一、绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存实验（论文文献综述）
褚博[1]（2021）在《转口蹄疫VP1基因奶山羊体外胚胎生产及冷冻保存》文中研究表明胚胎体外生产和冷冻保存技术在家畜种质资源保存方面有重要应用价值。近年来,随着动物转基因技术研究的不断推进,各种转基因动物育种新材料不断出现,部分转基因动物已经进入安全性评价阶段,转基因动物新品种培育在家畜种业创新领域具有重要应用价值。目前,所有转基因动物育种材料均在封闭性条件下饲养管理,建立一套转基因动物种质材料保存和利用方法,对促进转基因育种研究有重要意义。口蹄疫病毒的抗原表位大部分集中在VP1上,作为主要的免疫原性蛋白激发Th、B细胞产生免疫应答。本实验室课题组前期制备了转口蹄疫VP1基因奶山羊,本研究通过对转基因奶山羊后代羊进行PCR鉴定,筛选出转基因阳性后代,并验证外源基因在转基因公羊精液中的整合情况。利用转基因公羊精液进行体外受精,获得转基因胚胎,同时采用Cryotop玻璃化冷冻技术,通过对早期囊胚冷冻、解冻复苏的效率和继续培养发育后囊胚扩张率来筛选出玻璃化冷冻保护剂组分并进行优化,并对冷冻复苏后的胚胎质量进行检测,对比其与正常胚胎的囊胚总细胞数、滋养层细胞数（TE）、内细胞团数（ICM）和细胞凋亡情况,确定了适合转基因山羊精液体外受精和胚胎冷冻保存条件,用于转基因山羊胚胎资源的保存和利用。获得如下结果:1.对14只转基因奶山羊后代进行颈静脉采血提取山羊血液基因组进行PCR鉴定,其中8只奶山羊确定为转口蹄疫VP1基因奶山羊（OFMDV-VP1）,4只母羊,4只公羊,同时提取4只公羊精液基因组进行鉴定,精液中也整合有外源基因。2.通过电刺激采精法采集转基因公羊精液,利用Percoll法处理精液进行体外受精,获得体外胚胎,并进行PCR鉴定,确定转基因胚胎,继续培养,用于后续试验进行冷冻保存和胚胎移植。3.确定了采用Cryotop法以40%EG+0.5mol/L L?proline作为冷冻保护剂,可用于转基因山羊胚胎的冷冻保存,冷冻解冻后复苏率89.9%,囊胚扩张率74.5%。对比正常胚胎与冷冻解冻复苏胚胎的囊胚细胞总数、TE、ICM和凋亡细胞数,均差异不显着（P>0.05）。用冷冻后复苏的胚胎进行胚胎移植,母羊妊娠率为50%,可用于临床应用,为转基因羊胚胎资源的冷冻保存及生产应用提供帮助。
史振丹[2]（2016）在《CD81在绵羊性腺及精卵上的表达研究》文中指出卵母细胞冷冻在体外胚胎生产技术的研究中尤为突显。但在其冷冻过程中,易受到一系列的损伤。随着分子生物技术的快速发展,研究人员对卵母细胞冷冻损伤的研究逐步转向对其分子机制的探讨,其中跨膜蛋白的变化有可能引起精卵结合和融合异常。CD9是目前鉴定的唯一精卵融合必须的卵子蛋白,并且有相关报道CD81也参与精卵融合。胞间CD81和CD9互作时形成一个复合体,该复合体很可能在精卵互作时起作用。然而,它们在膜融合中的作用仍不清楚。本研究首次采用免疫荧光染色技术检测了不同发育期绵羊卵母细胞冻融前后细胞骨架的变化,CD81在绵羊卵巢组织、睾丸和附睾组织、卵母细胞及精子上的分布；采用实时荧光定量PCR技术,检测了CD81在不同发育期冻融前后的绵羊卵母细胞中：mRNA水平的表达量,并比较分析了不同发育阶段CD81基因mRNA水平的表达差异；利用IVF技术,检测了抗CD81抗体对绵羊精卵结合的影响,及冻融GV期和M Ⅱ期卵母细胞对IVF的影响。本研究得到如下几点结果：1.冷冻对卵母细胞器及细胞骨架的影响结果表明,冷冻后GV期和M Ⅱ期卵母细胞的形态正常率显着低于冷冻前,微丝、微管及核受到不同程度的损伤。说明冷冻保存损伤其结构和细胞骨架,可能影响卵母细胞的后期发育；2.CD81在绵羊卵巢组织、卵母细胞、睾丸和附睾组织及精子上的表达检测结果显示：（1）CD81表达于初级、次级和三级卵泡的卵泡细胞上,并且在卵泡发育成熟时,其在卵丘细胞、颗粒细胞、基膜、内膜细胞和外膜细胞上均表达；（2）CD81在成熟前后卵母细胞上均有表达,但GV期卵母细胞上CD81主要在卵母细胞膜上表达,而MⅡ期卵母细胞上CD81的表达主要在卵母细胞膜和透明带上,并且在透明带上的表达较GV期明显；（3）CD81在绵羊睾丸曲细精管上皮细胞上表达,靠近管腔基部信号更强。附睾头、体假复层纤毛柱状上皮细胞中高柱状纤毛上皮细胞和游离缘的纤毛中均检测到CD81阳性信号。附睾体、尾管腔中检测到CD81阳性信号,且附睾尾管腔内CD81阳性信号明显。