一、人细小病毒B19主要抗原片段的表达及临床初步应用（论文文献综述）
邵婷[1]（2021）在《猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究》文中提出猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是一种自主复制型单股负链DNA病毒,其复制完全依赖于宿主细胞的复制酶系统。PPV基因组主要包含两个开放性阅读框（Open reading frame,ORFs）ORF1和ORF2,ORF1编码非结构蛋白NS1、NS2和NS3,ORF2编码结构蛋白VP1和VP2。其中,VP2是病毒最重要的结构蛋白,占病毒衣壳组分的90%以上,是PPV最主要的免疫原性蛋白,能够刺激机体产生免疫反应,并且在病毒复制过程中发挥重要作用。微小染色体维持蛋白3（Minichromosome maintenance protein 3,MCM3）是MCM2～7复合物的组成亚基之一,参与了调控MCM复合物的组装,并与细胞DNA复制起始位点结合,从而影响细胞DNA的复制。还有研究报道,MCM复合物参与调控腺联病毒、疱疹病毒以及人细小病毒等多种病毒的复制过程。本实验室前期研究发现,在PPV感染过程中,PPV VP2通过与MCM3互作招募MCM3至病毒复制起始位点,促进病毒的复制。然而,PPV VP2是如何劫持MCM3促进自身复制的机制迄今尚不清楚。本研究拟首先制备VP2和NS1的多克隆抗体。然后,通过real-time PCR检测PPV感染PK-15细胞后病毒和细胞DNA的复制水平,通过Co-IP和Ch IP试验检测PPV感染PK-15细胞后MCM3与组蛋白H3的结合能力以及MCM3与细胞DNA复制起始位点的结合能力,研究PPV感染对宿主细胞DNA和自身复制的影响。最后,检测PPV感染对PK-15细胞MCM3表达及磷酸化水平的影响,确定MCM3磷酸化位点及调控MCM3磷酸化的关键病毒蛋白;检测MCM3磷酸化对VP2与MCM3的互作、MCM3与组蛋白H3的互作以及对PPV复制的影响。研究结果旨在阐明PPV VP2劫持MCM3促进自身复制的机制,为进一步探索PPV的致病机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.扩增并纯化得到PPV病毒粒子。构建NS1特异性片段（1395 nt～1986 nt）ns1s的原核表达载体p ET-32a-ns1s,经表达纯化得到NS1S重组蛋白。分别用纯化的PPV病毒粒子和NS1S重组蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制备出鼠抗PPV VP2和NS1的多克隆抗体,间接ELISA和western blotting检测结果显示,鼠抗PPV VP2和NS1多克隆抗体效价均为1:256000,并且能够很好的识别原核/真核表达的PPV VP2、NS1重组蛋白以及PPV感染PK-15细胞内源性PPV VP2和NS1。2.以1 MOI PPV感染PK-15细胞,在感染0、12、24 h后real-time PCR检测PPV和细胞DNA复制水平的变化,结果显示,随着感染时间的延长,PPV病毒拷贝数显着升高（P<0.05）,宿主细胞DNA拷贝数显着降低（P<0.05）。Co-IP和Ch IP检测PPV感染后MCM3与组蛋白H3的结合情况以及MCM3与细胞DNA复制起始位点Lamin b2prom以及dhfr prom的结合情况,Co-IP结果显示,与Mock对照组相比,PPV感染组MCM3与组蛋白H3的结合能力显着降低（P<0.05）;Ch IP结果显示,与Mock对照组相比,PPV感染组MCM3和细胞DNA复制起始位点Lamin b2 prom以及dhfr prom的结合能力显着降低（P<0.05）。3.以1 MOI PPV感染PK-15细胞,在感染0、12、24、36 h后western blotting检测MCM3的表达及磷酸化水平的变化,结果显示,随着PPV感染时间的延长,MCM3总蛋白的表达无明显变化（p>0.05）,MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平显着降低（P<0.05）。重组质粒pCI-Flag-ns1、pCI-His-vp2分别转染PK-15细胞,在转染0、12、24、36 h后western blotting检测MCM3的表达及磷酸化水平的变化,结果显示,随着转染时间的延长,NS1重组质粒转染组中MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平显着降低（P<0.05）;而VP2重组质粒转染组中MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平无明显变化（P>0.05）。用重组质粒pCI-His-vp2与pCI-neo或与pCI-Flag-ns1共转染PK-15细胞,Co-IP结果显示,与pCI-His-vp2和pCI-neo共转染组相比,pCI-Flag-ns1和pCI-His-vp2共转染组中VP2与MCM3结合能力显着增加（P<0.05）。用重组质粒pCI-Flag-ns1转染PK-15细胞,Co-IP结果显示,与pCI-neo空载体转染组相比,pCI-Flag-ns1转染组中MCM3与组蛋白H3的结合能力显着降低（P<0.05）。最后构建过表达Flag-MCM3T 160A重组蛋白的PK-15细胞,1 MOI PPV感染野生型PK-15细胞、PK-15MCM3细胞和PK-15MCM3T160A细胞,在感染后24 h检测病毒粒子拷贝数、TCID50以及PPV VP2的表达,结果显示,与野生型PK-15细胞感染组相比,PK-15MCM3细胞感染组和PK-15MCM3T160A细胞感染组病毒粒子拷贝数和TCID50均显着升高（P<0.05）,同时,PPV VP2的表达也显着升高（P<0.05）;与PK-15MCM3细胞感染组相比,PK-15MCM3T160A细胞感染组病毒粒子拷贝数和TCID50均显着升高（P<0.05）,同时,PPV VP2的表达也显着升高（P<0.05）。本研究成功制备出鼠抗PPV VP2和NS1的多克隆抗体。发现PPV感染PK-15细胞后随着感染时间的延长,PPV复制水平显着升高,而细胞DNA复制水平却显着降低,MCM3与组蛋白H3及细胞DNA复制起始位点的结合能力显着降低。发现PPV NS1是PPV感染抑制MCM3 160位苏氨酸磷酸化的关键病毒蛋白,并且MCM3磷酸化降低促进了VP2与MCM3的互作、抑制了MCM3与组蛋白H3的互作。构建了MCM3T160A过表达细胞系,并命名为PK-15MCM3T160A细胞,发现了MCM3 160位苏氨酸磷酸化位点的突变显着促进了PPV的复制。上述研究结果阐明了PPV VP2劫持MCM3促进自身复制的分子机制,为进一步探索PPV的致病机制提供理论依据。
韩聪[2]（2020）在《宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究》文中提出猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显着升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高（96.3%）。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高（98.2%）。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高（90.9%）。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异（p>0.05）,而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显着高于对照组（p<0.05）。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显着低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数（p<0.05）。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序（5’TTCTCTGAA3’）,该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆（PCV2-MDS）不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链（负链）的探针（RFP）和靶向病毒基因组模板链（正链）的探针（CP）阳性细胞数量都显着降低（p<0.05）;荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显着低于野生型PCV2感染细胞（p<0.05）。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株（PCV2-Nm A）感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显着降低（p<0.05）。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显着增加（p<0.05）,48 h进一步增加（p<0.01）,DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显着降低（p<0.05）。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着降低（p<0.01）。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15（PKV）发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显着增加（p<0.05）,并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着升高（p<0.05）。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）,且病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.01）。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显着下降（p<0.01）。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显着降低（p<0.01）。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显着降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显着低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显着降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。
