一、人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析（论文文献综述）
辛胜男[1]（2013）在《2个新的鸽β-防御素5的克隆与生物学特性的初步研究》文中进行了进一步梳理随着抗生素滥用所产生的负面影响日益增多，抗菌肽作为一种新型抗菌制剂渐渐引起了人们的关注，其稳定结构所发挥出的优势和独特的抗菌机制也成为了科学家们研究的热点。防御素是抗菌肽家族中的一员，具有高效广谱的杀菌能力，而且它的抗菌机制使病原菌不易产生耐药性，无论在先天性免疫还是获得性免疫中都起到重要作用，有着极大的开发潜力作为饲料添加剂应用于畜牧养殖业。从上一世纪八十年代开始，有关鸡、鸭、鹅、火鸡和企鹅等禽β-防御素的研究已经取得了突破性进展，但有关鸽β-防御素到目前为止还罕有报道。为进一步研究新的禽β-防御素，本试验采用RT-PCR方法，从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增到2个新的禽β-防御素（AvBD）基因。将测序结果与目前已知的禽β-防御素（AvBD）和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列进行同源性分析并绘制分子遗传进化树。测序结果得到这2个基因的cDNA大小均为201bp，编码66个氨基酸残基，内含6个位置保守的半胱氨酸。经遗传进化分析发现，该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高，分别为87.9%（骨髓）和78.8%（肝脏），两组氨基酸序列之间的同源性为83.3%。因此，将其分别命名为鸽AvBD5α（骨髓）和鸽AvBD5β（肝脏）。另外，这两个基因与哺乳动物β-防御素的同源性较低。进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达，转化大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导表达，两个重组融合蛋白和标签蛋白GST进行纯化后，以4种革兰氏阳性菌和8种革兰氏阴性菌为检测菌，通过菌落计数法测定其体外抗菌活性。结果表明，重组鸽AvBD5α和重组鸽AvBD5β蛋白对这12种细菌均有较强的抑制作用（p<0.05或p<0.01）。其中重组鸽AvBD5α和重组鸽AvBD5β蛋白对金黄色葡萄球菌、多杀性巴士杆菌、奇异变型菌、绿脓杆菌的抗菌活性相对其他较强，二者对鸡白痢沙门氏菌的抗菌活性较弱。重组鸽AvBD5α的抗菌活性与重组鸽AvBD5β无显着差异。另外，经检测，标签蛋白GST对12种细菌均无抗菌作用。在高盐浓度下，重组蛋白仍然对多杀性巴氏杆菌有抑制作用，但随着盐离子浓度的不断升高，重组鸽AvBD5α和重组鸽AvBD5β蛋白抗菌活性显着降低（p<0.05或p<0.01）。此外，重组鸽AvBD5α和重组鸽AvBD5β蛋白溶血活性极低，与阴性对照相比，无显着差异（p>0.05）。
刘阳欣[2]（2013）在《表达猪抗菌肽PF1和PR39重组干酪乳杆菌的构建及其生物学活性测定》文中研究说明抗菌肽是宿主先天性免疫防御系统中产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽类生物活性物质，能识别和杀灭侵入并定植于动物机体的细菌、真菌，所以在生物体内固有免疫机制过程中它扮演重要角色。本实验以GeneBank发表的猪抗菌肽PR39和PF1基因为模板，根据乳酸杆菌密码子偏嗜性，通过密码子优化全基因合成了PF1-PR39基因，以其为模板，利用P3、P4引物扩增PR39基因并与表达载体质粒pCold相连接，转入大肠杆菌BL21（DE3）中获得重组菌pCold-PR39/BL2（1DE3）；经IPTG诱导并对其表达条件进行优化，通过SDS-PAGE和Westernblot分析均表明获得表达猪抗菌肽PR39的约51kDa重组蛋白；抑菌试验表明重组抗菌肽PR39对大肠杆菌和沙门氏菌有明显的抑菌作用，抑菌圈直径分别为5.7mm和4.9mm；对金黄色葡萄球菌和干酪乳杆菌没有观察到抑菌作用。将PR39基因和PF1-PR39基因分别定向插入到乳酸菌分泌表达型载体质粒pPG612的多克隆酶切位点Sac I和Xho I之间，构建了细胞分泌表达型重组乳酸菌pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393。用1%的乳糖诱导重组菌，经Western blot鉴定可见目的蛋白得到表达，分别获得约36kDa、30kDa和6kDa的重组蛋白。生长曲线的测定结果表明，与对照菌相比抗菌肽基因的表达并不影响重组菌的生长。以时间动态曲线法测定的体外抑菌试验结果表明重组菌pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393诱导后浓缩上清对金黄色葡萄球菌生长没有抑制作用；而对革兰氏阴性菌大肠杆菌、沙门氏菌均可产生明显的抑菌作用；重组菌表达的猪抗菌肽PF1-PR39的抑菌效果要优于PR39。为检测本研究获得的重组猪抗菌肽是否具有提高动物自身免疫能力的功效，选取SPF级6周龄的BALB/c雌性小鼠，将其随机分成4组，每组9只。实验组分别灌服200μL浓度为109CFU/mL的菌液pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393，对照组分别灌服pPG612/L.casei393和培养基，连续饲喂28d，每周对实验小鼠体重和鼠粮消耗用量进行称重，计算料重比。28d后检测各组实验小鼠外周血淋巴细胞百分率和白细胞数量，在无菌环境下解剖小鼠取空肠和十二指肠的前段约2cm做小鼠肠绒毛扫描电镜切片。称量脾脏重量，计算脾脏指数。采用PCR-DGGE法分析各组实验小鼠饲喂重组菌前后粪便菌群结构的多样性，同时以产肠毒素的大肠埃希氏菌K88+菌株进行攻毒试验，检测重组菌株的保护效果。结果表明通过口服途径饲喂重组菌后，实验组pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393的料重比分别为30.935±0.87和29.702±0.67低于对照组，差异极显着（P<0.01）其中共表达PF1-PR39组的料重比低于单独表达PR39组，差异显着（P<0.05）；实验组pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393的淋巴细胞百分率、白细胞数量、脾脏指数与对照组相比均有增加的趋势性且差异显着（P<0.05）。其中共表达PF1-PR39组的脾脏指数和淋巴细胞比率与PR39单独表达组相比差异不显着，二者的白细胞数相比差异显着（P<0.05）；小鼠肠绒毛扫描电镜切片可见实验组pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393空肠和十二指肠的绒毛高度和及V/C值与对照组相比均增加，差异极显着（P<0.01），而隐窝深度与对照组相比差异不显着，且共表达组的绒毛高度及V/C值明显高于单独表达组，二者比较差异显着（P<0.05）。从DGGE图谱分析可知，实验组pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393小鼠粪便菌群结构与对照组相比丰富度没有变化，但是微生物多样性指数和均匀度降低。攻毒保护试验结果表明，与对照组相比表达抗菌肽的重组菌株可以明显降低大肠埃希氏菌K88菌株引起的死亡率。以上结果表明所构建的表达猪抗菌肽PF1-PR39重组干酪乳杆菌表达系统具有潜在的应用前景，重组菌株既具有乳酸菌的益生性，又可以发挥抗菌肽的生物学功能，为以乳酸菌作为传递系统开发新型的动物抗菌肽产品奠定了一定的理论基础。
