为4μg/mL。PAE的长短与药物的浓度及细菌在药物溶液中暴露的时间呈明显相关性。体外杀菌曲线和半体内杀菌曲线均表明达氟沙星对大肠杆菌的抗菌活性呈浓度依性,因此与达氟沙星抗菌作用最相关的PK/PD参数是AUC/MIC或Cmax/MIC。根据体内回肠超滤液中达氟沙星PK数据和半体内的MIC,相对应的半体内PK/PD数据AUC/MIC和AUC/MPC分别为170.64 h和21.33 h。回肠超滤液的浓度保持在MIC和MBC以上的时间分别为29.76 h和19.32 h。平均Cmax/MIC比和Cmax/MPC分别为13.32和1.67。回肠超滤中达氟沙星产生抑菌、杀菌和根除细菌效果的AUC24h/MIC分别为99.85h、155.57 h和218.02 h;Cmax/MIC分别为4.14、6.49和9.05。根据以上达到不同效果的AUC24h/MIC值计算得到三种不同给药剂量分别为（1.49 mg/kg、2.42 mg/kg和3.24 mg/kg）。使用Mlxplore软件模拟不同剂量方案治疗3天后发现2.42 mg/kg每12 h给药一次的杀菌效果最好。给药方案验证结果也表明以2.42 mg/kg达氟沙星的剂量方案每12 h给药一次治疗3 d后,足以清除猪肠道感染的大肠杆菌。综上所述,本研究建立的ECV为8μg/mL、COPD为0.03μg/mL。COPD远低于ECV可能是由于达氟沙星的给药剂量较低,因此本研究建议将ECV（8μg/mL）定义为猪源大肠杆菌对达氟沙星的最终敏感性临界值。对达氟沙星耐药的猪源大肠杆菌对人类医学上常用的四种氟喹诺酮类抗菌药（诺氟沙星,环丙沙星,氧氟沙星和左氧氟沙星）存在明显交叉耐药现象。猪源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制是主要是由染色体氟喹诺酮类药物靶标基因发生突变（gyrA、parC、parE、marR和acrR双位点或单位点突变）引起以及质粒上捕获的介导氟喹诺酮类药物耐药的基因（qnrS、oqxAB和aac（6’）-Ib-cr）引起。猪回肠超滤液中能实现抑菌、杀菌和根除细菌的平均AUC24h/MIC分别为99.85、155.57和218.02 h。本研究优化的达氟沙星剂量方案为2.42 mg/kg剂量、每12 h肌肉注射一次及连续治疗3 d足以清除猪回肠中大肠杆菌的感染,且最大程度减少细菌耐药性产生的机会。
高艳[10]（2019）在《藏药复方翼草景香提取物对多杀性巴氏杆菌的药效和毒理学研究》文中研究说明青藏高原地区多发生以多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）为主要致病菌的牛出血性败血症等疾病,该病原菌造成牛羊大量死亡、生产性能下降,给畜牧业造成严重危害,且常规疫苗和化学药物防治效果不理想。本人整理了从西藏牧区基层畜牧兽医站收集到的藏药复方,开展抗Pm的藏药复方药效和毒理学筛选研究,现将研究内容总结如下:（1）藏药复方对多杀性巴氏杆菌的体外抑菌活性研究选取三个藏药复方,分别制备提取物,采用牛津杯法和试管2倍稀释法测定对Pm的抑菌圈直径和最小抑菌浓度（MIC）,筛选确定体外抑菌活性最佳藏药复方。结果表明,藏药复方一、二、三对该标准菌株均有抑菌作用;MIC值分别为15.63 mg/mL、3.9 mg/mL、15.63 mg/mL。藏药复方二具有良好的体外抑菌活性。（2）藏药复方对小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌的药效学研究通过建立死亡率为75%的Pm体内感染昆明小鼠模型,测定三个藏药复方在3个不同给药量以及感染前、后两种给药方式下的小鼠死亡率,评价藏药复方对小鼠体内感染防治作用。结果表明,经病理解剖、细菌镜检、全自动微生物鉴定及药敏系统（VTEK2 COMPACT）细菌鉴定,该模型建立成功;复方一预防组和治疗组小鼠死亡率分别为58.3%、41.7%、83.3%、66.7%、58.3%、91.7%;复方二小鼠死亡率分别为50%,41.7%,81.8%,66.7%,50%、75%;复方三小鼠死亡率分别为66.7%、66.7%、66.7%、75%、75%、50%。（3）藏药复方翼草景香提取物急性毒性和亚急性毒性试验研究选用SPF级昆明小鼠,测定翼草景香提取物的半数致死量(LD50),评价其急性毒性;选用80只SPF级SD大鼠随机分为低（10000 mg/kg）、中（20000 mg/kg）、高（40000mg/kg）剂量组,空白对照组（灌服超纯水40000 mg/kg）,开展亚急性毒性试验,每组雌雄各10只,大鼠连续给药30 d,每天记录大鼠状态,检测分析各组大鼠体重、脏器指数、血常规、血生化指标和组织病理学。结果表明,未检测出翼草景香提取物的LD50,最大耐受量试验显示,试验组小鼠体重与空白组无差异显着性（P>0.05）;亚急性毒性试验中,各组大鼠给药期间无明显不良反应,精神状态良好。与空白对照组相比,低剂量组大鼠各指标无显着性差异（P>0.05）;高剂量组体重、肝脏脏器指数、丙氨酸氨基转移酶差异极显着（P<0.01）,雌性大鼠的淋巴细胞、红细胞、血红蛋白、血小板等均差异极显着（P<0.01）,单核细胞差异显着（P<0.05）,雄性大鼠血清中葡萄糖差异极显着（P<0.01）;中剂量组大鼠血常规、血生化指标基本正常。病理学组织检查结果表明,除高剂量组肝脏有轻微肿大外,其他试验各组脏器均无明显病理学变化。（4）藏药复方翼草景香提取物中红景天苷含量测定采用HPLC测定翼草景香提取物中红景天苷含量,结果表明,红景天苷进样量在0.035093750.56150000 mg/mL之间线性关系良好,相对标准偏差为0.17%4.35%,回收率为90.99%,提取物中红景天苷含量为2.7668 mg/g,该方法检测灵敏度高、专属性和重复性好,结果可靠。综上所述,藏药复方翼草景香提取物对Pm具有良好的体内、外抑菌活性,急性毒性试验LD50远高于5000 mg/kg,亚急性毒性试验结果表明,低、中剂量组血常规和血生化指标基本正常,且病理组织无病变。因此,筛选获得的藏药复方翼草景香提取物在临床应用中安全可靠,该研究为以后临床防治巴氏杆菌病提供了一定的理论依据。