CD81于附睾头、体、尾部的基细胞层表达,且在附睾体、尾的基细胞层强表达；（4）CD81强表达于精子的顶体部,其余部位均未检测到CD81蛋白荧光信号；3.CD81在不同发育阶段冷冻的卵母细胞中mRNA表达规律结果显示：新鲜MⅡ期卵母细胞中CD81 mRNA表达量显着高于冷冻MⅡ、新鲜GV和冷冻GV（P<0.01）,冷冻M Ⅱ显着高于新鲜GV和冷冻GV（P<0.01）,新鲜GV与冷冻GV差异不显着（P>0.05）;4.抗CD81抗体和超低温冷冻对精卵结合和融合的影响。卵母细胞与CD81单克隆抗体共孵育处理后的试验结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组（4.2±0.8,30%）明显低于对照组（13±1.22,85%）,差异均显着（P<0.01）。冻融后GV期卵母细胞对IVF的影响结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组（5.8±0.8,45%）明显低于对照组（13±1.22,85%）,差异均显着（P<0.01）。冻融后M Ⅱ期卵母细胞经IVF后试验结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组（7.0±1.0,62%）明显低于对照组（13±1.22,85%）,差异均显着（P<0.01）。并且,冻融后M Ⅱ期和GV期卵母细胞经IVF后每卵黏附精子数和精子穿透率差异显着（P<0.01）。
马媛,权国波,洪琼花[3]（2015）在《羊卵母细胞冷冻保存研究进展》文中指出近年来,绵羊、山羊胚胎工程技术的快速发展致使对卵母细胞的需求量越来越大。此外,作为家畜种质资源保护体系的组成部分,卵母细胞也是保存优秀雌性家畜遗传资源的重要方式之一。然而,作为胚胎生物技术的重要环节,由于其自身特殊的结构功能特点,卵母细胞对低温和冷冻极其敏感,其冷冻保存研究水平远低于胚胎。因此,如何提高冷冻保存卵母细胞质量是低温生物学和胚胎生物技术研究领域的热点和难点。针对目前绵羊、山羊卵母细胞冷冻保存的最新研究进展和存在问题进行综述,同时针对如何进一步提高绵羊、山羊卵母细胞冷冻保存质量提出建议,以期为之后的研究工作提供理论指导。
莫显红[4]（2014）在《内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究》文中进行了进一步梳理生物体细胞内钙稳态对于维持细胞正常机能至关重要。钙稳态受到多种因素的影响,钙稳态失衡可导致细胞内钙浓度异常性升高,即钙超载,从而影响钙信号调控作用,导致细胞及细胞器功能异常,严重时可诱导细胞损伤或凋亡。冷冻保存作为刺激因素可导致卵母细胞内钙稳态失衡,但这种失衡机制及其与冷冻损伤的关系尚不清楚。因此,本研究在玻璃化冷冻保存成熟牛卵母细胞前阻断内质网钙通道,探明介导钙稳态失衡的主要钙通道及其作用机制。此外,本文探讨了LIF（leukemia inhibitory factor,LIF）在牛卵母细胞体外成熟与发育中的调控作用。为提高卵母细胞冷冻保存效率,获得更多高质量体外操作用卵母细胞具有较高的理论意义。在玻璃化冷冻保存卵母细胞前,用内质网Ca2+-ATPase（SERCA）阻断剂毒胡萝卜素（TG）预处理,解冻后的存活率显着降低（p<0.05）;用IP3R特异性的膜渗透性抑制剂10μmol/L2-APB预处理10 min,存活率显着升高。冷冻前用2-APB预处理,解冻后卵母细胞CG异常分布比例（42.40%）显着低于冷冻对照组（51.81%,p<0.05）,胞内GSH含量显着升高,活性氧（ROS）水平显着降低;孤雌激活卵裂率（61.45%vs.87.83%）和囊胚率（25.95%vs.47.31%）显着高于冷冻对照组。玻璃化冷冻保存前用2-APB预处理卵母细胞,解冻后内质网（ER）重组（ER皮质区簇状分布）明显恢复;内质网应激蛋白GRP78和CHOP的表达显着下调;且与细胞凋亡相关蛋白细胞色素C（cytC）,caspase-9及caspase-3的表达量显着降低。在IVM培养液中添加25 ng/mL LIF,分别培养卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）和裸卵（denuded oocytes,DOs）,与对照组相比,核成熟率显着提高（72.53%vs.81.23%;60.59%vs.70.04%）;同时,LIF 可显着提高皮质颗粒（cortical granule,CG）迁移率、胞内谷胱甘肽（GSH）水平及受精相关蛋白CD9的表达。体外受精后,LIF处理组的卵裂率（66.52%vs.76.03%）、囊胚率（25.82%vs.35.35%）和囊胚细胞数（67.52 vs.80.75）均显着提高（p<0.05）。