袁曦[3]（2009）在《中国荷斯坦奶牛β-防御素基因LAP分子克隆及真核表达初步研究》文中认为防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽,它在先天性免疫系统宿主防御机制中起着重要的作用。研究发现一些β-防御素基因在奶牛感染乳房炎时可在乳腺中诱导表达,表明在乳房炎发生时β-防御素可能在乳腺局部防御中发挥作用。本研究进行了β-防御素基因LAP的克隆与序列分析,构建了LAP基因的真核表达载体,并成功进行了真核融合表达。实验以患乳房炎的中国荷斯坦奶牛乳腺为材料,提取乳腺上皮细胞总RNA,根据GenBank中注册的牛β-防御素基因LAP的cDNA序列设计了5’端带有EcoRI和BamHI酶切位点的一对引物,采用RT-PCR技术扩增LAP基因的cDNA序列,并将其连接到pMDTM 19-T Simple载体中进行序列测定,将测序鉴定正确的克隆质粒命名为pMD19-T-LAP。生物信息学分析结果表明,本研究成功扩增出牛β-防御素基因LAP的编码区序列,大小为195bp,推导该序列编码64个氨基酸,并含有β-防御素的特征性分子结构即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基（C）。与已报道的牛β-防御素基因LAP cDNA（登录号:EF630358.1）序列进行比较,核苷酸同源性达98%,有三个碱基发生了变异,分别为核苷酸序列第196的A-G突变、第199和201位的T-C突变;氨基酸同源性为95%,三个突变碱基引起第63位Arg→Lys的变异,这种核苷酸的序列差异,可能是由于牛的不同品种之间的差异造成的。用EcoRI和BamHI双酶切重组克隆质粒pMD19-T-LAP,然后插入到pEGFP-C1载体的EcoRI和BamHI位点,构建了真核表达重组质粒pEGFP-C1-LAP,经质粒PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明重组表达质粒pEGFP-C1-LAP构建成功。利用脂质体转染技术,将重组质粒转化到COS7细胞系,用荧光显微镜检测到增强型绿色荧光,分别提取重组质粒组和空载体对照组转染后细胞的总RNA,经RT-PCR检测表明重组质粒组LAP基因mRNA已经在COS7细胞内得到转录。本试验结果为进一步研究奶牛β-防御素基因LAP的表达特性、基因功能及表达产物的抑菌活性奠定了一定的基础,同时重组多肽治疗和预防奶牛乳房炎提供了基础资料。
刘一江[4]（2007）在《仙人掌抗菌肽的筛选分离纯化及性质研究》文中研究表明采用硫酸铵梯度盐析法提取金手球、金晃、银世界、量天尺、金琥锦、黄金柱缀化6种仙人掌在不同饱和度硫酸铵下沉淀的蛋白质组分，并分别进行抑菌性试验，以筛选含具有抗菌效果的蛋白质组分的仙人掌品种。用Sephadex G75和Sephadex G25柱层析对抗菌效果最为显着的蛋白质组分作进一步分离纯化，并对纯化到的具有抗菌活性的多肽物质进行分子量、理化性质和抗菌活性检测，其主要研究结果如下：1．经过筛选发现，在6种被试品种中，有4种仙人掌含有具抗菌作用的蛋白质成分，主要沉淀于40％～80％硫酸铵饱和度盐析范围，部分大于80％，说明其蛋白分子量较小。其中以金手球（Mammillaria Haw.）所含蛋白质组分的抗菌效果最为显着。2．以灭活的金黄色葡萄球菌菌液作为诱导菌液，分别采用划伤自然诱导、蘸菌针刺诱导和划伤蘸菌涂抹诱导三种方法对金手球仙人掌植株进行诱导。诱导实验发现：诱导后的金手球组织周围有明显的抑菌圈出现，未诱导的组织未表现出明显抗菌活性。采用划伤蘸菌涂抹诱导的金手球植株所产生的抑菌效果最为明显，说明金手球组织中所含的抗菌物质不仅是可诱导的，而且还与诱导菌液的菌浓度有关，随诱导菌液的菌浓度的增大而增多。在诱导时间上，仙人掌组织诱导24h即可表现出明显的抑菌效果。采用比浊法进一步测试不同诱导方法和诱导时间仙人掌植株抗菌肽粗提物的杀菌效果发现：金手球仙人掌在诱导24h即产生大量的抗菌肽类物质，杀菌率显着提高；诱导72h杀菌率达最大。3．对金手球仙人掌的蛋白质粗提物进行分离纯化，得到分子量为8511Da、具有抗菌作用的小肽，命名为MH-AMP-1。在整个纯化过程中，用硫酸铵梯度盐析去除约55％的高分子量杂蛋白，纯化倍数为2.96。经Sephadex G75和Sephadex G25进一步分离纯化，最终使抗菌肽的比活性提高到376.81U.mg-1，回收率为5.52％。SDS-PAGE图谱显示所得纯化样品只呈现单一蛋白质电泳条带，表明已达到电泳纯。MH-AMP-1的茚三酮反应呈阳性，说明N端未封闭。4．对MH-AMP-1的热稳定性研究表明，在低于70℃水浴1h后，MH-AMP-1抗菌活性无明显变化；80℃～90℃水浴1h，抗菌活性略有下降，100℃水浴1h，抗菌活性仍保持在80％以上，说明MH-AMP-1具有较好的热稳定性。pH影响实验表明，MH-AMP-1在pH2.5～7.5都具有较强的抗菌活性，当缓冲液pH＞8时抗菌活性明显减弱，表现出阳离子抗菌肽特征。5．对MH-AMP-1的抗菌谱及最小抑菌浓度（MIC）值进行研究发现：MH-AMP-1对蜡样芽孢杆菌、化脓杆菌、白色念株菌、隐球酵母有较明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、绿脓杆菌有较强抗菌活性。说明MH-AMP-1对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌及真菌均有一定的抑制作用，抗菌谱较广。MH-AMP-1对黄色葡萄球菌、枯草杆菌的MIC为30μg.mL-1，对蜡样芽孢杆菌、隐球酵母的MIC为60μg.mL-1，对白色念株菌的MIC为120μg.mL-1，表明其抗菌活性强。通过对抗菌肽的筛选、诱导、分离纯化等实验不仅从金手球仙人掌中分离得到了新的抗菌肽MH-AMP-1，其性质研究还表明仙人掌的抗菌消炎作用除与传统观念认为的化学成分有关，还与受基因编码调控的抗菌肽有关。
郭小燕,傅玉娟,吕淑兰[5]（2007）在《人防御素与女性生殖》文中研究表明人防御素是近年来在人体内发现的富含半胱氨酸的内源性抗微生物活性肽,具有广谱抗细菌、抗真菌、抗原虫、抗病毒活性,同时具有调节固有免疫和获得性免疫的作用,是机体抵御病原微生物入侵的重要组成部分。女性生殖道是防御素产生的主要部位。近年来,在女性生殖领域中,防御素受到了相当的重视,对其研究也愈见深入。就防御素在女性生殖道的表达和分布,及其在生殖系统感染和肿瘤中的免疫防御作用综述。
杨毅[6]（2006）在《新型防御素基因的克隆与原核表达研究》文中进行了进一步梳理近年来由于抗生素的不规范使用等多种原因，细菌耐药问题日益严重，人们正努力从各个方面来解决，其中机体天然产生的抗菌肽（antibacterial peptide）由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们的关注。抗菌肽是一种阳离子小分子多肽，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。防御素（defensin）是抗菌肽中较为重要的一种，主要来源于皮肤、呼吸道等的上皮组织，是正常机体抵抗外界病原微生物入侵的重要防线。 为了构建具有广谱高效的抗菌肽基因，获得新型抗菌融合蛋白，本实验采用了改进的重叠区基因拼接法对牛的β防御素3’（BNBD3）cDNA和人的α防御素3（HNP3）cDNA分别加以改造。在去除BNBD3的终止密码子和HNP3的起始密码子的基础上，在BNBD3的5’端引入BamHI酶切位点，并在HNP3的3’端引入EcoRI酶切位点，同时在二者之间加上Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser柔性连接肽序列。利用多次PCR扩增出目标片段，并构建了pGEX-4T-1-BNBD3／HNP3原核表达载体，经质粒PCR以及BamHI／EcoRI双酶切鉴定，测序结果证实BNBD3／HNP3融合基因已成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1。 将已构建的BNBD3／HNP3融合蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），用2×YT培养基培养，以IPTG诱导融合蛋白表达，经SDS-PAGE分析表达蛋白分子量符合预期的34.9KDa。融合蛋白的表达产物在细胞破碎的上清中以可溶形式存在，将带有GST标签的融合蛋白用亲和层析法纯化。融合蛋白在体外抗菌实验中表现出了明显的抑制大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长的抗菌活性（P＜0.05），表明我们所构建的BNBD3／HNP3融