二、家禽注射途径给药有八忌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、家禽注射途径给药有八忌（论文提纲范文）
（1）NA基因位点变异对H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶功能及致病性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述: H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶功能及其抑制剂的研究进展 |
| 1 A型流感病毒概述 |
| 1.1 IAV基本结构 |
| 1.2 IAV的生命周期 |
| 1.3 IAV的变异与跨种间传播 |
| 2 流感病毒神经氨酸酶的研究进展 |
| 2.1 NA蛋白结构 |
| 2.2 NA蛋白的功能 |
| 3 流感病毒神经氨酸酶抑制剂的研究进展 |
| 3.1 Zanamivir的研发 |
| 3.2 Oseltamivir的研发 |
| 3.3 Peramivir的研发 |
| 3.4 靶向NA的新型抗流感药物的开发 |
| 4 目的和意义 |
| 第一章 分析H7N9亚型流感病毒NA基因氨基酸位点适应性变异 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 NA基因适应性氨基酸变异位点的初步分析 |
| 2.2 NA基因适应性氨基酸位点的再次筛选 |
| 3 讨论 |
| 第二章 H7N9亚型NA点突变重组病毒的拯救及病毒神经氨酸酶功能测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、质粒、细胞和鸡胚 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 分子生物学软件 |
| 1.1.5 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 高致病性H7N9病毒rGD15株NA点突变重组质粒的构建 |
| 1.2.2 高致病性H7N9病毒rGD15株NA点突变重组病毒的拯救 |
| 1.2.3 低致病性H7N9病毒ArGD15株NA点突变重组病毒的拯救 |
| 1.2.4 点突变重组病毒的基本生物学特性 |
| 1.2.5 点突变重组病毒的神经氨酸酶功能测定 |
| 1.2.6 点突变重组病毒生长曲线的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 rGD15 NA点突变重组质粒的构建 |
| 2.2 NA点突变重组病毒的拯救 |
| 2.3 点突变重组病毒的基本生物学特性 |
| 2.4 点突变重组病毒及其母本毒的神经氨酸酶活性 |
| 2.5 点突变重组病毒对神经氨酸酶抑制剂的IC_(50)测定 |
| 2.6 点突变重组病毒的红细胞病毒释放试验 |
| 3 讨论 |
| 第三章 NA点突变H7N9亚型重组病毒的受体结合特性及小鼠致病性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 鸡胚、试验动物 |
| 1.1.3 主要试剂与试剂配制 |
| 1.1.4 主要仪器和生物学软件 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 受体结合能力分析 |
| 1.2.2 部分病毒对小鼠致病性研究 |
| 1.2.3 小鼠肺内细胞因子的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 NA基因点突变重组病毒的受体结合能力 |
| 2.2 H7N9 HPAIV骨架NA基因点突变对小鼠致病性的研究 |
| 2.3 小鼠肺内细胞因子的测定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）AFB1致小鼠睾酮合成障碍的分子机制及ROS/AMPK信号通路的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 AFs概述 |
| 1.2 AFB_1的污染现状 |
| 1.3 AFB_1的危害 |
| 1.4 AFB_1的睾丸毒性 |
| 1.4.1 AFB_1损伤睾丸结构 |
| 1.4.2 AFB_1抑制精子发生 |
| 1.5 AFB_1抑制睾酮合成 |
| 1.5.1 AFB_1促进睾丸间质细胞细胞凋亡 |
| 1.5.2 AFB_1抑制睾酮合成关键酶 |
| 1.6 AFB_1与睾丸氧化应激 |
| 1.7 AFB_1与睾丸细胞线粒体损伤 |
| 1.8 AMPK信号通路与睾酮合成 |
| 1.8.1 AMPK信号通路与细胞凋亡 |
| 1.8.2 AMPK信号通路与睾酮合成关键酶 |
| 1.9 ROS与AMPK信号通路的激活 |
| 1.10 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验动物与TM3细胞系 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 主要材料与试剂 |
| 2.4 AFB_1的配制 |
| 2.5 动物试验总体设计 |
| 2.5.1 动物试验技术路线图 |
| 2.5.2 试验动物分组及处理 |
| 2.5.3 样品采集 |
| 2.6 检测项目与方法 |
| 2.6.1 试验小鼠临床症状观察及睾丸系数检测 |
| 2.6.2 睾丸组织形态学观察 |
| 2.6.3 精子数量及质量评价 |
| 2.6.4 血清中睾酮含量测定 |
| 2.6.5 睾丸组织氧化应激关键指标检测 |
| 2.6.6 睾丸组织细胞线粒体损伤关键指标检测 |
| 2.6.7 睾丸组织AMPK信号关键蛋白检测 |
| 2.6.8 睾丸组织细胞凋亡关键指标检测 |
| 2.6.9 睾丸组织中睾酮合成关键指标检测 |
| 2.7 细胞试验总体设计 |
| 2.7.1 TM3细胞试验技术路线图 |
| 2.7.2 TM3细胞培养 |
| 2.7.3 AFB_1对TM3细胞半数抑制浓度(IC50)测定 |
| 2.7.4 TM3细胞分组与处理 |
