一、探讨胎脾LAK细胞对不同的T淋巴白血病细胞的杀伤作用（论文文献综述）
王丹阳[1]（2020）在《新型磁性纳米粒子在杀伤性T细胞分离中的应用》文中进行了进一步梳理磁性纳米技术的应用促进了各个领域的发展,尤其是生物医学研究和临床领域。免疫细胞治疗作为一种新兴的癌症治疗手段,因其良好的治疗效果,近些年受到了越来越多的关注。在免疫细胞治疗的研究中,免疫细胞的分选显得尤为重要,分选技术会影响所需免疫细胞的质量。磁性纳米粒子具有磁响应强,良好的生物相容性,比表面积大等许多优点,科学家研究发现磁性纳米粒子在细胞分离中有着重要的应用价值。为更好的探究可应用于肿瘤杀伤性T淋巴细胞分离中的磁性纳米粒子,本课题利用实验室的新型磁性纳米平台,选用两种不同的磁性纳米粒子:羧基磁珠和氨基磁珠,进行CD8特异性抗体偶联实验,结合BCA微量蛋白浓度测定法探究两种磁性纳米粒子对抗体的偶联效果,发现在抗体添加量相同的条件下,氨基磁珠的偶联效果优于羧基磁珠。进一步通过抗体用量的梯度实验对氨基磁珠表面抗体的偶联量进行研究,结果显示在抗体与磁珠的比例为50μg:3 mg时,氨基磁珠具有96.65%的最大偶联率。同时,利用Nicomp380/ZLS纳米粒度分析仪对磁珠与抗体的偶联反应前后进行粒度分析,结果显示免疫磁珠的平均粒径和多分散系数都有不同程度的增长,表明抗体的偶联会对免疫磁珠的分散性以及粒径产生影响,且在相同条件下氨基免疫磁珠的分散性优于羧基免疫磁珠,进一步证明了氨基磁珠比羧基磁珠更适合用于本课题研究。该课题旨在探究可以用于分离杀伤性T细胞的磁性纳米粒子,从磁性纳米粒子的选择入手,进行了抗体的偶联量以及免疫磁珠性质的分析,得到了对后续磁性纳米粒子在CD8+T淋巴细胞分离应用中的探究有参考价值的结论,为进行磁性纳米粒子参与的细胞分离以及CD8+T淋巴细胞在免疫细胞治疗方面的研究提供了理论依据。
李增政[2]（2020）在《补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选》文中指出背景:免疫力低下在祖国医学看来多属于肾阳虚的范畴,以温阳补肾固卫气的根本出发对治疗临床上免疫力低下的患者有较好的疗效,尤其是对白血病患者,可以减轻白血病患者因药物产生的副作用和免疫抑制。细胞免疫治疗是新兴的肿瘤治疗手段之一,其通过各种生物技术手段在体外对免疫活性细胞进行改造,扩增后再回输到患者体内,进而达到提高患者免疫力,同时抑制或杀死肿瘤细胞的目的。此外在现代医学治疗白血病中小分子抑制剂占了重要一席,尤其是酪氨酸酶抑制剂,自伊马替尼诞生以来大大改变了慢性粒细胞白血病的治疗方式。许多中药或有药用作用的植物药对白血病细胞具有一定的杀伤作用,尽管已经报道了很多有治疗效果的小分子,但诸多药物中存在的小分子对白血病细胞的作用我们仍然不清楚。前期的临床实践证明补阳中药方剂有助于提升肾阳虚患者免疫力和白血病预后的线索,但方剂中的主要活性成分和起重要作用的中药我们对此知之甚少。同时诸多药用植物在民间被用来抗肿瘤,但其中起抗肿瘤作用的活性分子我们也仍然不清楚。因此本课题围绕补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫细胞的调节及活性成分分析和新型小分子抗白血病细胞的筛选来开展。目的:（1）探索中药补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫系统的调节作用为临床用药提供基础研究数据。（2）通过对补肾回阳方中的主要活性成分单体解析使得对该方剂的认识更加深入。（3）筛选出药用植物中具有抗白血病细胞的新型天然小分子为后续工作打下基础。方法:（1）补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:通过腹腔注射25mg/kg氢化可的松,建立肾阳虚小鼠模型,对照组每日腹腔注射等量生理盐水,各组连续给药10天后,检测肾阳虚模型组和对照组小鼠的一般体征、外周血象、以及T淋巴细胞亚群等指标。随后给予肾阳虚模型小鼠补肾回阳方0.25ml/天灌胃治疗,模型对照组和空白对照组用生理盐水灌胃,一天一次,连续给药15天。治疗结束后检测小鼠的一般体征、外周血的相关免疫细胞,和通过流式细胞术测定各组小鼠的外周血、骨髓和脾脏的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平;以及分离小鼠外周血单核细胞进行后期细胞因子诱导培养DC细胞,检测其体外扩增情况,最后进行数据统计分析。（2）补肾回阳方的活性成分法分析:将补肾回阳方的浓缩液和标准品进行高效液相色谱分析和液质色谱串联分析,通过对比标准品和数据库来探索补肾回阳方中的活性成分。（3）新型小分子抗白血病细胞作用的:将分离得到的新型小分子化合物进行CCK-8药敏实验,筛选对白血病细胞有抑制作用的小分子。结果:（1）补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:中药灌胃治疗后,与模型对照组相比补肾回阳组小鼠的体重增长明显;外周血中白细胞和淋巴细胞水平明显上升;外周血、骨髓和脾脏中的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平明显提高;经过补肾回阳方灌胃治疗的肾阳虚模型小鼠,由外周血分离单核细胞经体外细胞因子诱导培养的DC细胞,细胞数量也明显高于模型对照组。（2）补肾回阳方的活性成分分析:结合标准品和数据库分析得到补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外还得到与淫羊藿成分:异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2;炙甘草成分:甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸;干姜成分:6-姜烯酚、6-姜辣素;肉桂成分:桂皮醛分子式和分子量一致的11种物质。（3）YWF-10、YHL-14、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7、DX-15小分子对THP-1、Jurkat、KG-1三种细胞均有抑制作用,其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞的抑制作用没有统计学差异（P>0.05）,但对KG-1、THP-1的抑制作用有统计学差异（P<0.01）,并且YWF-08对Jurkat细胞也有较强的抑制作用（P<0.001）。YWF-10、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;相比于对32D细胞的抑制率Jurkat细胞的抑制率也远大于对32D细胞的抑制率。结论:（1）补肾回阳方可以提升肾阳虚小鼠外周血中的白细胞和淋巴细胞数量,可以提高外周血、骨髓和脾脏中的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平,以及可以提高DC细胞的体外诱导培养数量,证明补肾回阳方对肾阳虚小鼠具有增强和恢复免疫的功效。（2）补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外含有与异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2、甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸、6-姜烯酚、6-姜辣素、桂皮醛分子式和分子量一致的物质11种,其中淫羊藿和炙甘草的活性成分最多,鉴于前人的研究和本研究结果在补肾回阳方对免疫的正向调节作用中淫羊藿和炙甘草发挥了要作用。（3）YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞没有抑制作用,但对KG-1细胞和THP-1细胞有较强的抑制作用。