王轶[7]（2005）在《甘蓝型油菜“蜀杂九号”防御素基因全长cDNA的克隆与原核表达》文中指出植物防御素是一类广泛分布于植物种子的阳离子、低分子量的短肽。其能强烈抑制病原微生物的入侵,是植物先天性非特异免疫的重要组成部分。尤其是被认为能通过真菌细胞膜上特异受体而强烈抑制丝状真菌的生长。研究表明,其保守的含有8个Cys,而形成4个二硫键。因其与动物防御素同源而得名。 本实验根据GenBank数据库中登记的十字花科植物防御素基因序列,运用Primer5.0软件设计了两个引物5’-GCGGAATTCATGGCTAAGTTTGCTTCC-‘3和5’-CGCTCTAGATTAACATGGGAAATAACAGATAC-‘3,并为后插入到改造自Pharmacia公司的pGEX—2T克隆表达载体GTK中而加入了EcoRⅠ和XbaⅠ的酶切位点（粗体部分）。从正在萌发的甘蓝型油菜“蜀杂九号”的种子提取总RNA,反转录为cDNA。并以此为模板进行PCR扩增,成功地从甘蓝型油菜中克隆出长243bp编码80个氨基酸的防御素基因的cDNA序列。 将所得甘蓝型油菜防御素基因的cDNA片段插入到pGEX—2T表达载体GTK的EcoRⅠ和XbaⅠ多克隆位点之间。将重组原核表达质粒转化到E.coli BL21的感受态细胞中,获得了表达甘蓝型油菜防御素基因的重组子。在2×YTA培养基中,通过0.1mM的IPTG诱导,18℃培养2h,经SDS-PAGE分析,获得了与理论值相符合的34KD的融合蛋白。而且经Western-blot进一步检测,证明了融合蛋白的表达。 在融合蛋白的初步纯化中发现:不论是改变IPTG浓度还是降低培养温度,融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在。所以选择对细胞毒副作用小的0.1mM
李春丽[8]（2005）在《人β防御素3和植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein基因的重组表达研究》文中研究表明食品安全一直是人们关注的焦点,安全、天然的食品添加剂是保障食品安全的重要方面。人β防御素3（hBD3）因其广谱高效的杀菌作用和较低的细胞毒性,有望成为新型食品防腐剂。植物des-pGlul-Brazzein甜蛋白因其高甜度和对pH、热的稳定性而有望成为新型甜味剂。本课题以大肠杆菌和甲醇酵母为宿主重组表达了hBD3、des-pGlul-Brazzein以及两者的嵌合基因,并采用摇瓶发酵分析了适合三株重组大肠杆菌菌株生长和目的蛋白表达的发酵条件。主要结果如下: 采用细菌和酵母偏爱密码子分别合成了hBD3、des-pGlul-Brazzein及两者的嵌合基因片段（中间加了一段编码凝血酶酶切位点的片段）,这些编码序列被插入pET30a和pPIC9K载体,分别构建成重组载体pET-hBD3、pET-Bra、pET-hBD3-Bra和pPIC9K-hBD3、pPIC9K-Bra、pPIC9K-hBD3-Bra。 以E.coli为重组表达宿主,pET30a为表达载体,对hBD3进行了融合表达,重组hBD3融合蛋白占总蛋白的30.9%,实现了目的蛋白的高效表达。通过亲和层析和进一步酶切纯化得到了较纯的hBD3蛋白,无论是重组hBD3融合蛋白还是hBD3蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌都具有较高的抑菌活性,并且酶切后得到的hBD3蛋白的活性比重组hBD3融合蛋白高,完全可以与提取得到的天然hBD3的活性相媲美。 以E.coli为重组表达宿主,pET30a为表达载体,对des-pGlul-Brazzein进行了融合表达,重组des-pGlul-Brazzein融合蛋白占总蛋白的35%以上,通过亲和层析和进一步酶切纯化得到了较纯的des-pGlul-Brazzein蛋白,两者的相对甜度分别是蔗糖的400和600倍,在80℃作用4h后其甜味并未丧失,说明得到的甜蛋白具有较强热稳定性。 以E.coli为重组表达宿主,pET30a为表达载体,对嵌合基因hBb3-Bra进行了融合表达。hBD3-Bra融合蛋白占总蛋白的30.5%,实现了在大肠杆菌中的高效表达。融合蛋白只有很弱的杀菌活性,但甜度约为蔗糖200倍,通过凝血酶切割纯化后,得到了具有明显杀菌活性的重组hBD3融合蛋白和甜度约为蔗糖600倍的des-pGlul-Brazzein蛋白。
任洪艳,张苓花,王运吉[9]（2003）在《人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析》文中进行了进一步梳理为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因人α 防御素HNP 1,提取人外周静脉血液总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到长度约为380bp的防御素（De fensin）基因片段,并将该扩增产物连接入pMD18 T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行核苷酸序列测定,获得α 防御素HNP 1基因克隆。用序列处理在线工具包分析HNP 1基因结构。
杨应华[10]（2003）在《人源多肽抗生素LL-37/hCAP-18的初步研究》文中提出天然免疫是机体防御系统的第一道防线。多肽抗生素既是天然免疫的重要组成部分，在宿主抵抗病原物入侵的防御反应中起重要作用；也是开发新型抗生素的理想候选物，在医药工业和培育抗病动物、植物新品种上有着广阔的应用前景。LL-37／hCAP-18是迄今在人体发现的多肽抗生素cathelicidin家族的唯一成员，也是人体内唯一的双亲性α-螺旋结构的多肽抗生素，在血细胞和上皮细胞中广泛表达。LL-37具有广谱抗菌作用，中和内毒素作用和趋化作用。很多感染性疾病与LL-37低表达或功能失活有关。越来越多的资料表明LL-37是开发新型抗生素的理想模板和分子骨架，对治疗感染性疾病有潜在的应用价值。 为了探讨LL-37／hCAP-18在白血病细胞中的表达与白血病患者容易感染的关系，本实验采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot等方法，对9个代表不同谱系的人白血病细胞系的LL-37／hCAP-18表达进行了初步观测。其中6个细胞系有mRNA水平的表达，表达量差异较大，Raji细胞表达水平最高，Ramos表达水平最低，两者相差8倍之多。然而，在蛋白质水平，只有J6-1和U937细胞系呈阳性。同时发现白血病患者骨髓中LL-37／hCAP-18阳性细胞的比例和阳性指数均较特发性血小板减少性紫瘢患者（对照组）低。这些观察结果提示，LL-37／hCAP-18低表达，可能是白血病患者容易感染的原因之一。 应用RT-PCR技术从人白血病细胞系J6-1克隆了hCAP-18基因编码区cDNA序列，构建hCAP-18重组表达质粒phCAP-18。DNA序列分析显示该cDNA序列与报道的同源性为99％，有两个点突变，一个错义突变(Codon 6，
二、人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析（论文提纲范文）
（1）2个新的鸽β-防御素5的克隆与生物学特性的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 抗菌肽简介 |
| 1.2 防御素的研究进展 |
| 1.2.1 防御素的结构及分类 |
| 1.2.2 防御素的生物学作用 |
| 1.2.3 防御素的应用 |
| 1.3 禽β-防御素的研究进展 |
| 1.3.1 禽β-防御素分子结构 |
| 1.3.2 禽β-防御素的抗菌活性 |
| 1.3.3 禽β-防御素重组蛋白的制备 |
