一、单核吞噬细胞应答伤寒沙门菌的实验研究（论文文献综述）
周莹莹[1]（2021）在《鸡白痢沙门菌诱导Th2应答相关抗原的鉴定及功能研究》文中指出鸡白痢（Pullorumdisease）是一种急性、全身性传染病,给养禽业带来了巨大的危害,其病原为鸡白痢沙门菌（Salmonella enterica serovar Pullorum,Salmonella Pullorum）,具有宿主专嗜性,可引起雏鸡的急性败血症;也可以感染成年鸡,常导致母鸡产蛋减少,体重下降,或导致孵化率和出雏率明显下降,该病原菌亦可垂直传播给子代。鸡白痢沙门菌作为兼性胞内寄生菌,在鸡体内诱导的免疫应答偏向于Th2型,有助于其在巨噬细胞内存活,为细菌持续感染提供了有利的条件,是鸡白痢免疫防控的难点。挖掘鸡白痢沙门菌中与Th2应答相关的抗原（诱导Th2应答或抑制Th1应答的抗原）,有助于鸡白痢沙门菌持续感染的机制的解析,同时为鸡白痢疫苗的研制提供新思路和新靶点。巨噬细胞M1/M2表型与T细胞介导Th1/Th2应答存在相互联系,M1巨噬细胞产生的IL-12、趋化因子CXCL9和CXCL10会促进Th1细胞的分化,Th1应答中的IFN-γ会刺激巨噬细胞产生M1极化;M2巨噬细胞产生的趋化因子CCL17、CCL22和CCL24则促进Th2细胞的分化,Th2应答中的IL-4会诱导巨噬细胞产生M2极化。因此,通过检测巨噬细胞的极化分型可以间接反映宿主的T细胞应答类型。巨噬细胞的极化分型中存在着不同的精氨酸代谢途径,其中诱导型一氧化氮合成酶（Induciblenitricoxidesynthase,iNOS）是M1巨噬细胞的重要标志物,可将精氨酸代谢为一氧化氮（Nitric oxide,NO）和鸟氨酸。因此巨噬细胞NO的产生可以作为其极化分型的指标。本研究通过构建鸡白痢沙门菌转座突变库,以巨噬细胞为感染模型,基于突变株感染后巨噬细胞中NO的产生判断巨噬细胞是否发生M1极化,从而筛选出促进Th1应答的候选突变株,相应的基因编码产物即为抑制Th1或诱导Th2应答的候选抗原。构建相关基因的缺失株,通过体外实验和体内实验评价缺失株诱导Th1/Th2免疫应答的能力以及机体免疫应答对相应病原菌的清除作用,并初步评价其作为疫苗候选株的潜能。进一步为鸡白痢沙门菌持续感染机制的解析以及鸡白痢防控技术的开发提供理论依据和靶点。1.鸡白痢沙门菌中调控巨噬细胞产生NO的基因筛选利用pSC189转座质粒构建鸡白痢沙门菌449/87的转座子突变库,PCR及抗性鉴定结果显示转座子插入到鸡白痢沙门菌基因组中的成功率为100%。以鸡巨噬细胞系HD11为感染模型,利用转座突变株感染细胞,通过检测NO的产生情况进行鸡白痢沙门菌影响宿主NO产生相关基因的高通量筛选。本文共筛选了2807个转座突变株,与野生株449/87感染组相比,诱导HD11产生NO上调的菌株有49个,下调的菌株有12个。通过PCR、测序和比对分析对筛选出来的转座突变株进行基因定位,并构建相应的基因缺失株和回复株,以构建的鸡白痢沙门菌基因缺失株、回复株和野生株感染HD11,对上述筛选结果进行验证,结果表明,与野生株449/87感染组相比,arcB、cyaA、cysB、hilA、glnD、invE和prgI的单基因缺失株可显着上调NO的产生。2.鸡白痢沙门菌中NO相关基因对巨噬细胞M1/M2极化分型的影响利用贴壁培养法制备鸡外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）来源的原代巨噬细胞,流式细胞术检测结果显示以7.5×106cells/孔接种6孔板时,获得的巨噬细胞纯度最高,为93%。野生株449/87和基因缺失株感染原代巨噬细胞后NO的检测结果显示,cysB、arcB、prgI、invE、hilA、cyaA和glnD7个基因的单基因缺失株均能显着上调巨噬细胞产生的NO,与HD11细胞感染模型的结果一致。将上述7个单基因缺失株感染HD11和原代巨噬细胞后,检测iNOS的活性,IFN-γ、IL-12p40、IL-4和IL-10 mRNA水平及IL-12p40蛋白质水平。结果显示,与野生株449/87相比,7个单基因缺失株感染后HD11和原代巨噬细胞中iNOS活性显着增加,IL-12p40蛋白水平也显着提高,表明缺失株感染巨噬细胞后会促进其M1极化。与野生株449/87感染组相比,7个单基因缺失株感染HD11后Th2相关细胞因子IL-4和IL-10 mRNA水平没有变化,而Th1相关细胞因子IL-12p40 mRNA显着上调;另外,除了449/87ΔcysB和449/87ΔglnD,其余5个基因（prgI、invE、hilA、cyaA和arcB）的单基因缺失株均可以显着上调HD11感染后的IFN-γ mRNA水平,表明这5个缺失株可能通过上调HD11产生的IFN-γ促进其M1极化。在鸡原代巨噬细胞感染模型中,相比野生株449/87,cyaA、hilA和invE单基因缺失株感染后Th1相关细胞因子IFN-γ mRNA显着上调,而Th2相关细胞因子IL-4mRNA显着下调,表明449/87ΔcyaA、449/87ΔhilA和449/87Δ invE通过上调原代巨噬细胞产生的IFN-γ从而促进其发生M1极化,且同时通过下调IL-4从而抑制其发生M2极化。3.鸡白痢沙门菌449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA诱导鸡体免疫应答的研究将鸡白痢沙门菌449/87、449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA分别通过肌肉注射方式接种海兰白雏鸡,在感染后不同时间点分别收集肝脏和脾脏,观察脏器的组织病理学变化。通过检测血清抗体、脾脏CD4+/CD8+T细胞的比例、淋巴细胞增殖和细胞因子表达水平,评估了 449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA感染雏鸡后激发的体液和细胞免疫应答。血清抗体检测结果显示,449/87和449/87ΔhilA感染雏鸡后可诱导机体产生相同水平的鸡白痢沙门菌抗体,而449/87ΔcyaA感染组的抗体低于449/87野生株感染组,表明CyaA的缺失降低了鸡白痢沙门菌激发的体液免疫应答水平。脾脏CD4+和CD8+T细胞的比例及脾脏淋巴细胞增殖试验检测结果显示,与449/87野生株感染组相比,449/87ΔcyaA感染的鸡脾脏CD4+T细胞减少,CD8+T细胞增加（21 d）,449/87ΔhilA感染组脾脏CD4+T细胞比例增加（28 d）;449/87ΔcyaA和449/87ΔhilA感染的鸡分别在感染后21和28 d时其脾脏细胞增殖能力显着增强,表明这两个基因缺失株诱导T淋巴细胞应答的能力增强。脾脏细胞因子检测结果显示,与449/87野生株感染组相比,449/87ΔhilA感染组IFN-γ mRNA水平显着升高（感染后的3和7 d）;449/87ΔcyaA感染组IFN-γ mRNA表达水平升高（感染后7d）,IL-4 mRNA水平显着降低（感染后的3 d）。以上结果表明,449/87AcyaA和449/87ΔhilA感染后海兰白鸡产生的应答均偏向Th1型。对449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA感染组肝脏和脾脏中的载菌量进行检测,发现449/87ΔcyaA感染组肝脏和脾脏中定植的菌量较少,且分别在感染后7d和21d,肝脏和脾脏中的449/87ΔcyaA被清除。449/87ΔhilA感染组肝脏和脾脏中沙门菌的定植量低于野生株组,且在感染后第21d,肝脏中的449/8 7ΔhilA被清除。以上结果表明缺失株诱导的Th1应答可加速机体对细菌的清除。4.鸡白痢沙门菌449/87ΔcyaA作为疫苗候选株的免疫保护效力评估以3日龄海兰白雏鸡为模型进行449/87和449/87ΔcyaA的LD50测定,结果显示肌肉注射时449/87和449/87ΔcyaA的 LD50分别为7.02×107 CFU和4.82×109 CFU,表明CyaA缺失后鸡白痢沙门菌的毒力减弱。将449/87△cyaA以1×107CFU/只的剂量通过肌肉注射免疫接种3日龄海兰白雏鸡进行疫苗免疫保护效力的评估。体重变化和临床表现显示,与PBS对照组相比,449/87ΔcyaA免疫组的鸡只生长性能正常,且未出现任何临床症状。血清抗体水平检测结果显示449/87ΔcyaA免疫后第14和21d鸡体产生针对鸡白痢沙门菌的抗体。脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示,449/87ΔcyaA免疫组的脾脏细胞在ConA和可溶性抗原刺激下增殖能力显着提高。细胞毒性淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）结果显示,449/87ΔcyaA免疫组的脾脏CD8+T细胞对靶细胞（449/87感染的巨噬细胞）具有较强的杀伤能力,显着高于未免疫组。免疫后第14d对雏鸡进行攻毒,攻毒后免疫组鸡只没有明显临床症状,鸡只的存活率为100%;而未免疫攻毒组的鸡却呈现高发病率和死亡率。细菌定植结果显示,在攻毒后的第3和14d,免疫后攻毒组肝脏中的鸡白痢沙门菌载量显着低于未免疫攻毒组。上述结果表明鸡白痢沙门菌减毒株449/87ΔcyaA可诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,为雏鸡提供良好的保护效力,具有作为鸡白痢疫苗候选株的潜力。
熊丹[2]（2020）在《肠炎沙门菌新型抑炎效应蛋白TcpS逃逸宿主天然免疫的机制研究》文中进行了进一步梳理Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是一类Ⅰ型跨膜的模式识别受体（Pattern recognitionreceptors,PRRs）,其作为免疫哨兵分子能够识别不同的病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）、活化核转录因子 κB（Nuclear factorκB,NF-κB）,从而激活天然免疫应答,诱导炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的产生,在抵抗和清除病原微生物的感染中发挥了关键作用。TLRs活化后诱导MyD88（Myeloid differentiation factor 88）依赖的NF-κB活化,促进前炎性细胞因子和趋化因子的产生。在MyD88非依赖的信号通路中,TLRs可直接招募TRIF（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β）,与 TRAF6 相互作用激活 NF-κB,也可与 TBK1 互作激活IRF3（Interferon regulatory factor 3）。TLR和下游的适配蛋白含有一个进化上保守的细胞质区域,即TIR（Toll/IL-1 receptor）结构域,可形成同源或异源二聚体,对TLR信号通路的转导尤为重要。TLR信号通路的异常或过度活化会引起炎性反应,许多感染性疾病、自身免疫病和恶性肿瘤都会引发机体产生过度炎症反应,因而靶向天然免疫应答和信号转导的药物具有潜在的医疗前景。