| 2.8 检测项目与方法 |
| 2.8.1 TM3细胞形态观察 |
| 2.8.2 TM3细胞活性检测 |
| 2.8.3 TM3细胞氧化应激关键指标检测 |
| 2.8.4 TM3细胞线粒体损伤关键指标检测 |
| 2.8.5 TM3细胞AMPK信号关键蛋白检测 |
| 2.8.6 TM3细胞凋亡关键指标检测 |
| 2.8.7 TM3细胞睾酮合成检测 |
| 2.9 数据分析及统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鼠试验结果 |
| 3.1.1 AFB_1对小鼠精神状态的影响 |
| 3.1.2 AFB_1对小鼠体重的影响 |
| 3.1.3 AFB_1对小鼠睾丸系数及体积的影响 |
| 3.1.4 AFB_1对小鼠睾丸组织显微结构的影响 |
| 3.1.5 AFB_1对小鼠睾丸细胞超微结构的影响 |
| 3.1.6 AFB_1对小鼠精子数量及质量的影响 |
| 3.1.7 AFB_1对小鼠血清睾酮含量的影响 |
| 3.1.8 AFB_1对小鼠睾丸组织中氧化应激的影响 |
| 3.1.9 AFB_1对小鼠睾丸组织细胞线粒体的影响 |
| 3.1.10 AFB_1对小鼠睾丸组织AMPK信号通路的影响 |
| 3.1.11 AFB_1对小鼠睾丸组织细胞凋亡的影响 |
| 3.1.12 AFB_1对小鼠睾酮合成关键酶的影响 |
| 3.2 TM3细胞AFB_1中毒的试验结果 |
| 3.2.1 AFB_1对TM3细胞IC50的测定 |
| 3.2.2 AFB_1对TM3细胞活力的影响 |
| 3.2.3 AFB_1对TM3形态的影响 |
| 3.2.4 AFB_1对TM3细胞超微结构的影响 |
| 3.2.5 AFB_1对TM3细胞睾酮含量的影响 |
| 3.2.6 AFB_1对TM3细胞中氧化应激的影响 |
| 3.2.7 AFB_1对TM3细胞中线粒体的影响 |
| 3.2.8 AFB_1对TM3细胞中AMPK信号通路的影响 |
| 3.2.9 AFB_1对TM3细胞凋亡的影响 |
| 3.2.10 AFB_1对TM3细胞睾酮合成关键酶的影响 |
| 3.3 Compound C对AFB_1暴露TM3细胞毒性的影响 |
| 3.3.1 Compound C干预剂量的确定 |
| 3.3.2 Compound C对AFB_1暴露TM3细胞睾酮含量的影响 |
| 3.3.3 Compound C对AFB_1暴露TM3细胞中AMPK信号通路的影响 |
| 3.3.4 Compound C对AFB_1暴露TM3细胞凋亡的影响 |
| 3.3.5 Compound C对AFB_1暴露TM3细胞睾酮合成关键酶的影响 |
| 3.4 NAC对AFB_1暴露TM3细胞毒性的影响 |
| 3.4.1 NAC干预剂量的确定 |
| 3.4.2 NAC对AFB_1暴露TM3细胞中ROS含量的影响 |
| 3.4.3 NAC对AFB_1暴露TM3细胞中AMPK信号通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 试验处理条件的确定 |
| 4.2 AFB_1对小鼠生长发育的影响 |
| 4.3 AFB_1对睾丸组织损伤的影响 |
| 4.3.1 AFB_1对睾丸组织结构的影响 |
| 4.3.2 AFB_1对精子发生的影响 |
| 4.4 AFB_1对睾酮合成的影响 |
| 4.4.1 AFB_1对睾丸间质细胞凋亡的影响 |
| 4.4.2 AFB_1对睾酮合成关键酶的影响 |
| 4.5 AFB_1对睾丸组织及TM3细胞氧化应激的影响 |
| 4.6 AFB_1对睾丸间质细胞线粒体损伤的影响 |
| 4.7 AMPK信号通路在AFB_1致睾酮合成障碍中的调控作用 |
| 4.7.1 AFB_1对AMPK信号通路的影响 |
| 4.7.2 AMPK信号通路在AFB_1致睾丸间质细胞凋亡中的作用 |
| 4.7.3 AMPK信号通路在AFB_1抑制睾酮合成关键酶中的作用 |
| 4.8 ROS对AFB_1激活AMPK信号通路的介导作用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 新城疫病毒的发现 |
| 1.1.2 新城疫病毒的理化性质与基因组结构 |
| 1.1.3 新城疫病毒的类型 |
| 1.1.4 新城疫病毒的致病性与感染后临床症状 |
| 1.2 新城疫病毒检测技术 |
| 1.2.1 血清学检测 |
| 1.2.2 分子生物学技术检测 |
| 1.3 新城疫病毒疫苗主要类型 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 载体疫苗 |
| 1.3.3 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3.4 纳米粒子递送疫苗 |
| 1.3.5 生物佐剂疫苗 |
| 1.4 酿酒酵母表达系统 |
| 1.4.1 酿酒酵母表面展示表达系统 |
| 1.4.2 酿酒酵母表达系统的特点及应用 |
| 1.5 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 目的和意义 |
| 第2章 新城疫病毒F与HN基因酿酒酵母表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验用毒株、质粒及引物 |
| 2.2.2 实验用主要试剂 |
| 2.2.3 培养基的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 新城疫病毒F和HN蛋白片段的生物信息学分析 |
| 2.3.2 新城疫病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 目的基因的扩增与克隆 |
| 2.3.5 目的片段纯化回收 |
| 2.3.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 |
| 2.3.7 PCR回收产物的酶切及与载体的连接 |