涂宏蕾[3]（2020）在《运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用》文中指出目的:血液恶性肿瘤的免疫治疗在近几年已经实现了重大的突破。然而,部分患者免疫治疗后出现耐药和复发,不同患者或同一患者不同阶段,对相同免疫疗法反应不同,存在严重异质性,然而,我们现阶段,对免疫治疗异质性的理解还严重不足。传统的研究方法是基于大样本,从整体水平来研究肿瘤对治疗的反应,而忽视了单个免疫细胞活性状态的差异,免疫突触的形成,免疫细胞对肿瘤靶细胞的识别,以及免疫细胞杀伤效率存在异质性的问题。为了克服这个缺陷,本课题基于急性髓系白血病（AML）免疫治疗的需求,设计了能在单细胞层面观察免疫细胞和白血病细胞相互识别,相互作用的微流控芯片。运用该微流控芯片,能够精确控制白血病细胞和T细胞的数量和比例,以及所处的内环境,同时,利用微流控芯片高通量的优点,能够一次追踪大量的T细胞与白血病细胞之间动态的相互作用。我们期望我们建立的单细胞研究平台在未来,有潜力可以作为辅助诊断工具,更好的评估患者接受过继性免疫细胞疗法的疗效以及异质性,为临床个体化的免疫治疗方案的设计提供技术支持。方法:1.设计并制备一种微流控芯片,与细胞原位孵育系统及显微镜延时成像系统（time-lapse imaging）整合,追踪T细胞和白血病细胞的动态运动轨迹,以定量分析T细胞的效应功能。2.通过调控输入细胞浓度的初始浓度,从1?106/m L-20?106/m L,以及不同的效靶比,以使单个微流控芯片井中获得最佳的T细胞-白血病细胞对。3.选择OT-I＿OVA体系用于体外单细胞研究抗原提呈,T细胞活化。细胞分组情况如下:（1）阳性对照组:OT-I＿C1498-OVA+;（2）阴性对照组:Na?ve T细胞＿C1498-OVA+,Na?ve T来自于普通C57BL/6小鼠的脾脏;（3）阴性对照组:OT-I＿C1498-OVA-。4.Fluo-4钙离子荧光探针预处理OT-I细胞,研究T细胞免疫突触形成的异质性。5.充分混合的OT-I细胞和C1498细胞悬浮液中加入小鼠来源抗PD-1抗体,来研究免疫检查点抑制在单细胞水平对AML免疫治疗的影响。实验分两组:（1）治疗组:OT-T＿C1498+PD-1抗体;（2）对照组:OT-T＿C1498。结果:1.我们发现OT-I＿C1498-OVA+组显示出明显更高的细胞死亡,且随时间不断增加,显着高于Na?ve T细胞＿C1498-OVA+和OT-I＿C1498-OVA-组,5小时内三组的细胞死亡率分别为32.89%,16.09%和14.75%。63.28%的OT-I细胞能够在5小时内杀死了一个或多个OVA+的白血病细胞（C1498）,对OVA-的C1498细胞,仅有9.51%的OT-I细胞能够识别并且发挥细胞毒作用,同样,Na?ve T细胞对C1498细胞基本不能识别,仅表现了非特异性杀死,杀伤率为8.30%,后两组比较（OT-I＿C1498-OVA-和Na?ve T细胞＿C1498-OVA+）没有明显的统计学差异。2.由于T细胞抗原受体的参与和T细胞活化,同一来源的单个T细胞发挥细胞毒性所需的时间具有很强的异质性。51%的OT-I细胞能够在50分钟内杀死白血病C1498细胞。只有16.3%的OT-I细胞能够在20分钟内杀死白血病细胞,在20-30分钟之间杀死白血病细胞的T细胞占14.5%。自T细胞的激活,18.2%的T细胞需要大于等于60分钟才能杀死白血病C1498细胞。3.T细胞发挥杀伤作用时,T细胞与白血病细胞之间的初始距离从0μm到18μm不等。当T细胞和C1498细胞直接接触时,有85%的C1498细胞被杀死,而初始距离在1至15μm之间时,有15%的C1498细胞被杀死。4.同种来源的T细胞杀伤能力的异质性:有54.5%的T细胞在5小时内杀死了1个白血病细胞,而有4.9%的T细胞杀死了2个白血病细胞,只有0.78%的T细胞杀死了3个或更多的白血病细胞,剩余占39.8%的T细胞没有杀死任何白血病细胞。5.从最初的白血病细胞与T细胞相互接触到白血病细胞死亡,我们总共分析了522个被T细胞杀死的白血病细胞。细胞死亡时间从20分钟到300分钟不等,重要的是,自T细胞与靶细胞最初接触,有90%的杀伤发生在相互接触90分钟之后。白血病细胞死亡数量最多是发生在接触后3.5小时到4小时,占死亡总数的22.4%。6.我们分析了对照组中1024个OT-I细胞的杀伤效率和有PD-1抗体的实验组中的777个OT-I细胞的杀伤效率。结果显示:微环境中加入PD-1抗体后,OT-I细胞在5小时内的杀伤效率明显增强,并且PD-1抗体能部分加速T细胞对靶细胞的杀伤。在3.5小时的时候,对照组和治疗组中OT-I细胞的总杀伤效率分别为37.52%±5.33 vs 61.48%±7.86（p<0.05）;在5小时的时候,两组中OT-I细胞的总杀伤效率分别为63.28%±2.93 vs 73.04%±3.7（p<0.05）。7.在5小时内,在对照组中,没有发挥细胞毒性的T细胞占总T细胞的39.8%。而在使用了PD-1抗体的实验组中,仅有27.3%的T细胞没有发挥细胞毒性,明显低于对照组（p<0.05）。此外,在对照组中,分别杀死1、2和3个白血病C1498细胞的T细胞分别占统计的总的T细胞数量的54.47%,4.92%和0.77%,均明显低于加入了PD-1抗体的治疗组,治疗组结果为:60.77%,10.53%和1.43%。8.在行免疫检查点（PD-1）抑制治疗后,在对照组（没有用PD-1抗体）中,在2小时内被T细胞攻击致死的C1498细胞数量占死亡总数的12.06%,而在治疗组中,2小时内被杀死细胞的比例为30.85%。在治疗组中,当C1498细胞与T细胞接触时间在3-3.5之间,细胞死亡的比例达到最大,比对照组的3.5-4小时达到最大比例提前了半小时。结论:使用我们的微流控芯片和OT-I＿OVA系统能够很好的体外观察T细胞的抗原识别,杀伤,具备在单细胞水平研究T细胞-靶细胞相互作用的异质性的可行性。本研究成功阐述了单个免疫细胞-靶细胞的异质性,以及免疫检查点抑制（PD-1/PD-L1）对细胞异质性的影响。此外,从方法学来看,这项研究基于微流控芯片,为探讨细胞间间隙连接,细胞内脂质变化,旁分泌以及细胞耐药提供了一个新的技术平台。此平台具有方便,快速,高通量和易操作的优点。能够为研究疾病的早期诊断以及细胞间的相互作用提供帮助。该技术平台为在单细胞水平上研究癌症免疫治疗的疗效和耐药性开辟了新的途径,增强我们对癌症免疫治疗基础理论的探索,为设计个性化的癌症免疫疗法提供理论支持。
谭庆龙[4]（2018）在《巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价》文中认为肿瘤微环境是一个复杂结构系统,具有增强或逃避宿主免疫监视和杀伤的作用。组成肿瘤免疫环境的核心免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞和中性粒细胞。肿瘤微环境中的免疫细胞的位置、数量、功能表型和Closstalk影响肿瘤的免疫应答、治疗和预后结果。因此,重塑肿瘤免疫环境中免疫细胞的特征和削弱其在肿瘤免疫治疗中抑制性,对开发针对癌症的新型免疫治疗和化疗抵抗至关重要。由于肿瘤生长通常伴随着髓系细胞在肿瘤中的积累和免疫表型改变,从而抑制T细胞靶向肿瘤的免疫治疗。本研究针对肿瘤微环境中关键的“保安”巨噬细胞和“特种兵”T淋巴细胞入手,分别探寻调节巨噬细胞免疫极化表型的物质及其机制,和构建人源化T细胞免疫的小鼠膀胱癌肿瘤评价模型,希冀为重塑肿瘤免疫环境的治疗关键问题提供启示。1、巨噬细胞具有两种作用相反的表型,经典激活的M1表型和选择激活的M2表型,M1型巨噬细胞抵抗入侵病原体、抑制肿瘤、吞噬微生物、促进炎症反应和增强免疫监视功能。相反,M2型为“休息”表型,抑制免疫反应、促进组织愈合、降低炎症发生和促进肿瘤生长。猪苓多糖具有免疫调节作用已被证实,在本研究中,通过甲醇脱脂、水提醇沉提取猪苓粗多糖,经过滤、Savage法去蛋白、冷冻干燥、DEAE-Cellulose及Sephadex G-100柱层析分离猪苓均一多糖（Polyporus polysaccharide,PPS）;发现纯化的PPS极化M-CSF诱导人M2(CD206 high)型巨噬细胞极化为M1(CD86 high)型,且PPS影响巨噬细胞的粘附和诱变细胞形态;降低PD1表达,升高MHCⅡ分子表达;促进细胞因子白细胞介素（IL）‐1β、IL‐6、IL‐8、IL10及肿瘤坏死因子（TNF）‐α（P<0.01）分泌;增强M2巨噬细胞对肿瘤杀伤的能力（P<0.05）;降低FN、COLⅢ和ICMA-1转录水平（P<0.05）,升高TLR2、TLR4和NF-κB蛋白的表达（P<0.05）;RNA-seq也证实NF-κB信号及细胞生理的基质组成参与了PPS对巨噬细胞的作用。本研究发现PPS抑制M2巨噬细胞的粘附和伪足生成,且具有显着增强巨噬细胞免疫和抗肿瘤功能。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）对非肌层浸润性膀胱癌有效,其激活了免疫系统和加剧炎症反应,其中巨噬细胞为BCG的重要靶细胞之一。实验探讨了BCG在巨噬细胞极化调控中的作用和潜在机制,以及和信号调节蛋白-α（SIRPα）的关系。将单核细胞系THP-1分化为M2巨噬细胞(CD206 high和Th2细胞因子分泌细胞),观察到BCG诱导的M2极化为M1表型(CD86 high、CD197 high和Th1细胞因子分泌细胞);下调SIRPα（CD172α）;促进IL-1β、IL-6、TNF-α、干扰素（IFN）-γ和诱导型一氧化氮合酶（i NOS）等促炎因子的表达（P<0.05）。