沙门菌是一类重要的食源性人兽共患肠道致病菌,可在人和多种动物中引起局部感染,甚至造成严重的全身性疾病,包括胃肠炎、腹泻和伤寒等疾病。沙门菌可通过Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system,T3SS）分泌多种毒力效应蛋白促进其在体内的定殖,沙门菌致病岛（Salmonellapathogenicityisland,SPI）编码的效应蛋白通过T3SS直接进入宿主细胞,进而调控细胞的生化过程。SPI-1和SPI-2在沙门菌的感染过程中尤为重要,这些效应蛋白在沙门菌感染期间具有多种作用,包括参与宿主细胞骨架的重排、免疫细胞的募集、细胞代谢、体液分泌以及宿主炎症反应的调控。沙门菌已经进化出多种逃逸或操纵宿主免疫防御的策略以促进其在宿主中的生存。本研究鉴定了肠炎沙门菌含TIR结构域基因tcpS,探究了其序列结构特征、表达分泌特性和动态感染规律;通过体内外实验研究了 TcpS对肠炎沙门菌毒力的影响;揭示了抑炎效应蛋白TcpS干扰TLR信号通路以逃逸宿主天然免疫的分子机制;通过小鼠模型鉴定了 TcpSTIR结构域功能性肽段的抑炎抗感染功效。本研究揭示了肠炎沙门菌逃逸机体天然免疫的新机制,亦为新型抑炎小分子药物的设计提供了新思路。1.肠炎沙门菌TcpS生物信息学分析及其表达分泌规律研究通过生物信息学方法鉴定肠炎沙门菌C50041中存在含TIR结构域基因tcpS（TIR-and Coiled-coil-domain containing Protein of Salmonella）。TcpS 位于 ROD21（Region of difference 21）5’asn tRNA岛,其附近含有噬菌体整合酶和接合转移蛋白。通过PCR方法鉴定tcpS基因在不同血清型沙门菌和其它细菌中的分布,结果显示tcpS仅存在于肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌和都柏林沙门菌中。引入沙门菌lygD和flhB两个基因,建立了基于tcpS的多重PCR检测方法,可快速高效鉴定这三种血清型沙门菌。TcpS蛋白共含有293个氨基酸,其羧基端137个氨基酸为TIR结构域。TcpS与TLR4/MyD88 TIR结构域的氨基酸相似性约为40%。TIR结构域有三个较为保守的基序:Box 1、Box 2和Box 3,其对TLR信号转导尤为重要。将TcpS TIR的三个Box与不同TLRs和适配蛋白进行比较,结果显示TcpS Box 1序列与其它蛋白高度相似。生物信息学分析表明TcpS的三维结构与其它蛋白TIR结构域具有高度的相似性和较好的空间重叠性。利用原核表达系统表达TcpS蛋白并制备TcpS多抗血清,将肠炎沙门菌C50041单独培养或与RAW264.7细胞共培养后分别检测TcpS的表达,结果显示在细菌沉淀中可检测到TcpS,表明肠炎沙门菌C50041可组成型表达TcpS蛋白,即tcpS不是假定基因。与RAW264.7细胞共培养后,可在培养基上清中检测到TcpS,表明共培养可促进TcpS的分泌。构建C50041 ΔSPI-1和ΔSPI-2缺失株,通过Transwell实验鉴定C50041菌株表达并分泌TcpS蛋白,结果显示C50041感染组上区室中可检测到TcpS,下区室的上清中未检测到DnaK,表明TcpS蛋白是由细菌分泌出来的。在SPI-1缺失后,TcpS的分泌水平显着降低,而SPI-2缺失不会影响其分泌,表明TcpS可通过T3SS1分泌至胞外。构建 C50041 ΔtcpS、C50041 ΔtcpS+pCX340 和 C50041 ΔtcpS+pCX340-TcpS,将表达各融合蛋白的沙门菌感染HeLa细胞,利用CCF2/TEM-1报告系统鉴定TcpS可分泌至细胞内。结果显示TEM-1和TcpS-TEM-1融合蛋白均成功表达,表达TEM-1的沙门菌感染后细胞呈现绿色荧光,表明TEM-1未转运至胞内,而表达TcpS-TEM-1的沙门菌感染后细胞呈现蓝色荧光,表明TcpS-TEM-1成功转运至胞内,并将CCF2底物进行分解。将肠炎沙门菌C50041进行灌胃攻毒,并在灌胃后不同时间点采集小鼠肝脏,荧光定量PCR检测沙门菌促炎和抑炎效应蛋白以及小鼠细胞因子的水平。结果显示抑炎效应蛋白（tcpS、avrA和sptP）在感染后24 h-2 d表达水平较高,促炎效应蛋白（sopB、sopE、srfA和sopD）在感染后24 h最高,小鼠细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40、IFN-γ、CXCL2和CCL4）则在感染后12 h和7 d时表达水平最高。表明在感染早期沙门菌通过降低促炎效应蛋白并增加抑炎效应蛋白来抑制细胞因子的产生,并且TcpS的动态感染规律与其它抑炎效应蛋白较为一致。2.肠炎沙门菌抑炎效应蛋白TcpS对细菌毒力的影响构建肠炎沙门菌C50041 ΔtcpS缺失株和C50041 ΔtcpS+pBR322-TcpS回复株,细菌生长曲线显示TcpS野生株、缺失株和回复株的生长速率较为一致。以RAW264.7细胞为感染模型,检测TcpS对细菌的侵袭率、增殖率和炎性细胞因子表达的影响。结果显示C50041和TcpS回复株比ΔtcpS缺失株具有更高的侵袭率和增殖率,而炎性细胞因子IL-6和IL-1p显着低于ΔtcpS缺失株感染组。表明在细胞水平上,TcpS能显着抑制细胞因子的产生,并促进细菌在胞内的定殖。与野生株相比,回复株中TcpS过量表达,对TLR信号通路的抑制作用更为明显,因而具有更低的炎性细胞因子水平以及更高的侵袭率和增殖率。将肠炎沙门菌C50041、ΔtcpS和ΔtcpS+pTcpS分别感染BALB/c小鼠,攻毒4天后分别收集肝脏和脾脏,检测脏器中的炎性细胞因子水平、载菌量和组织病理学变化。结果显示,C50041野生株和TcpS回复株在肝脏和脾脏中的载菌量显着高于ΔtcpS缺失株感染组,表明TcpS可在体内促进细菌的存活。与ΔtcpS缺失株相比,C50041野生株和TcpS回复株可抑制脏器中CXCL15、TNF-α、IL-6和IL-1β的产生,表明TcpS可在体内外抑制炎性细胞因子的产生,并促进细菌在胞内的增殖。组织病理学分析显示在感染早期TcpS能够抑制组织炎性反应,ΔtcpS缺失株感染组小鼠的肝脏和脾脏炎性浸润程度显着高于野生株和TcpS回复株感染组,而在感染后期ΔtcpS缺失株感染组小鼠的肝脏和脾脏则恢复正常。这些结果表明在感染早期沙门菌效应蛋白TcpS能够抑制炎症反应,逃逸宿主的天然免疫从而促进细菌在胞内的生存。在感染后6天采集小鼠血清,沙门菌野生株和TcpS回复株感染组小鼠的血清颜色为深红色,而ΔtcpS缺失株感染组小鼠血清呈现为正常的浅黄色。检测小鼠血清中血红蛋白的含量,结果显示沙门菌野生株和TcpS回复株在感染后期可导致小鼠血液中红细胞的破碎和血红蛋白的释放,且肝脏和脾脏均出现了较为严重的病理损伤。通过ELISA检测感染后期小鼠血清中炎性细胞因子,结果显示野生株和回复株感染组小鼠血清中炎性细胞因子IL-12p40、TNF-α IL-1β和IL-6水平显着高于缺失株感染组,表明TcpS在感染早期逃逸天然免疫并促进细菌的存活,导致感染后期产生炎性风暴和组织病理损伤。在沙门菌攻毒后期,野生株和TcpS回复株攻毒组小鼠的毛发明显凌乱无光泽、食欲减退、没有活力。通过生存曲线评价了 TcpS在沙门菌逃逸天然免疫过程中对细菌毒力的影响,结果显示ΔtcpS缺失株感染的小鼠死亡率显着降低。以小鼠动物模型进行LD50攻毒实验,LD50结果显示沙门菌野生株和TcpS回复株的LD50分别为1.7 ×105 CFU 和 4.5 × 105CFU,而 ΔtcpS 缺失株的 LD50 为 5.4 × 106CFU,表明 TcpS 缺失后沙门菌毒力减弱,是逃逸机体免疫系统的一种新型毒力效应蛋白。3.肠炎沙门菌TcpS干扰宿主天然免疫的分子机制研究以HEK293T和RAW264.7为细胞模型,利用NF-κB荧光素酶报告系统检测TcpS对TLR信号通路的抑制作用,结果显示TcpS可抑制TLR2、TLR4、TLR5、TLR7和TLR9介导的NF-κB的活化,且抑制作用存在剂量依赖关系。此外,TcpS能强烈抑制TLR3介导的IFN-β和NF-κB的活化,而TLR3信号通路的活化是MyD88非依赖的,表明TcpS可同时抑制MyD88和TRIF介导的TLRs的活化。过表达MyD88和TRIF可显着激活NF-κB和IRF通路,而TcpS能够有效抑制MyD88和TRIF介导的NF-κB和IRF的活化,MyD88和TRIF特异的siRNA干扰实验进一步证明TcpS的抑制作用是由MyD88和TRIF介导的。为证明MyD88是TcpS发挥抑制功能所必需的,将肠炎沙门菌C50041野生株、ΔtcpS缺失株和TcpS回复株分别感染C57BL/6J WT和MyD88-/-BMMs细胞,荧光定量PCR检测炎性细胞因子水平、细菌的侵袭率和增殖率,结果显示在WT BMMs细胞中,TcpS可促进细菌在胞内的侵袭和增殖,并抑制IL-1β的表达;而在MyD88-/-BMMs细胞中,TcpS丧失了抑制炎症反应和促进细菌增殖的能力,表明MyD88在TcpS发挥抑炎功能中的重要作用。利用免疫共沉淀方法检测TcpS与MyD88之间的相互作用,结果显示TcpS与MyD88之间存在直接的相互作用,表明TcpS可通过与MyD88相互作用直接干扰其介导的天然免疫。将TcpS真核表达质粒转染HeLa细胞,LPS刺激后通过激光共聚焦显微镜观察p65亚基在细胞内的定位,结果显示TcpS可显着抑制p65的入核,并具有剂量依赖关系。将TcpS/TLR4/MD2转染HEK293T细胞,LPS刺激后检测TcpS对炎性细胞因子表达的影响,结果显示TcpS能够显着抑制LPS诱导的IL-1β、IL-8、IL-17A和TNF-α的表达。此外,在HeLa细胞中,TcpS可抑制LPS诱导的炎性细胞因子IL-1β的表达,表明TcpS能够干扰TLR-NF-κB信号通路进而阻断天然免疫系统。为鉴定TcpS TIR结构域中发挥抑炎功能的关键氨基酸,选择可能对点突变较为敏感的氨基酸位点并构建一系列关键氨基酸突变体。将TIR-TcpS和各突变体转染细胞后,检测各突变体对NF-κB活化和IL-8分泌水平的影响,结果显示E180A减弱了其抑制作用,而Y191A和I284A则完全废除了其抑制作用。尤为注意的是,TIR-TcpS对TLR信号通路的抑制作用显着弱于全长TcpS,表明TcpS的氨基端序列在其发挥抑炎作用中具有重要作用。生物信息学分析表明TcpS除羧基端TIR结构域外,在其氨基端含有 Coiled-coil（CC）结构域。将 pCMV-HA-TcpS 和 pCMV-HA-ACCTcpS 分别转染HEK293T细胞,检测CC结构域对TcpS功能的影响,结果显示全长TcpS可显着抑制NF-κB的活化和IL-8的分泌,而ACCTcpS的抑炎效果则大幅降低,表明CC结构域在TcpS发挥高效抑制TLR信号通路中具有重要作用。将pFlag-TcpS和pFlag-ΔCCTcpS分别与pMyc-TcpS共转染HEK293T细胞,通过免疫共沉淀试验检测TcpS是否会形成同源二聚体,结果表明Myc-TcpS和Flag-TcpS存在相互作用,且其相互作用是通过CC结构域实现的。