| 2.3.8 连接产物的转化与鉴定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 新城疫病毒F和HN蛋白片段的生物信息学分析 |
| 2.4.2 新城疫病毒F与HN基因的克隆 |
| 2.4.3 重组质粒验证 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 新城疫病毒F与HN蛋白片段在酿酒酵母表面的表达及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验用酵母质粒、引物和菌株 |
| 3.2.2 实验用主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液和培养基配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PCR反应体系 |
| 3.3.2 酶切构建转化体系 |
| 3.3.3 酵母转化 |
| 3.3.4 酵母基因组提取 |
| 3.3.5 Western blot鉴定 |
| 3.3.6 F与HN蛋白片段酿酒酵母表面展示菌株生长曲线 |
| 3.3.7 免疫荧光 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 酵母转化构建NDV F和 HN蛋白片段表面展示菌株 |
| 3.4.2 重组菌株验证 |
| 3.4.3 新城疫病毒F与HN蛋白酿酒酵母表面展示菌株的生长曲线 |
| 3.4.4 新城疫病毒F与HN蛋白的表达鉴定 |
| 3.4.5 蛋白表达免疫荧光结果 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 新城疫病毒F/HN酿酒酵母表面展示疫苗免疫效果评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验用主要试剂 |
| 4.2.2 主要溶液和培养基配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 原核表达载体构建 |
| 4.3.2 蛋白纯化 |
| 4.3.3 酶联免疫吸附测定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 新城疫病毒HN蛋白原核表达载体构建 |
| 4.4.2 新城疫病毒HN原核蛋白的纯化 |
| 4.4.3 新城疫病毒血清抗体的ELISA检测 |
| 4.5 分析与讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）大肠杆菌氨苄西林耐药性对其噬菌体裂解作用的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 噬菌体治疗细菌感染的研究进展 |
| 1.1 噬菌体概述 |
| 1.2 噬菌体疗法研究进展 |
| 第二章 大肠杆菌氨西林耐药性相关分子研究现状 |
| 2.1 细菌抗生素耐药性机制概述 |
| 2.2 氨苄西林耐药性相关分子β-内酰胺酶AmpC研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 大肠杆菌氨苄西林耐药性对噬菌体裂解的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 氨苄西林耐药性大肠杆菌蛋白组学差异分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 大肠杆菌转座子突变库构建及影响噬菌体裂解的大肠杆菌蛋白的筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 AmpC对噬菌体裂解大肠杆菌的影响及其机制的初步探索 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）硒对镉诱导神经元损伤的干预作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 镉的研究概况 |
| 1.1.1 环境中的镉污染 |
| 1.1.2 镉的暴露途径 |
| 1.2 镉的毒性效应 |
| 1.2.1 镉的肾脏毒性 |
| 1.2.2 镉的骨毒性 |
| 1.2.3 镉的致癌性 |
| 1.2.4 镉的生殖系统毒性 |
| 1.2.5 镉的神经毒性 |
| 1.3 镉毒性的可能作用机制 |
| 1.3.1 氧化应激 |
| 1.3.2 DNA损伤 |
| 1.3.3 细胞凋亡 |
| 1.4 硒与硒蛋白 |
| 1.4.1 抗氧化作用 |
| 1.4.2 抗炎作用 |
| 1.4.3 免疫功能 |
| 1.4.4 抗甲状腺疾病作用 |
| 1.4.5 抗心血管疾病作用 |
| 1.4.6 抗癌作用 |
| 1.4.7 促进生育和繁殖 |
| 1.4.8 中枢神经系统保护作用 |
| 1.5 本课题的研究目的、内容及意义 |
| 1.5.1 本课题的研究目的 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 1.5.3 本课题的研究意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验细胞株 |
| 2.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂配方 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 模型构建 |
| 2.4.1 不同浓度、不同时间镉暴露毒性模型 |
| 2.4.2 添加硒保护剂镉暴露毒性模型 |
| 2.5 细胞形态和活力的检测 |
| 2.6 ROS的检测 |
| 2.7 细胞总蛋白提取 |
| 2.8 蛋白定量 |
| 2.9 免疫印迹法 |
| 2.10 细胞凋亡的检测 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 镉暴露对SH-SY5Y神经元的影响的结果 |
| 3.1.1 镉对神经元形态及存活率的影响 |
| 3.1.2 镉对神经元ROS水平的影响 |