LIF相关信号通路MAPK3/1和JAK/STAT3检测结果显示:MAPK3/1和STAT3磷酸化水平显着升高;用MEK抑制剂U0126处理卵母细胞,仅部分抑制了 LIF诱导的卵母细胞核成熟,但胞质成熟被完全抑制;用JAK/STAT3通路抑制剂JAK inhibitor处理卵母细胞后核成熟和胞质成熟均被完全抑制。本研究分别在IVM、IVC及全程（IVM+IVC）添加LIF检测其对早期胚胎发育的影响。IVM中添加LIF,孤雌激活卵裂率和囊胚率显着高于对照组,全程添加LIF囊胚率（57.19%）最高,且囊胚中多潜能基因POU5F1和NANOG表达量显着高于对照组。综上所述,玻璃化冷冻前用2-APB预处理牛卵母细胞,维持了胞内钙稳态平衡,提高了冷冻解冻后的存活率及卵母细胞的发育能力,降低了内质网应激蛋白及细胞凋亡相关蛋白的表达,可保护卵母细胞免受内质网过度应激引发的钙稳态失衡。此外,LIF通过激活MAPK和JAK/STAT3信号通路,可促进牛卵母细胞核质成熟。
赵驻军,孙树春,田树军[5]（2013）在《玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究》文中研究表明为了提高玻璃化冷冻保存山羊卵母细胞的效果,试验用不含Ca2+的玻璃化冷冻液1[30%乙二醇（EG）]、玻璃化冷冻液2[27.5%EG+2.5%二甲基亚砜（DMSO）]和玻璃化冷冻液3（25%EG+5%DMSO）研究抗冻保护剂DMSO和EG的不同浓度配比对山羊卵母细胞形态正常率、孤雌激活率、体外受精卵裂率及胚胎发育能力的影响。结果表明:山羊卵母细胞经玻璃化冷冻液1,2,3处理后细胞形态正常率（97.1%、97.3%、97.3%）与对照组（100%）相比有所降低,但差异不显着（P>0.05）,且对卵母细胞均不产生具有化学毒性作用的孤雌激活;山羊卵母细胞经3种玻璃化冷冻液冷冻保存后,玻璃化冷冻液2冷冻保存卵母细胞的囊胚率（13.8%）显着高于玻璃化冷冻液1（5.7%）和玻璃化冷冻液3（5.1%）（P<0.05）。说明采用玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞可获得较为理想的效果。
任立坤,刘月琴,张英杰,杨少华,王红娜[6]（2012）在《羊卵母细胞冷冻保存研究进展》文中研究指明哺乳动物卵母细胞冷冻保存不仅对于濒危物种的保存具有重要意义,而且可以对胚胎生物技术的发展、生物资源保护与利用以及人类辅助受精技术的研究等具有重要意义,同时为基础研究提供大量可利用的材料。卵母细胞玻璃化冷冻保存的应用前景非常广阔,利用卵母细胞玻璃化冷冻保存技术建立"卵子库"不仅可以解决目前卵母细胞来源短缺的问题,还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转基因动物生产不受时间和空间的限制,并且代替家畜的活体保种和濒危动物遗传种质
任立坤,刘月琴,张英杰,杨少华,王红娜[7]（2012）在《羊卵母细胞冷冻保存研究进展》文中认为哺乳动物卵母细胞冷冻保存不仅对于濒危物种的保存具有重要意义,而且可以对胚胎生物技术的发展、生物资源保护与利用以及人类辅助受精技术的研究等具有重要意义,同时为基础研究提供大量可利用的材料。卵母细胞玻璃化冷冻保存的应用前景非常广阔,利用卵母细胞玻璃化冷冻保存技术建立"卵子库"不仅可以解决目前卵母细胞来源短缺的问题,还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转基因动物生产不受时间和空间的限制,并且代替家畜的活体保种和濒危动物遗传种质
赵驻军,蔡文涛,温兵强,王志刚[8]（2012）在《羊卵母细胞冷冻保存研究进展》文中认为卵母细胞的冷冻保存在动物科学、临床医学等领域具有重要作用,同时,也可以为核移植、转基因等现代生物技术研究提供丰富的试验材料,使卵母细胞的供给不受时间和空间的限制。本文综述了羊卵母细胞冷冻保存及其损伤机制的研究进展,并指出了其存在的问题和应用前景。