TcpS Coiled-coil结构域是由两个两性α螺旋相互缠绕形成的超螺旋,能够增强TcpS与TLRs或其它含TIR适配蛋白的结合能力。这些结果表明TcpS通过其氨基端Coiled-coil结构域形成同源二聚体,使其高效阻断TLR信号通路,进而抑制炎性反应。4.TcpS TIR结构域功能性肽段的抑炎抗感染功效通过生物信息学方法分析TcpS的TIR结构域,将TIR-TcpS划分为6个多肽区域,在小鼠原代腹腔巨噬细胞中检测各多肽对TLR4信号通路的抑制作用。结果显示,所有多肽尤其是SR2、SR3、SR4、SR5和SR6能够显着抑制MyD88介导的IL-1β和TNF-α的产生,多肽SR3和SR5可中度抑制IFN-β的产生,而SR2、SR5和SR6可抑制RANTES的产生。不同多肽对LPS诱导的p-ERK的活化均有不同程度的抑制作用,其中SR3、SR5和SR6的抑制作用尤为明显,SR6甚至消除了其活化,这些多肽可能是TcpSTIR结构域中潜在的功能性TIR-TIR结合位点。使用SWISS-MODEL在线预测了各多肽在TcpS TIR空间结构中的位置,这些多肽均位于TIR结构的表面并环绕着TIR球形结构,预示着这些位点可以更直接地与其它分子进行相互作用。将初筛的功能TIR-TcpS多肽SR4、SR5和SR6分别腹腔注射小鼠,再以亚致死剂量LPS进行攻毒,检测小鼠血清中炎性细胞因子的分泌水平,进而确定TcpS多肽对小鼠的免疫保护作用。引人注意的是,在LPS攻毒后,PBS组小鼠血清呈现深红色,而LPS未攻毒组的小鼠血清则呈现正常的浅黄色。SR4、SR5和SR6多肽均可缓解颜色的加重,尤其是SR4处理组可防止血清颜色的变化。此外,LPS注射后可大幅增加血清中血红蛋白的含量,而多肽处理则可显着降低血红蛋白的释放。三种多肽均可有效抑制小鼠血清中炎性细胞因子IL-6、IL-12p40和TNF-α的产生,甚至恢复至正常水平。这些结果表明SR4、SR5和SR6多肽在体内具有良好的抑炎效果,对LPS攻毒具有良好的保护作用。为检测多肽对细胞活性的影响,将不同TIR-TcpS多肽与小鼠腹腔巨噬细胞进行孵育,通过MTT试验评价细胞活性。结果显示SR1、SR3和SR4多肽处理后,细胞活性仍大于90%,甚至与培养基处理组相当。因此,TcpSTIR衍生的多肽SR4可在体内外阻断TLR介导的炎症反应,且对细胞活性影响较小。在小鼠模型中检测了 SR4多肽对流感病毒的攻毒保护作用,结果显示在H1N1流感病毒感染后,PBS和对照多肽CP组小鼠的体重急剧地连续下降（27%和29%）,而SR4处理组小鼠的体重有轻微的下降（5.5%）,表明SR4多肽能够调节机体病理状态下的免疫系统,从而抵抗流感病毒的感染。TIR-TcpS多肽可抑制LPS介导的过度炎症反应,并具有抗病毒感染功效,其可作为过度炎性反应或自身免疫性疾病的潜在治疗药物。
史艺[3]（2020）在《生物被膜在鼠伤寒沙门菌逃逸树突状细胞免疫监视中的作用和机制》文中研究表明鼠伤寒沙门菌是一种常见的人畜共患病原菌,主要通过消化道感染宿主,能够引起人的多种食源性疾病及食物中毒。主要的临床症状是腹泻、胃肠炎和败血症。鼠伤寒沙门菌从肠黏膜入侵后,肠道黏膜树突状细胞（Dendritic cells,DCs）可通过形成跨上皮树突摄取肠腔内的沙门菌,随后DCs活化和成熟,向肠系膜淋巴结迁移,建立早期天然免疫,最后DCs递呈抗原并启动获得性免疫应答。因此,DCs是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。鼠伤寒沙门菌在环境中常以生物被膜状态存在,该状态下的沙门菌大大增强了对外界不利生长环境和抗生素等的抵抗力。肠腔中的病原相关分子模式可被肠黏膜天然免疫应答器-Toll样受体特异性识别,诱导DCs形成跨上皮树突抓取细菌。那么生物被膜是否会影响肠黏膜DCs跨上皮摄取能力及相关天然免疫,目前尚不明确。本研究选用了鼠伤寒沙门菌野生株S025和基因缺失突变株（S025ΔcsgD、S025ΔrpoN）,首先研究了生物被膜对鼠伤寒沙门菌感染小鼠的影响,其次,体内评价生物被膜对肠黏膜DCs跨上皮树突形成及捕获鼠伤寒沙门菌能力的影响,最后体外研究生物被膜对鼠伤寒沙门菌诱导DCs成熟的影响。本研究解析了鼠伤寒沙门菌生物被膜与肠黏膜DCs间的相互关系,为进一步阐明沙门菌的致病机理奠定了基础。研究内容主要分为以下两个部分:1生物被膜对鼠伤寒沙门菌感染小鼠的影响本试验对鼠伤寒沙门菌野生株S025及其基因缺失突变株（S025ΔcsgD、S025ΔrpoN）的生物学特性进行研究,包括:生长特性、生物被膜形成能力、对小鼠的致病性及脏器中细菌载量、对肠上皮的黏附入侵能力。结果显示,与野生株相比,csgD和rpoN基因缺失后,细菌的生长速度没有发生改变,但△csgD缺失株丧失生物被膜形成能力,△rpoN缺失株生物被膜形成能力增强。野生株浮游状态、野生株生物被膜状态、ΔcsgD和△rpoN缺失株对小鼠的LD50分别为:3.3 × 1 06、5.3 × 1 05、3.9× 1 06和8.2×105。野生株生物被膜状态及ΔrpoN缺失株组小鼠15 d后存活率仅为10%,野生株浮游状态组小鼠存活率为50%,ΔcsgD缺失株组15 d后小鼠存活率为40%。与野生株生物被膜状态相比,野生株浮游状态和ΔcsgD缺失株感染后的小鼠存活率显着提高,且对小鼠结肠癌上皮细胞CMT-93的黏附和入侵能力下降,△rpoN缺失株对小鼠的存活率和对CMT-93的黏附入侵能力没有显着影响。生物被膜状态的鼠伤寒沙门菌感染小鼠后,粪便、肝脏、脾脏、肾脏和血液中的带菌量显着高于浮游状态的鼠伤寒沙门菌组。上述结果表明,鼠伤寒沙门菌形成生物被膜能显着提高细菌对小鼠的致病力。2生物被膜对鼠伤寒沙门菌诱导DCs跨上皮摄取能力及成熟能力的影响肠道黏膜DCs具有跨上皮摄取细菌的能力。本试验对肠结扎后的小鼠接种鼠伤寒沙门菌,30 min后,共聚焦观察和流式检测。结果显示,与生物被膜状态的鼠伤寒沙门菌组相比,浮游状态的鼠伤寒沙门菌组跨上皮树突数量显着增多,上皮细胞间摄取细菌的DCs数量显着增多,上皮细胞CCL20的分泌量显着增强。野生株浮游状态和△csgD缺失株组,迁移到肠系膜淋巴结中摄取细菌的DCs数量显着增多。上述结果表明,生物被膜抑制鼠伤寒沙门菌诱导DCs跨上皮摄取能力。DCs摄取抗原后逐渐活化和成熟。为了探讨生物被膜对鼠伤寒沙门菌诱导DCs天然免疫应答水平的影响,本试验将鼠伤寒沙门菌与小鼠原代DCs共孵育后,收集DCs及细胞上清液,检测DCs吞噬能力、表型标志、细胞因子的分泌、刺激CD4+T细胞增殖。结果显示,与野生株生物被膜状态组相比,野生株浮游状态组与△csgD缺失株组的DCs吞噬能力较强,ΔrpoN缺失株的DCs吞噬能力较弱;其次,ΔcsgD缺失株可显着促进DCs的表型标志（MHCⅡ、CD40、CD80、CD86）、早期活化标志（CD69）、迁移标志（CCR7）的表达,并且显着促进促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的分泌。在混合淋巴细胞反应试验中,△csgD缺失株组DCs可显着促进CD4+T细胞的增殖。上述结果表明,生物被膜抑制鼠伤寒沙门菌诱导DCs的活化和成熟。
宋丽[4]（2020）在《沙门菌鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应及其机制研究》文中提出2013年3月,中国出现首例人感染新型H7N9禽流感病毒的病例,至今引起了五波流行,共导致1567人感染,死亡率接近40%。在第五波流行中爆发的H7N9高致病性禽流感病毒,对中国家禽贸易和活禽市场构成严重威胁;同时感染人数也急剧增加,感染范围进一步扩大,引起了国内外广泛关注,这些病毒是最有可能导致下一次流感大流行的亚型。因此,针对H7N9禽流感开发一种安全有效的疫苗非常重要。与传统疫苗相比,亚单位疫苗具有更高的安全性,能减少疫苗生产时间。但是,亚单位疫苗的免疫原性较弱,需要添加佐剂来增强其免疫原性。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是细胞表面能够识别病原相关分子模式的一种受体家族,在天然免疫系统中发挥重要作用。鞭毛蛋白是一种TLR5配体,其佐剂活性不断在多种病原上得到验证,但其作为H7N9禽流感亚单位疫苗佐剂,能否诱导抗原特异性细胞免疫应答尚不完全清楚,而细胞免疫对于预防流感病毒这类胞内感染的病原亦十分重要。由于哺乳动物和家禽免疫系统的差异,鞭毛蛋白在家禽流感疫苗中的作用和机制,例如将鞭毛蛋白与抗原融合后,如何激活家禽天然免疫系统,诱导何种免疫应答类型偏向（Th1或Th2）,在家禽中能否诱导黏膜免疫应答,是否能促进抗原诱导的免疫保护效应等尚不完全清楚。鞭毛蛋白是一种强效的佐剂候选,但是它自身的抗原性很强,可能影响其佐剂活性;而且高剂量的鞭毛蛋白可诱导潜在的炎性损伤,引发一些副反应,可能限制其临床应用。因此,减弱鞭毛蛋白的副反应,并维持其佐剂活性,开发具有调节免疫功能的改良型鞭毛蛋白佐剂,应作为人用疫苗佐剂重点研究的方向,这也是一项重要的挑战。鞭毛蛋白发挥佐剂作用的分子机制,一是通过与细胞表面TLR5受体结合,激活MyD88依赖的通路,促进多种细胞因子表达;二是与细胞质中NLRC4受体结合,激活炎性小体,促进炎性因子的表达和分泌;从而激活免疫细胞和非免疫细胞。巨噬细胞是天然免疫系统的吞噬细胞,位于各种组织中,是生物体抗感染的第一道防线。转录组测序（RNA-Seq）是通过高通量测序平台,快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下几乎所有的转录本和基因序列,可从整体水平上反映出细胞中基因的表达情况及其调控规律,因此可作为研究鞭毛蛋白与巨噬细胞相互作用的重要手段,以期补充和完善其激活天然免疫应答的分子机制。1.小鼠模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究以H7N9禽流感亚单位疫苗血凝素（Hemagghutinin,HA）球状部HA1-2抗原为对照,评价其与沙门菌鞭毛蛋白（FliC）的融合蛋白HA1-2-FliC在体内外的佐剂活性。体外细胞实验结果显示,与HA1-2组相比,HA1-2-FliC刺激C3H/HeJ小鼠的BMDCs和脾脏淋巴细胞后,能显着上调细胞因子和趋化因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL2和CXCL10）的表达水平,表明鞭毛蛋白能促进小鼠免疫细胞的活化。通过腹腔免疫C3H/HeJ小鼠,研究鞭毛蛋白对H7N9禽流感HA1-2亚单位疫苗免疫原性的影响。结果显示,二免后12 d,相比于单独HA1-2免疫组,HA1-2-FliC可显着提高HA1-2特异性IgG和血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）抗体水平。同时,HA1-2-FliC诱导的IgG亚型（IgG1和IgG2a）水平均显着提高;ELISpot结果显示脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ和IL-4的细胞数量相当,均显着高于HA1-2组,这些结果表明HA1-2-FliC可诱导Th1/Th2混合型免疫应答。