| 3.1.3 镉对TrxR1抗氧化酶水平的影响 |
| 3.2 硒对镉暴露诱导的神经元损伤的干预作用及机制研究的结果 |
| 3.2.1 硒改善神经元的形态及活力 |
| 3.2.2 硒降低神经元ROS水平 |
| 3.2.3 硒抑制神经元凋亡 |
| 3.2.4 硒提高TrxR1抗氧化酶水平 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 缩略词表 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（6）中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 甲型流感病毒 |
| 1.1.1 甲型流感病毒的结构 |
| 1.1.2 血凝素HA |
| 1.1.3 H7N9 禽流感 |
| 1.2 全人源单克隆抗体 |
| 1.2.1 全人源单克隆抗体技术的研究进展 |
| 1.2.2 记忆B细胞PCR技术 |
| 1.3 中和流感病毒的全人源单克隆抗体 |
| 1.3.1 靶向HA杆部的中和抗体 |
| 1.3.2 靶向HA受体结合位点的中和抗体 |
| 1.3.3 靶向HA头部抗原位点A的中和抗体 |
| 1.3.4 没有中和活性的抗流感病毒人源抗体 |
| 1.4 本文选题及研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 伦理声明 |
| 2.2 耗材与试剂 |
| 2.3 病毒 |
| 2.4 重组蛋白的表达和多肽合成 |
| 2.5 稳定表达CD40 配体的细胞系构建 |
| 2.6 康复病人的血液收集 |
| 2.7 酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 2.8 记忆B细胞法制备全人源单克隆抗体 |
| 2.8.1 分选CD19+ IgM–IgA–IgD–B 细胞 |
| 2.8.2 记忆B细胞的激活、分化和培养 |
| 2.9 微量中和实验 |
| 2.10 抗体基因的克隆 |
| 2.11 抗体基因的表达和纯化 |
| 2.12 血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HAI或 HI)实验 |
| 2.12.1 血凝(Hemagglutination,HA)实验 |
| 2.12.2 血凝抑制实验 |
| 2.13 抗体的特异性和亲和力检测 |
| 2.13.1 抗体的特异性结合检测(间接免疫荧光实验,Indirect immunofluorescent assay,IFA;流式细胞技术,Flow Cytometry) |
| 2.13.2 抗体结合抗原的亲和力检测 |
| 2.14 稳转抗体基因细胞株的构建以及抗体生产 |
| 2.14.1 稳转抗体基因细胞株的构建 |
| 2.14.2 抗体生产 |
| 2.15 中和抗体预防和治疗H7N9 病毒感染小鼠 |
| 2.16 ADCC实验 |
| 2.17 利用质谱(mass spectroscopy,MS)技术分析抗体的表位多肽 |
| 2.18 利用氢氘交换质谱(hydrogen deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)分析抗体的抗原表位 |
| 2.19 H7N9 病毒逃逸突变株的筛选 |
| 2.20 膜融合抑制实验 |
| 2.21 统计学分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 记忆B细胞PCR技术筛选中和人源单克隆抗体 |
| 3.1.1 构建稳定表达人CD40L的 NTH-3T3 饲养细胞 |
| 3.1.2 流式分选记忆B细胞 |
| 3.1.3 活化记忆B细胞 |
| 3.1.4 筛选中和H7N9 病毒抗体 |
| 3.1.5 PCR克隆抗体基因 |
| 3.1.6 抗体基因瞬时转染和表达 |
| 3.1.7 抗体基因的稳转株构建和生产 |
| 3.2 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的中和活性 |
| 3.3 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的血凝抑制活性 |
| 3.4 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的特异性结合检测 |
| 3.5 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的亲和力检测 |
| 3.6 人源单克隆抗体预防和治疗H7N9 病毒感染的小鼠 |
| 3.6.1 评估人源抗体预防H7N9 病毒感染小鼠的能力 |
| 3.6.2 评估人源抗体治疗H7N9 病毒感染小鼠的能力 |
| 3.7 人源单克隆抗体的抗原表位鉴定(Epitope mapping) |
| 3.7.1 3L11 抗体的抗原表位鉴定 |
| 3.7.2 5J13 抗体的全新的抗原表位 |
| 3.8 3L11 抗体的保护机制研究 |
| 3.9 5J13 抗体的中和机制研究 |
| 3.9.1 位阻效应的研究 |
| 3.9.2 膜融合抑制作用的研究 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 快速筛选抗禽流感病毒人源抗体及鉴定中和表位 |
| 4.2 记忆B细胞PCR技术是研究流感病毒致病及变异新机制的重要工具 |
| 4.3 人源单克隆抗体3L11 及其保守的表位 |
| 4.4 人源单克隆抗体5J13 及其全新的中和表位 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全人源单克隆抗体3L11 的研究结果 |
| 5.2 全人源单克隆抗体5J13 的研究结果 |
| 5.3 不足及下一步研究计划 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 博士期间发表的论文 |
| 博士期间申请的发明专利 |