赵宏敬[3]（2019）在《东北虎源细小病毒间接ELISA方法的建立及FPV对凋亡通路的影响》文中研究指明东北虎源细小病毒是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleucopenia virus,FPV）引起的一种急性和致死性极高的传染病。又称猫泛白细胞减少症、猫瘟热病毒、猫细小病毒、猫传染性肠炎病毒。在自然条件下,可感染熊、虎、水貂、豹等多种食肉类动物,该病发病过程急、患病过程短、传染性和死亡率较高。FPV的爆发在很大程度上对特种经济动物以及野生动物造成威胁,因此控制FPV在我国的流行、诊断和预防具有重要的意义本研究以黑龙江省某虎林园的东北虎粪便为研究对象,该虎具有出血性肠炎,精神萎靡等症状。通过病毒分离鉴定、动物回归试验及分子生物学检测等方法,证明东北虎的发病原是东北虎源细小病毒,命名为FPV-HER-NEFU。细小病毒NS1蛋白在病毒的复制和转录过程中起重要作用。研究NS1基因对细小病毒的生物学特性及诊断预防等方面研究具有指导意义。本研究对分离的东北虎源细小病毒NS1全长基因进行克隆,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析和构建分子遗传进化树。成功扩增2007bp靶基因并连接到表达载体pGEX-6P-1中以构建重组表达载体pGEX-FPV-NS1。将阳性重组质粒转化到大肠杆菌感受态Rosetta（DE3）中并用IPTG诱导。获得的可溶性蛋白质为102.6kDa,具有良好的免疫原性。我们使用该重组蛋白作为诊断抗原,建立细小病毒的间接ELISA检测方法。通过方针滴定法确定最佳条件,包括250ng/孔的抗原浓度,1:100的血清稀释度和5%脱脂乳作为封闭液,二抗浓度为1:8000,底物作用时间为25分钟。实验结果表明,建立的间接ELISA方法具有较高的特异性和灵敏度。最后,采用 TdT-mediateddUTP Nick-End Labeling（Tunel）荧光染色,DNA 片段化分析,实时荧光定量,Western Blot等方法初步探究FPV对F81细胞凋亡的影响。结果表明FPV感染F81细胞后,细胞的凋亡率随着病毒感染时间的延长而逐渐升高;FPV感染F81细胞能够显着激活细胞内Caspase-9及Caspase-3,而Caspase-8,Fas和FasL的表达无显着变化,该病毒可能通过Caspase-9/-3级联活化来诱导F81细胞发生凋亡,并且FPV感染能够上调细胞内促凋亡分子Bax的表达,下调细胞内的抑凋亡分子Bcl-2的表达。综上所述,本研究成功从东北虎粪便中分离出一株细小病毒FPV-HER-NEFU毒株,通过克隆测序获得了其主要ORF序列并进行生物信息学分析;并以表达的pGEX-FPV-NS1蛋白为抗原,建立了猫科血清抗体的间接ELISA检测方法。本研究将有助于分析我国虎源细小病毒的分子流行情况和遗传规律,为筛选虎源细小病毒疫苗株及其诊断奠定基础。并初步探究FPV对F81细胞凋亡的影响,为进一步研究FPV感染对宿主细胞的致病机制提供理论依据,同时也为其它病毒的研究提供新思路。
钟亚迪[4]（2018）在《血源性人细小病毒的分子流行病学分析与人细小病毒B19非结构蛋白功能研究》文中研究指明人细小病毒B19（Human parvovirus B19,B19V）和人细小病毒4（Human parvovirus 4,PARV4）可以感染人类,且可经血液及血液制品传播。我国捐献血液/血浆时未对其中的B19V和PARV4进行检验,我国血液制品企业在生产血液制品时也未对它们进行筛查,且常规的病毒去除/灭活技术难以有效地将人细小病毒去除/灭活。血源性人细小病毒（B19V和PARV4）的存在对我国捐献的血液/血浆和我国血液制品的使用存在着不可忽视的安全隐患。因此,B19V和PARV4对临床用血和血液制品的潜在威胁越来越引起人们的关注。为了更好地保障我国临床用血和血液制品的病毒安全性,我们有必要对我国献血/献浆人群中的B19V和PARV4进行分子流行病学分析。因此,在本研究的第一部分,我们使用B19V-PARV4双重核酸检测体系对我国西安地区3200例单人份献血者血浆和我国某血液制品企业54份混合原料血浆进行了B19V和PARV4的核酸检测。为了解B19V不同基因型的分布状况,本研究基于B19V基因组中NS1-VP1u区的核苷酸序列或基因组近全长序列进行克隆测序后,经多重序列比对,最后基于此NS1-VP1u区的核苷酸序列或基因组近全长序列进行了系统发育分析,对B19V核酸阳性血浆样品进行了毒株的基因分型。结果显示,在我国西安地区3200例单人份献血者血浆中,B19V核酸阳性的样品有12份,总阳性率为0.38%;而PARV4核酸阳性的样品有4份,总阳性率为0.13%。B19V核酸阳性样品中有4份样品鉴定为1a亚型,2份样品鉴定为1b亚型。在我国某血液制品企业54份混合原料血浆中,B19V核酸阳性的样品有5份,总阳性率为9.26%;而PARV4核酸阳性样品有11份,总阳性率为20.37%。B19V核酸阳性样品中有1份样品成功进行了基因组近全长克隆,其基因型鉴定为1b亚型。B19V感染宿主细胞并造成细胞损害或引起宿主细胞死亡。当宿主细胞的自噬水平提高时,被B19V感染的宿主细胞更容易存活。鉴于被B19V感染的细胞存在此种现象,我们认为对B19V的蛋白功能进行细胞自噬方面的研究是有必要的。多数病毒在感染细胞后,会在宿主细胞的内质网内合成大量的病毒蛋白,引起细胞内质网应激。内质网应激可能与细胞自噬存在一定的联系。因此在本研究的第二部分,我们进行了B19V蛋白在诱导细胞自噬和内质网应激方面的初步探索。我们通过分子克隆和细胞转染技术使UT7/Epo-S1细胞中表达B19V的非结构蛋白X和7.5kDa。然后,通过LC3B-Ⅱ的转化分析和研究膜型LC3B在自噬小体膜上的聚集来鉴定细胞自噬的诱导情况。结果显示非结构蛋白7.5kDa可以诱导UT7/Epo-S1细胞自噬,而X蛋白没有这种效果。这表明在B19V诱导宿主细胞自噬的分子机制中,非结构蛋白7.5kDa可能发挥着重要的作用。通过免疫印迹分析了转染细胞中的内质网应激相关蛋白Bip和CHOP的表达情况,结果显示非结构蛋白X和7.5k Da的存在不能使UT7/Epo-S1细胞中Bip蛋白和CHOP蛋白的表达发生显着地上调。这表明非结构蛋白X和7.5kDa不能诱导UT7/Epo-S1细胞产生内质网应激的效应。综上所述,本研究内容分成两部分。第一部分为我国献血/献浆人群中人细小病毒B19和人细小病毒4的分子流行病学分析,并对其中存在的B19V进行了基因型鉴定。这部分研究工作有助于我们了解B19V和PARV4在我国的流行状况和B19V不同基因型在我国的分布状况,并为更好地保障我国血液制品的病毒安全性提供必要的基础性数据。第二部分为人细小病毒B19非结构蛋白7.5kDa和X在诱导细胞自噬和内质网应激方面的功能研究,对阐明B19V感染细胞的分子机制有一定的参考和借鉴意义。
贾俊婷[5]（2017）在《血源性人细小病毒核酸检测体系建立与人细小病毒B19分子特性分析》文中研究表明血液制品的病毒安全性一直是倍受关注的热点问题。随着输血传播病毒筛查技术以及病毒灭活/去除技术的发展应用,人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）及丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）等对血液制品安全的威胁已极大降低。人细小病毒B19（human parvovirus B19,B19病毒）和人细小病毒4（human parvovirus4,PARV4）成为了新的威胁血液制品安全性的病原体,近年来日益引起人们的关注。为降低B19病毒经血液制品传播的潜在风险,国际组织及发达国家均采取了一系列监控措施,建议/要求在血液制品生产过程中使用B19病毒核酸扩增检测技术（nucleic acid amplification technology,NAT）作为在线控制措施,保证用于血液制品生产的混合原料血浆中B19病毒载量不高于104 IU/m L。PARV4因其生物学特性、理化特性等与B19病毒高度相似而引起关注,其也有可能通过血液制品输注途径传播,但国外尚未制定相关监控措施及标准。我国目前对于原料血浆中细小病毒的监控尚无任何相关文件和技术指导原则,对于献血/献浆人群中细小病毒的携带情况以及原料血浆中的污染状况缺乏足够的基础性数据,也没有对国内现有毒株特性进行系统分析。根据以上研究背景,结合我国实际情况,本研究主要进行了以下几方面工作:（1）人细小病毒B19通用核酸检测体系中竞争性内标的优化与评价在前期建立的基于实时荧光定量PCR技术（fluorescence-based quantitative real-time PCR,qPCR）的B19病毒通用核酸检测体系基础上,对竞争性内标的构建方法进行优化。将竞争性内标的扩增片段克隆到M13mp18噬菌体载体中,转染XL1-Blue感受态细胞获得了噬菌体蛋白包裹单链DNA的竞争性噬菌体内标M13mp18-IC,并确定了该内标在血浆样品中的最佳添加浓度为10 copies/μL。最后对添加内标的B19病毒检测体系分别进行了敏感性、特异性、重复性和准确性评价。结果显示,B19病毒通用核酸检测体系的定量下限可达10 copies/μL,即可对病毒载量低至492 IU/mL的血浆中B19病毒核酸进行准确定量;与其他经血传播病毒均无交叉反应;5×1075×101 copies/μL浓度范围内,B19病毒参考品质粒在批内和批间重复实验中各浓度质粒的Cq值变异系数均小于2%,批内和批间实验中,各浓度B19病毒参考品质粒的拷贝数平均变异系数分别为8.60%和9.17%;1×1081×104 copies/μL浓度范围内,B19病毒通用核酸检测体系具有高度准确性（斜率=1.005）。本研究建立的B19病毒通用核酸检测体系,既有良好的敏感性、特异性、重复性和准确性,又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所导致的假阴性检测结果,可用于将来对血液制品生产用混合原料血浆的B19病毒NAT筛查,对于保障我国血液制品安全性具有重要意义。此外,此检测体系还可应用于B19病毒感染的早期诊断,为下一步B19病毒诊断试剂盒的研发奠定了基础。（2）人细小病毒B19-人细小病毒4双重核酸检测体系的建立与评价首先分别合成B19病毒、PARV4的通用检测引物与探针,根据辅助噬菌体M13K07序列设计和合成非竞争性内标的检测引物与探针,并合成或构建B19病毒、PARV4和非竞争性内标的参考品质粒。然后分别对B19病毒和PARV4的qPCR的退火温度、探针浓度和引物浓度以及反应体系中MgCl2+浓度等进行优化,确定了最佳反应体系和条件。确定非竞争性内标在血浆样品中的最佳添加浓度（2.5 copies/μL）后,对双重核酸检测体系分别进行了敏感性、特异性和重复性评价。结果显示B19病毒和PARV4检测下限均可达5 copies/μL;与其他经血传播病毒均无交叉反应;5×1065×101 copies/μL浓度范围内,B19病毒和PARV4参考品质粒在批内和批间重复实验中各浓度质粒的Cq值变异系数均小于2%;批内实验中,B19病毒和PARV4各浓度参考品质粒拷贝数的平均变异系数分别为4.74%和5.97%,批间实验中平均变异系数分别为8.22%和12.29%。