此外,HA1-2-FliC免疫组小鼠脾脏中T细胞表面CD69分子表达量显着增加,细胞增殖水平显着提高,进一步表明HA1-2-FliC能有效地诱导抗原特异性细胞免疫应答。综上所述,本研究结果表明候选疫苗HA1-2-FliC能够有效促进小鼠免疫细胞的活化,诱导高效的HA1-2特异性体液和细胞免疫应答,为研制H7N9禽流感病毒重组亚单位疫苗提供了重要的基础。2.家禽模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究在体外和离体条件下,检测了鞭毛蛋白作用不同类型禽免疫细胞后诱导的细胞因子和趋化因子的表达谱。结果显示,鞭毛蛋白刺激禽巨噬细胞系HD11后,显着提高了 CXCL炎性趋化因子（CXCLi1和CXCLi2）和CCL趋化因子（MIP-1β和MCP-3）的表达水平。此外,融合蛋白HA1-2-FliC体外刺激SPF鸡脾脏淋巴细胞和外周血单核细胞（PBMCs）后,显着上调细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18和IFN-γ）和趋化因子（CXCLi1、CXCLi2和MIP-1β）的表达,表明鞭毛蛋白能在体外激活禽细胞的免疫应答。本研究还评估了 HA1-2-FliC免疫SPF鸡后诱导的抗原特异性体液和细胞免疫应答,结果显示,肌肉注射HA1-2-FliC候选疫苗,可显着提高血清中HA1-2特异性IgG水平。此外,CD4+和CD8+T细胞显着增加,PBMCs增殖能力的显着提高均反映了HA1-2-FliC可诱导鸡体产生强效的细胞免疫应答。接种HA1-2-FliC后,鸡PBMCs中IFN-γ和IL-4的表达量均显着提高,表明鞭毛蛋白FliC在鸡模型中也可促进了Th1/Th2混合型免疫应答。通过鼻腔内免疫SPF鸡,评价鞭毛蛋白作为H7N9禽流感亚单位疫苗的黏膜佐剂,在鸡模型中诱导的免疫保护效应。结果显示,免疫HA1-2-FliC候选疫苗后,显着提高了血清中HA1-2特异性IgG,鼻腔和支气管肺泡灌洗液中HA1-2特异性IgA水平。此外,攻毒结果显示,与HA1-2免疫组相比,添加FliC佐剂能显着降低鸡喉头和泄殖腔中的病毒载量,提高机体清除病毒的能力。综上所述,鞭毛蛋白在体内和体外均能活化禽免疫细胞,促进多种细胞因子和趋化因子的表达;通过肌注和滴鼻免疫SPF鸡,HA1-2-FliC均能显着增强流感亚单位疫苗HA1-2的免疫原性和免疫保护效应,这些发现为在家禽中开发H7N9禽流感HA1-2亚单位疫苗提供了依据。3.改良型鞭毛蛋白FliCΔD2D3在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究构建了一种改良的鞭毛蛋白佐剂FliCΔD2D3（缺失与鞭毛蛋白抗原性相关的高变区D2和D3）,将H7N9禽流感病毒HA1-2抗原融合到FliCΔD2D3的N端,得到改良型H7N9禽流感亚单位疫苗候选HA1-2-FliCΔD2D3。原核系统表达的HA1-2-FliCΔD2D3免疫反应性良好,保留了 TLR5配体活性,可以在体外和离体条件下激活小鼠巨噬细胞、脾脏和外周血单核淋巴细胞,促进各种细胞因子和趋化因子的表达。将 HA1-2、HA1-2-FliC 和 HA1-2-FliCΔD2D3 蛋白腹腔免疫 BALB/c 小鼠,在免疫早期,HA1-2-FliCΔD2D3 诱导产生炎性细胞因子（IL-6、IL-12p40、TNF-α 和 IL-23p19）的水平均显着低于HA1-2-FliC组。二免后12 d,与HA1-2-FliC组相比,HA1-2-FliCΔD2D3组显着降低了血清中鞭毛蛋白自身特异性抗体水平,但并不影响HA1-2特异性抗体和细胞免疫应答水平。IFN-γ/IL-4表达水平表明FliCΔD2D3仍可促进Th1/Th2混合型免疫应答。SPF鸡免疫和攻毒保护实验结果显示,添加FliCΔD2D3佐剂的疫苗比单独HA1-2疫苗诱导更高水平的抗体应答,与FliC佐剂组一致,均能显着减少鸡喉头和泄殖腔中病毒载量。综上所述,本研究构建的改良型H7N9禽流感候选亚单位疫苗HA1-2-FliCΔD2D3显着降低FliC的免疫原性,减弱由其引起的全身性炎性反应,但不影响其佐剂活性。改良后的鞭毛蛋白佐剂FliCΔD2D3为开发更安全有效的人用流感亚单位疫苗提供了基础。4.鞭毛蛋白诱导细胞表达IFN-β的初步探究本研究利用转录组测序（RNA-seq）技术对鞭毛蛋白刺激的RAW264.7细胞基因表达水平进行分析。测序结果显示,共筛选出2204个显着差异表达基因,其中上调表达基因1114个,下调表达基因1090个。KEGG Pathway分析中,富集到免疫相关途径的显着差异表达基因数量最多。GO功能分析中,生物过程分布的显着差异基因主要集中在代谢、正向调控、免疫、防御和应答等过程。其中,值得注意的是,鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞后,涉及多条通路的IFN-β基因显着上调表达。通过qRT-PCR和ELISA方法验证了 RNA-seq结果,发现鞭毛蛋白不仅可以刺激RAW264.7细胞,也可以刺激小鼠BMMs和BMDCs细胞上调表达IFN-β。为了进一步排除鞭毛蛋白FliC提取过程中其它因素对实验的影响,本研究在刺激RAW264.7细胞时,设置同步提取的FliC-FljB-和FliC+Trypsin组作为对照,结果显示,FliC-FljB-和Trypsin+FliC组均不能促进IFN-β上调表达,进一步证明了 FliC本身具有诱导细胞上调表达IFN-β的能力。根据鞭毛蛋白的结构特征,本研究构建并表达His标签融合蛋白FliC、N-FliC、C-FliC和FliCΔD2D3。结果显示,原核表达的全长FliC及其不同结构域片段均具有良好的免疫反应性,其中FliC和FliCΔD2D3具有良好的TLR5配体活性,与预期一致。用不同结构域鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞后,FliC、C-FliC和FliCΔD2D3蛋白均能显着提高IL-1β和IFN-β上调表达;而N-FliC与阴性对照一致,表明鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞上调表达IFN-β的关键结构域是与IL-1β一致,均是C-FliC。这些发现为鞭毛蛋白佐剂机制的进一步研究提供了新的科学线索。
吕强华[5]（2020）在《丁香醛对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的抑制作用及机制》文中进行了进一步梳理沙门氏菌是在全球公共卫生学上具有重要意义的人兽共患病原菌之一。沙门氏菌感染给畜禽养殖业造成重大经济损失,同时造成食物中毒威胁人类生命健康。目前,治疗沙门氏菌感染的首选方法是使用抗生素,而随着沙门氏菌耐药性问题的日趋严重,给沙门氏菌病的防控带来严峻挑战。如何有效的对抗沙门氏菌感染已成为世界各国共同关注的问题,以抗细菌毒力为代表的抗生素替代策略引起人类广泛关注。研究证实,在感染过程中沙门氏菌主要依赖于其毒力岛（SPI）介导的Ⅲ型分泌系统（T3SS）发挥致病作用,而SPI1-1的某些关键基因或效应蛋白缺失后感染宿主的能力显着降低甚至丧失。因此,沙门氏菌T3SS成为抗感染药物研发的理想靶标。中药在我国的应用历史悠久,具有分布广、生物学活性多样、成本低、药残低和不易诱导耐药等诸多优势,为抗细菌毒力药物研发提供天然资源宝库。因此,自中药来源的天然化合物中进行抗细菌毒力药物的研发成为人们的首选。本研究通过构建沙门氏菌SipA/SipB-TEM-β-内酰胺酶融合报告菌株,以沙门氏菌T3SS效应蛋白的转运功能为表型进行天然化合物来源抑制剂筛选。通过大量筛选和鉴定,发现丁香醛、杨梅素和丹皮酚等在无抗菌活性浓度内有效抑制沙门氏菌T3SS效应蛋白的转运,后续选择活性最强的丁香醛进行研究。体外药物活性评价发现,丁香醛显着抑制沙门氏菌入侵宿主细胞和显着降低其介导的宿主细胞损伤。通过生物化学、分子生物学和高通量测序转录组学等研究方法进行作用机制研究,发现经丁香醛处理后,T3SS入侵效应蛋白和调节蛋白表达显着下调;高通量测序转录组学发现经丁香醛处理后沙门氏菌多个差异性表达基因mRNA转录水平均显着下调;继续追踪T3SS调控网络中多个关键毒力基因进行实时荧光定量PCR（RT-PCR）分析,表明丁香醛通过抑制SPI-1中的hilD-hilC-rstA-hilA基因调控路径,降低下游效应蛋白（SipA,SipB和SipC）和调节蛋白（HilA）的表达,从而抑制沙门氏菌的致病力。沙门氏菌感染小鼠实验治疗学表明,丁香醛有效延长沙门氏菌感染小鼠的存活时间,并显着提高感染小鼠的存活率;病理组织学分析发现,丁香醛缓解鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的肝脏、脾脏和盲肠的病理性损伤;显着降低感染小鼠盲肠组织的细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ）含量。综上所述,本文从抑制剂的筛选、体内外药物活性评价和作用机制等三方面进行系统分析,发现丁香醛具有良好的体外药物活性和体内保护效果,并初步阐明其抑制沙门氏菌T3SS功能的作用机制,本研究将为抗沙门氏菌感染提供候选化合物。
李智伟[6]（2020）在《布鲁氏菌感染中巨噬细胞极化通过PD-1/PD-L2途径对T细胞亚群的调控作用研究》文中指出目的:布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌（brucella）感染导致的一种人畜共患病。慢性程度高,免疫机制不清。本研究以布鲁氏菌病为疾病模型,探讨巨噬细胞极化和程序性死亡蛋白1（Programmed death 1,PD-1）及其配体2（Programmed cell death ligand2,PD-L2）通路在布鲁氏菌病发生发展中的作用及分子机制,为研究布鲁氏菌感染的免疫机制提供新的理论依据。通过研究明确布鲁氏菌持续感染时巨噬细胞极化特点以及淋巴细胞亚群的变化特点;阐明M2型巨噬细胞通过PD-1/PD-L2途径变化调控Th细胞的机制;探讨外膜蛋白2b（Outer membrane protein 2b,Omp2b）蛋白对巨噬细胞极化的影响。方法:（1）对581例布鲁氏菌病患者进行人口学,流行病学,临床特征和实验室检查特点分析。收集2017年9月至2019年6月就诊于维吾尔自治区人民医院住院和门诊的布鲁菌患者共126例,同期120例体检健康志愿者作为健康对照人群。通过流式细胞术检测外周血M1和M2型巨噬细胞以及PD-L2的表达;荧光定量PCR和Western Blot检测iNOS、Arg-1、TNF-α、IL-1RA的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测血清中TNF-α、IL-1RA水平。通过体外试验观察被布鲁氏菌刺激后的巨噬细胞功能特点改变。（2）通过流式细胞术检测外周血中淋巴细胞亚群,Th1,Th2,Th17,Treg细胞及其上PD-1的表达变化。荧光定量PCR和Western Blot检测T-bet、GATA-3、IFN-γ、IL-4的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测血清中IFN-γ和IL-4水平。