（7）刺五加苷B1抗流感病毒作用及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 现代医学对流感的研究与认识 |
| 一、流感病毒简介 |
| 二、流感病毒与宿主的相互作用 |
| 第二节 现代医学抗流感病毒研究进展 |
| 一、流感疫苗 |
| 二、抗流感化学药物及耐药性 |
| 三、重症流感的免疫治疗 |
| 第三节 中医药抗流感研究的现状 |
| 一、中医对流感的认识 |
| 二、流感的中医证候 |
| 三、抗流感中医药的临床研究 |
| 四、抗流感中药及中药组分的研究进展 |
| 第四节 肿节风药效研究现状 |
| 一、肿节风的民族药背景及中药性味的独特性 |
| 二、肿节风的化学成分研究 |
| 三、肿节风的药效研究现状 |
| 四、肿节风的抗病毒机制研究 |
| 五、肿节风的研究不足及展望 |
| 第二章 肿节风主要单体成分抗流感病毒药效研究 |
| 第一节 肿节风主要单体成分抗流感病毒药效初筛及刺五加苷B1的分离制备 |
| 一、实验目的 |
| 二、实验对象及材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、统计学方法 |
| 五、实验结果 |
| 六、讨论 |
| 第二节 刺五加苷B1抗流感病毒药效研究 |
| 一、实验目的 |
| 二、实验材料及设备 |
| 三、实验方法 |
| 四、统计学方法 |
| 五、实验结果 |
| 六、讨论 |
| 第三章 刺五加苷B1抗流感病毒活性中诱导的宿主细胞基因差异表达研究 |
| 一、实验目的 |
| 二、实验对象及材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、统计方法 |
| 五、实验结果 |
| 六、讨论 |
| 第四章 刺五加苷B1对宿主细胞POLR2A基因调控作用机制研究 |
| 一、实验目的 |
| 二、实验对象及材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、统计学分析 |
| 五、实验结果 |
| 六、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件1:统计学处理合格证明 |
（8）鸡大肠杆菌病模型建立与辨证分型（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 鸡大肠杆菌病的研究进展 |
| 1 鸡大肠杆菌病 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 致病机制 |
| 1.3 鸡大肠杆菌病耐药性研究 |
| 1.4 鸡大肠杆菌病的诊断 |
| 1.5 防治措施 |
| 2 中兽医药抗鸡大肠杆菌病现状 |
| 2.1 中兽医学对大肠杆菌病的认识 |
| 2.2 治疗鸡大肠杆菌常用中药复方 |
| 2.3 中药的抑菌作用 |
| 2.4 中药制剂对鸡大肠杆菌的防治作用 |
| 2.5 中药防治存在的问题 |
| 研究目的及意义 |
| 第一章 喉头气管接种鸡大肠杆菌模型的建立与观察 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株来源 |
| 1.3 主要仪器与试剂 |
| 1.4 细菌培养与细菌计数 |
| 1.5 预试验 |
| 1.6 喉头气管接种模型的建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 预试验结果 |
| 2.2 喉头气管接种模型 |
| 3 讨论 |
| 3.1 感染前期 |
| 3.2 感染中期 |
| 3.3 感染后期 |
| 第二章 肌注模型的建立与观察 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株来源、主要仪器和细菌培养计数 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 预试验 |
| 1.5 肌注模型的建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 预试验结果 |
| 2.2 肌注模型 |
| 3 讨论 |
| 3.1 感染前期 |
| 3.2 感染中期 |
| 3.3 感染后期 |
| 第三章 鸡大肠杆菌病中兽医辨证 |
| 鸡大肠杆菌病的六经辨证 |
| 鸡大肠杆菌的卫气营血辨证 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（9）猪源大肠杆菌对达氟沙星敏感性临界值及其耐药机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 大肠杆菌的危害和防治 |
| 1.1.1 大肠杆菌致病性和危害 |
| 1.1.2 用于治疗肠道大肠杆菌病的抗菌药物 |
| 1.2 达氟沙星研究进展 |
| 1.2.1 化学结构 |
| 1.2.2 构效关系 |
| 1.2.3 抗菌谱和抗菌活性 |
| 1.2.4 药物代谢动力学 |
| 1.2.5 副作用 |
| 1.2.6 动物源大肠杆菌对达氟沙星的耐药性及其对人类的危害 |
| 1.3 临界值分类及其制定方法 |
| 1.3.1 流行病学/野生型临界值(ECV/COWT) |
| 1.3.2 药效学临界值(COPD) |
| 1.3.3 临床临界值(COCL) |
| 1.4 大肠杆菌对氟喹诺酮类抗菌药物分子耐药机制研究进展 |
| 1.5 抗菌药物PK/PD模型研究进展 |
| 1.5.1 药代动力学 |
| 1.5.2 体外药效学 |
| 1.5.3 动物模型研究 |
| 1.5.4 PD的临床研究 |
| 1.5.5 抗菌药物PK/PD模型研究 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 药品和试剂 |
| 2.1.2 仪器和设备 |
| 2.2 菌种和动物 |
| 2.3 达氟沙星对猪源大肠杆菌流行病学临界值的制定 |
| 2.3.1 大肠杆菌菌株的采集、分离纯化、鉴定与保存 |