本研究建立的B19病毒-PARV4双重核酸检测体系,既有较高的敏感性、特异性和重复性,又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所导致的假阴性检测结果。为进行我国献血/献浆人群中B19病毒与PARV4的核酸检测奠定了基础。（3）我国献血/献浆人群中血源性人细小病毒的检测应用本研究建立的B19病毒-PARV4双重核酸检测体系,对我国北京地区和西安地区共计1151份单人份献血员血浆进行B19病毒和PARV4核酸检测。结果显示,共有5份单人份血浆为B19病毒核酸阳性,总阳性率为0.43%,病毒载量为6.80×1021.38×105 copies/m L;其中西安地区B19病毒DNA阳性率为0.3%（3/1000）,北京地区阳性率为1.32%（2/151）;而所有血浆均为PARV4核酸阴性。应用本研究建立的B19病毒通用核酸检测体系,对我国三家不同血液制品企业的共计235份混合原料血浆样品进行了B19病毒核酸检测。结果显示,169份（169/235,71.91%）样品存在B19病毒污染,病毒载量为5.18×1021.05×109IU/m L;其中115份样品（115/169,68.05%）的B19病毒核酸阳性的样品病毒载量高于104 IU/mL。结果表明,本研究中献血人群的B19病毒和PARV4核酸阳性率和病毒载量均较低。但混合原料血浆中B19病毒的污染率和污染程度相对较高,使得血液制品存在传播B19病毒的潜在风险,因此建议我国血液制品企业对原料血浆进行B19病毒NAT筛查,对于保障血液制品的病毒安全性具有重要意义。（4）我国献血/浆人群中人细小病毒B19分子特性分析对123份B19病毒核酸阳性血浆样品进行了B19病毒NS1-VP1u区的克隆和测序,与GenBank上的B19病毒参考序列多重比对后,进行系统发育分析和重组分析。系统发育分析结果显示,在我国至少有3种亚型（1a、1b和3b）的B19病毒传播,其中1a亚型占主导地位（78/123,63.41%）,其次为3b亚型（21/123,17.07%）和1b亚型（12/123,9.76%）,没有B19病毒2型的存在。重组分析结果显示,有4个序列为B19病毒1a/3b重组型,5个序列中没有检测到重组信号,可能为B19病毒新的亚型。此外,对部分样品中B19病毒近全长序列进行了克隆与测序,与GenBank上的B19病毒参考序列多重比对后,进行系统发育分析。共获得6个B19病毒近全长序列,系统发育分析显示其均为B19病毒1a亚型。本研究首次发现在我国至少有3种亚型B19病毒（1a、1b和3b）的流行,并首次发现B19病毒1a/3b重组型和可能新基因亚型的存在。有助于了解不同基因型B19病毒在我国的流行情况及其进化趋势,对于B19病毒感染的预防和控制以及保障输血和血液制品病毒安全性具有重要意义。
邱琪[6]（2017）在《20092015年山西省发热伴出疹症候群病毒性病原谱的构成及人细小病毒B19的基因特征》文中研究说明研究背景:发热伴出疹症候群（Rash and fever syndrome,RFS）是以发热（≥37.5℃,持续一天以上）和出疹（全身或局部皮肤或粘膜）为主要临床表现的一系列疾病的总称。引起RFS的病原体包括病毒和细菌两大类,以病毒为主,包括肠道病毒（enterovirus,EV）、麻疹病毒（measles virus,MV）、风疹病毒（rubella virus,RV）、水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus,VZV）、人细小病毒B 19（human parvovirus virus B19,HPV B19）和登革病毒（dengue virus,DENV）等。其中,人细小病毒B19是常见的人类致病病原体之一,可导致传染性红斑、关节病、暂时性再障危象及异常妊娠等一系列疾病,人群感染率高,且可引起暴发,对公共健康产生了不可忽视的威胁。借助“十一五”和“十二五”国家科技重大专项,我国大部分省市已建立起RFS网络实验室监测技术平台,监测结果为阐明我国RFS病原谱的构成和动态变化提供了一定的本底资料,但整体上我国对于RFS的病原学和相关疾病的研究尚不系统,且监测质量和敏感性还有待提高。尤其是国内目前对于B19病毒感染的流行病学及基因特征的研究相对局限,缺乏科学、系统、详实的报道。研究目的:本研究首次对2009～2015年山西省RFS监测病例资料进行分析,以揭示其六种病毒（肠道病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、人细小病毒B19和登革病毒）感染阳性病例中各病原的构成情况及流行规律。同时采用Nest-PCR（Nest-polymerase chain reaction）方法对收集到的山西省B19病毒核酸阳性临床标本进行基因定型和基因变异变迁规律的分析,为建立敏感特异的B19病毒核酸检测方法、阐明B19病毒的疾病负担和防控相关疾病提供重要的科学数据。材料与方法:1.数据来源:通过传染病监测技术平台信息管理系统获得2009～2015年山西省发热伴出疹症候群监测病例和标本的相关信息。2.流行病学研究:采用Excel 2013和SPSS 22软件对原始数据进行整理和流行病学描述,分析阳性病例中六种病毒性病原的构成及流行规律。3.标本来源:山西省疾病预防控制中心和太原市传染病医院采集的B19病毒感染病例的临床标本。4.序列测定:提取病毒核酸,通过Nest-PCR方法进行B19病毒基因的扩增和序列测定。5.生物信息分析:采用Sequencher、Mega和Bioedit软件进行序列的整理和基因特征分析。研究结果:1.2009年1月1日至2015年12月31日,山西省疾病预防控制中心（CDC）和太原市传染病医院两家哨点单位共监测到六种病毒感染的RFS疑似病例850例,采集临床标本1114份,病例和标本的阳性检出率分别为59.57%（504/846）和 58.88%（653/1109）。2.504例RFS阳性病例中,六种病毒性病原体的构成依次为麻疹病毒阳性192例（38.10%）,肠道病毒阳性93例（18.45%）,风疹病毒阳性87例（17.26%）,水痘-带状疱疹病毒阳性83例（16.47%）,人细小病毒B19阳性48例（9.52%）,登革病毒阳性1例（0.20%）。3.RFS阳性病例以15岁以下的儿童和学生为主,不同性别之间六种病毒的总检出率无统计学差异,但不同年龄组的病原谱略有差别。RFS病例分布呈现出明显的季节性,阳性病例集中在3～8月。4.基于Nest-PCR方法对山西省B19病毒感染病例相应的临床标本进行B19病毒核酸的检测,结果显示4份为阳性,阳性率为5.97%。经基因测序和亲缘性关系分析,4株病毒均属于B19病毒1a亚型。5.本研究获得一株山西B19病毒（SX-T1）近全长基因组序列,长4983bp,未发现核苷酸或氨基酸的插入和缺失。SX-T1在全基因组编码区水平上与各参考株间的核苷酸同源性为86.7%～99.3%,其中,与1型参考株间的核苷酸同源性最高,2型次之,3型相对较低。尤其与中国B19病毒HZ1株的核苷酸同源性最高,达99.3%,二者在编码NS、VP1、X、VP2和11KD蛋白的基因序列上分别有1、3、0、1和1个氨基酸发生变异。而与B19病毒1a基因亚型的原型株Wi相比,二者的核苷酸同源性为98.3%,在编码蛋白的基因序列上分别有6、7、2、2和3个氨基酸发生变异。研究结论:1.从整体上看,2009～2015年山西省RFS六种病毒的病原谱构成以麻疹病毒、肠道病毒和风疹病毒为主。RFS的发病呈现出明显的季节性,病例多发生在3～8月。山西省RFS阳性病例集中在15岁以下,男女检出率差异无统计学意义,因此,应将儿童和青少年作为RFS重点人群并加强监测和保护。此外,对于20岁以上年龄组人群应加强成人麻疹的预防和控制。2.本研究以Nest-PCR技术为基础进行了山西省RFS病例临床标本中B19病毒的基因测序和定型,提高了 B19病毒的实验室检测水平,为建立敏感特异的B19病毒核酸检测方法积累了技术经验。3.本研究发现引起山西省RFS病例感染的B19病毒均为1a亚型,但不排除其他基因型的存在。同时,获得了山西省B19病毒SX-T1的近全长基因组序列,并对中国流行的B19病毒进行全基因组特征及变异变迁的分析,掌握了山西省流行的B19病毒基因特征的本底资料,为阐明B19病毒的疾病负担和防控相关疾病提供了重要的科学数据。
徐焕洲[7]（2017）在《人细小病毒B19类染色质结构调控基因组复制及RNA加工》文中研究指明人类细小病毒B19（B19V）属于细小病毒科的嗜红细胞属,基因组为单链DNA,全长5.6kb。B19V和人博卡病毒是现今可以感染人类的仅有的两种细小病毒科的病毒。B19V感染主要引起传染性红斑、急性再生障碍性贫血、关节炎等,感染孕妇后可导致胎儿水肿,流产或者死胎。B19V基因组内有两个polyA信号,位于3’端的称为（pA）d,位于第二个内含子内的称为（pA）p。（pA）p直接抑制病毒转录出全长pre-mRNA,在转录后水平与第二个内含子的剪切相互竞争抑制病毒结构蛋白mRNA的生成,而病毒的复制利于启动子通读过（pA）p位点,使用（pA）d位点。病毒基因组的复制和第二个内含子的剪切都影响（pA）p的使用,但是复制如何影响（pA）p的使用还不清楚。细小病毒MVM和腺相关病毒AAV感染敏感细胞后,可以和组蛋白结合,形成类染色质结构,但是类染色质结构有哪些功能还没有相关报道。因此,本研究主要目的是探讨B19V基因组是否可以在细胞内形成类染色质结构,研究B19V基因组甲基化修饰以及类染色质结构对基因复制和RNA加工的影响,进一步揭示基因组复制影响（pA）p使用的分子机制。为了研究B19V基因组DNA是否形成类染色质结构,转染B19V DNA到HEK293T细胞内,分别在12、24、36和48小时提取细胞核,微球菌核酸酶消化后用苯酚-氯仿抽提,同时在这四个时间段提取Hirt DNA,Southern blot检测。结果证实B19V基因组DNA可以在细胞内形成类染色质结构,且类染色质结构的形成早于复制。为了研究病毒染色质的修饰是否影响病毒的复制、转录或转录后加工,我们应用甲基转移酶抑制剂5-Aza-2’-deoxycytidine（DAC）处理转染B19V基因组DNA后的HEK293T细胞,48小时后提取小分子量DNA（Hirt DNA）,利用DpnI消化,用甲基化检测试剂盒处理后进行PCR扩增反应,通过测序我们发现,DAC处理后基因组上特定位点的甲基化修饰被抑制,表明在B19V基因组内存在甲基化修饰位点。用终浓度为20μM的DAC处理转染后的293T细胞,48h后分别提取细胞核、Hirt DNA和总RNA,并用Southern blot和RNA酶保护实验进行检测。结果发现,与DMSO处理组和未处理组比较,DAC明显抑制B19V类染色质结构的形成及基因组的复制。RPA实验证实DAC抑制第二个内含子的剪切,促进（pA）p的使用。为了研究B19V基因组复制影响（pA）p使用的具体机制,分别利用IRES2-eGFP和pBluescript KS II载体构建了基因组5’和3’端一半基因的复制型和非复制型克隆,并在此基础上获得了敲除D1和D2剪切位点的克隆,转染HEK293T细胞,48小时后提取总RNA,RNA酶保护实验进行检测。结果发现B19V基因组的复制主要通过影响第二个内含子的剪切影响（pA）p的使用。本研究证实B19V基因组上存在甲基化修饰,DAC可以使基因组去甲基化,抑制类染色质结构的形成和复制,导致基因组第二个内含子的剪切被抑制,进而影响（pA）p的使用。本研究首次报道了B19V基因组甲基化修饰和类染色质结构影响基因组的复制和RNA转录后加工,揭示了B19V基因组中央poly位点选择性使用的分子调控机制,为B19V的防治提供了理论依据。