与BCG处理的M2巨噬细胞共培养的人膀胱癌T24和RT4细胞,显示出CD47高表达的于生长抑制作用的正相关（P<0.05）。此外,BCG以剂量依赖性方式显着增加Janus激酶2（JAK2）和p信号转导物和转录激活物1（STAT1）蛋白的表达。实验结果表明JAK2/STAT1途径介导BCG极化巨噬细胞为M1和抑制SIRPα表达是BCG作用于巨噬细胞为杀伤膀胱癌的重要机制。另外,通过体内研究BCG（0.25、1.25和6.25μg/小鼠,i.v.）在NOD/scid IL2Rg-/-（NSI）小鼠膀胱癌肿瘤模型中的作用和潜在机制。惊讶的是,观察到NSI小鼠T24膀胱癌模型在尾静脉注射BCG后,显示巨噬细胞标志物CD11b+F4/80+高水平浸润以及肿瘤体积的显着减少（P<0.05）。与对照组相比,外周巨噬细胞的M2比例显着下降（P<0.05）,血清和肿瘤上清中巨噬细胞相关炎症和分化细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12P70、RANKL和MCP-1的水平也显着增加（P<0.05）。此外,BCG促进骨髓中促分化基因PU-1、EGR-1、NF-κB和C-Fos m RNA转录的表达（P<0.05）。结合分析,本研究结果表明体内注射BCG可以靶向巨噬细胞来抑制膀胱癌的生长,其机制与巨噬细胞成熟、免疫激活和浸润膀胱肿瘤的巨噬细胞数量增加有关。2、人源化小鼠或小鼠-人类嵌合体已成为研究体内替代活生物体的重要模型。近年来,人源化小鼠模型在人类艾滋病、癌症、传染病、血液疾病和退行性疾病领域研究得到了广泛的认可和应用。患者来源的异种移植肿瘤（PDX）保留了原始的肿瘤特征如组织学异质性、生物分子特征、临床恶性表型、基因型、肿瘤结构和肿瘤脉管系统,可提供相关评估特别是新型癌症疗法和对临床结果的具有预见性,与肿瘤细胞系相比为更可靠的药物研发平台,已成为公认的临床前药物评价模型。Atezolizumab（MPDL3280A）作为化免疫治疗药物为膀胱肿瘤近30年以来的首个重大药物,开启了膀胱癌精准免疫靶向治疗。实验建立PBMC人源化NSI皮下荷瘤T24膀胱癌CDX小鼠模型,Atezolizumab（10mg/kg,i.v）每周尾静脉给药2次,连续治疗4周,对Atezolizumab的免疫治疗效果和机制进行评价。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;但对T细胞亚群CD8+/CD4+比例无影响;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1、TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）但对T细胞激活分子CD25、CD69均无影响。实验另进行了人源化NSI膀胱癌PDX小鼠模型构建,观测Atezolizumab（高、中、低:20、10、5 mg/kg,i.v）对患者来源肿瘤样本（PDX）的治疗作用。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;能明显增加CD4+亚群细胞数量;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）,但对外周T细胞激活CD25、CD69无影响。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1和TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）,对T细胞激活分子CD25和CD69均无影响。本次建立的人源化膀胱癌PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,且具有与CDX某些不同的特征表型,特别是T细胞浸润情况,CDX模型中浸润T细胞远大于PDX模型肿瘤。实验建立的人源化膀胱癌CDX或PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,为具有T淋巴细胞特征的肿瘤免疫评价模型。实验表明Atezolizumab不仅对肿瘤PD-L1具有明显抑制作用,还能间接抑制PD1促进NSI小鼠体内人源T细胞的增加,具有重塑肿瘤免疫环境的作用。PDX与CDX模型的差异,能为患者肿瘤的异质性、不同免疫浸润环境和精准治疗提供临床前依据。
徐梅[5]（2014）在《化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察》文中提出卵巢癌发病隐匿，大部分患者就诊时已经是晚期，位居妇科肿瘤患者致死首位。结肠癌的发病率和死亡率也位居消化系统肿瘤首位。因此，它们都迫切需要寻找更有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学和分子生物学的不断发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤的第四大治疗模式。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）兼具有强大的抗瘤活性和增殖活性，又具有非MHC限制性杀瘤的优点，近些年已经得到广泛关注并应用于多种实体瘤的临床治疗，但对卵巢癌治疗报道少见。本文首先通过体外实验研究顺铂（cis-Dichloro diamine in platinum，CDDP或DDP）、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应，接着通过体内实验研究氟尿嘧啶（5-FU）、CIK细胞及其联合对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用，初步探讨其作用机制。最后，回顾分析本中心6例CIK细胞治疗的卵巢癌患者临床资料，初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性及有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。第一部分DDP联合CIK细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应目的：探讨DDP、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应并初步探讨其机制。方法：利用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）在体外用多种细胞因子诱导生成CIK细胞，于培养第0、7、14、21、28及35天进行细胞计数及流式细胞术分析CD3+CD56+双阳性细胞百分比；于培养14天收获CIK细胞作为效应细胞，用含有CIK细胞培养液上清的培养液培养对数生长期的SKOV-3细胞，于培养24及48小时用流式细胞仪检测SKOV-3细胞的凋亡情况，同时设正常培养的SKOV-3细胞作对照组；杀伤实验分为Ａ14CIK细胞作用组（效靶比分别为5:1、10:1、20:1、40:1）、B17DDP作用组（DDP浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）及C12CIK联合DDP作用组（DDP浓度均为2.5μg/ml，效靶比分别为5:1和10:1）。同时设效应细胞和靶细胞作对照孔。于24h和48h采用MTT法检测各组对SKOV-3的生长抑制效应。结果：CIK细胞体外培养第0、7、14、21、28及35天细胞计数依次为（1.8±0.2）×107、（14.67±1.53）×107、（230.0±20.0）×107、（225.0±22.91）×107及（220.0±17.32）×107，细胞数于培养第2l天时约增加127.78倍，达到增殖高峰；CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量依次为（0.47±0.17）%、（11.30±1.96）%、（35.50±2.30）%、（38.23±1.92）%、（31.40±3.91）%和（28.61±3.45）%，到21天也达到增殖高峰；SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为（12.30±1.47）%和（27.13±2.03）%，差异有统计学意义（P <0.05）。对照组24h及48h凋亡率分别为（0.62±0.35）%和（0.65±0.38）%，差异无统计学意义（P>0.05）；Ａ14CIK作用组24h抑制率分别为（16.52±2.52）%、（24.18±4.05）%、（35.98±5.19）%及（53.98±5.02）%，48h抑制率分别为（24.20±5.59）%、（41.23±3.64）%、（57.27±6.68）%及（74.74±6.87）%。