| 1.3.4 禽β-防御素的组织分布 |
| 1.3.5 禽β-防御素的诱导表达 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌株、载体质粒及重组蛋白 |
| 2.1.3 试剂与仪器 |
| 2.1.4 实验动物样品 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 鸽 AvBD 基因的克隆与序列分析 |
| 2.2.1 组织总 RNA 的提取 |
| 2.2.2 反转录（RT） |
| 2.2.3 聚合酶链式反应（PCR） |
| 2.2.4 PCR 产物的回收 |
| 2.2.5 PCR 产物的连接 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 连接产物的转化 |
| 2.2.8 重组质粒的提取 |
| 2.2.9 重组质粒的鉴定与测序 |
| 2.2.10 序列分析及同源性比较 |
| 2.3 重组鸽 AvBD5 蛋白在原核中的表达 |
| 2.3.1 原核表达载体的构建与测序 |
| 2.3.2 重组鸽 AvBD5 蛋白的诱导表达 |
| 2.3.3 重组鸽 AvBD5 蛋白的纯化 |
| 2.3.4 重组鸽 AvBD5 蛋白浓度的测定 |
| 2.4 重组鸽 AvBD5 蛋白的抗菌活性测定 |
| 2.5 盐离子浓度对重组鸽 AvBD5 蛋白抗菌活性的影响 |
| 2.6 重组鸽 AvBD5 蛋白对鸡血红细胞的溶血活性 |
| 2.7 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸽 AvBD5α、5β基因的克隆 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.3 测序结果与分析 |
| 3.4 鸽 AvBD5α、5β基因的遗传进化分析 |
| 3.5 重组鸽 AvBD5α、5β蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.5.1 表达用重组质粒 pMD18-T-pigeon AvBD5α、5β的鉴定 |
| 3.5.2 重组表达质粒 pGEX- pigeon AvBD5α、5β的鉴定 |
| 3.5.3 重组鸽 AvBD5α、5β蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.6 重组鸽 AvBD5α、5β蛋白的抗菌活性 |
| 3.7 盐离子浓度对重组鸽 AvBD5α、5β蛋白抗菌活性的影响 |
| 3.8 重组鸽 AvBD5α、5β蛋白对鸡血红细胞的溶血活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸽 AvBD5α、5β基因的克隆与遗传进化分析 |
| 4.2 鸽 AvBD5α、5β的基因多态性 |
| 4.3 重组鸽 AvBD5α、5β蛋白的原核表达 |
| 4.4 重组鸽 AvBD5α、5β蛋白的生物学特性 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（2）表达猪抗菌肽PF1和PR39重组干酪乳杆菌的构建及其生物学活性测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 猪源 Cathelicidin 抗菌肽的研究进展 |
| 1.1.1 猪源 Cathelicidin 抗菌肽的结构特点 |
| 1.1.2 猪源抗菌肽 PR39 和 PF1 的结构特点 |
| 1.2 猪源 Cathelicidin 抗菌肽的生物学功能 |
| 1.2.1 猪源 Cathelicidin 抗菌肽的抗菌作用及抗菌机理 |
| 1.2.2 猪源 Cathelicidin 抗菌肽的抗肿瘤作用 |
| 1.2.3 猪源 Cathelicidin 抗菌肽的免疫调节作用 |
| 1.3 乳酸杆菌表达外源基因的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 抗体试剂 |
| 2.1.3 质粒与菌种 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 培养基 |
| 2.1.7 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因 PF1-PR39 和 PR39 的获得 |
| 2.2.2 表达 PR39 基因重组大肠杆菌的构建 |
| 2.2.3 PR39 基因在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.2.4 重组蛋白抑菌活性检测 |
| 2.2.5 PR39 基因与 PF1-PR39 基因重组干酪乳杆菌的构建 |
| 2.2.6 重组干酪乳杆菌的诱导表达及鉴定 |
| 2.2.7 外源基因 PR39 和 PF1-PR39 对重组菌生长曲线的影响 |
| 2.2.8 重组干酪乳杆菌体外抑菌实验 |
| 2.2.9 口服重组干酪乳杆菌小鼠生理指标的测定 |
| 2.2.10 口服重组菌对小鼠外周血淋巴细胞和白细胞数量的影响 |
| 2.2.11 口服重组菌对小鼠肠绒毛发育形态的影响 |
| 2.2.12 应用 PCR-DGGE 分析口服重组菌后小鼠粪便菌群结构的多样性 |
| 2.2.13 重组干酪乳杆菌对产肠毒素大肠埃希氏菌灌服小鼠保护作用 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因 PF1-PR39 和 PR39 的获得 |
| 3.2 大肠杆菌重组质粒 pCold-PR39 的鉴定结果 |
| 3.3 PR39 基因在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定 |
| 3.3.1 表达产物的 SDS-PAGE 鉴定 |
| 3.3.2 Western Blot 鉴定 PR39 重组蛋白 |
| 3.4 重组蛋白抑菌活性检测 |
| 3.5 PR39 基因与 PF1-PR39 基因重组干酪乳杆菌的构建 |
| 3.6 重组干酪乳杆菌的诱导表达及鉴定 |
| 3.7 外源基因 PR39 和 PF1-PR39 对重组菌生长曲线的影响 |
| 3.8 重组干酪乳杆菌体外抑菌实验结果 |
| 3.9 口服重组菌对小鼠生长性能的影响 |
| 3.10 口服重组菌对小鼠白细胞数和淋巴细胞比率和脾脏指数的影响 |
| 3.11 口服重组菌对小鼠肠绒毛发育形态的影响 |
| 3.12 应用 PCR-DGGE 分析口服重组菌后小鼠粪便菌群结构的多样性 |
| 3.13 重组菌对产肠毒素大肠埃希菌口服小鼠的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PR39 与 PF1-PR39 重组蛋白的表达及其结构分析 |
| 4.2 表达 PR39 与 PF1-PR39 蛋白重组菌的抑菌作用分析 |
| 4.3 表达 PR39 与 PF1-PR39 蛋白的重组菌免疫调节作用分析 |
| 4.4 表达猪抗菌肽重组干酪乳杆菌的潜在应用价值 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（3）中国荷斯坦奶牛β-防御素基因LAP分子克隆及真核表达初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 动物防御素研究进展 |
| 1.1 动物防御素的分类及分布 |
| 1.2 防御素的染色体定位 |
| 1.3 防御素的分子结构与特征 |
| 1.4 防御素的进化关系 |
| 1.5 防御素基因的表达调控 |
| 1.6 防御素的生物学作用 |
| 1.7 防御素的应用前景 |
| 2 研究目的与意义 |
| 第二章 中国荷斯坦奶牛LAP基因的克隆与序列分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 感受态细胞与克隆载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 LAP基因的扩增及回收 |