董衍明[8]（2013）在《人细小病毒B19非结构蛋白对启动子的调控及其出核转运机制研究》文中指出人细小病毒B19（Human Parvovirus B19, HPV B19）,简称B19病毒,属于细小病毒科（Parvoviridae）,红细胞病毒属（Erythrovirus）,是目前为止仅有的两种能感染人类的细小病毒科成员之一。B19病毒作为一种重要病原,能感染儿童及成年人并引起一系列的疾病,感染孕妇则会导致胎儿贫血、流产及胎儿水肿。随着社会生活水平及人们疾病预防知识的提高,对于该病毒的研究已经越来越受到人们的重视。目前国内对于该病毒的研究主要局限于分子流行病学及其诊断方面,对于该病毒致病机制的分子生物学方面报道较少。本研究选择了B19病毒的非结构蛋白NS1、11kDa、7.5kDa及X蛋白为研究对象,希望通过研究B19病毒非结构蛋白对病毒启动子及细胞内因子启动子的调控作用以及非结构蛋白的出核转运机制,为揭示B19病毒非结构蛋白在病毒侵染细胞途径及其复制中的作用提供理论基础。具体研究内容包括以下两个方面：（1）人细小病毒B19非结构蛋白对p6启动子和细胞内因子启动子的调控作用B19病毒的转录由单一的p6启动子调控,通过选择性的剪切和选择性的多腺苷酸化生成12个病毒mRNA转录物。和其它细小病毒成员一样,p6启动子的活性受细胞内转录因子Spl/3,YY1,hGABP等的调控。本实验中我们通过分析预测,在p6启动子的上游存在三个ATF/CREB结合基序及一个E2F结合位点,该区域对于p6启动子活性的影响还没有相关报道。通过检测绿色荧光蛋白表达和荧光素酶活性定性并定量研究该区域对启动子活性的影响,结果显示预测的ATF/CREB结合位点能够影响p6启动子在Hela细胞内的活性,而潜在的E2F结合位点对p6启动子活性影响不大。同时,通过比较p6启动子、CMV启动子在不同非敏感细胞系中的活性,显示p6启动子在不同非敏感细胞系中均具有较高的活性,但均低于CMV启动子的活性。同时软件预测发现细小病毒科成员均存在潜在的CpG岛,而CpG岛的体外甲基化修饰能抑制p6启动子的活性。由于B19病毒NS1蛋白对p6启动子及某些细胞内基因启动子具有激活的功能,而其它非结构蛋白是否具有类似的功能还未知。我们利用荧光素酶报告检测系统发现11kDa蛋白不能反式激活p6启动子的活性；而x蛋白则如NS1蛋白一样可以上调p6启动子的活性;并且其上调启动子活性的DNA效应元件区域为其3’端78个碱基,即nt.265-343区域（含有3个潜在的ATF/CREB结合位点、1个EBS基序以及一个Spl/3结合位点）,而该区域与NS1蛋白上调p6启动子活性的DNA效应元件区域一致。虽然11kDa蛋白不能上调p6启动子的活性,却能显着上调细胞内TNF-α,IL6,STAT3启动子的活性；进一步的研究发现,11kDa蛋白对IL6启动子活性的上调依赖于NF-κB信号途径,主要通过降解细胞内IκBa,诱导p65入核,进而激活IL6启动子的表达。（?）人细小病毒B19非结构蛋白定位及出核转运机制研究细小病毒成功侵染宿主细胞后,在细胞核内完成病毒基因组的复制、病毒粒子的包装。为了避免宿主细胞凋亡及宿主细胞天然免疫保护反应的影响,细小病毒在长期进化的过程中演化出一种优先机制,即在细胞衰亡之前完成核输出转运。目前大量研究发现,许多病毒的非结构蛋白通过与细胞内出核转运受体蛋白CRM1相互作用,执行自身的核质转运,进而在介导病毒RNA、蛋白质乃至病毒粒子的出核过程中起作用。由于B19病毒NS1及11kDa蛋白的缺失会降低其感染性,并且11kDa蛋白的缺失导致病毒衣壳蛋白的核集聚,因此,我们推测B19病毒非结构蛋白,尤其是11kDa蛋白可能具有介导病毒粒子出核的功能。本实验中我们主要探究了B19病毒的非结构蛋白NSl、11kDa及7.5kDa蛋白的细胞定位及其出核转运机制,发现前两者具有依赖于CRM途径的出核转运过程,同时利用哺乳动物双杂交实验证实NSl及11kDa蛋白能够与CRM1发生相互作用,通过系列的截短及定点突变确定了分别影响其出核转运的关键氨基酸位点。然而对7.5kDa蛋白的研究则发现其细胞质定位不依赖于CRM1途径,并且进一步的细胞组分及激光共聚焦显微镜观察发现,该蛋白主要定位于线粒体中；通过截短及定点突变确定了决定其亚细胞定位的关键氨基酸位点。关于B19病毒非结构蛋白的细胞定位及其出核转运机制的研究,为进一步探究B19病毒非结构蛋白在病毒复制周期尤其是病毒RNA、病毒粒子出核过程中扮演的角色奠定了基础,同时也为抗病毒药物的靶标的开发提供线索。
刘雪莉[9]（2012）在《嵌合腺病毒对人白血病细胞的体外感染及其对人细小病毒B19复制的辅助作用》文中提出白血病是我国最常见的造血系统恶性肿瘤之一,发病率在恶性肿瘤中居前十位,是35岁以下青少年和儿童恶性肿瘤死亡的首位原因,而且发病率每年有递增趋势,成为严重威胁人类健康的恶性疾病之一。目前白血病的治疗已由传统单一肿瘤药物的治疗发展到造血干细胞移植、靶点药物等的治疗,多种治疗方式和手段的综合运用,使白血病得到很大程度的缓解,但药物作用产生的相关毒性、非选择性以及复发难治等问题促使人们研究各种新型的、更具靶向性的生物制剂应用于白血病的治疗,病毒的基因治疗就是其中新兴的方向之一。近年来,病毒的基因治疗在临床应用明显增多,病毒载体临床应用中,有25%是腺病毒,而其中75%用于肿瘤的临床治疗。溶瘤腺病毒又称条件复制型腺病毒（CRAd）,以其能在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞的特性,成为抗肿瘤治疗的一个新策略。针对造血细胞的肿瘤,近些年来有报道将Ad5纤维顶球（fiber）基因替换为Ad35同源基因（Ad5/f35）的溶瘤腺病毒,它增强了对造血肿瘤细胞的感染性和抗肿瘤作用,但它们是基于腺病毒E1B55K蛋白表达缺失实现在肿瘤细胞中的特异性复制,而E1B55kD蛋白表达缺失,会影响腺病毒自身在肿瘤细胞中的复制从而削弱其抗肿瘤作用,因而针对造血细胞的肿瘤仍需开发更具靶向性和强大抗瘤效应的生物制剂。本研究将fiber替换（Ad5/f11p, Ad5的fiber替换为Adllp的同源基因）和启动子替换（端粒酶逆转录酶启动子TERTp,简称为TPE基因,替换内源性的E1A启动子）的靶向转录相结合,构建一株对造血肿瘤细胞敏感,并能在其中高效复制的嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP,通过体外实验我们证实该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo、U937、Jurkat、K562的感染及杀伤作用,从而为进一步开发人白血病治疗的靶向腺病毒载体奠定基础。有关同时携带fl1p和TPE基因的嵌合腺病毒杀伤白血病细胞的研究,目前国内外均未见报道。另外,新近的研究表明腺病毒相关基因对人细小病毒B19的复制有辅助作用,这一辅助作用帮助B19V实现了在非容许细胞293中复制,并且产生了低水平的感染性子代病毒。但在B19V半容许细胞UT-7/Epo-S1中,这一辅助作用并不明显。造成这一结果的原因一方面考虑可能由于腺病毒对人造血肿瘤细胞UT-7/Epo感染效率低,影响腺病毒基因产物的表达,再者,UT-7/Epo细胞属悬浮细胞,质粒转染困难,两方面因素都会影响腺病毒基因对B19病毒复制的辅助作用的表现。因此我们尝试将构建的嵌合腺病毒（既能高效感染造血细胞又能在其中复制）作为人细小病毒B19体外培养的辅助病毒,观察B19在半容许细胞UT-7/Epo中的复制,为其作为细小病毒B19体外拯救和扩增的工具奠定基础。以改造的Ad5嵌合腺病毒为辅助病毒,体外扩增人细小病毒B19,目前国内外均未见有报道。本文研究内容包括以下两部分：第一部分：嵌合腺病毒对人白血病细胞的体外感染第二部分：嵌合腺病毒对人细小病毒B19复制的辅助作用。第一部分：嵌合腺病毒对人白血病细胞的体外感染目的构建携带报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒Ad5f11pTPEGFP,其嵌合有Adllp的纤毛蛋白基因（简称f11p基因）,并且E1A的启动子替换为端粒酶逆转录酶启动子（promoter of telomerase reverse transcriptase, TERTp,简称为TPE基因）。通过体外实验证实该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo、U937、Jurkat、K562的感染及杀伤作用,为进一步开发人白血病治疗的靶向腺病毒载体奠定基础。方法构建嵌合腺病毒质粒Ad5f11pTPEGFP,脂质体介导其转染至HEK293细胞包装出嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP,经酶切和PCR鉴定正确后,扩增并纯化得到滴度较高的嵌合腺病毒。以空载体病毒Ad5GFP作为对照,将纯化的嵌合腺病毒感染人白血病细胞,通过荧光倒置显微镜、流式细胞术、透射电镜和病毒滴度分析病毒对细胞的感染性和复制活性；通过CCK-8（cell counting kit-8）法检测病毒对人白血病细胞株的生长抑制率反映该病毒对细胞的杀伤作用；通过AnnexinV-APC/7-AAD（别藻蓝素标记的膜联蛋白v和7-氨基放线菌素D）双染法检测嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP感染所诱导的早期细胞凋亡,并进一步采用Western Blot法检测嵌合腺病毒感染白血病细胞株后PARP（多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶,poly-（adenosinediphosphate ribose）polymerase）蛋白的裂解。结果（1）成功构建并制备了同时携带f11p和TPE基因的嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP它能有效感染人白血病细胞,并呈时间依赖性和剂量依赖性；以相同剂量MOI=50感染人白血病细胞株,嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP产生的病毒滴度较空载体腺病毒Ad5GFP至少高2个数量级；（2）以空载体腺病毒Ad5GFP为对照,嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP对人白血病细胞株表现出明显的细胞毒性作用,呈时间依赖和剂量依赖；（3）以相同剂量MOI=50感染人白血病细胞株,嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP诱导细胞发生凋亡的细胞比例较空载体腺病毒Ad5GFP高,并且检测到随时间逐渐增加的裂解的PARP蛋白。结论成功构建并制备一株对人白血病细胞株敏感,且能在其中高效复制的嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP; Ad5f11pTPEGFP能有效感染多种白血病细胞,并能显着抑制细胞生长,诱导细胞凋亡。本研究为进一步开发人白血病治疗的靶向腺病毒载体奠定了基础。