通过分选布鲁氏菌患者的M2细胞和健康对照人群的CD4+T细胞,进行体外刺激试验。分别对PD-L2进行增强或阻断,以及对PD-1阻断,观察荧光定量PCR和Western Blot检测T-bet、GATA-3、IFN-γ、IL-4的mRNA和蛋白表达;Aimplex法检测IFN-γ和IL-4的变化情况。（3）将THP-1细胞诱导为M1和M2型巨噬细胞,加入Omp2b蛋白进行体外培养试验。通过流式细胞术检测CD86、CD80、CD206和CD163表达情况;荧光定量PCR和Western Blot检测iNOS、Arg-1、TNF-α和IL-1RA的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测TNF-α、IL-6、IL-1RA、IL-10的水平变化情况。观察Omp2b蛋白对M1和M2型巨噬细胞的影响。使用生物信息学分析Omp2b蛋白并进行免疫原性检验。结果:（1）流式细胞术检测发现M2型巨噬细胞在布鲁氏菌病时增加,PD-L2在M2细胞上表达降低。荧光定量PCR和Western Blot在分子和蛋白水平检测表明iNOS和TNF-α轻度增加,Arg-1和IL-1RA显着增加,Arg-1/iNOS和IL-1RA/TNF-α显着增加。血清中TNF-α增高,IL-1RA显着增高,IL-1RA/TNF-α显着增高。体外试验结果发现被布鲁氏菌刺激后的巨噬细胞吞噬能力下降,未刺激组的iNOS、TNF-α的mRNA和蛋白水平下降,而Arg-1、IL-1RA的mRNA相对水平升高。CD206表达上调,CD86、PD-L2和HLA-DR表达下调。（2）流式细胞术检测发现,CD3+T比例无明显变化,CD4+T比例下降,CD8+T、CD19+B、CD16+56+NK细胞比例增多,绝对数量检测发现所有淋巴细胞都增加。Th1降低,Th2增多,Th17不变,Treg增高,PD-1在Th1、Th2、Treg细胞上的表达增高。血清中IFN-γ轻度增加,IL-4明显增加,IL-4/IFN-γ显着增加。T-bet的mRNA和蛋白水平无明显变化,GATA-3和IL-4的mRNA和蛋白水平则升高,IFN-γ的mRNA和蛋白水平升高。体外试验结果发现,在加入了PD-L2后,M2型巨噬细胞会上调T-bet和IFN-γ的表达水平,并下调GATA-3和IL-4的表达水平。在加入了Anti-PD-L2后,M2型巨噬细胞会进一步下调T-bet的表达水平,并上调GATA-3和IL-4的表达水平,阻断PD-L2后则会得到相反的结果。加入PD-L2使T-bet和IFN-γ的表达水平升高后,进一步加入Anti-PD-L2阻断PD-L2可以下调T-bet和IFN-γ的表达水平。在加入PD-L2并阻断PD-L2后,T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-4的表达水平恢复到与M2组相同的水平。在阻断PD-L2或者阻断PD-1后T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-4的表达水平无明显差异。（3）体外试验表明,Omp2b刺激后的M2细胞上的CD86、CD80的表达水平上调,CD206和CD163表达水平下调;iNOS、TNF-α的mRNA和蛋白水平上调,Arg-1、IL-1RA的mRNA和蛋白水平下调;TNF-α,IL-6水平增多,IL-1RA、IL-10水平降低。Omp2b刺激后的M1细胞上的iNOS、Arg-1、IL-1RA的mRNA和蛋白无变化;TNF-α,IL-6水平增多,IL-1RA、IL-10水平无明显变化。生物信息学分析发现Omp2b蛋白中有3个Th表位、7个CTL表位,8个B细胞表位和1个TB联合表位,可以有效刺激宿主产生免疫应答。结论（1）布鲁氏菌病患者体内巨噬细胞以M2型极化占优势,M2型巨噬细胞上的PD-L2表达下调。体外试验表明布鲁氏菌能诱导巨噬细胞向M2方向极化以及表型改变,PD-L2参与了巨噬细胞极化及免疫应答改变。（2）布鲁氏菌病患者外周血中CD4+T淋巴细胞亚群数量增加,CD4/CD8比值下降。Th1细胞比例降低,Th2细胞比例增多,Treg细胞比例增多,Th1、Th2、Treg上的PD-1增高,PD-1参与了CD4+T亚群的调控。体外试验表明M2型巨噬细胞通过PD-1/PD-L2途径影响Th1/Th2平衡参与布鲁氏菌病的发生发展。（3）Omp2b蛋白能够抑制M2型极化,并促进M2型巨噬细胞向M1方向转变。生物信息学分析发现Omp2b蛋白中有10个T细胞表位,8个B细胞表位和1个T-B联合表位,可以有效刺激T细胞产生IFN-γ,发生Th1型免疫应答,有助于抵抗布鲁氏菌感染。
朱悦[7]（2019）在《基于肠炎沙门菌CZ14-1的减毒疫苗候选株的构建与免疫保护效力的评价》文中研究说明肠炎沙门菌是一种重要的食源性病原菌,宿主谱广泛且具有侵害性,具有重要的公共卫生意义。利用抗生素治疗虽能达到一定的效果,但极易导致多重耐药菌株的产生及肉产品中的药物残留。因此,研制出安全、有效的疫苗是预防和控制畜禽肠炎沙门菌病的有效措施。随着基因工程和分子生物学技术的发展,将沙门菌的重要毒力基因敲除,构建沙门菌减毒活疫苗的研究得到了国内外的广泛关注。减毒活疫苗具有使用方便、免疫原性好、毒力弱等优点,即使在“免疫空白期”也能产生良好的免疫保护力。此外,通过基因敲除可获得血清学上的阴性标记,建立区分野毒感染和疫苗接种动物的（Differentiating Infected and Vaccinated Animals,DIVA）检测方法,从而为养殖与生产过程区分疫苗接种动物和野生型细菌感染动物提供依据。本研究联合应用λ-Red同源重组系统和自杀质粒介导的同源重组方法,分别将肠炎沙门菌CZ14-1的毒力相关基因spiC和外膜蛋白相关基因nmpC以及脂多糖O-抗原链合成相关基因rfaL敲除,在构建CZ14-1AspiC单缺失株的基础上构建了两株双基因缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC与CZ14-1ΔspiCΔrfaL,并评价了两株双基因缺失株生理生化特性以及对不同品种雏鸡的致病性,同时对双缺失株的免疫保护效力进行了初步探究,为肠炎沙门菌减毒活疫苗的研究提供了材料和依据。1.减毒肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCAnmpC与CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株的构建与鉴定以肠炎沙门菌CZ14-1为模板,通过重组自杀质粒pGMB152-ΔspiC/Cm介导的同源重组系统,敲除肠炎沙门菌CZ14-1的spiC基因,成功构建CZ14-1ΔspiC缺失株。随后利用PCR技术扩增出两端与肠炎沙门菌基因nmpC上、下游序列同源且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段和两端与肠炎沙门菌基因rfaL上、下游序列同源且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,电击转化入含有质粒pKD46的CZ14-1ΔspiC中,分别获得替换nmpC和rfaL的阳性克隆（CZ14-1ΔspiCΔnmpC::cat和CZ14-1ΔspiCΔrfaL::cat）,再电转入温度敏感性型质粒pCP20以消除氯霉素抗性基因,通过PCR以及测序鉴定,成功构建了肠炎沙门菌双基因缺失株 CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL。对野生株CZ14-1和缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC、CZ14-1ΔspiCΔrfaL的体外生长特性、生化特性进行鉴定,结果表明,spiC和nmpC基因的缺失对细菌的生长特性和生化特性无显着影响,但是rfaL基因的缺失会使细菌的生长速度减缓,并且对甘露醇的代谢能力发生了变化。2.减毒肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株免疫保护效力的初步研究动物实验结果显示:肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC在3日龄海兰白蛋鸡上的LD50为1.58 X 107CFU,细菌CZ14-1ΔspiCΔrfaL在3日龄海兰白蛋鸡上的LD50为7.76 ×106CFU。与野生株CZ14-1的LD50相比（约为2.24× 104CFU）,毒力约下降了 705倍和346倍。细菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC在3日龄SPF雏鸡上的LD50为2.57 × 107CFU,细菌CZ14-1ΔspiCΔrfaL在3日龄海SPF雏鸡上的LD50为4.07× 106CFU。与野生株CZ14-1的LD50相比（约为1.26× 104CFU）,毒力分别约下降了 2030倍和323倍。与野生株相比,在不同品种的雏鸡上,两株双缺失株的毒力均明显下降。将缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaZ分别以肌肉注射的途径免疫7日龄的海兰白雏鸡,在14日龄时进行二次免疫,10天后以肌肉注射的方式人工感染野生型菌株 CZ14-1,剂量为 2.0 X 109CFU/只。结果显示,CZ14-1ΔspiCΔnmpC 和 CZ14-1ΔspiCΔrfaL能够对野生株的大剂量攻毒分别产生80%和75%的保护力,未免疫组的存活率仅有5%;且免疫组体重净增量也较未免疫组有明显提高。在体内分布与定植试验中,将野生株和2株双缺失株以肌肉注射的方式接种3日龄的海兰白雏鸡,在肝脏和回肠内,两株缺失株在接种后21天被机体清除。利用间接ELISA检测血清中的IgG抗体,结果显示,两株缺失株在免疫后1周即可在血清中检测到IgG抗体,抗体水平在随后的数周逐渐上升并在免疫后第5周达到高峰。荧光定量PCR检测CZ14-1Δsp/CΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL在免疫过程中脾脏细胞因子的表达结果显示:与对照组相比,IFN-γ和IL-6表达水平显着上调,表明两株双缺失株都能引起强烈的Th1倾向的免疫应答,有助于胞内沙门菌的清除。以SpiC蛋白作为包被抗原进行间接ELISA检测,可以明显的区分出野生株感染和两株双缺失株接种的鸡。通过玻板凝集试验（SPA）可以明显区分野生株感染和CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株接种的鸡,说明两株双缺失株都具有DIVA能力,可以利用不同的方法区分出疫苗接种动物和野毒感染动物。以上结果显示,两株双缺失株不仅具有良好的安全性,并且能针对野生型毒株的高剂量攻毒提供较好的保护和DIVA能力,为将其开发成为肠炎沙门菌减毒活疫苗候选株奠定了基础。