在相同时间各组间细胞抑制率差异有统计学意义（P <0.05），相同效靶比24h和48h抑制率差异有统计学意义（P <0.05）；CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高；B17DDP作用组24h抑制率分别为（15.09±4.03）%、（25.95±3.36）%、（37.11±3.05）%、（50.07±5.21）%、（62.93±5.85）%、（77.93±3.28）%及（92.55±1.39）%，48h抑制率分别增为（23.42±5.63）%、（32.39±1.47）%、（46.04±2.76）%、（60.46±3.26）%、（72.77±2.38）%、（86.42±1.46）%及（96.24±0.59）%。除外DDP0.625μg/ml组24h和48h抑制率差异无统计学意义（P=0.102），其余各组差异均有统计学意义。DDP对SKOV-3细胞的抑制率也随着药物浓度的提高及作用时间的延长而提高；C12CIK联合DDP作用组24h抑制率分别为（50.50±3.69）%和（68.19±2.07）%，48h抑制率分别为（69.87±2.67）%和（80.11±6.87）%。CIK细胞联合DDP与单一处理因素相比，对SKOV-3的生长抑制率差异有统计学意义。但析因分析结果显示，低剂量组（效靶比为5:1）24h和48h抑制率未见到协同效应（P值分别为0.171和0.895），而高剂量组（效靶比为10:1）24h和48h抑制率见到协同效应（P <0.05）。结论：PBMC在体外经多种细胞因子刺激诱导下可大量扩增获得CIK细胞，其主要效应细胞（CD3+CD56+CIK）在第1421天为高表达平台期，在此期间可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可明显增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用。第二部分氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究目的：探讨氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用。方法：建立BALB/C小鼠结肠癌模型，在体外诱导培养小鼠CIK细胞，于第0和7天进行流式细胞术CIK主要效应细胞表型分析。10只荷瘤鼠随机分两组，一组给5-FU（12.5mg/kg）当天腹腔注射，另一组给予NS（0.2ml/只）腹腔注射作对照，第十天采用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞细胞毒性T细胞活化抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-activation antigen4，CTLA-4）和非淋巴细胞CD80、CD86表达。另取40只荷瘤鼠随机分成四组，A组（正常对照组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；B组（5-FU组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；C组（CIK组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）；D组（5-FU+CIK组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线，生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。用药第10天各组处死5只小鼠，采用RT-PCR法检测四组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-表达量。结果：小鼠CIK主要效应细胞在体外扩增第7天达到（18.4±6.8）%。与对照组相比，5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高，且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加；5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单因素治疗组，差异有统计学意义（P <0.05）；5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-表达量，且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义（P <0.05）。结论：5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用，且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型的免疫功能。第三部分化疗联合CIK细胞治疗卵巢癌的临床观察目的：初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性和有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。方法：利用接受常规手术和化疗结束后卵巢癌患者外周血分离出单个核细胞，在体外经多种细胞因子诱导培养出CIK细胞，流式细胞术分析其表型特征。将体外培养第1421天的CIK细胞通过静脉回输给患者，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞表型变化，回顾性观察6例接受CIK细胞治疗的卵巢癌患者资料，观察患者治疗前后卡式评分（Karnofsky performance score，KPS）差异、肿瘤指标差异、外周血T细胞亚群分布及治疗后相关毒副反应。结果：有5例治疗后KPS较治疗前明显提升，另外1例治疗后KPS保持不变。所有接受CIK细胞治疗的患者均未出现明显毒副作用。1例III期EOC患者手术联合化疗治疗后CA199升高，在接受CIK细胞治疗3个疗程后，CA199逐渐下降至正常。目前状况良好，肿瘤标记物和影像学随访没有肿瘤复发迹象，无瘤生存期（progression free survival，PFS）已达到3年。1例II期透明细胞癌合并浆液性癌患者，接受CIK细胞治疗2个疗程，PFS已接近4年，随访瘤标和影像学检查无肿瘤复发迹象。另外1例II期EOC患者接受8个疗程CIK细胞治疗后，PFS已达5年，目前状况良好，也没有肿瘤复发迹象。结论：CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生存质量，是一种有希望的治疗方法。综上所述，本文通过对化疗联合CIK细胞治疗肿瘤的基础研究和治疗卵巢癌病例的回顾分析，我们认为，CIK细胞可在体外经多种细胞因子刺激下诱导扩增，第1421天可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用；5-FU联合CIK细胞治疗对BALB/C小鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞，且可提高小鼠结肠癌模型的细胞免疫功能。CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生活质量，是一种有希望的治疗方法。
李玲[6]（2010）在《DC对同源CIK细胞生物学活性及抗急性白血病细胞作用的研究》文中进行了进一步梳理目的：探讨急性白血病细胞免疫治疗的新途径。将树突状细胞（dendritic cells, DC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells, CIK）一起孵育,观察共培养物DC细胞与CIK细胞的增殖能力、免疫膜标变化、分泌细胞因子水平以及抗急性白血病细胞的效应。同时与CIK细胞单独培养的生物学活性和抗白血病作用相比较,为白血病治疗寻找一种更理想的免疫活性细胞。方法：CIK细胞的体外培养。采取正常健康人的外周血,经肝素抗凝后,用H-F（Hypaque-Ficoll）淋巴细胞分离液相对密度为1.077±0.001,分离获得单个核细胞（mononuclearn cells, MNC）。然后用RPMI 1640培养液洗涤3次,调整细胞浓度至4×106／ml,进行贴壁细胞培养,收集悬浮的细胞,用含10%小牛血清（fetal calf serum, FBS） RPMI 1640液将细胞浓度调整至1×106／ml,经37℃、5%C02培养,分别于第0天、第1天加入不同的细胞因子,以后每隔3天更换新的培养液。3天后更换培养液的同时补充加入重组人白细胞介素-2（rh-interleukin-2, rhIL-2）。