第二部分嵌合腺病毒对人细小病毒B19复制的辅助作用目的克隆全长B19基因组,以构建的嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP为辅助病毒,在B19半容许细胞UT-7/Epo中由B19基因组拯救出有活性的B19病毒。方法先通过分子克隆技术分段获得B19ITR各片段,通过低温转化感受态细菌Sure2将ITR各片段依次连接,然后再与ITR以外B19基因组各片段连接获得全长的B19基因组,通过酶切和测序鉴定全长B19基因组克隆；以嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP为辅助病毒,使用电穿孔（Electroporation）方法将B19基因组转染至UT-7/Epo细胞。通过荧光定量PCR检测不同时间点（Oh、24h、8h、72h）B19基因组的拷贝数；从质粒载体上切下B19基因组克隆至腺病毒穿梭质粒,通过与Adeasy/f11p骨架质粒同源重组构建携带B19基因组的重组腺病毒质粒,将其转染293细胞,拯救重组腺病毒,以荧光定量PCR监测重组Ad5基因组和B19基因组的拷贝数。结果成功构建包含全长B19基因组的重组质粒pMD-B19N105,以嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP为辅助病毒,转染pMD-B19N105至UT-7/Epo细胞,未观察到B19基因组拷贝数的显着增加；成功构建携带一半ITR的B19基因组腺病毒质粒pAd5fl1p-h1B19,转染293细胞,拯救的Ad5腺病毒基因组拷贝数未见明显增加,而B19基因组拷贝数减少。结论克隆了全长B19基因组。质粒转染的方式在UT-7/Epo细胞未能拯救出B19病毒；而以腺病毒质粒为载体的方式将B19基因组转染293细胞,观察到腺病毒的复制和增殖受到抑制,B19基因组丢失。本研究为进一步改进腺病毒载体,为其作为细小病毒B19体外拯救和扩增的工具奠定了基础。
梁莉莉,叶祥忠,周厚清,张娜,李良红,李益民,刘岩峰[10]（2012）在《人细小病毒B19结构蛋白VP1的表达及IgM间接ELISA检测方法的初步建立》文中指出目的原核表达并纯化人细小病毒B19（Human parvovirus B19,HPVB19）结构蛋白VP1,并初步建立IgM ELISA检测方法,用于B19病毒感染的检测。方法采用PCR法从B19 IgM阳性血清中扩增VP1基因片段,亚克隆至表达载体pGEX-2T中,构建重组表达质粒pGEX-2T-VP1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经疏水纯化后进行Western blot分析。以纯化的重组蛋白包被酶标板,建立IgM间接ELISA检测方法,确定Cut-off值,并进行初步应用。结果重组原核表达质粒经双酶切鉴定构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量为61 000,主要以包涵体形式存在,纯度为96%,可与B19 IgG阳性血清发生特异性反应;建立的间接ELISA方法 Cut-off值为0.102,灵敏度为91.7%,特异性为98.6%,与对照试剂检测结果的符合率为97.1%;用建立的方法检测4 500份健康献血者及39份类风湿性关节炎患者血清的B19 IgM抗体,阳性率分别为1.04%和10.3%。结论原核表达并纯化了HPVB19 VP1蛋白,并初步建立了IgM间接ELISA检测方法,为B19病毒感染的早期诊断提供了参考。
二、人细小病毒B19主要抗原片段的表达及临床初步应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人细小病毒B19主要抗原片段的表达及临床初步应用（论文提纲范文）
（1）猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRAC T |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 细小病毒宿主互作蛋白研究进展 |
| 1.1 细小病毒概述 |
| 1.1.1 细小病毒分子生物学特征 |
| 1.1.2 细小病毒感染与复制机制 |
| 1.2 细小病毒宿主互作蛋白研究进展 |
| 1.2.1 STAT5 |
| 1.2.2 p53 |
| 1.2.3 细胞生长受体因子结合蛋白2 |
| 1.2.4 磷脂酰肌醇3-激酶样激酶家族蛋白 |
| 1.2.5 MCM家族蛋白 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪细小病毒VP2 和NS1 多克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株、毒株和菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PPV增殖 |
| 2.2.2 PPV鉴定 |
| 2.2.3 PPV病毒粒子的纯化及鉴定 |
| 2.2.4 PPV滴度测定 |
| 2.2.5 重组质粒p ET-32a-ns1s的构建与鉴定 |
| 2.2.6 NS1S重组蛋白的原核表达及鉴定 |
| 2.2.7 NS1S重组蛋白的纯化效果鉴定 |
| 2.2.8 VP2 与NS1 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.9 VP2 与NS1 多克隆抗体效价检测 |
| 2.2.10 VP2 与NS1 多克隆抗体特异性检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PPV的增殖与鉴定 |
| 2.3.2 PPV病毒粒子纯化效果检测 |
| 2.3.3 PPV滴度测定 |
| 2.3.4 NS1 抗原表位预测 |
| 2.3.5 重组质粒p ET-32a-ns1s的构建与鉴定 |
| 2.3.6 NS1S重组蛋白的表达鉴定 |
| 2.3.7 NS1S重组蛋白最佳诱导表达条件的筛选 |
| 2.3.8 NS1S重组蛋白的纯化 |
| 2.3.9 VP2 与NS1 多克隆抗体的效价检测 |
| 2.3.10 VP2 与NS1 多克隆抗体的特异性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪细小病毒感染对宿主细胞DNA和自身复制影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株和毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Real-time PCR检测PPV拷贝数 |
| 3.2.2 Real-time PCR检测PPV感染后细胞DN A复制水平的变化 |
| 3.2.3 Co-IP检测PPV感染后MCM3 与组蛋白H3 的互作 |
| 3.2.4 Ch IP检测PPV感染对MCM3 与细胞DNA复制起始位点结合的影响 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PPV感染PK-15 细胞后病毒拷贝数显着增加 |
| 3.3.2 PPV感染显着抑制PK-15 细胞DNA的复制 |
| 3.3.3 PPV感染显着降低MCM3 与组蛋白H3 的互作 |
| 3.3.4 PPV感染显着降低MCM3 与宿主细胞DNA复制起始位点的结合 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猪细小病毒VP2 与宿主蛋白MCM3 对病毒复制的影响及机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞株、毒株和菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 westernblotting检测PPV感染对PK-15 细胞MCM3 表达及磷酸化的影响 |
| 4.2.2 筛选PPV感染过程中调控MCM3 磷酸化的病毒蛋白 |
| 4.2.3 Co-IP检测MCM3 磷酸化对VP2与MCM3 互作的影响 |
| 4.2.4 Co-IP检测MCM3 磷酸化对MCM3 与组蛋白H3 互作影响 |
| 4.2.5 MCM3 160 位点突变质粒pCI-Flag-mcm3~(T160A)的构建及鉴定 |
| 4.2.6 过表达MCM3及MCM3~(T160A)的PK-15 细胞系的构建和鉴定 |
| 4.2.7 过表达MCM3及MCM3~(T160A)的PK-15 细胞系的细胞活性检测 |
| 4.2.8 Real-time PCR检测病毒DNA拷贝数 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PPV感染显着降低PK-15 细胞MCM3 160 位苏氨酸的磷酸化 |
| 4.3.2 NS1 能够显着抑制MCM3 160 位苏氨酸的磷酸化 |
| 4.3.3 MCM3 磷酸化水平降低显着促进VP2与MCM3 的互作 |
| 4.3.4 MCM3 磷酸化水平降低显着抑制MCM3与组蛋白H3 的互作 |
| 4.3.5 MCM3 160 位苏氨酸位点突变质粒pCI-Flag-mcm3~(T160A)的构建及鉴定 |
| 4.3.6 过表达MCM3及MCM3T160A的 PK-15 细胞系的构建 |
| 4.3.7 MCM3 160 位苏氨酸突变能够促进PPV的复制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 NPM蛋白家族 |
| 1.1.2 Hsp家族成员 |
| 1.1.3 组蛋白分子伴侣 |
| 1.1.4 MCM家族成员 |
| 1.1.5 STAT家族成员 |
| 1.1.6 TRIM家族成员 |
| 1.1.7 波形蛋白 |
| 1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制 |
| 1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制 |
| 1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 2.1.2 载体及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对 |
| 2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 试验动物及分组设计 |
| 2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测 |
| 2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.5 STAT5序列比对分析 |
| 2.3.6 NPM1序列比对分析 |
| 2.3.7 DNAJB6序列比对分析 |
| 2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化 |
| 2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及菌种 |