王静,林嘉鹏,石庆华,陈博,汪立芹,赵云程,黄俊成[9]（2011）在《玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响》文中认为为详细了解玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响,分别玻璃化冷冻GV期和IVM期（18、24h）绵羊卵母细胞,解冻后进行体外培养。GV期和IVM期卵母细胞经过冷冻-解冻后,卵裂率（10.37%、23.17%、33.07%）均极显着低于对照组（82.96%,P<0.01）,且冷冻-解冻后的GV期卵母细胞卵裂率极显着低于冷冻-解冻后的IVM期卵母细胞（P<0.01）。本试验利用荧光实时定量PCR技术检测4种母源基因:Gdf9（生长分化因子-9）、Zar1（合子阻泄因子）、Mater（胚胎必要的母体抗原）、Dnmt1（DNA甲基化转移酶1）在不同处理后的绵羊卵母细胞中的mRNA含量。结果表明,4个基因的mRNA在GV期的表达量均高于IVM期的卵母细胞（P<0.01）;经玻璃化冷冻处理后,4个基因的mRNA表达量升高,其中GV期含量最高（P<0.01）。结果提示,绵羊GV或IVM期卵母细胞玻璃化冷冻导致母源基因mRNA表达量升高,可能会对胚胎发育产生负面影响。
莫显红[10]（2011）在《影响绵羊卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素研究》文中进行了进一步梳理卵母细胞玻璃化冷冻保存对于珍稀和濒危种质资源保存、“卵子库”的建立、胚胎生物技术的发展具有重要意义。本实验以绵羊卵母细胞为研究模型,通过比较卵母细胞不同发育阶段、卵丘细胞有无及冷冻前用紫杉醇及细胞松弛素B预处理对绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响,并对解冻后卵母细胞进行体外受精、孤雌激活,结果表明:（1）体外成熟24h绵羊卵母细胞（MⅡstage）与未成熟卵母细胞（GV stage）相比,玻璃化冷冻-解冻后FAD染色存活率为（70.63% vs. 58.51%）;体外受精卵裂率（38.42%vs.22.68%）,囊胚率（5.89%vs.0）具有显着性差异（P<0.05）。表明:成熟的绵羊卵母细胞更适宜冷冻保存。（2）卵丘细胞的有无对玻璃化冷冻MⅡ期卵母细胞解冻后存活率、卵裂率、囊胚率均无显着性差异（P>0.05）。（3）采用浓度为0.5μmol/L紫杉醇预处理绵羊卵母细胞冷冻保存效果最佳,解冻后卵母细胞的存活率（82.38%）与其他三个实验组相比有显着差异性（P<0.05）;体外受精卵裂率（51.17%）和桑囊胚率（20.30%）亦显着高于其他实验组（P<0.05）,但低于对照组（69.42%,34.77%）（P<0.05）;0.5μmol/L紫杉醇处理组孤雌激活卵裂率（53.61%）和桑囊胚率（22.64%）,显着高于其他实验组,但于对照组（73.40%,33.79）（P<0.05）。（4）7.5μg/mL的细胞松弛素B预处理绵羊卵母细胞冷冻-解冻后的存活率（64.50% vs.68.87%）无显着性差异,体外受精卵裂率及桑囊胚率和孤雌激活卵裂率及桑囊胚率两组之间亦无显着性差异（P>0.05）,但均显着低于对照组（P<0.05）。综上所述,与GV期绵羊卵母细胞相比,MⅡ期卵母细胞更适宜冷冻保存; 0.5μmol/L紫杉醇有利于提高绵羊体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存效果。
二、绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存实验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存实验（论文提纲范文）
（1）转口蹄疫VP1基因奶山羊体外胚胎生产及冷冻保存（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 体外胚胎生产及胚胎玻璃化冷冻研究进展 |
| 1.1 体外胚胎生产研究进展 |
| 1.2 玻璃化冷冻研究进展 |
| 1.2.1 玻璃化冷冻的原理 |
| 1.2.2 胚胎冷冻的历史 |
| 1.2.3 玻璃化冷冻的方法 |
| 1.2.4 冷冻保护剂 |
| 1.2.5 胚胎冷冻的意义与展望 |
| 1.3 本论文研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 转基因山羊的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 山羊血液基因组提取 |
| 2.2.2 山羊精液基因组提取 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 PCR反应体系 |
| 2.2.5 PCR反应程序 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶回收测序鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 转基因奶山羊血液基因组PCR鉴定 |