DC细胞的体外培养方法是通过将健康人外周血单个核细胞,用RPMI1640培养液调整细胞浓度为4×106／ml,培养1到2小时,吸弃培养基及悬浮的细胞,在培养瓶中加入新鲜的RPMI1640培养液,反复吹吸使贴壁细胞悬浮。收集悬浮贴壁细胞,离心洗涤,进行细胞计数,调整细胞浓度为1×106／ml。然后用含有10%的FBS的RPMI 1640培养液培养,培养液中同时加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rh-granulocyte-macroph-age.colony-stimulating.factor,rhGM-CSF） 550 U/ml、重组人白细胞介素-4（rh-interleukin-4, rhIL-4） 500U/ml。按照常规培养,隔日半量换液,并补加细胞因子。于培养72小时前再加入重组人肿瘤坏死因子-a（rh-tumor necrosis factor-a, rhTNF-a） 50U/ml,诱导DC细胞的成熟。将获培养第9天的DC细胞及CIK细胞经台盼蓝排斥法活细胞计数后,用含有10%FBS的RPMI1640液调整细胞浓度,调整DC细胞浓度为1×106／ml,CIK细胞浓度为5×106／ml,按照DC细胞与CIK细胞之比为1：5的比例将两者混合培养,培养至第3天与第6天收集共培养的细胞,进行生物学活性测定。结果：研究结果表明,DC细胞与CIK细胞共培养后,其细胞增殖能力、细胞毒活性、免疫表型的表达、细胞因子分泌水平与单独CIK细胞相比有明显或显着性差异。结论：与DC细胞共培养可以提高CIK细胞的增殖速度；DC细胞可增强CIK细胞的杀伤活性,在同一效靶比对急性白血病细胞的杀伤活性各型之间无明显差异,随着效靶比的增高对急性白血病细胞的杀伤活性增强；共培养细胞CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞比值明显高于同条件下单独CIK细胞培养组；共培养细胞分泌细胞因子水平较单独CIK细胞培养组分泌水平高。
刘苗[7]（2010）在《细胞因子诱导的杀伤细胞体外生物活性和杀瘤机制的研究》文中指出第一部分：细胞因子诱导的杀伤细胞体外生物活性的研究目的：探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）的体外生物活性。方法：从白血病患儿外周血分离淋巴细胞,经过IFN-γ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的DC-CIK。光镜下观察其细胞形态学及动态增殖情况,流式细胞仪检测DC-CIK细胞免疫表型,MTT法研究DC-CIK细胞对多种白血病细胞株的杀伤活性,ELISA方法测定DC-CIK细胞释放细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达水平。结果：诱导后的DC-CIK细胞形态规则,DC-CIK细胞起初增殖缓慢,第4-8天快速增殖,于第9-10天达到增殖高峰,扩增约100倍。DC-CIK细胞中主要效应细胞是CD3+CD8+双阳性细胞和CD3+CD56+双阳性细胞。MTT结果示DC-CIK对肿瘤细胞B95杀伤作用最强,对Jhhan细胞和M07e细胞杀伤作用较弱。ELISA方法检测,发现诱导培养的DC-CIK细胞上清液中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α的分泌水平较高。结论：细胞因子诱导培养的杀伤细胞扩增能力和杀伤能力均较强。Th1细胞因子如IL-12、IFN-γ、TNF-α分泌较高,提示DC-CIK可能通过Th1途径发挥杀伤作用。第二部分：LFA-1/ICAM-1介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外杀瘤机制的研究目的：探讨LFA-1/ICAM-1介导的细胞因子诱导杀伤细胞的体外杀瘤机制。方法：从白血病患儿外周血分离淋巴细胞,经过IFN-γ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的DC-CIK。在予以10μg/ml、20μg/ml等不同浓度小鼠抗人LFA-1单克隆抗体处理后,采用MTT法研究DC-CIK细胞对多种白血病细胞株的杀伤活性,RT-PCR与Western-Blot方法检测GATA-3和T-bet基因表达水平的变化。ELISA方法测定DC-CIK细胞释放细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达水平。结果：诱导后的DC-CIK细胞形态规则,在予以10μg/ml、20μg/ml等不同浓度的LFA-1单克隆抗体处理后,MTT结果表明与阴性对照组相比,20μg/ml LFA-1单克隆抗体封闭的实验组DC-CIK细胞对B95细胞杀伤作用下降最为明显,差异有统计学意义（P<0.05）,而对Jhhan细胞和M07e细胞杀伤作用均下降,但差异没有统计学意义（P>0.05; P>0.05）。RT-PCR与Western-Blot结果表明与阴性对照组相比,20μg/mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞实验组GATA-3基因mRNA水平和蛋白水平表达增加最为明显,差异有统计学意义（P<0.05；P<0.05）。20μg/mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞实验组T-bet基因mRNA水平和蛋白水平表达降低最为明显,差异有统计学意义（P<0.05;P<0.05）。ELISA结果表明与阴性对照组相比,20μg/mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞实验组DC-CIK细胞上清液中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α分泌水平下降最为明显,差异有统计学意义（P<0.05；P<0.05；P<0.05）。结论：GATA-3和T-bet基因参与了LFA-1/ICAM-1介导的DC-CIK杀瘤途径,并且通过分泌Thl型细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α等发挥杀瘤作用。第三部分：T-bet介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外杀瘤机制的研究目的：研究T-bet介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外杀瘤的作用机制。方法：从白血病患儿外周血分离淋巴细胞,经过IFN-γ、CD3McAb、IL-2诱导,经树突细胞共培养后,获得大量的DC-CIK。在予以1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml等不同浓度小鼠抗人T-bet单克隆抗体处理后,采用MTT法研究DC-CIK细胞对多种白血病细胞株的杀伤活性,流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞比例,RT-PCR与Western-Blot方法分别检测Foxp3和GATA-3基因表达水平的变化,ELISA方法测定DC-CIK细胞释放细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-a的表达水平。结果：诱导后的DC-CIK细胞形态规则,在予以1μg/ml、51μg/ml、10μg/ml等不同浓度小鼠抗人T-bet单克隆抗体处理后,MTT结果表明与阴性对照组相比,10μg/mlT-bet单克隆抗体封闭的实验组DC-CIK细胞对B95细胞杀伤作用下降最为明显,差异有统计学意义（P<0.05）,而对Jhhan细胞和M07e细胞杀伤作用均下降,但差异没有统计学意义（P>0.05；P>0.05）。流式结果表明与阴性对照组相比,10μg/mlT-bet单克隆抗体封闭的B95细胞实验组CD4+CD25+Treg细胞表达上调最为明显,差异有统计学意义（P<0.05）,而Jhhan细胞实验组和M07e细胞实验组CD4+CD25+Treg细胞表达也上调,但差异没有统计学意义（P>0.05;P>0.05）。RT-PCR与Western-Blot结果表明与阴性对照组相比,10μg/mlT-bet单克隆抗体封闭的B95细胞实验组Foxp3基因mRNA水平和蛋白水平表达增加最为明显,差异有统计学意义（P<0.05;P<0.05）。10μg/m1T-bet单克隆抗体封闭的B95细胞实验组GATA-3基因mRNA水平和蛋白水平表达增加最为明显,差异有统计学意义（P<0.05；P<0.05）。ELISA结果表明与阴性对照组相比,10μg/m1T-bet单克隆抗体封闭的B95细胞实验组DC-CIK细胞上清液中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-a分泌水平下降最为明显,差异有统计学意义（P<0.05；P<0.05；P<0.05）。结论：Foxp3和GATA-3基因参与了T-bet介导的DC-CIK细胞杀瘤途径,其杀瘤机制主要表现为Thl途径活化,而Th2和Treg途径受抑。