| 3.1.2 载体、主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 stat5原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响 |
| 3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域 |
| 3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作 |
| 3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作 |
| 3.3.4 干扰stat5 表达显着抑制 PCV2 的复制 |
| 3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定 |
| 3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域 |
| 3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 4.1.2 载体和主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响 |
| 4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响 |
| 4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1 |
| 4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建 |
| 4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作 |
| 4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平 |
| 4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响 |
| 4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定 |
| 4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作 |
| 4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域 |
| 4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 5.1.2 载体和主要试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数 |
| 5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况 |
| 5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建 |
| 5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建 |
| 5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定 |
| 5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体 |
| 5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平 |
| 5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达 |
| 5.2.13 抑制试验 |
| 5.2.14 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达 |
| 5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位 |
| 5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作 |
| 5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域 |
| 5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定 |
| 5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制 |
| 5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制 |
| 5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成 |
| 5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）东北虎源细小病毒间接ELISA方法的建立及FPV对凋亡通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 细小病毒科概述 |
| 1.1.1 细小病毒结构形态与理化性质 |
| 1.1.2 细小病毒的培养特性及基因组结构 |
| 1.2 FPV的研究进展 |
| 1.3 FPV编码蛋白 |
| 1.4 流行病学情况 |
| 1.5 FPV的诊断研究 |
| 1.5.1 电镜与免疫电镜观察 |
| 1.5.2 病毒的分离与鉴定 |
| 1.5.3 血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验 |
| 1.5.4 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.6 细胞凋亡的研究进展 |
| 1.6.1 细胞凋亡的概述 |
| 1.6.2 病毒感染与细胞凋亡的关系 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料的来源 |
| 2.1.2 实验动物及细胞株 |
| 2.1.3 主要试验试剂及抗体 |
| 2.1.4 主要试验仪器 |
| 2.2 东北虎源细小病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1 对粪便样品进行PCR鉴定 |
| 2.2.2 病毒的分离培养 |
| 2.2.3 病毒毒力的检测 |
| 2.2.4 病毒理化性质的测定 |
| 2.2.5 血凝试验 |
| 2.2.6 病毒PCR检测 |
| 2.2.7 动物回归实验 |
| 2.3 东北虎源细胞病毒主要ORF的克隆 |
| 2.3.1 主要ORF的克隆 |
| 2.4 东北虎源细小病毒分离株的生物信息学分析 |
| 2.4.1 主要ORF序列的分析 |
| 2.4.2 NS1基因序列校对后ORF预测 |
| 2.4.3 NS1蛋白的氨基酸序列分析 |
| 2.4.4 NS1蛋白磷酸化位点预测分析 |
| 2.5 东北虎源细小病毒NS1蛋白的原核表达和纯化 |
| 2.5.1 NS1基因的引物设计及合成 |
| 2.5.2 PCR扩增基因及琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.5.3 重组表达载体的构建及鉴定 |
| 2.5.4 NS1蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.6 兔抗东北虎源细小病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.6.1 兔抗东北虎源细小病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.6.2 兔抗东北虎源细小病毒NS1蛋白多克隆抗体效价的测定 |
| 2.6.3 NS1表达产物的Western-Blotting分析 |
| 2.7 东北虎源细小病毒NS1蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 2.7.1 方阵滴定法确定NS1蛋白最佳包被浓度及血清最佳稀释度 |
| 2.7.2 最佳封闭液 |
| 2.7.3 酶标二抗最佳工作浓度 |
| 2.7.4 酶标二抗最佳作用时间 |
| 2.7.5 底物最佳作用时间 |
| 2.7.6 ELISA阴阳性临界点的确定和结果判断方法 |
| 2.7.7 特异性、敏感性试验 |
| 2.7.8 重复性试验 |
| 2.7.9 间接ELISA方法对临床种猫科动物抗体的检测 |
| 2.8 东北虎源细小病毒诱导F81细胞凋亡 |
| 2.8.1 FPV感染F81细胞 |
| 2.8.2 Tunel细胞凋亡检测 |
| 2.8.3 DNA片段化分析 |
| 2.8.4 荧光定量的方法检测凋亡相关因子的变化 |
| 2.8.5 Western方法检测凋亡相关因子的变化 |
| 2.8.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 东北虎源细小病毒鉴定结果 |
| 3.1.1 粪便样品PCR检测结果 |
| 3.1.2 细胞传代分离病毒结果 |
| 3.1.3 病毒毒力的测定 |
| 3.1.4 病毒的电镜结果 |
| 3.1.5 理化性质试验结果 |
| 3.1.6 病毒的血凝试验结果 |
| 3.1.7 PCR检测及测序结果 |
| 3.2 动物回归试验结果 |
| 3.2.1 幼猫的临床症状 |
| 3.2.2 幼猫组织PCR检测结果 |
| 3.2.3 幼猫组织病理学变化 |
| 3.3 东北虎源细小病毒主要ORF克隆结果 |
| 3.3.1 分离毒株扩增主要ORF的PCR结果 |
| 3.3.2 分离株主要ORF序列分析 |
| 3.3.3 FPV-HER-NEFU分离株NS1蛋白氨基酸同源性分析 |
| 3.3.4 东北虎源细小病毒分离株NS1基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.4 东北虎源细小病毒NS1基因的克隆 |
| 3.4.1 东北虎源NS1基因的扩增 |
| 3.5 东北虎源细小病毒NS1基因的原核表达 |
| 3.5.1 东北虎源NS1基因原核表达载体的构建和鉴定 |
| 3.5.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.5.3 重组蛋白NS1的纯化 |
| 3.6 兔抗东北虎源细小病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.7 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.8 间接ELISA方法的建立 |
| 3.8.1 ELISA抗原最佳包被浓度及血清稀释度的筛选 |
| 3.8.2 最佳封闭液的确定 |
| 3.8.3 酶标二抗的最佳工作浓度的确定 |
| 3.8.4 酶标二抗最佳工作时间的确定 |