| 2.3 LAP基因的连接转化与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 cDNA第一链的检测 |
| 3.2 RT-PCR结果 |
| 3.3 重组质粒pMD-19T-LAP的鉴定 |
| 3.4 LAP基因序列测定及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 中国荷斯坦奶牛LAP基因的真核表达载体的构建及其表达研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 重组质粒pEGFP-C1-LAP的构建流程 |
| 2.2 目的基因的酶切及纯化 |
| 2.3 连接与转化 |
| 2.4 重组阳性转化子的鉴定 |
| 2.5 LAP基因在COS7细胞中的表达与检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒pEGFP-C1-LAP的鉴定 |
| 3.2 LAP基因在COS7细胞中的表达鉴定 |
| 3.3 RT-PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 牛β-防御素基因的表达研究 |
| 4.2 关于真核细胞转染 |
| 4.3 β-防御素基因LAP与奶牛乳房炎防治 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附图1 |
| 附图2 |
| 附图3 |
（4）仙人掌抗菌肽的筛选分离纯化及性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述与立题依据 |
| 1.1 抗菌肽的研究进展 |
| 1.1.1 抗菌肽的发现 |
| 1.1.2 抗菌肽的分类 |
| 1.1.3 抗菌肽的结构特征 |
| 1.1.4 抗菌肽的功能 |
| 1.1.5 抗菌肽的作用机制 |
| 1.1.6 抗菌肽基因的表达调控 |
| 1.1.7 抗菌肽的应用前景及存在问题 |
| 1.2 立题依据 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试材料、试剂和仪器 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 抗菌物质的活性测定 |
| 2.2.2 含抗菌肽仙人掌的筛选 |
| 2.2.3 仙人掌抗菌肽类物质的诱导 |
| 2.2.4 仙人掌抗菌肽的分离纯化 |
| 2.2.5 抗菌肽MH-AMP-1的部分性质研究 |
| 2.2.6 蛋白质浓度测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 含抗菌肽仙人掌的筛选 |
| 3.2 金手球抗菌肽的诱导 |
| 3.3 MH-AMP-1的分离纯化 |
| 3.4 MH-AMP-1的部分性质 |
| 3.4.1 MH-AMP-1的分子量测定及茚三酮反应试验 |
| 3.4.2 温度及pH值对MH-AMP-1抗菌活性的影响 |
| 3.4.3 MH-AMP-1的抗菌谱及MIC值 |
| 4 讨论 |
| 4.1 仙人掌的抗菌消炎成分 |
| 4.2 抗菌肽的诱导 |
| 4.3 抗菌肽的纯化 |
| 4.4 抗菌肽的生物活性 |
| 4.4.1 抗菌肽的抗菌性和广谱抗性 |
| 4.4.2 pH和温度对抗菌肽抗菌活性的影响 |
| 4.5 抗菌肽的应用前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间论文发表情况 |
（5）人防御素与女性生殖（论文提纲范文）
| 人防御素 (human defensin, h D) 概述 |
| 一、α-防御素 (humanα-defensins, hαD) |
| 二、β-防御素 (humanβ-defensins, hβD) |
| h D的作用 |
| 一、h D抗微生物活性 |
| 二、h D的细胞毒性 |
| 三、h D免疫激活特性 |
| h D在女性生殖系统的表达和分布 |
| h D与女性生殖系统疾病 |
| 一、生殖系统感染 |
| 1. h D的抗人免疫缺陷病毒 (HIV) 作用 |
| 2. h D与其他类型的女性生殖道感染 |
| 二、生殖系统肿瘤 |
（6）新型防御素基因的克隆与原核表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 BNBD3和HNP3融合防御素基因的构建 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增产物的鉴定 |
| 3.2 重组原核表达质粒的构建 |
| 3.3 融合cDNA序列分析 |
| 3.4 蛋白序列的Blast分析 |
| 3.5 蛋白序列的三维结构分析 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 BNBD3和HNP3融合防御素基因的原核表达研究 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 融合蛋白的诱导表达和SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.2 融合蛋白表达条件的探索 |
| 3.3 融合蛋白性质检测 |
| 3.4 融合蛋白的纯化 |
| 3.5 融合蛋白活性检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 融合蛋白的表达 |
| 4.2 抗菌肽的活性研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 防御素研究进展 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 防御素的分类和分布 |
| 3 防御素的分子特征 |
| 3.1 α防御素,β防御素和θ防御素 |
| 3.2 昆虫防御素 |
| 3.3 植物防御素 |
| 4 防御素的生物学作用 |
| 4.1 抗细菌作用 |
| 4.2 抗真菌作用 |
| 4.3 抗病毒的作用 |
| 4.4 影响抗微生物活性的因素 |
| 4.5 细胞毒性作用 |
| 4.6 联系先天性免疫和获得性免疫的作用 |
| 5 人防御素基因表达调控 |
| 5.1 α防御素基因的表达 |
| 5.2 α防御素基因的调控 |
| 5.3 β防御素的基因表达调控 |
| 6 防御素的应用前景 |
| 6.1 在食品中的应用 |
| 6.2 在植物抗病育种中的应用 |
| 6.3 医药中的应用 |
| 6.4 畜牧业中的应用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）甘蓝型油菜“蜀杂九号”防御素基因全长cDNA的克隆与原核表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述抗菌肽基因的表达调控研究 |
| 1 哺乳动物抗菌肽基因的表达调控 |
| 1.1 哺乳动物的 Toll通路 |
| 1.2 TNFR通路 |
| 1.3 人体抗菌肽基因的表达调控 |
| 1.3.1 α防御素的基因表达调控 |
| 1.3.2 β防御素(hBD)的基因表达调控 |
| 1.3.2.1 hBD-1 |
| 1.3.2.2 hBD-2 |
| 1.3.3 小结 |
| 1.3.4 LL-37的表达调控 |
| 1.4 其他动物抗菌肽基因的表达调控 |
| 2 昆虫抗菌肽基因的表达调控 |
| 2.1 Toll信号途径调控机理 |
| 2.2 Imd信号途径调控机理 |
| 2.3 果蝇与哺乳动物先天兔疫应答信号途径比较 |
| 3 植物抗菌肽基因的表达调控 |
| 4 结束语 |
| 前言 |