| 2.3.2 转基因奶山羊精液基因组PCR鉴定 |
| 2.3.3 测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转基因羊体外胚胎生产及冷冻保存 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验动物、组织和细胞 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 山羊卵母细胞采集和体外成熟 |
| 3.2.2 山羊精液采集 |
| 3.2.3 山羊卵母细胞体外受精和体外培养 |
| 3.2.4 胚胎冷冻液筛选 |
| 3.2.5 胚胎冷冻液优化 |
| 3.2.6 囊胚质量评级 |
| 3.2.7 胚胎冷冻与解冻 |
| 3.2.8 冷冻解冻后囊胚免疫荧光染色 |
| 3.2.9 冷冻解冻后囊胚凋亡检测 |
| 3.2.10 体外胚胎鉴定 |
| 3.2.11 同期发情 |
| 3.2.12 胚胎移植 |
| 3.2.13 数据统计与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胚胎冷冻液筛选结果 |
| 3.3.2 胚胎冷冻液优化结果 |
| 3.3.3 冷冻对囊胚细胞数的影响 |
| 3.3.4 冷冻对囊胚细胞凋亡的影响 |
| 3.3.5 转基因胚胎体外生产效率 |
| 3.3.6 体外胚胎PCR鉴定 |
| 3.3.7 胚胎移植妊娠结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）CD81在绵羊性腺及精卵上的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 四次跨膜蛋白 |
| 1.2 CD81的分子结构 |
| 1.3 CD81参与细胞融合 |
| 1.4 CD81在免疫系统中的作用 |
| 1.4.1 CD81在CD19转运到细胞表面的过程中有重要作用 |
| 1.4.2 CD81在B细胞信号传导过程中的作用 |
| 1.4.3 CD81在抗原呈递中的作用 |
| 1.4.4 CD81在T细胞中的作用 |
| 1.4.5 CD81存在于B与T细胞免疫突触(IS)的中央区域 |
| 1.5 CD81与人类疾病 |
| 1.5.1 CD81与肿瘤侵袭和转移 |
| 1.5.2 CD81与生物标记 |
| 1.5.3 CD81与病毒感染 |
| 1.6 卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究 |
| 1.6.1 卵母细胞玻璃化冷冻保存方法 |
| 1.6.2 卵母细胞冷冻保护剂 |
| 1.6.3 卵母细胞细胞骨架稳定剂 |
| 1.6.4 卵母细胞在冷冻过程中的损伤 |
| 1.6.5 冷冻对卵母细胞结构和发育潜力的影响 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.8 试验研究内容 |
| 1.9 本研究的技术路线 |
| 2 实验一 绵羊卵母细胞玻璃化冷冻对其细胞骨架的影响 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 卵巢来源 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 2.2.2 绵羊卵母细胞的成熟鉴定 |
| 2.2.3 卵母细胞的玻璃化冻融 |
| 2.2.4 微丝微管核染色 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 冻融后卵母细胞微丝的细胞学观察 |
| 2.3.2 冻融后卵母细胞微管的细胞学观察 |
| 2.3.3 冻融后卵母细胞染色体的细胞学观察 |
| 2.3.4 不同发育时期绵羊卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二 CD81在绵羊卵巢组织和卵母细胞上的表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验仪器 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 GV期和MⅡ期卵母细胞的获取 |
| 3.2.2 免疫组织化学法检测CD81在绵羊卵巢中的表达 |
| 3.2.3 免疫细胞化学法检测CD81在卵母细胞上的表达 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 CD81在绵羊卵母细胞上的分布 |