| 3.8.5 底物最佳作用时间的确定 |
| 3.8.6 ELISA阴阳性临界点的确定及结果判断方法 |
| 3.8.7 ELISA方法的特异性分析 |
| 3.8.8 ELISA方法的敏感性分析 |
| 3.8.9 重复性分析 |
| 3.8.10 间接ELISA方法对临床种猫科动物抗体的检测 |
| 3.9 东北虎源细小病毒诱导F81细胞凋亡 |
| 3.9.1 Tunel细胞凋亡检测 |
| 3.9.2 DNA片段化分析 |
| 3.9.3 FPV感染对F81细胞凋亡的影响 |
| 3.9.4 FPV感染对F81细胞内Caspase及Fas表达的影响 |
| 3.9.5 FPV感染F81细胞对线粒体通路相关基因表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 东北虎源细胞病毒的分离和鉴定 |
| 4.2 动物实验分析 |
| 4.3 东北虎源细小病毒NS1蛋白的表达 |
| 4.4 间接ELISA方法的初步建立 |
| 4.5 东北虎源FPV对F81细胞凋亡的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）血源性人细小病毒的分子流行病学分析与人细小病毒B19非结构蛋白功能研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 我国献血/献浆人群中人细小病毒B19和人细小病毒4的分子流行病学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 血浆样品的准备与处理 |
| 1.3 血浆样品中病毒核酸的提取 |
| 1.4 B19V-PARV4双重核酸检测体系对血浆样品的检测 |
| 1.5 人细小病毒B19核酸阳性样品中目的片段的TA克隆 |
| 1.6 目的片段的核苷酸序列测定 |
| 1.7 核苷酸序列多重比对及系统发育分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 单人份献血者血浆中B19V和PARV4的核酸阳性率 |
| 2.2 混合原料血浆中B19V和PARV4的核酸阳性率 |
| 2.3 B19V的NS1-VP1u区基因片段的克隆及鉴定 |
| 2.4 B19V基因组近全长的克隆及鉴定 |
| 2.5 核苷酸序列测定结果 |
| 2.6 单人份献血者血浆中B19V的基因型鉴定 |
| 2.7 混合原料血浆中B19V的基因型鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原料血浆中B19V的核酸阳性率高于其在单人份献血者血浆 |
| 3.2 原料血浆中PARV4的核酸阳性率高于其在单人份献血者血浆 |
| 3.3 关于B19V核酸阳性样品中的毒株基因型鉴定 |
| 4 小结 |
| 第二部分 人细小病毒B19非结构蛋白X和7.5kDa的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 UT7/Epo-S1细胞的常规培养 |
| 1.3 工具质粒pEGFP-hLC3B的构建与鉴定 |
| 1.4 真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa和pcDNA3.1(+)-HA-X的构建与鉴定 |
| 1.5 重组质粒转染UT7/Epo-S1细胞 |
| 1.6 免疫印迹检测蛋白的表达 |
| 1.7 激光共聚焦显微镜观察荧光自噬小体 |
| 2 结果 |
| 2.1 常规培养的UT7/Epo-S1细胞 |
| 2.2 工具质粒pEGFP-hLC3B的构建与鉴定结果 |
| 2.3 pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa和pcDNA3.1(+)-HA-X的构建与鉴定结果 |
| 2.4 自噬体膜标记蛋白和内质网应激相关蛋白的免疫印迹检测 |
| 2.5 荧光自噬小体的观察 |
| 3 讨论 |
| 3.1 非结构蛋白7.5kDa和X对内质网应激和细胞自噬影响的初步探索 |
| 3.2 关于本研究中观察荧光自噬小体的研究方法 |
| 3.3 关于鉴定非结构蛋白7.5kDa诱导细胞自噬的待完善处 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 与学位论文密切相关的文献综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间取得的学术性成果(全文) |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）血源性人细小病毒核酸检测体系建立与人细小病毒B19分子特性分析（论文提纲范文）
| 缩略词表（Abbreviation） |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 人细小病毒B19通用核酸检测体系中竞争性内标的优化与评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 定量PCR检测引物与探针的合成 |
| 1.3 参考品质粒的制备 |
| 1.4 定量PCR反应体系和反应条件 |
| 1.5 竞争性噬菌体内标的构建及鉴定 |
| 1.6 竞争性噬菌体内标添加量的确定 |
| 1.7 B19病毒核酸检测体系标准曲线的建立 |
| 1.8 B19病毒国际标准品标定参考品质粒 |
| 1.9 方法学评价 |
| 1.10 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 竞争性噬菌体内标的构建及鉴定 |
| 2.2 竞争性噬菌体内标添加量的确定 |
| 2.3 B19病毒核酸检测体系标准曲线的建立 |
| 2.4 B19病毒国际标准品标定结果 |
| 2.5 方法学评价 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 人细小病毒B19-人细小病毒4双重核酸检测体系的建立与评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物与探针的合成 |
| 1.3 参考品质粒的构建与制备 |
| 1.4 定量PCR反应体系和反应条件的优化 |
| 1.5 B19病毒-PARV4双重定量PCR检测下限的初步确定 |
| 1.6 非竞争性噬菌体内标添加量的确定 |
| 1.7 B19病毒-PARV4双重核酸检测体系标准曲线的建立 |
| 1.8 方法学评价 |
| 1.9 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 参考品质粒的构建及鉴定 |
| 2.2 定量PCR反应体系和反应条件的确定 |
| 2.3 B19病毒-PARV4双重定量PCR检测下限的初步确定 |
| 2.4 非竞争性噬菌体内标添加量的确定 |
| 2.5 B19病毒-PARV4双重核酸检测体系标准曲线的建立 |
| 2.6 方法学评价 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 我国献血/献浆人群中血源性人细小病毒的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 血浆样品的预处理 |
| 1.3 血浆样品核酸的提取 |
| 1.4 实时荧光定量PCR检测样品中病毒核酸 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 单人份血浆样品中B19病毒和PARV4核酸阳性率 |
| 2.2 单人份血浆样品中B19病毒载量 |
| 2.3 混合原料血浆样品中B19病毒核酸阳性率 |
| 2.4 混合原料血浆样品中B19病毒载量 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 我国献血/献浆人群中人细小病毒B19分子特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.3 PCR扩增 |
| 1.4 PCR产物克隆与鉴定 |
| 1.5 序列测定与系统发育分析 |
| 1.6 重组分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 B19病毒NS1-VP1u区序列克隆与鉴定结果 |
| 2.2 B19病毒NS1-VP1u区序列序列测定与系统发育分析 |
| 2.3 B19病毒3型NS1-VP1u区序列的核苷酸差异分析 |
| 2.4 B19病毒NS1-VP1u区序列重组分析结果 |
| 2.5 B19病毒重组型序列的进一步分析 |
| 2.6 B19病毒近全长序列克隆与鉴定结果 |
| 2.7 B19病毒近全长序列测定与初步分析 |
| 2.8 B19病毒近全长序列系统发育分析及基因型鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）20092015年山西省发热伴出疹症候群病毒性病原谱的构成及人细小病毒B19的基因特征（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一部分 2009～2015年山西省发热伴出疹症候群病毒病原谱的构成及流行特征 |
| 前言 |
| 1.概述 |
| 2.发热伴出疹症候群主要病毒性病原 |
| 3.研究目的和意义 |
| 材料与方法 |
| 1.监测流程 |
| 2.质量控制 |
| 3.数据收集和统计分析 |
| 结果 |
| 1.病毒阳性检出率 |
| 2.发热伴出疹症候群病毒病原谱 |
| 3.时间分布 |
| 4.人群分布 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 山西省人细小病毒B19的基因特征 |
| 前言 |
| 1.概述 |
| 2.病原学特征 |
| 3.疾病谱 |
| 4.流行病学特征 |
| 5.研究目的和意义 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.序列整理和分子生物学信息分析 |
| 结果 |
| 1.标本鉴定 |
| 2.序列测定及基因定型 |
| 3.B19病毒全基因组序列分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）人细小病毒B19类染色质结构调控基因组复制及RNA加工（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 人细小病毒B19概述 |
| 1.2 B19V病原学特性 |
| 1.2.1 B19V结构和基因组特点 |
| 1.2.2 B19V基因编码蛋白的功能 |
| 1.2.2.1 非结构蛋白NS1 |
| 1.2.2.2 衣壳蛋白（VP1/VP2） |
| 1.2.2.3 11kDa蛋白和 7.5kDa蛋白 |
| 1.2.3 B19V生物学特性 |
| 1.2.4 B19V的流行病学 |
| 1.2.5 B19V的致病机制 |
| 1.2.6 B19V感染的临床表现 |
| 1.2.6.1 红细胞再生障碍性贫血 |
| 1.2.6.2 传染性红斑 |