任维凤[8]（2009）在《IL-2/抗IL-2抗体复合物体外诱导扩增外周血和骨髓CD56+淋巴细胞的实验研究》文中研究说明目的探索一种从人外周血单个核细胞（PBMC）和骨髓中高效扩增CD56+细胞毒性淋巴细胞的方法。方法以干细胞生长培养基（SCGM）为基础培养基,设计IL-2/抗IL-2抗体复合物（IL-2和抗IL-2抗体按质量比1:20混合）实验组、相应因子浓度的IL-2、抗IL-2抗体以及IL-2+IL-15三组对照组,分别从PBMC和骨髓单个核细胞中诱导扩增CD56+淋巴细胞,流式细胞仪分别检测外周血来源细胞第7、10天和骨髓来源细胞第7、14天的CD3/CD56表达率。用四甲基氮唑蓝（MTT）法检测其对肿瘤细胞株K562的杀伤活性,并分别与对照组激活的杀伤细胞进行比较。结果在以SCGM为基础培养基时,CD56+淋巴细胞经IL-2/抗IL-2抗体作用获得大量增殖。在培养第7和第10天时,外周血实验组CD56+细胞分别扩增了（24.67±3.14）和（31.63±5.01）倍;其中CD3+CD56+和CD3-CD56+细胞分别扩增（110.93±19.10）、（157.60±46.31）和（7.8±1.17）、（12.03±1.64）倍,与对照组相比,差别有统计学意义（P均＜0.05）;在培养第7和第14天时,骨髓实验组CD56+细胞分别扩增了（11.08±2.08）和（21.72±2.19）倍;其中CD3+CD56+和CD3CD56+细胞分别扩增（30.30±5.14）、（60.18±6.68）和（6.05±1.05）、（10.75±1.51）倍,与对照组相比,差别有统计学意义（P＜均0.05）;细胞效/靶比10:1时,外周血和骨髓实验组细胞对K562细胞的杀伤率分别为（83.46±1.56）%和（74.94±2.28）%;与同期对照组细胞相比具有更强的淋巴细胞毒性作用（P均＜0.05）。结论在IL-2/抗IL-2抗体（IL-2/抗IL-2抗体质量比为1/20）符合物作用下,以SCGM为基础培养基,可获得大量以CD56+淋巴细胞为主细胞毒性免疫效应细胞,为肿瘤过继免疫治疗提供了一种新的体外扩增CD56+淋巴细胞的方法。
方军[9]（2007）在《CD3和CD28双刺激活化的健康人外周血T淋巴细胞与胃泌素拮抗剂合用对结直肠癌细胞杀伤作用的研究》文中指出在肿瘤免疫及基因治疗中,过继性免疫方法是肿瘤的疗法中研究较为广泛的一种方案。共刺激细胞对肿瘤的治疗是目前研究的热点。有实验已经证明,共刺激健康人外周血淋巴细胞对于肝癌、膀胱癌均有一定的杀伤作用。另外,胃泌素是一种重要的胃肠激素,它主要由G细胞分泌。G细胞是典型的开放型细胞,以存在于胃窦部最多,其次是胃底、十二指肠和空肠等处。近年发现,颊粘膜、舌、食道、中枢神经系统也含有胃泌素。胃泌素促进胃肠道的分泌功能,增加胃肠道的运动,松驰幽门括约肌,胆道口括约肌和回盲部括约肌,促进胃及上部肠道粘膜细胞的分裂增殖,促进胰岛素和降钙素的释放。胃泌素不仅有刺激肠道上皮增生的能力,且胃泌素及其受体在胃肠肿瘤细胞生长调节中起着重要作用,而胃泌素拮抗剂对结肠癌的生长及转移具有明显抑制作用。本研究主要在体外联合应用胃泌素拮抗剂和CD3/ CD28刺激外周血T淋巴细胞,对活化细胞在体外对结肠癌细胞的影响及杀伤途径进行初步的研究。目的:探讨联合应用胃泌素拮抗剂和CD3/ CD28单克隆抗体共刺激活化健康人外周血T淋巴细胞在体外对结肠癌细胞株HT-29的影响及杀伤作用。方法:外周血T淋巴细胞的分离与体外培养;用含CD3/ CD28单抗共刺激活化的外周血T淋巴细胞或（和）CI-988（胃泌素拮抗剂）的RPMI1640培养基培养靶细胞（结肠癌细胞株HT-29）; MTT法获得生长曲线,检测活化细胞的体外淋巴细胞毒作用。电镜观察效应细胞杀伤的结肠癌细胞超微结构并用流式细胞仪检测结肠癌细胞的相关凋亡情况。结果:用CD3/CD28单抗共刺激活化的T细胞与靶细胞共同培养2天后效应细胞对结肠癌细胞株HT-29杀伤率可达60.4%。而加用胃泌素拮抗剂处理杀伤率达89.5%。较单用CD3/CD28单抗共刺激细胞处理杀伤作用明显提高（P <0.01）。流式细胞仪检测靶细胞HT-29细胞12小时显示凋亡。共刺激细胞、CI-988二者合用与肿瘤细胞共同培养72小时后,电镜下可见坏死及凋亡后死亡细胞,并可见各期的凋亡细胞。结论:联合应用胃泌素拮抗剂CI-988,可以提高单抗协同诱导的效应细胞对结肠癌细胞株HT-29抑制作用,而这种杀伤效应可能是通过诱导肿瘤细胞坏死及细胞凋亡两条途径来实现的。
叶子,师建国,张希国[10]（2006）在《CD3AK细胞的研究进展》文中认为过继免疫疗法是目前治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法。它是指体内回输免疫活性细胞,从而达到杀伤恶性肿瘤细胞的目的。与其他抗肿瘤药物相比,它可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞,并且调节和增强机体的免疫功能。用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的细胞毒活性和增殖力,目前常用的有抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（anti-CDlmon-odonal antibody activated killer cells,CD3AK）、淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated killer cells,LAg）及细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,aKl）[13]。其中研究最多最重要的就是CD3AK细胞。本文拟就其研究进展作一综述。
二、探讨胎脾LAK细胞对不同的T淋巴白血病细胞的杀伤作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、探讨胎脾LAK细胞对不同的T淋巴白血病细胞的杀伤作用（论文提纲范文）
（1）新型磁性纳米粒子在杀伤性T细胞分离中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源及其研究背景和意义 |
| 1.1.1 课题来源 |
| 1.1.2 研究背景及意义 |
| 1.2 国内外相关研究分析 |
| 1.2.1 免疫细胞治疗技术的研究现状 |
| 1.2.2 T淋巴细胞分离技术的发展 |
| 1.2.3 磁性纳米粒子的种类及性质 |
| 1.2.4 磁性纳米粒子的制备方法 |
| 1.2.5 磁性纳米粒子的应用 |
| 1.2.6 国内外研究总结 |
| 1.3 本文的主要研究内容 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 磁性纳米粒子类型的选择 |
| 2.3.2 抗体最佳用量的选择 |
| 2.3.3 磁性纳米粒子表面抗体偶联量测量 |
| 2.3.4 磁性纳米粒子表面抗体偶联量计算 |
| 2.3.5 磁性纳米粒子的粒度测量 |
| 第3章 磁性纳米粒子偶联抗体的实验分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 标准蛋白浓度曲线绘制 |
| 3.3 用于抗体偶联的磁珠类型的确认 |
| 3.4 磁珠表面抗体偶联量的结果分析 |
| 3.5 磁性纳米粒子粒径分布检测 |
| 3.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 急性淋巴细胞白血病 |
| 1.1.2 慢性淋巴细胞白血病 |
| 1.1.3 急性髓细胞性白血病 |
| 1.1.4 慢性粒细胞白血病 |
| 1.1.5 AML和 CML中的白血病干细胞 |
| 1.2 免疫细胞概述 |
| 1.2.1 T淋巴细胞概述 |
| 1.2.2 B淋巴细胞概述 |
| 1.2.3 自然杀伤细胞概述 |
| 1.2.4 NKT细胞概述 |
| 1.2.5 树突状细胞概述 |
| 1.3 中药与免疫概述 |
| 1.4 补肾回阳方的介绍 |
| 1.5 肾虚型小鼠模型概述 |
| 1.6 新型小分子介绍 |