尹超,徐黎娟,李求春,潘志明,耿士忠,焦新安[8]（2019）在《禽沙门菌诱导宿主免疫应答的特性》文中认为沙门菌病（Salmonellosis）是全世界最普遍的食源性疾病之一,不仅对养殖业造成经济损失,还对人类安全构成威胁。禽沙门菌感染肠道后,可诱导肠上皮细胞表达多种TLRs和炎症反应的发生,在分泌的趋化因子作用下免疫效应细胞迁移到感染部位。细菌通过肠上皮细胞屏障后被巨噬细胞或树突状细胞吞噬,其中巨噬细胞是沙门菌的主要定殖场所。天然免疫系统将抗原递呈给淋巴细胞后,机体能够在2–3周内通过以Th1为主的免疫应答清除在肠道和深层组织中的沙门菌。而宿主特异性血清型鸡白痢沙门菌从肠道侵入后,在肝脾和其他器官中定殖,进而引发全身感染。早期感染阶段不会引起肠道炎症反应,主要诱导以Th2为主的免疫应答,而Th1型应答相对较弱,有利于鸡白痢沙门菌在机体内的持续存在和感染。本文围绕禽沙门菌的致病机理和免疫应答特性进行阐述,尤其对鸡白痢沙门菌免疫逃逸和持续载菌的特性进行深入分析,为禽沙门菌病的防控提供新靶标和新见解。
于水星[9]（2018）在《MLKL在鼠伤寒沙门菌黏膜感染中的作用及机制研究》文中研究指明MLKL是一种假激酶蛋白,最初作为RIPK3的特异性底物被发现,是目前发现介导细胞坏死性凋亡信号的最下游效应分子。由于MLKL的N端四螺旋束功能区具有与生物膜结合并介导生物膜打孔或透化的特性,因此MLKL被认为是细胞发生坏死性凋亡的执行者。目前,关于MLKL生物学功能的报道主要集中于细胞死亡领域,其介导的细胞坏死性凋亡参与金黄色葡萄球菌的局部和全身性感染以及某些自身炎症性疾病的发生。然而,MLKL是否参与调节肠道黏膜屏障功能并不清楚。沙门菌感染引起的肠炎严重危害畜牧业发展和人类健康,是全球重要的公共卫生问题。研究调节肠道黏膜免疫反应的分子机制,找到干预靶标,有利于沙门菌感染性肠炎的防控。本论文对MLKL在宿主防御沙门菌黏膜感染中的作用和机制进行了较为深入的研究。利用WT和MLKL-/-小鼠构建沙门菌感染性肠炎模型,首先分析MLKL是否影响宿主对沙门菌的易感性。结果发现,与WT小鼠相比,MLKL-/-小鼠对沙门菌黏膜感染更为易感,主要表现为小鼠存活率显着降低、体重减轻更为明显,且在沙门菌感染48h后,伴有以盲肠重量减轻、杯状细胞减少、黏膜下层水肿明显、肠上皮完整性破坏明显、大量的炎性细胞浸润以及炎性介质产生等为主要特征的肠道病理损伤。由于沙门菌经消化道进入宿主体内后,突破肠道黏膜屏障并扩散至系统位点,引起宿主的胃肠炎、败血症及全身性感染（伤寒症）等。因此,我们推测沙门菌感染后MLKL-/-小鼠体现的严重肠道炎症和全身症状可能伴随细菌的大量定殖,实验证实沙门菌感染48h后,MLKL-/-小鼠盲肠组织和肠系膜淋巴结（肠道位点）与肝脏和脾脏（系统位点）均定殖了大量的细菌。总之,沙门菌感染后,MLKL-/-小鼠存活率降低,组织损伤严重,炎性反应加剧,沙门菌入侵和扩散增多,说明MLKL有助于机体抗沙门菌黏膜感染。肠道黏膜屏障功能的完整性在防御肠道病原入侵和扩散中起重要作用。为了探究MLKL是否通过促进黏膜屏障功能完整和维护肠道稳态实现其抗感染作用,我们进行如下实验:首先,通过AB-PAS染色和免疫组织化学方法检测盲肠组织中黏蛋白的表达情况。结果发现,在沙门菌感染48h后,与WT小鼠相比,MLKL-/-小鼠盲肠组织中黏蛋白的表达显着减少,且粘液的主要组成成分mucin 2表达也显着减少,说明MLKL缺失导致肠道黏膜化学屏障受损更严重。肠上皮细胞的更替（增殖和凋亡）也是维护肠道组织平衡和屏障功能的要素,通过免疫荧光和TUNEL染色发现,在沙门菌感染48h后,尽管两种基因型小鼠肠上皮细胞的增殖无明显差异,但MLKL-/-小鼠肠上皮细胞的凋亡明显增加,说明MLKL信号参与调节组织平衡以维持肠道黏膜层的完整,进而限制沙门菌的入侵。此外,通过实时荧光定量PCR、免疫组织化学和免疫蛋白印迹检测盲肠组织中紧密连接蛋白的表达情况。结果发现,在沙门菌感染48h后,尽管两种基因型小鼠盲肠组织中occludin和ZO-1的表达无明显差异,但与WT小鼠相比,MLKL-/-小鼠盲肠组织中claudin-3的表达显着减少。与此同时,在体应用葡聚糖荧光探针检测肠道渗透性的变化情况,发现在沙门菌感染48h后,与WT小鼠相比,MLKL-/-小鼠肠道的渗透性显着增加,说明MLKL-/-小鼠的肠道黏膜屏障功能更易被破坏。上述结果表明,在MLKL基因缺失后,肠道黏膜屏障功能和肠道稳态更易被沙门菌所破坏。然而,上述结果还不能准确揭示MLKL的保护机制,例如不能明确脆弱的肠道黏膜屏障、过度的炎症和增多的入侵沙门菌之间的因果关系,因此进行沙门菌急性感染实验。结果发现,在沙门菌感染6h后,与WT小鼠相比,MLKL-/-小鼠肠道位点的细菌定殖数量有明显的增加趋势,然而两种基因型小鼠的肠炎并不显着,且黏蛋白的表达也无明显差异。尽管感染后MLKL-/-小鼠盲肠组织中claudin-3的表达减少,但在未感染状态下,两种基因型小鼠盲肠组织中claudin-3的表达并无明显差异。这些结果说明MLKL主要通过限制沙门菌在肠道黏膜的早期定殖,从而阻止肠道黏膜屏障功能和稳态的破坏、抑制过度炎症和阻止细菌向系统位点的扩散,起到抗沙门菌黏膜感染作用。MLKL如何限制沙门菌的早期定殖,是我们需要探究的新问题。首先,应用免疫组织化学方法分析MLKL的表达定位,发现在沙门菌感染后,p-MLKL主要表达于肠隐窝处的上皮细胞和浸润的炎性细胞。肠上皮细胞和浸润的单核巨噬细胞等炎性细胞均是肠道黏膜天然免疫的结构基础,表达多种模式识别受体（PRRs）识别病原和介导免疫应答反应,是构成肠道黏膜免疫的第一道防线。然而,通过构建WT/MLKL-/-骨髓嵌合体小鼠,发现主要是肠道黏膜非造血细胞（肠上皮细胞）表达的MLKL限制沙门菌的早期定殖。近年来,炎性体是天然免疫研究领域的前沿课题,相继发现肠上皮细胞表达的NLRP3、NLRC4和NLRP9b等多种炎性体在防御肠道病原如细菌、病毒或寄生虫等感染中发挥重要作用,因此我们分析MLKL介导的抗感染保护作用是否依赖于炎性体信号。结果发现,在沙门菌感染6h和48h后,与WT小鼠相比,MLKL-/-小鼠盲肠组织中炎性体信号被显着抑制。同时,在MLKL基因缺失后,盲肠组织中炎性体活化依赖的IL-18分泌也显着减少,回补外源的IL-18重组蛋白可显着降低MLKL-/-小鼠肠道位点和系统位点的沙门菌定殖数。上述结果说明肠道黏膜非造血细胞（肠上皮细胞）表达的MLKL通过促进炎性体信号活化,起到限制沙门菌在肠道黏膜早期定殖的作用。综上所述,本论文证明了坏死性凋亡信号的效应分子MLKL通过促进肠道黏膜非造血细胞（肠上皮细胞）炎性体信号活化,限制沙门菌在肠道黏膜的早期定殖,并维护肠道稳态和抑制感染性肠炎,从而实现其抗感染保护作用。
李建波[10]（2018）在《肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株的安全性及免疫效果评价》文中指出肠炎沙门氏菌（salmonella enteritidis）是一种兼性胞内寄生菌,能引起人和各种动物的沙门氏菌病,主要表现为胃肠炎和败血症,是人类食物中毒的主要病原菌之一。肠炎沙门氏菌主要通过沙门氏菌毒力岛（Salmonella Pathogenicity Island,SPI）发挥致病作用,毒力基因ssr AB作为SPI-2上的双组份调控系统,对肠炎沙门氏菌在宿主细胞的定植起重要作用。免疫接种是预防沙门氏菌病最有效的方法,相对于灭活疫苗,弱毒活疫苗对于预防肠炎沙门氏菌在肠道的定植及系统性感染方面具有更好的效果。与传统方法致弱的活疫苗相比,沙门氏菌基因工程减毒活疫苗不仅能更有效地激发宿主的体液免疫和细胞免疫,而且具有突变特性稳定、不易发生毒力返强等优点。本研究在前期利用基因工程技术将宠物犬源肠炎沙门氏菌G9（亲本株）成功构建的1株ssr AB基因缺失减毒株（G9Δssr AB）的基础上,进一步开展生物安全性和免疫原性、免疫保护力的评价研究,从而为该基因缺失减毒株在免疫预防肠炎沙门氏菌病/感染中的应用提供科学依据。本研究利用构建的肠炎沙门氏菌基因缺失减毒株G9Δssr AB,以昆明小鼠为实验动物模型,进行如下研究:第一,利用口服接种的方法接种不同剂量的G9Δssr AB,并采用间接ELISA方法测定血清Ig G抗体效价,结合小鼠存活率确定G9Δssr AB的最佳免疫剂量。第二,将G9Δssr AB在LB液体培养基上连续传代至第30代,每5代利用PCR方法鉴定并测序验证,进行体外遗传稳定性试验。第三,对接种G9Δssr AB及其亲本株G9后小鼠的肝脏、脾脏、小肠定期无菌采样、称重、研磨、匀浆、梯度稀释后,采用倾注平板法接种至沙门氏菌显色培养基上进行菌落计数,测定G9Δssr AB及G9在小鼠体内的定植清除效率。第四,采用间接ELISA方法测定G9Δssr AB免疫后小鼠外周血Ig G及肠道粘膜Ig A抗体水平,5种细胞因子水平（IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1）,利用MTT法测定脾淋巴细胞增殖指数,利用流式细胞术测定外周血中CD4+、CD8+T细胞亚群百分比。第五,通过免疫攻毒试验,测定G9Δssr AB对肠炎沙门氏菌的免疫保护力以及对鼠伤寒沙门氏菌的交叉保护力,并取攻毒后小鼠的肝脏、脾脏、小肠制作病理组织切片观察病理变化。综合评价G9Δssr AB的生物安全性、免疫原性及免疫保护力。结果显示:G9Δssr AB口服免疫小鼠的最佳免疫剂量为5.0×107CFU;G9Δssr AB体外连续传代30代能够稳定遗传;与亲本株G9相比G9Δssr AB在小鼠体内能够更快的清除,在接种后12天基本清除其体内定植的G9Δssr AB;以5.0×107CFU/0.2m L/只的G9Δssr AB免疫小鼠并在两周后以相同剂量加强免疫,一免一周、一免二周、二免一周、二免二周的Ig G抗体效价分别为1:800、1:1600、1:12800、1:51200;与亲本株G9相比G9Δssr AB诱导机体产生的5种细胞因子水平（IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1）、肠道粘膜分泌型Ig A抗体水平、脾淋巴细胞增殖指数、CD4+与CD8+T细胞亚群百分比均无显着差异（P>0.05）,且与对照组相比差异显着（P<0.05）;以10倍LD50剂量的G9攻毒,攻毒保护率为90%,攻毒后小鼠肝脏、脾脏、小肠无明显病理变化,以10倍LD50剂量的鼠伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50115攻毒,攻毒保护率为60%。结果表明:G9Δssr AB符合研制肠炎沙门氏菌病/感染活疫苗的菌株生物安全性要求,具有良好的免疫原性、免疫保护力及交叉免疫保护力,具有在制备肠炎沙门氏菌基因工程减毒活疫苗中的应用前景。
二、单核吞噬细胞应答伤寒沙门菌的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单核吞噬细胞应答伤寒沙门菌的实验研究（论文提纲范文）
（1）鸡白痢沙门菌诱导Th2应答相关抗原的鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述一 沙门菌持续感染宿主的研究进展 |
| 1 沙门菌的宿主嗜性 |
| 2 沙门菌的持续感染 |
| 3 沙门菌持续感染存在的部位 |