| 1.2.6.3 关节病 |
| 1.2.6.4 肢端瘀斑综合征 |
| 1.2.6.5 血管性紫癜 |
| 1.2.6.6 孕妇感染B19V |
| 1.2.6.7 其他疾病 |
| 1.2.7 B19V感染的诊断 |
| 1.2.8 治疗 |
| 1.3 染色质（体） |
| 1.3.1 染色体与染色质 |
| 1.3.1.1 真核生物染色质结构 |
| 1.3.1.2 病毒染色质结构 |
| 1.3.2 染色质结构的功能 |
| 1.3.2.1 染色质结构与病毒感染 |
| 1.3.2.2 染色质结构与基因表达 |
| 1.3.2.3 染色质与mRNA可变剪切 |
| 1.3.3 细小病毒类染色质结构 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 本研究的主要内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、细胞系 |
| 2.1.2 质粒、载体 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要工作液的配制 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 主要实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 RNA酶保护实验相关质粒的制备 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 质粒的构建 |
| 3.1.1 核酸酶保护实验探针制备 |
| 3.1.2 B19V复制型质粒的构建 |
| 3.2 B19V基因组可以在HEK293T细胞内复制和转录 |
| 3.2.1 B19V基因组的制备 |
| 3.2.2 B19V感染性克隆可以在HEK293T细胞内复制和转录 |
| 3.3 B19V基因组可以在HEK293T细胞内形成类染色质结构 |
| 3.4 B19V基因组DNA类染色质结构形成早于复制 |
| 3.5 B19V基因组DNA存在甲基化位点 |
| 3.6 B19基因组DNA染色质状态调控基因的表达 |
| 3.6.1 MTT检测 5-Aza-2’-deoxycytidine（DAC）对细胞的毒性 |
| 3.6.2 DAC影响B19V类染色质结构的形成 |
| 3.6.3 DAC影响B19V基因组的复制 |
| 3.7 B19基因组DNA的复制间接影响(pA)p的使用 |
| 3.7.1 B19V复制通过影响内含子的剪切而影响(pA)p的使用 |
| 3.7.2 B19V复制间接影响(pA)p的使用 |
| 3.8 DAC影响B19V RNA的转录后加工 |
| 3.9 DAC影响B19V (pA)p的使用 |
| 第4章 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 本文所用的引物信息 |
| 作者简历 |
（8）人细小病毒B19非结构蛋白对启动子的调控及其出核转运机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 细小病毒科简介及其分类 |
| 1.2 细小病毒亚科主要成员及其特点 |
| 1.2.1 细小病毒属 |
| 1.2.2 红细胞病毒属 |
| 1.2.3 依赖病毒属 |
| 1.2.4 阿留申水貂疾病病毒属 |
| 1.2.5 博卡病毒属 |
| 1.3 人细小病毒B19 |
| 1.3.1 人细小病毒B19简介及其分类 |
| 1.4 人细小病毒B19感染的流行病学及传播机制 |
| 1.5 人细小病毒B19感染的临床症状与疾病 |
| 1.6 人细小病毒B19感染的临床检测与诊断 |
| 1.7 人细小病毒B19分子生物学研究进展 |
| 1.7.1 人细小病毒B19病毒粒子及基因组基本特征 |
| 1.7.2 人细小病毒B19复制与转录机制 |
| 1.7.3 人细小病毒B19非结构蛋白与结构蛋白功能研究进展 |
| 1.8 人细小病毒B19的细胞趋性与病毒复制周期 |
| 1.9 细小病毒非结构蛋白核质转运机制及其在病毒复制周期中的作用 |
| 1.9.1 蛋白质核质转运概述 |
| 1.9.2 核输出受体蛋白CRM1 |
| 1.9.3 蛋白质的出核转运机制 |
| 1.9.4 细小病毒非结构蛋白的核质转运及其在病毒复制周期中的作用 |
| 1.10 研究目的和意义 |
| 2. 人细小病毒B19非结构蛋白对P6启动子和细胞内因子启动子的调控作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株、细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及引物 |
| 2.1.3 载体构建所需材料及所受馈赠载体 |
| 2.1.4 重组载体的构建 |
| 2.1.5 细胞培养与DNA转染 |
| 2.1.6 B19病毒非结构蛋白在Hela细胞内的表达 |
| 2.1.7 启动子荧光素酶活性测定 |
| 2.1.8 非结构蛋白对启动子的调控 |
| 2.1.9 体外甲基化 |
| 2.1.10 主要仪器设备 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 p6启动子区转录因子结合位点分析与预测 |
| 2.2.2 全长p6启动子及其截短突变体的构建及鉴定 |
| 2.2.3 B19病毒全长p6及p44启动子在不同非敏感细胞系中活性检测 |
| 2.2.4 B19病毒p6启动子及其截短体在Hela细胞内活性比较 |
| 2.2.5 CpG岛甲基化修饰对p6启动子活性的影响 |
| 2.2.6 免疫荧光检测NS1,11kDa,X protein在Hela细胞内的表达 |
| 2.2.7 B19病毒非结构蛋白NS1,11kDa,7.5kDa,X protein对p6启动子调控作用的比较 |
| 2.2.8 B19病毒p6启动子X蛋白DNA效应元件的确定 |
| 2.2.9 B19病毒非结构蛋白11kDa对细胞内因子STAT3,IL6,TNF-α,IFNβ启动子的调控作用 |
| 2.2.10 B19病毒非结构蛋白11kDa对IL6的调控依赖于NF-κB信号通路 |
| 2.3 讨论与结论 |
| 2.3.1 讨论 |
| 2.3.2 结论 |
| 3. 人细小病毒B19非结构蛋白定位及出核转运机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、细胞 |
| 3.1.2 主要试剂及引物 |
| 3.1.3 载体构建所需材料及所受馈赠载体 |
| 3.1.4 重组载体的构建 |
| 3.1.5 细胞培养与DNA转染 |
| 3.1.6 LMB处理 |
| 3.1.7 免疫荧光检测及激光共聚焦显微镜观察 |
| 3.1.8 哺乳动物双杂交系统检测11kDa,NS1蛋白与CRM1之间的相互作用 |
| 3.1.9 细胞线粒体蛋白的提取 |
| 3.1.10 Western blot检测 |
| 3.1.11 分子生物学分析软件 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 非结构蛋白11kDa细胞定位及其出核转运分子机制 |
| 3.2.2 人细小病毒非结构蛋白NS1出核转运分子机制 |
| 3.2.3 人细小病毒非结构蛋白7.5kDa细胞定位机制 |
| 3.3 讨论与结论 |
| 3.3.1 讨论 |
| 3.3.2 结论 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文、科研成果在校期间发表的论文、科研成果 |
| 致谢 |
（9）嵌合腺病毒对人白血病细胞的体外感染及其对人细小病毒B19复制的辅助作用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 嵌合腺病毒对人白血病细胞的体外感染 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 嵌合腺病毒对人细小病毒B19复制的辅助作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）人细小病毒B19结构蛋白VP1的表达及IgM间接ELISA检测方法的初步建立（论文提纲范文）
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 引物设计及合成 |
| 1.5 VP1基因的扩增 |
| 1.6 目的基因的克隆 |
| 1.7 重组表达质粒的构建 |
| 1.8 目的基因的诱导表达及表达产物的纯化 |
| 1.9 纯化重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 1.1 0 间接ELISA检测方法的建立 |
| 1.1 1 Cut-off值的确定 |
| 1.1 2 方法的初步应用 |
| 2. 结果 |
| 2.1 VP1基因扩增产物的鉴定 |
| 2.2 重组克隆和表达质粒的鉴定 |
| 2.3 表达及纯化产物的鉴定 |
| 2.4 纯化蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.5 Cut-off值的确定 |
| 2.6 方法的初步应用 |
| 3. 讨论 |
四、人细小病毒B19主要抗原片段的表达及临床初步应用（论文参考文献）
- [1]猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究[D]. 邵婷. 西北农林科技大学, 2021
- [2]宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究[D]. 韩聪. 西北农林科技大学, 2020
- [3]东北虎源细小病毒间接ELISA方法的建立及FPV对凋亡通路的影响[D]. 赵宏敬. 东北林业大学, 2019(01)
- [4]血源性人细小病毒的分子流行病学分析与人细小病毒B19非结构蛋白功能研究[D]. 钟亚迪. 军事科学院, 2018(12)
- [5]血源性人细小病毒核酸检测体系建立与人细小病毒B19分子特性分析[D]. 贾俊婷. 中国人民解放军军事医学科学院, 2017(11)
- [6]20092015年山西省发热伴出疹症候群病毒性病原谱的构成及人细小病毒B19的基因特征[D]. 邱琪. 中国疾病预防控制中心, 2017(06)
- [7]人细小病毒B19类染色质结构调控基因组复制及RNA加工[D]. 徐焕洲. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2017(09)
- [8]人细小病毒B19非结构蛋白对启动子的调控及其出核转运机制研究[D]. 董衍明. 华中师范大学, 2013(06)
- [9]嵌合腺病毒对人白血病细胞的体外感染及其对人细小病毒B19复制的辅助作用[D]. 刘雪莉. 中国疾病预防控制中心, 2012(04)
- [10]人细小病毒B19结构蛋白VP1的表达及IgM间接ELISA检测方法的初步建立[J]. 梁莉莉,叶祥忠,周厚清,张娜,李良红,李益民,刘岩峰. 中国生物制品学杂志, 2012(03)