| 3.3.2 CD81在绵羊卵巢组织上的分布 |
| 3.4 讨论 |
| 4 实验三 CD81mRNA在冷冻前后不同发育阶段卵母细胞中的表达规律 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实时荧光定量PCR法检测冻融前后GV期和MⅡ期绵羊卵母细胞中CD81mRNA表达水平 |
| 4.2.2 统计学处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CD81基因和GAPDH基因普通PCR扩增 |
| 4.3.2 实时荧光定量PCR结果 |
| 4.3.3 CD81基因的时空特异表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 5 实验四 CD81在绵羊睾丸、附睾及精子中的表达检测 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 CD81在绵羊睾丸上的分布 |
| 5.3.2 CD81在绵羊精子上的分布 |
| 5.3.3 CD81在绵羊附睾上的分布 |
| 5.4 讨论 |
| 6 实验五 CD81的表达和超低温冷冻对IVF的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验仪器 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 主要溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 绵羊卵母细胞的采集 |
| 6.2.2 绵羊卵母细胞体外成熟 |
| 6.2.3 绵羊卵母细胞的成熟鉴定 |
| 6.2.4 绵羊体外受精 |
| 6.2.5 检测精子黏附每卵数 |
| 6.2.6 检测穿透每卵的精子穿透率 |
| 6.2.7 统计分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 CD81单克隆抗体对MⅡ期卵母细胞IVF的影响 |
| 6.3.2 冻融后GV期卵母细胞对IVF的影响 |
| 6.3.3 冻融后MⅡ期卵母细胞对IVF的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）羊卵母细胞冷冻保存研究进展（论文提纲范文）
| 1 卵母细胞冷冻损伤机制研究现状 |
| 2 羊卵母细胞冷冻保存技术研究现状 |
| 2.1 冷冻保存方法的筛选 |
| 2.2 抗冻保护剂的选择 |
| 3 羊卵母细胞冷冻保存中存在的问题 |
| 3.1 卵巢来源复杂、质量参差不齐 |
| 3.2 卵母细胞自身结构功能有其特殊性 |
| 3.3 卵母细胞质量评价体系不完善 |
| 3.4 玻璃化操作水平尚未实现标准化 |
| 4 展 望 |
（4）内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文章综述 |
| 第一章 钙稳态 |
| 1.1 钙稳态失衡 |
| 1.2 钙稳态失衡与内质网应激及细胞凋亡 |
| 第二章 玻璃化冷冻保存卵母细胞的研究 |
| 2.1 玻璃化冷冻 |
| 2.2 卵母细胞玻璃化冷冻损伤 |
| 2.3 牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展 |
| 第三章 牛卵母细胞的体外成熟的研究进展 |
| 3.1 牛卵母细胞体外成熟概况 |
| 3.2 影响牛卵母细胞体外成熟的因素 |
| 第四章 白血病抑制因子在哺乳动物生殖中的作用 |
| 4.1 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF) |
| 4.2 LIF调控卵母细胞减数分裂恢复及相关信号通路 |
| 4.3 LIF在哺乳动物早期胚胎发育中的作用 |
| 4.4 LIF在胚胎附植中的作用 |
| 第二部分 研究论文 |
| 第一章 内质网钙通道对牛卵母细胞冷冻后存活率的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二章 2-APB对冷冻后卵母细胞发育能力的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三章 2-APB对冷冻后卵母细胞内质网应激和细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四章 LIF促进牛卵母细胞体外成熟及其作用机制 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第五章 LIF对牛卵母细胞发育能力和多潜能基因表达的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 博士期间发表的论文 |