| 1.7 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 试剂和化学药品 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 相关实验试剂的配制 |
| 2.1.5.1 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 |
| 2.1.5.2 ACK裂红液的配制 |
| 2.1.5.3 补肾回阳方的熬制与药液浓缩 |
| 2.1.5.4 细胞因子的配制与储存 |
| 2.1.5.5 其他化学试剂的配制 |
| 2.1.6 中药标准品配制 |
| 2.1.7 细胞完全培养基的配制 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 动物实验 |
| 2.3.1 小鼠肾阳虚模型的建立 |
| 2.3.2 小鼠体征变化的记录 |
| 2.3.3 小鼠外周血的采集 |
| 2.3.4 小鼠外周血血常规的测定 |
| 2.3.5 外周血T淋巴细胞亚群的流式检测 |
| 2.3.6 补肾回阳方给药 |
| 2.3.7 补肾回阳方治疗后样本的采集与检测 |
| 2.3.7.1 摘眼球采血 |
| 2.3.7.2 血细胞分析 |
| 2.3.7.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 2.3.7.4 心脏采血 |
| 2.3.7.5 脾细胞和骨髓细胞的制备 |
| 2.3.7.6 脾细胞和骨髓细胞的T淋巴细胞亚群检测 |
| 2.3.8 DC细胞的体外诱导培养 |
| 2.3.8.1 分离外周血单核细胞 |
| 2.3.8.2 体外细胞因子诱导培养DC |
| 2.3.8.3 DC细胞的流式鉴定 |
| 2.4 补肾回阳方物质分析 |
| 2.4.1 高效液相色谱条件 |
| 2.4.2 质谱条件 |
| 2.5 新型小分子抗白细胞细胞的筛选 |
| 2.5.1 白血病细胞细胞系复苏 |
| 2.5.2 小分子的作用浓度 |
| 2.6 数据统计方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 肾阳虚模型小鼠的鉴定 |
| 3.1.1 造模后小鼠形态的变化 |
| 3.1.2 外周血血常规的变化 |
| 3.1.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 3.1.4 结论 |
| 3.2 补肾回阳方对肾阳虚小鼠模型的影响 |
| 3.2.1 补肾回阳方灌胃后小鼠体重的变化 |
| 3.2.2 补肾回阳方对小鼠外周血血象的影响 |
| 3.2.3 补肾回阳方对小鼠CD3~+细胞占比的影响 |
| 3.2.4 补肾回阳方对肾阳虚小鼠CD3-NK1.1~+细胞占比的影响 |
| 3.2.5 补肾回阳方对小鼠CD3+NK1.1+细胞占比的影响 |
| 3.2.6 补肾回阳方治疗后DC细胞的数量变化 |
| 3.2.7 结论 |
| 3.3 补肾回阳方的高效液相色谱实验结果 |
| 3.3.1 补肾回阳方高效液相色谱分析 |
| 3.3.2 补肾回阳方与标准品的高效液相色谱图对比。 |
| 3.4 补肾回阳方液质色谱联用仪分析 |
| 3.4.1 淫羊藿成分分析 |
| 3.4.2 炙甘草成分分析 |
| 3.4.3 干姜成分分析 |
| 3.4.4 肉桂成分分析 |
| 3.4.5 结论 |
| 3.5 抗白血病细胞小分子的筛选 |
| 3.5.1 小分子对32D细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.2 小分子对KG-1细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.3 小分子对THP-1细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.4 小分子对Jurkat细胞48 小时抑制率检测。 |
| 3.5.5 结论 |
| 第四章 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 硕士研究生期间发表的论文 |
（3）运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词简表 |
| 1 引言 |
| 第一部分 用于AML单细胞研究的微流控芯片的设计与优化 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 芯片的结构和尺寸 |
| 3.2 实验的设置 |
| 3.3 芯片内细胞分布 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 运用微流控芯片在单细胞水平研究AML免疫治疗的异质性 |
| 5 材料与方法 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 6 结果 |
| 6.1 本课题中OT-I_OVA细胞体系的选择与验证 |
| 6.2 在微流控芯片上研究T细胞免疫突触形成的异质性 |
| 6.3 T细胞与靶细胞的初始距离对T细胞细胞毒性的影响 |
| 6.4 T细胞与癌细胞的初始比例对T细胞杀伤效率的影响 |
| 7 讨论 |
| 第三部分 免疫检查点(PD-1/PD-L1)抑制在单细胞水平对AML免疫治疗的影响 |
| 8 材料与方法 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 方法 |
| 9 结果 |
| 9.1 免疫检查点(PD-1)抑制后,T细胞杀伤效率的评估 |
| 9.2 免疫检查点(PD-1)抑制对单个T细胞杀伤能力的影响 |
| 9.3 免疫检查点(PD-1)抑制对单个白血病细胞死亡时间的影响 |
| 10 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 AML患者的免疫机制及治疗进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（4）巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 巨噬细胞与肿瘤免疫治疗相关进展 |
| 一、巨噬细胞来源和功能分型 |
| 二、目前的肿瘤相关的巨噬细胞 |
| 三、TAM在肿瘤治疗中的作用与治疗策略 |
| 第二节 人源化PDX小鼠肿瘤模型研究进展 |
| 一、国内外研究现状发展趋势评述 |
| 二、人源化鼠的模型建立方法 |
| 三、人源化PDX小鼠模型研究与应用 |
| 第三节 中药猪苓研究进展 |
| 一、化学成分研究 |
| 二、现代药理作用研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究 |
| 第一部分 猪苓多糖对人巨噬细胞的形态及抗肿瘤作用的影响 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果分析 |
| 四、小结 |
| 第二部分 卡介苗增强THP-1 源巨噬细胞的抗膀胱癌作用及其机制 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第三部分 卡介苗(BCG)在膀胱癌NOD /scid~(IL2Rg -/-) (NSI)小鼠模型中通过靶向巨噬细胞的免疫治疗研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第二节 人源化肿瘤小鼠模型的建立与Atezolizumab免疫治疗评价 |
| 第一部分 人源化膀胱癌CDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 第二部分 人源化膀胱癌PDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校发表论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 一、EOC 的生物标志物 |
| 二、筛查策略 |
| 三、治疗 |
| 四、小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DDP 联合 CIK 细胞对卵巢癌细胞株 SKOV-3 的杀伤效应 |
| 第一章 材料与方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 氟尿嘧啶联合 CIK 细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究 |