| 4 影响沙门菌持续感染的宿主和病原体因素 |
| 5 沙门菌持续感染机制的研究 |
| 6 针对沙门菌持续感染的T细胞应答 |
| 7 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 巨噬细胞M1/M2分型的研究进展 |
| 1 M1/M2巨噬细胞的定义和特征 |
| 2 M1/M2巨噬细胞参与Th1/Th2应答 |
| 3 M1/M2巨噬细胞在炎症中的作用 |
| 4 M1/M2巨噬细胞的转换 |
| 5 M1/M2巨噬细胞中Akt信号通路的作用 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡白痢沙门菌中调控巨噬细胞产生NO的基因筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门菌中NO相关基因对巨噬细胞M1/M2极化分型的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡白痢沙门菌449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA诱导鸡体免疫应答的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡白痢沙门菌449/87ΔcyaA作为疫苗候选株的免疫保护效力评估 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）肠炎沙门菌新型抑炎效应蛋白TcpS逃逸宿主天然免疫的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 沙门菌调控宿主免疫系统的研究进展 |
| 1 沙门菌概述 |
| 2 沙门菌SPI-1和SPI-2效应蛋白 |
| 3 沙门菌诱导宿主免疫应答的机制 |
| 4 沙门菌逃逸宿主免疫系统的策略 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 肠炎沙门菌TcpS生物信息学分析及其表达分泌规律研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 肠炎沙门菌抑炎效应蛋白TcpS对细菌毒力的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 肠炎沙门菌TcpS干扰宿主天然免疫的分子机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 TcpS TIR结构域功能性肽段的抑炎抗感染功效 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）生物被膜在鼠伤寒沙门菌逃逸树突状细胞免疫监视中的作用和机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 第一章 细菌生物被膜的形成及其致病机制的研究进展 |
| 1 生物被膜的相关成分 |
| 2 生物被膜形成的过程 |
| 3 生物被膜的危害 |
| 4 细菌感染的致病机制 |
| 5 生物被膜感染的防治 |
| 参考文献 |
| 第二章 生物被膜对宿主免疫应答影响的研究进展 |
| 1 先天性免疫应答 |
| 2 适应性免疫应答 |
| 参考文献 |
| 第一章 生物被膜对鼠伤寒沙门菌感染小鼠的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物、细胞、菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细菌培养 |
| 1.4 生长曲线测定 |
| 1.5 生物被膜测定 |
| 1.6 LD_(50)、体重变化及存活率测定 |
| 1.7 脏器载菌量测定 |
| 1.8 黏附和入侵试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 生长曲线的测定 |
| 2.2 鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力 |
| 2.3 生物被膜对鼠伤寒沙门菌感染小鼠后LD_(50)的影响 |
| 2.4 生物被膜对鼠伤寒沙门菌感染小鼠后体重变化和存活率的影响 |
| 2.5 生物被膜对鼠伤寒沙门菌感染小鼠后脏器中细菌载量的影响 |
| 2.6 生物被膜对鼠伤寒沙门菌黏附入侵CMT-93细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 生物被膜对鼠伤寒沙门菌诱导DCs跨上皮摄取及成熟能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及菌株 |
| 1.2 试剂和设备 |
| 1.3 细菌培养及灭活 |
| 1.4 共聚焦显微镜检测肠道黏膜DCs跨上皮树突形成 |
| 1.5 流式检测肠道上皮细胞CCL20/CCL5的表达情况 |
| 1.6 流式检测肠系膜淋巴结中摄取鼠伤寒沙门菌的DCs数量 |
| 1.7 小鼠DCs的原代诱导培养 |
| 1.8 DCs吞噬鼠伤寒沙门菌能力的检测 |
| 1.9 流式检测DCs表面标志 |
| 1.10 流式检测DCs活化标志 |
| 1.11 ELISA检测DCs细胞因子分泌水平 |
| 1.12 流式检测DCs迁移标志 |
| 1.13 混合淋巴细胞反应 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物被膜对鼠伤寒沙门菌诱导肠道黏膜下方DCs伸出树突数目的影响 |
| 2.2 生物被膜对鼠伤寒沙门菌诱导肠道上皮细胞分泌趋化因子CCL20和CCL5的影响 |
| 2.3 生物被膜对肠系膜淋巴结中摄取鼠伤寒沙门菌的DCs数量的影响 |
| 2.4 生物被膜对DCs吞噬鼠伤寒沙门菌能力的影响 |
| 2.5 生物被膜对DCs表型标志的影响 |
| 2.6 生物被膜对DCs活化标志的影响 |
| 2.7 生物被膜对DCs分泌细胞因子的影响 |
| 2.8 生物被膜对DCs迁移标志CCR7表达的影响 |
| 2.9 混合淋巴细胞反应结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）沙门菌鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述一 H7N9流感疫苗研究进展 |
| 1 临床前阶段H7N9流感疫苗 |
| 2 临床阶段H7N9流感疫苗 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 鞭毛蛋白作为疫苗佐剂的分子机制及应用 |
| 1 鞭毛蛋白的结构特征 |
| 2 鞭毛蛋白佐剂的分子机制 |
| 3 鞭毛蛋白的佐剂活性 |
| 4 基于鞭毛蛋白佐剂疫苗的优点 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 小鼠模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 家禽模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 改良型鞭毛蛋白FliCΔD2D3在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鞭毛蛋白诱导细胞表达IFN-β的初步探究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）丁香醛对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的抑制作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 沙门氏菌的研究进展 |
| 1.1 沙门氏菌的微生物学特性 |
| 1.2 沙门氏菌的危害 |
| 1.3 沙门氏菌的感染机制 |
| 1.4 沙门氏菌的毒力因子 |
| 第2章 沙门氏菌Ⅲ型分泌系统研究进展 |
| 2.1 T3SS的分子结构 |
| 2.2 T3SS结构的组装 |
| 2.3 T3SS的功能 |
| 第3章 Ⅲ型分泌系统抑制剂的筛选及应用的研究进展 |
| 3.1 T3SS抑制剂的研究简介 |
| 3.2 T3SS抑制剂筛选的方法和机理 |
| 3.3 沙门氏菌T3SS抑制剂的研究进展 |
| 3.4 丁香醛的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂的筛选与发现 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 丁香醛体外药物活性评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 丁香醛抑制沙门氏菌T3SS功能作用机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 丁香醛对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的治疗学实验 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间的学术成果 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）布鲁氏菌感染中巨噬细胞极化通过PD-1/PD-L2途径对T细胞亚群的调控作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 布病患者外周血巨噬细胞M2 极化及其PD-L2 改变特点 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 病人资料与方法 |
| 1.2 临床实验方案 |
| 1.3 试剂与耗材 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 布病患者淋巴亚群变化特点及PD-1/PD-L2 途径介导Th亚群平衡 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 布鲁氏菌外膜蛋白Omp2b抑制巨噬细胞M2 极化影响Th1/Th2 失衡 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 创新点和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）基于肠炎沙门菌CZ14-1的减毒疫苗候选株的构建与免疫保护效力的评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 沙门菌疫苗研究进展 |
| 1. 沙门菌的病原学特征 |
| 2. 沙门菌疫苗的研究进展 |
| 2.1 常见的沙门菌疫苗种类 |
| 2.1.1 传统灭活疫苗 |
| 2.1.2 亚单位疫苗 |