| 试验部分 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂配置 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 蜀杂9号油菜种子总 RNA的提取 |
| 1.3.2 总 RNA质量检测 |
| 1.3.3 第一链cDNA的合成 |
| 1.3.4 甘蓝型油菜防御素基因的扩增 |
| 1.3.5 PCR产物的回收 |
| 1.3.6 PCR产物的克隆(表达载体的构建) |
| 1.3.7 DNA片段分析 |
| 1.3.8 融合蛋白的诱导表达 |
| 1.3.9 Western-blot检测 |
| 1.3.10 融合蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 种子总RNA的提取 |
| 2.2 甘蓝型油菜防御素基因的扩增 |
| 2.3 PCR产物的克隆(表达载体的构建) |
| 2.4 甘蓝型油菜防御素基因全长cDNA的序列及推导蛋白质序列 |
| 2.5 甘蓝型油菜防御素基因全长cDNA的核酸序列分析 |
| 2.6 甘蓝型油菜防御素基因cDNA的推导蛋白质序列与结构分析 |
| 2.6.1 序列分析 |
| 2.6.2 信号肽序列分析 |
| 2.6.3 二硫键预测 |
| 2.6.4 蛋白质二级结构分析 |
| 2.6.5 防御素三级结构预测 |
| 2.7 融合蛋白的 SDS-PAGE检测 |
| 2.8 Westem-blot鉴定 |
| 2.9 融合蛋白纯化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 在读硕士期间发表论文情况 |
| 声明 |
| 致谢 |
（8）人β防御素3和植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein基因的重组表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 防御素 |
| 2 甜蛋白 |
| 3 pET表达系统 |
| 4 甲醇酵母表达系统 |
| 第二章 人β防御素3基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的克隆表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 hBD_3基因的设计合成 |
| 1.2.2 基因的连接和PCR反应 |
| 1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.2.4 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.2.5 感受态细胞的制备及转化 |
| 1.2.6 PCR产物的克隆 |
| 1.2.7 质粒的提取 |
| 1.2.8 重组质粒pUCmT-hBD_3的筛选和鉴定 |
| 1.2.9 表达载体pET-hBD_3的构建 |
| 1.2.10 表达载体pET-hBD_3的筛选和鉴定 |
| 1.2.11 SDS-PAGE电泳 |
| 1.2.12 β防御素3的诱导表达及电泳检测 |
| 1.2.13 融合蛋白的提取和纯化 |
| 1.2.14 蛋白浓度的检测 |
| 1.2.15 重组天然蛋白的获取与纯化 |
| 1.2.17 防御素蛋白的抑菌活性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 hBD_3基因的构建 |
| 2.2 重组质粒pUCmT-hBb_3的鉴定 |
| 2.3 重组表达载体pET-hBD_3的鉴定 |
| 2.4 目的基因的表达与检测 |
| 2.5 目的蛋白的纯化 |
| 2.6 防御素蛋白的活性检测 |
| 3 讨论 |
| 第三章 植物des-pGlu1-Brazzein基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的克隆表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 甜蛋白基因的设计合成 |
| 1.2.2 基因的连接和PCR反应 |
| 1.2.3 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.2.4 PCR产物的克隆 |
| 1.2.5 重组质粒pUCmT-Bra的筛选和鉴定 |
| 1.2.6 表达载体pET-Bra的构建 |
| 1.2.7 表达载体pET-Bra的筛选和鉴定 |
| 1.2.8 des-pGlu1-Brazzein基因的诱导表达及电泳检测 |
| 1.2.9 des-pGlul-Brazzein融合蛋白与天然蛋白的获取与蛋白浓度检测 |
| 1.2.10 目的蛋白活性的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 des-pGlu1-Bra基因的构建 |
| 2.2 重组载体pUCmT-Bra的鉴定 |
| 2.3 表达载体pET-Bra的鉴定 |
| 2.4 目的基因的表达与检测 |
| 2.5 目的蛋白的纯化 |
| 2.6 des-pGlu1-Brazzein的甜度测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 人β防御素3与植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 hBD_3和des-pGlu1—Brazzein基因的合成 |
| 1.2.2 嵌合基因hBD_3-Bra的构建 |
| 1.2.3 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.2.4 PCR产物的克隆 |
| 1.2.5重组质粒pUCmT-hBD_(3)-Bra的筛选和鉴定 |
| 1.2.6 表达载体pET-hBD_3-Bra的构建 |
| 1.2.7 表达载体pET-hBD_3-Bra的筛选和鉴定 |
| 1.2.8 hBD_3-Bra嵌合基因的诱导表达及电泳检测 |
| 1.2.9 hBD_3-Bra嵌合蛋白的获取与蛋白浓度检测 |
| 1.2.10 hBD_3和des-pGlu1-Brazzein的获取 |
| 1.2.11 目的蛋白的活性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 嵌合基因hBD_3-Bra的构建 |
| 2.2 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的鉴定 |
| 2.3 表达载体pET-hBD_3-Bra的鉴定 |
| 2.4 嵌合基因hBD_3-Bra的重组表达与检测 |
| 2.5 目的蛋白的纯化 |
| 2.6 目的蛋白的活性检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 BL21-pET—hBD_3的摇瓶发酵工艺研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 菌种活化 |
| 1.2.2 装液量、接种量和初始pH值的选择 |
| 1.2.3 IPTG诱导BL21-pET-hBD_3表达目的蛋白的条件选择 |
| 1.2.4 乳糖诱导BL21-pET-hBD_3表达目的蛋白的条件选择 |
| 1.2.5 诱导温度的选择 |
| 1.2.6 菌株BL21-pET-hBD_3的生物量测定 |
| 1.2.7 诱导BL21-pET-hBD_3表达目的产物的最佳条件分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定 |
| 2.2 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果 |
| 2.2.1 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 |