| 2.3.2 达氟沙星对猪源大肠杆菌临床分离株的最小抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 2.3.3 数据处理及流行病学临界值的制定 |
| 2.4 部分猪源大肠杆菌临床分离株血清型的鉴定 |
| 2.5 达氟沙星对猪源大肠杆菌药效学临界值的制定 |
| 2.5.1 达氟沙星对JLP95(O_8)的体外杀菌曲线 |
| 2.5.2 达氟沙星在香猪血浆中的药动学特征研究 |
| 2.5.3 蒙特卡洛模拟建立药效学临界值 |
| 2.6 猪源大肠杆菌对四种氟喹诺酮类药物的交叉耐药性研究 |
| 2.6.1 菌株选择 |
| 2.6.2 猪源大肠杆菌对人类医学常用四种氟喹诺酮药物敏感性研究 |
| 2.7 猪源耐药大肠杆菌对氟喹诺酮类药物分子耐药机制研究 |
| 2.7.1 PCR扩增猪源大肠杆菌染色体上氟喹诺酮类药物靶位基因 |
| 2.7.2 PCR扩增猪源大肠杆菌质粒上介导氟喹诺酮类药物耐药的基因 |
| 2.8 达氟沙星在仔猪体内的PK/PD同步整合模型研究 |
| 2.8.1 四株猪源大肠杆菌临床分离株(O_(158))的致病性测定 |
| 2.8.2 达氟沙星在猪血浆和回肠液中的药动学特征 |
| 2.8.3 达氟沙星对猪源大肠杆菌菌株HP501 的体外药效学研究 |
| 2.8.4 达氟沙星对猪源大肠杆菌HP501 的体外杀菌曲线 |
| 2.8.5 达氟沙星对猪源大肠杆菌HP501 的半体内杀菌曲线 |
| 2.8.6 达氟沙星在杂交仔猪回肠液的PK/PD同步整合模型研究 |
| 2.8.7 给药方案的制定 |
| 2.8.8 给药方案治疗效果的验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪源大肠杆菌临床分离株的分离鉴定结果 |
| 3.2 达氟沙星对猪源大肠杆菌临床分离株的MIC测定结果 |
| 3.3 达氟沙星对猪源大肠杆菌流行病学临界值的确定 |
| 3.4 部分猪源大肠杆菌临床分离株血清型的测定结果 |
| 3.5 达氟沙星对猪源大肠杆菌JLP95(O_8)体外杀菌曲线 |
| 3.6 达氟沙星在香猪体内的药动学研究结果 |
| 3.6.1 达氟沙星在香猪血浆中的HPLC检测方法的确定 |
| 3.6.2 达氟沙星在香猪血浆中的药动学特征 |
| 3.7 达氟沙星对猪源大肠杆菌药效学临界值的确定 |
| 3.8 猪源大肠杆菌对人医常用四种氟喹诺酮类抗菌药物敏感性研究结果 |
| 3.9 猪源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药机制研究结果 |
| 3.10 猪源大肠杆菌临床分离株的致病性测定结果 |
| 3.11 达氟沙星在猪血浆和回肠液的药动学特征 |
| 3.11.1 猪血浆和回肠液中达氟沙星浓度测定的HPLC方法的确定 |
| 3.11.2 达氟沙星在仔猪血浆和回肠液的药动学特征 |
| 3.12 达氟沙星对HP501(O_(158))的体外药效学结果 |
| 3.13 达氟沙星对HP501(O_(158))的体外杀菌曲线 |
| 3.14 达氟沙星对HP501(O_(158))的半体内杀菌曲线 |
| 3.15 达氟沙星在杂交猪回肠液中的PK/PD同步整合模型 |
| 3.16 给药方案的确定 |
| 3.17 给药方案的治疗效果验证结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 敏感性临界值的确定 |
| 4.1.1 流行病学临界值的制定 |
| 4.1.2 药效学临界值的制定 |
| 4.1.3 本研究推荐的敏感性临界值 |
| 4.2 猪源大肠杆菌对人类医学常用氟喹诺酮类药物的交叉耐药 |
| 4.3 猪源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的分子耐药机制研究 |
| 4.4 达氟沙星在猪体内PK/PD同步模型研究 |
| 4.4.1 猪回肠超滤取样探针的安置 |
| 4.4.2 达氟沙星在杂交仔猪血浆和回肠液中的药动学特征 |
| 4.4.3 给药方案的制定 |
| 4.4.4 给药方案的验证 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）藏药复方翼草景香提取物对多杀性巴氏杆菌的药效和毒理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词英汉对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 多杀性巴氏杆菌概述 |
| 1.1 多杀性巴氏杆菌病原学研究 |
| 1.2 多杀性巴氏杆菌的流行病学及发病机理 |
| 1.3 多杀性巴氏杆菌致病机制简述 |
| 1.4 巴氏杆菌病临床症状与病理变化 |
| 1.4.1 猪巴氏杆菌病 |
| 1.4.2 牛巴氏杆菌病 |
| 1.4.3 羊巴氏杆菌病 |
| 1.4.4 兔巴氏杆菌病 |
| 1.4.5 禽霍乱 |
| 1.5 巴氏杆菌病的诊断方法 |
| 2 巴氏杆菌病的防控现状 |
| 2.1 疫苗接种 |
| 2.2 药物防治 |
| 2.2.1 化药治疗 |
| 2.2.2 中药治疗 |
| 2.3 加强管理 |
| 3 藏药复方的成分及药理作用 |
| 3.1 三个藏药复方组分 |
| 3.2 藏药复方翼草景香的成分及药理作用 |
| 3.2.1 红景天 |
| 3.2.2 翼首草 |
| 3.2.3 兔耳草 |
| 3.2.4 诃子 |
| 3.2.5 草果 |
| 3.2.6 铁棒锤 |
| 3.2.7 藏木香 |
| 3.2.8 安息香 |
| 4 课题研究意义 |
| 第二章 藏药复方体外抑菌试验研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验药材与菌种 |
| 1.2 培养基与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 藏药复方提取物的制备 |
| 2.2 菌悬液的计数和制备 |
| 2.2.1 菌种的活化 |
| 2.2.2 菌悬液的计数和制备 |
| 2.3 牛津杯法测定藏药复方对多杀性巴氏杆菌抑菌试验 |