（5）玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 OPS管的制备 |
| 1.2 溶液的配制 |
| 1.3 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 2 方法 |
| 2.1 卵母细胞的玻璃化冷冻-解冻 |
| 2.2 体外受精 |
| 2 3 胚胎发育 |
| 2.4 地衣红 (Orcein) 染色液法测定卵母细胞核相 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 卵母细胞暴露在不同玻璃化冷冻液中对其正常形态数和孤雌激活数的影响 (结果见表2) |
| 3.2 卵母细胞暴露在不同玻璃化冷冻液中对其体外受精及胚胎发育能力的影响 (结果见表3) |
| 4 讨论与小结 |
（7）羊卵母细胞冷冻保存研究进展（论文提纲范文）
| 1 羊卵母细胞冷冻保存 |
| 1.1 慢速冷冻法 |
| 1.2 玻璃化冷冻法 |
| 2 冷冻损伤 |
| 3 小结 |
（8）羊卵母细胞冷冻保存研究进展（论文提纲范文）
| 1 不同发育阶段羊卵母细胞冷冻保存 |
| 1.1 羊成熟卵母细胞冷冻保存 |
| 1.2 羊未成熟卵母细胞冷冻保存 |
| 2 冷冻保存对羊卵母细胞损伤机制的研究 |
| 2.1 冷冻保存对羊卵母细胞纺锤体、染色体的影响 |
| 2.2 冷冻保存对羊卵丘颗粒细胞的影响 |
| 2.3 冷冻保存羊卵母细胞对凋亡基因的影响 |
| 3 存在问题及展望 |
（9）玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵母细胞收集和成熟 |
| 1.2 玻璃化冷冻和复苏 |
| 1.3 卵母细胞的孤雌激活 |
| 1.4 胚胎的体外培养 |
| 1.5 卵母细胞总RNA提取与RT-PCR |
| 1.6 标准曲线的制作 |
| 1.7 Quantitative RT-PCR检测 |
| 1.8 数据统计与分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 玻璃化冷冻对卵母细胞母源基因mRNA表达水平的影响 |
| 2.2 不同成熟时间的绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存效果 |
| 3 讨 论 |
| 3.1 玻璃化冷冻对不同发育阶段卵母细胞母源基因mRNA表达量的影响 |
| 3.2 玻璃化冷冻对不同体外成熟 (IVM) 时间的卵母细胞母源基因mRNA表达量的影响 |
| 4 结 论 |
（10）影响绵羊卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 卵母细胞冷冻保存的意义 |
| 1.2 卵母细胞冷冻保存的原理 |
| 1.3 卵母细胞冷冻保存的研究进展 |
| 1.3.1 玻璃化冷冻保存的方法 |
| 1.3.2 冷冻保存对卵母细胞所造成的损伤 |
| 1.3.3 提高卵母细胞冷冻保存效果的措施 |
| 1.4 卵母细胞自身的特性 |
| 1.4.1 卵母细胞的不同发育阶段 |
| 1.4.2 卵母细胞周围的卵丘细胞 |
| 1.5 细胞骨架稳定剂 |
| 1.5.1 紫杉醇(Taxol) |
| 1.5.2 细胞松弛素 B(CytochalasinB) |
| 1.6 本研究的主要目的和内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验主要仪器及设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作液及配制 |
| 2.1.4 卵巢来源 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 绵羊卵巢的采集与运输 |
| 2.2.2 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.2.3 卵母细胞成熟情况评定 |
| 2.2.4 卵母细胞冷冻 |