| 2.2.2 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.3 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.4 BL21-pET-hBD_3 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.5 BL21-pET-hBD_3 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.3 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果 |
| 2.3.1 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 |
| 2.3.2 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.3 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.4 BL21-pET-hBD_3 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.5 BL21-pET-hBD_337℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.4 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果 |
| 2.4.1 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果 |
| 2.4.2 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTC和乳糖诱导目的蛋白表达的结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 BL21-pET—Bra的摇瓶发酵工艺研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 菌种活化 |
| 1.2.2 装液量、接种量和初始pH值的选择 |
| 1.2.3 IPTG诱导BL21-pET-Bra表达目的蛋白的条件选择 |
| 1.2.4 乳糖诱导BL21-pET-Bra表达目的蛋白的条件选择 |
| 1.2.5 诱导温度的选择 |
| 1.2.6 菌株BL21-pET-Bra的生物量测定 |
| 1.2.7 诱导BL21-pET-Bra表达目的产物的最佳条件分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定 |
| 2.2 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果 |
| 2.2.1 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 |
| 2.2.2 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.3 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.4 BL21-pET-Bra 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.5 BL21-pET-Bra 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.3 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果 |
| 2.3.1 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 |
| 2.3.2 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.3 BL21-pET-Bras以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.4 BL21-pET-Bra 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.5 BL21-pET-Bra 37℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.4 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果 |
| 2.4.1 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果 |
| 2.4.2 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导目的蛋白表达的结果 |
| 3 讨论 |
| 第七章 BL21-pET—hBD_3-Bra摇瓶发酵工艺研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 菌种活化 |
| 1.2.2 装液量、接种量和初始pH值的选择 |
| 1.2.3 IPTG诱导BL21-pET—hBD_3-Bra表达目的蛋白的条件选择 |
| 1.2.4 乳糖诱导BL21-pET-hBD_3-Bra表达目的蛋白的条件选择 |
| 1.2.5 诱导温度的选择 |
| 1.2.6 菌株BL21-pET-hBD_3-Bra的生物量测定 |
| 1.2.7 诱导BL21-pET-hBD_3-Bra表达目的产物的最佳条件分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定 |
| 2.2 BL21-pFr-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果 |
| 2.2.1 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 |
| 2.2.2 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.4 BL21-pET-hBD_3-Bra 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.2.5 BL21-pET-hBD_3-Bra 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果 |
| 2.3.1 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 |
| 2.3.2 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.4 BL21-pET-hBD_3-Bra 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.3.5 BL21-pET-hBD_3-Bra 37℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 |
| 2.4 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果 |
| 2.4.1 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果 |
| 2.4.2 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导目的蛋白表达的结果 |
| 3 讨论 |
| 第八章 人β防御素3真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 hBD-3基因的合成 |