| 第一章 材料和方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 化疗联合 CIK 细胞治疗卵巢癌的临床观察 |
| 第一章 资料与方法 |
| 第二章 临床病例资料结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一：CIK 细胞过继免疫治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二：协同刺激分子 B7-H4 在卵巢癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三：miRNA 与卵巢癌 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（6）DC对同源CIK细胞生物学活性及抗急性白血病细胞作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献回顾 |
| 一.研究意义 |
| 1. DC细胞 |
| 1.1 DC细胞的生物学特性 |
| 1.2 DC细胞的作用机制 |
| 1.3 DC细胞与肿瘤疫苗 |
| 2. CIK细胞 |
| 2.1 CIK细胞的生物学特性 |
| 2.2 CIK细胞的作用机制 |
| 2.3 CIK细胞抗肿瘤特点 |
| 3. DC细胞与CIK细胞之间的相互作用 |
| 3.1 DC细胞对CIK细胞杀伤肿瘤细胞作用的影响 |
| 3.2 DC细胞对CIK细胞的作用 |
| 3.3 CIK细胞对DC细胞的影响 |
| 3.4 DC细胞与CIK细胞共同作用 |
| 4. 生物治疗 |
| 4.1 基因治疗 |
| 4.2 生物反应调节剂治疗 |
| 4.3 体细胞治疗 |
| 4.3.1 DC细胞的杀瘤作用 |
| 4.3.2 LAK细胞的杀瘤作用 |
| 4.3.3 CIK细胞的杀瘤作用 |
| 第二章 实验部分 |
| 一.材料与方法 |
| 1. 实验前的清洗和消毒 |
| 1.1 清洗液的配制 |
| 1.2 玻璃器材的清洗 |
| 1.3 塑料器材的清洗 |
| 2. 主要试剂的配制及来源 |
| 2.1 RPMI 1640培养液 |
| 2.2 四甲倡氮唑盐 |
| 2.3 FBS |
| 2.4 细胞因子 |
| 2.5 其他试剂 |
| 3. 主要仪器 |
| 4. 靶细胞来源 |
| 4.1 细胞的制备 |
| 4.2 细胞的复苏 |
| 5. DC细胞的体外培养 |
| 6. CIK细胞的培养扩增 |
| 7. DC细胞与CIK细胞共培养 |
| 8. 细胞毒活性的测定 |
| 9. 细胞免疫表型的分析 |
| 10. 细胞因子检测 |
| 10.1 IFN-r检测前的准备工作 |
| 10.2 操作步骤 |
| 10.3 结果判定 |
| 10.4 IL-12检测前的准备 |
| 10.5 操作步骤 |
| 10.6 结果判定 |
| 11. 统计学处理 |
| 二.结果 |
| 1. CIK细胞与DC-CIK细胞增殖能力观察 |
| 2. 细胞表型的分析 |
| 2.1 DC细胞的形态观察及表型检测 |
| 2.2 DC细胞-CIK细胞免疫表型 |
| 3. 细胞毒性检测 |
| 4. 细胞因子的测定 |
| 三.讨论 |
| 1. CIK细胞与DC-CIK细胞增殖能力 |
| 2. CIK细胞与DC-CIK细胞表型 |
| 3. CIK细胞与DC-CIK细胞杀伤作用 |
| 4. CIK细胞与DC-CIK细胞因子水平 |
| 四.结论 |
| 第三章.总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）细胞因子诱导的杀伤细胞体外生物活性和杀瘤机制的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分:细胞因子诱导的杀伤细胞体外生物活性的研究 |
| 一、研究材料 |
| 二、研究方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:LFA-1/ICAM-1介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外杀瘤机制的研究 |
| 一、研究材料 |
| 二、研究方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:T-bet介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外杀瘤机制的研究 |
| 一、研究材料 |
| 二、研究方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 全文缩略词中英文对照 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）IL-2/抗IL-2抗体复合物体外诱导扩增外周血和骨髓CD56+淋巴细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.0 细胞系种类和来源 |
| 2.0 主要试剂 |
| 3.0 实验仪器 |
| 4.0 实验方法和步骤 |
| 5.0 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 1.0 诱导过程中细胞形态观察 |
| 2.0 诱导过程中免疫表型及扩增倍数分析 |
| 3.0 细胞杀伤活性测定 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）CD3和CD28双刺激活化的健康人外周血T淋巴细胞与胃泌素拮抗剂合用对结直肠癌细胞杀伤作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士学位期间发表的论着 |
| 致谢 |
（10）CD3AK细胞的研究进展（论文提纲范文）
| 1 CD3AK细胞的超微结构 |
| 2 CD3AK细胞的来源与制备 |
| 3 CD3AK细胞的表型分析 |
| 4 CD3AK细胞的作用机制 |
| 5 CD3AK治疗肿瘤的特点 |
| 6 CD3AK细胞治疗的适应症 |
| 7 CD3AK细胞的治疗原则和注意事项 |
| 7.1 注重心理护理 |
| 7.2 CD3AK细胞输注过程要加以护理 |
| 8 CD3AK肿瘤细胞在人体肿瘤中的研究 |
| 8.1 CD3AK与结肠癌 |
| 8.2 CD3AK与膀胱癌 |
| 8.3 CD3AK与肝癌 |
| 8.4 CD3AK与胃癌 |
| 8.5 CD3AK与癌性胸腹腔积液 |
| 8.6 CD3AK与白血病 |
| 8.7 CD3AK与其它肿瘤 |
| 9 CD3AK治疗存在的不足 |
| 10 展望 |
四、探讨胎脾LAK细胞对不同的T淋巴白血病细胞的杀伤作用（论文参考文献）
- [1]新型磁性纳米粒子在杀伤性T细胞分离中的应用[D]. 王丹阳. 哈尔滨工业大学, 2020(01)
- [2]补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选[D]. 李增政. 昆明理工大学, 2020(05)
- [3]运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用[D]. 涂宏蕾. 武汉大学, 2020(07)
- [4]巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价[D]. 谭庆龙. 广州中医药大学, 2018(01)
- [5]化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察[D]. 徐梅. 苏州大学, 2014(04)
- [6]DC对同源CIK细胞生物学活性及抗急性白血病细胞作用的研究[D]. 李玲. 西北大学, 2010(10)
- [7]细胞因子诱导的杀伤细胞体外生物活性和杀瘤机制的研究[D]. 刘苗. 华中科技大学, 2010(11)
- [8]IL-2/抗IL-2抗体复合物体外诱导扩增外周血和骨髓CD56+淋巴细胞的实验研究[D]. 任维凤. 青岛大学, 2009(10)
- [9]CD3和CD28双刺激活化的健康人外周血T淋巴细胞与胃泌素拮抗剂合用对结直肠癌细胞杀伤作用的研究[D]. 方军. 第四军医大学, 2007(04)
- [10]CD3AK细胞的研究进展[J]. 叶子,师建国,张希国. 现代肿瘤医学, 2006(08)
标签：肿瘤论文; 肿瘤免疫论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 急性髓性白血病论文; 细胞免疫论文;