| 2.2.5 卵母细胞解冻 |
| 2.2.6 绵羊卵母细胞体外受精 |
| 2.2.7 绵羊卵母细胞孤雌激活 |
| 2.2.8 早期胚胎体外培养 |
| 2.2.9 卵母细胞存活率的检测 |
| 2.3 实验设计 |
| 2.3.1 不同发育阶段绵羊卵母细胞冷冻·解冻后体外受精及其胚胎发育效果 |
| 2.3.2 卵丘细胞的有无对绵羊卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 2.3.3 紫杉醇预处理对绵羊体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 2.3.4 细胞松弛素B 处理对玻璃化冷冻绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 2.4 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同发育阶段(GV,MⅡ)卵母细胞冷冻-解冻后体外受精胚胎发育效果 |
| 3.2 卵丘细胞有无对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响 |
| 3.3 紫杉醇预处理对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响 |
| 3.3.1 不同浓度紫杉醇对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻存活率的影响 |
| 3.3.2 紫杉醇预处理对玻璃化冷冻绵羊MⅡ期卵母细胞体外受精效果的影响 |
| 3.3.3 紫杉醇预处理对玻璃化冷冻绵羊MⅡ期卵母细胞孤雌发育效果的影响 |
| 3.4 CB 预处理对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 3.4.1 CB 预处理对玻璃化冷冻后绵羊MⅡ期卵母细胞体外受精发育效果的影响 |
| 3.4.2 CB 预处理对玻璃化冷冻后绵羊MⅡ期卵母细胞孤雌发育效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卵母细胞发育阶段（GV，MⅡ）对玻璃化冷冻效果的影响 |
| 4.2 卵丘细胞有无对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 4.3 紫杉醇预处理对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响 |
| 4.4 CB 预处理对绵羊MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存实验（论文参考文献）
- [1]转口蹄疫VP1基因奶山羊体外胚胎生产及冷冻保存[D]. 褚博. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]CD81在绵羊性腺及精卵上的表达研究[D]. 史振丹. 内蒙古农业大学, 2016(02)
- [3]羊卵母细胞冷冻保存研究进展[J]. 马媛,权国波,洪琼花. 家畜生态学报, 2015(01)
- [4]内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究[D]. 莫显红. 中国农业大学, 2014(02)
- [5]玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究[J]. 赵驻军,孙树春,田树军. 黑龙江畜牧兽医, 2013(03)
- [6]羊卵母细胞冷冻保存研究进展[A]. 任立坤,刘月琴,张英杰,杨少华,王红娜. 中国畜牧兽医学会养羊学分会2012年全国养羊生产与学术研讨会议论文集, 2012
- [7]羊卵母细胞冷冻保存研究进展[J]. 任立坤,刘月琴,张英杰,杨少华,王红娜. 中国草食动物科学, 2012(S1)
- [8]羊卵母细胞冷冻保存研究进展[J]. 赵驻军,蔡文涛,温兵强,王志刚. 畜牧与兽医, 2012(06)
- [9]玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响[J]. 王静,林嘉鹏,石庆华,陈博,汪立芹,赵云程,黄俊成. 畜牧兽医学报, 2011(09)
- [10]影响绵羊卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素研究[D]. 莫显红. 河北农业大学, 2011(07)