| 2.4 试管二倍稀释法测定藏药复方对多杀性巴氏杆菌的MIC值 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细菌菌液计数结果 |
| 3.2 牛津杯法测定藏药复方对多杀性巴氏杆菌抑菌试验结果 |
| 3.3 试管二倍稀释法测定藏药复方对多杀性巴氏杆菌的MIC值 |
| 4 讨论 |
| 第三章 藏药复方对小鼠感染多杀性巴氏杆菌模型的防治研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验药材与菌种 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 培养基与试剂 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 藏药复方提取物的制备 |
| 2.2 菌悬液的计数 |
| 2.3 小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌模型的建立 |
| 2.4 翼草景香提取物对小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌防治作用 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌模型的建立结果 |
| 3.2 藏药复方对小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌防治作用结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鼠感染多杀性巴氏杆菌模型讨论 |
| 4.2 复方防治结果讨论 |
| 4.3 复方二翼草景香提取物组方 |
| 第四章 复方二翼草景香提取物急性毒性及亚急性毒性试验 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验药材 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 藏药复方提取物的制备 |
| 2.2 翼草景香提取物急性毒性试验 |
| 2.2.1 翼草景香提取物急性毒性预试验 |
| 2.2.2 翼草景香提取物最大耐受量试验 |
| 2.3 翼草景香提取物亚急性毒性试验 |
| 2.3.1 分组及给药 |
| 2.3.2 临床症状 |
| 2.3.3 体重 |
| 2.3.4 脏器指数及组织病理学检查 |
| 2.3.5 血液学指标的检测 |
| 2.3.6 血液生化指标的检测 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 翼草景香提取物的急性毒性试验结果 |
| 3.1.1 翼草景香提取物的急性毒性预试验结果 |
| 3.1.2 翼草景香提取物的最大耐受量试验结果 |
| 3.2 翼草景香提取物的亚慢性毒性试验结果 |
| 3.2.1 临床症状 |
| 3.2.2 翼草景香提取物对大鼠体重的影响 |
| 3.2.3 翼草景香提取物对大鼠脏器指数的影响 |
| 3.2.4 翼草景香提取物对大鼠血液学指标的影响 |
| 3.2.5 翼草景香提取物对大鼠血液生化指标的影响 |
| 3.2.6 翼草景香提取物对大鼠组织病理学的影响 |
| 4 讨论 |
| 第五章 复方二翼草景香提取物中红景天苷含量测定 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验药品 |
| 1.2 试剂及耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 翼草景香提取物的制备 |
| 2.2 HPLC测定翼草景香提取物中红景天苷方法 |
| 2.2.1 色谱条件 |
| 2.2.2 对照品溶液的制备 |
| 2.2.3 供试品溶液的制备 |
| 2.2.4 标准曲线 |
| 2.2.5 精密度试验 |
| 2.2.6 稳定性试验 |
| 2.2.7 重复性试验 |
| 2.2.8 加样回收率试验 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 标准曲线 |
| 3.2 精密度试验 |
| 3.3 稳定性试验 |
| 3.4 重复性试验 |
| 3.5 加样回收率试验 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
四、家禽注射途径给药有八忌（论文参考文献）
- [1]NA基因位点变异对H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶功能及致病性的影响[D]. 郑沁玫. 扬州大学, 2021
- [2]AFB1致小鼠睾酮合成障碍的分子机制及ROS/AMPK信号通路的调控作用[D]. 黄婉月. 东北农业大学, 2021
- [3]表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价[D]. 姚舜禹. 天津大学, 2020
- [4]大肠杆菌氨苄西林耐药性对其噬菌体裂解作用的影响及机制研究[D]. 王爽. 吉林大学, 2020(08)
- [5]硒对镉诱导神经元损伤的干预作用及机制研究[D]. 任妍. 大连理工大学, 2020(02)
- [6]中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究[D]. 李俊鑫. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2019(02)
- [7]刺五加苷B1抗流感病毒作用及其调控机制研究[D]. 颜雯. 广州中医药大学, 2019(08)
- [8]鸡大肠杆菌病模型建立与辨证分型[D]. 王强. 扬州大学, 2019(02)
- [9]猪源大肠杆菌对达氟沙星敏感性临界值及其耐药机制研究[D]. 杨雨齐. 东北农业大学, 2019(09)
- [10]藏药复方翼草景香提取物对多杀性巴氏杆菌的药效和毒理学研究[D]. 高艳. 甘肃农业大学, 2019