| 1.2.2 基因的连接和PCR反应 |
| 1.2.3 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.2.4 基因的克隆 |
| 1.2.5 重组质粒pUCmT-hBD_3的筛选和鉴定 |
| 1.2.6 表达载体pPIC9K-hBD_3的构建 |
| 1.2.7 表达载pPIC9K-hBD_3的筛选和鉴定 |
| 1.2.8 pPIC9K-hBD_3质粒的线性化 |
| 1.2.9 酵母感受态细胞的制备和转化 |
| 1.2.10 整合转化子的筛选 |
| 1.2.11 GS115-pPIC9K-hBD_3的PCR鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 hBD_3基因的构建 |
| 2.2 重组质粒pUCmT-hBD_3的鉴定 |
| 2.3 表达载体pPIC9K-hBD_3的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第九章 植物des-pGlul-Brazzein基因真核表达载体的构建及其在甲醇酵母中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 甜蛋白基因的设计合成 |
| 1.2.2 基因的连接和PCR反应 |
| 1.2.3 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.2.4 PCR产物的克隆 |
| 1.2.5 重组质粒pUCmT-Bra的筛选和鉴定 |
| 1.2.6 表达载体pPIC9K-Bra的构建 |
| 1.2.7 表达载pPIC9K-Bra的筛选和鉴定 |
| 1.2.8 pPIC9K-Bra质粒的线性化 |
| 1.2.9 酵母感受态细胞的制备、转化及整合转化子的筛选 |
| 1.2.10 GS115-pPIC9K-Bra的PCR鉴定 |
| 1.2.11 GSIl5-pPIC9K-Bra的诱导表达 |
| 1.2.12 表达产物分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 des-pGlul-Brazzein的基因合成 |
| 2.2 重组质粒pUCmT-Bra的鉴定 |
| 2.3 表达载体pPIC9K-Bra的鉴定 |
| 2.4 GS115-pPIC9K-Bra的筛选和鉴定 |
| 2.5 GS115-pPIC9K-Bra的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 第十章 人β防御素3与植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的合成及其在甲醇酵母中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 hBD_3和des-pGlu1-Bra基因的合成 |
| 1.2.2 基因的连接和PCR反应 |
| 1.2.3 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.2.4 PCR产物的克隆 |
| 1.2.5 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的筛选和鉴定 |
| 1.2.6 表达载体pPIC9K-hBb_3-Bra的构建 |
| 1.2.7 表达载体pPIC9K-hBD_3-Bra的筛选和鉴定 |
| 1.2.8 pPIC9K-hBD_3-Bra质粒的线性化 |
| 1.2.9 酵母感受态细胞的制备、转化及整合转化子的筛选 |
| 1.2.10 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的PCR鉴定 |
| 1.2.11 GS115-pPIC9K—hBD_3-Bra的诱导表达 |
| 1.2.12 表达产物分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 hBD_3-Bra基因合成 |
| 2.2 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的鉴定 |
| 2.3 表达载体pPIC9K-hBD_3-Bra的鉴定 |
| 2.4 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的筛选和鉴定 |
| 2.5 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 结论及后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.1.1 质粒与菌株 |
| 1.1.2 试 剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 引物 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 人外周静脉血液中总RNA的提取[7] |
| 1.2.2 RT-PCR扩增cDNA |
| 1.2.3 PCR扩增HNP-1基因 |
| 1.2.4连接反应 |
| 1.2.5 重组质粒转化JM109感受态宿主菌 |
| 1.2.6 重组质粒的筛选及鉴定 |
| 1.2.7 测序 |
| 2 结果与结论 |
| 2.1 RT-PCR扩增HNP-1基因 |
| 2.2 HNP-1基因重组载体的构建及转化 |
| 2.3 重组子的检测 |
| 2.4 HNP-1基因序列测定及其结构分析 |
| 3 结 论 |
（10）人源多肽抗生素LL-37/hCAP-18的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一节 LL-37／hCAP-18在白血病细胞中的表达 |
| 第二节 hCAP-18的分子克隆与真核表达 |
| 第三节 利用原核表达系统表达有活性的LL-37 |
| 第四节 LL-37基因在烟草中的表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 缩写词表 |
| 博士生期间发表论文题录 |
| 致谢 |
四、人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析（论文参考文献）
- [1]2个新的鸽β-防御素5的克隆与生物学特性的初步研究[D]. 辛胜男. 东北农业大学, 2013(10)
- [2]表达猪抗菌肽PF1和PR39重组干酪乳杆菌的构建及其生物学活性测定[D]. 刘阳欣. 东北农业大学, 2013(10)
- [3]中国荷斯坦奶牛β-防御素基因LAP分子克隆及真核表达初步研究[D]. 袁曦. 四川农业大学, 2009(07)
- [4]仙人掌抗菌肽的筛选分离纯化及性质研究[D]. 刘一江. 四川农业大学, 2007(02)
- [5]人防御素与女性生殖[J]. 郭小燕,傅玉娟,吕淑兰. 国外医学（计划生育/生殖健康分册）, 2007(03)
- [6]新型防御素基因的克隆与原核表达研究[D]. 杨毅. 四川大学, 2006(03)
- [7]甘蓝型油菜“蜀杂九号”防御素基因全长cDNA的克隆与原核表达[D]. 王轶. 四川大学, 2005(02)
- [8]人β防御素3和植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein基因的重组表达研究[D]. 李春丽. 浙江大学, 2005(05)
- [9]人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析[J]. 任洪艳,张苓花,王运吉. 大连轻工业学院学报, 2003(04)
- [10]人源多肽抗生素LL-37/hCAP-18的初步研究[D]. 杨应华. 中国协和医科大学, 2003(12)