| 2.1.3 基因缺失疫苗 |
| 2.2 减毒沙门菌疫苗的构建方法 |
| 2.2.1 化学诱变减毒 |
| 2.2.2 基因工程减毒 |
| 2.3 减毒沙门菌常见的突变基因 |
| 2.3.1 芳香酸生物合成途径相关基因 |
| 2.3.2 htrA |
| 2.3.3 phoP/phoQ调控基因 |
| 2.3.4 腺苷酸环化酶和环AMP受体蛋白编码基因 |
| 2.3.5 hilA |
| 2.3.6 其他减毒基因 |
| 3. 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC与CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiC突变株的筛选与验证 |
| 1.2.3 用于同源重组的PCR片段的扩增与纯化 |
| 1.2.4 λ-Red同源重组系统的诱导表达和感受态细胞的制备 |
| 1.2.5 目的基因nmpC的替换和鉴定 |
| 1.2.6 目的基因rfaL的替换和鉴定 |
| 1.2.7 氯霉素抗性基因的敲除与验证 |
| 1.2.8 肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株的生理生化特性鉴定 |
| 1.2.9 缺失株对雏鸡的LD_(50)测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiC的筛选和验证 |
| 2.2 肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC的筛选和验证 |
| 2.2.1 用于同源重组的PCR片段的获得与纯化 |
| 2.2.2 目的基因nmpC的缺失与鉴定 |
| 2.3 肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔrfaL的筛选和验证 |
| 2.3.1 用于同源重组的PCR片段的获得与纯化 |
| 2.3.2 目的基因rfaL的缺失与鉴定 |
| 2.3.3 氯霉素抗性基因的消除 |
| 2.4 CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL突变株的生化特性鉴定 |
| 2.5 CZ14-1ΔspiCΔnmpC和CZ14-1ΔspiCΔrfaL突变株的生长曲线 |
| 2.6 肠炎沙门菌缺失株对3日龄雏鸡的LD_(50)测定 |
| 2.6.1 三株细菌对3日龄SPF雏鸡的LD_(50)测定 |
| 2.6.2 三株细菌对3日龄海兰白雏鸡的LD_(50)测定 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC与CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株免疫保护力的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 突变株对鸡群的免疫保护试验 |
| 1.2.2 细菌在鸡体内的分布与定植变化规律测定 |
| 1.2.3 缺失株免疫后血清抗体IgG的动态消长变化 |
| 1.2.4 缺失株所诱导的鸡细胞因子mRNA表达的分析 |
| 1.2.5 缺失株的DIVA能力评价 |
| 1.2.6 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺失株对鸡群的免疫保护力评价 |
| 2.1.1 野生株攻毒后鸡群的存活情况 |
| 2.1.2 缺失株免疫后鸡体重的变化 |
| 2.1.3 攻毒后细菌在脏器内的定植情况 |
| 2.2 细菌在鸡体内的分布与定植变化规律 |
| 2.2.1 细菌在鸡肝脏内的分布与定植规律 |
| 2.2.2 细菌在鸡脾脏内的分布与定植规律 |
| 2.2.3 细菌在鸡回肠内的分布与定植规律 |
| 2.2.4 细菌在鸡盲肠内的分布与定植规律 |
| 2.3 缺失株免疫后血清抗体IgG的动态消长变化 |
| 2.4 RT-PCR检测细胞因子mRNA的相对表达量 |
| 2.5 缺失株的DIVA能力评价 |
| 2.5.1 CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株免疫后血清的鉴别诊断 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表论文 |
（8）禽沙门菌诱导宿主免疫应答的特性（论文提纲范文）
| 1 沙门菌的分子免疫机制研究 |
| 2 沙门菌与宿主细胞互作机制研究 |
| 3 沙门菌的免疫应答规律及其机制研究 |
| 4 展望 |
（9）MLKL在鼠伤寒沙门菌黏膜感染中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 沙门菌黏膜感染与宿主免疫防御的研究进展 |
| 1.1 沙门菌流行病学 |
| 1.2 沙门菌毒力因子 |
| 1.3 沙门菌病和动物研究模型 |
| 1.4 沙门菌入侵机制 |
| 1.5 抗沙门菌感染免疫机制 |
| 1.6 沙门菌免疫逃逸机制 |
| 1.7 小结 |
| 第二章 肠道黏膜屏障与稳态的研究进展 |
| 2.1 肠道黏膜屏障的发育和形成 |
| 2.2 肠道黏膜屏障的组成及功能维持 |
| 2.3 肠道黏膜免疫系统 |
| 2.4 肠道稳态的维持 |
| 2.5 肠道黏膜屏障与疾病 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 MLKL的研究进展 |
| 3.1 MLKL的概述 |
| 3.2 MLKL的生物学功能 |
| 3.3 MLKL在炎症疾病中的作用 |
| 3.4 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 MLKL在鼠伤寒沙门菌肠道黏膜感染中的作用 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 MLKL促进肠道黏膜屏障功能的完整和肠道稳态的维持 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 MLKL限制鼠伤寒沙门菌黏膜感染的分子机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株的安全性及免疫效果评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验菌株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要培养基 |
| 1.1.5 主要试剂盒 |
| 1.1.6 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 G9ΔssrAB免疫剂量的确定 |
| 1.2.2 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)安全性评价 |
| 1.2.3 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)的免疫原性评价 |
| 1.2.4 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)的免疫保护力评价 |
| 1.2.5 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)免疫剂量的确定 |
| 2.2 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)的安全性评价 |
| 2.2.1 G9ΔssrAB的体外遗传稳定性试验结果 |
| 2.2.2 G9ΔssrAB及 G9 在小鼠体内的定植清除效率 |
| 2.3 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)的免疫原性评价 |
| 2.3.1 血清IgG抗体效价测定结果 |
| 2.3.2 肠道黏膜分泌型IgA抗体测定结果 |
| 2.3.3 外周血中CD4~+、CD8~+T细胞亚群百分比的测定结果 |
| 2.3.4 血清中细胞因子测定结果 |
| 2.3.5 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验结果 |
| 2.4 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)的免疫保护力评价 |
| 2.4.1 G9?ssrAB免疫保护力测定结果 |
| 2.4.2 G9?ssrAB交叉保护力测定结果 |
| 2.4.3 攻毒后肝脏、脾脏、小肠的病理变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)的安全性评价 |
| 3.2 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)的免疫原性评价 |
| 3.3 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株(G9ΔssrAB)的免疫保护力评价 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、单核吞噬细胞应答伤寒沙门菌的实验研究（论文参考文献）
- [1]鸡白痢沙门菌诱导Th2应答相关抗原的鉴定及功能研究[D]. 周莹莹. 扬州大学, 2021(02)
- [2]肠炎沙门菌新型抑炎效应蛋白TcpS逃逸宿主天然免疫的机制研究[D]. 熊丹. 扬州大学, 2020
- [3]生物被膜在鼠伤寒沙门菌逃逸树突状细胞免疫监视中的作用和机制[D]. 史艺. 扬州大学, 2020
- [4]沙门菌鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应及其机制研究[D]. 宋丽. 扬州大学, 2020
- [5]丁香醛对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的抑制作用及机制[D]. 吕强华. 吉林大学, 2020(08)
- [6]布鲁氏菌感染中巨噬细胞极化通过PD-1/PD-L2途径对T细胞亚群的调控作用研究[D]. 李智伟. 新疆医科大学, 2020(07)
- [7]基于肠炎沙门菌CZ14-1的减毒疫苗候选株的构建与免疫保护效力的评价[D]. 朱悦. 扬州大学, 2019(02)
- [8]禽沙门菌诱导宿主免疫应答的特性[J]. 尹超,徐黎娟,李求春,潘志明,耿士忠,焦新安. 微生物学报, 2019(04)
- [9]MLKL在鼠伤寒沙门菌黏膜感染中的作用及机制研究[D]. 于水星. 吉林大学, 2018(12)
- [10]肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失减毒株的安全性及免疫效果评价[D]. 李建波. 安徽农业大学, 2018(03)