一、外源p21~(WAF1)转染对人成纤维细胞凋亡的影响（论文文献综述）
陈亮[1]（2020）在《含磷树状大分子纳米载体的设计及其肿瘤治疗应用》文中认为治疗药物的高效负载和安全有效地输运到肿瘤组织是癌症高效治疗的关键。然而,传统的肿瘤化疗药物通常存在稳定性和水溶性差、毒副作用大,新型的基因药物存在体内易降解等问题,使药物难以在肿瘤部位有效富集。此外,金属离子型药物如顺铂（Pt）被证明对肿瘤具有较好的抑制治疗效果,但其潜在的不稳定性和易氧化性极大地限制了其在肿瘤治疗的应用。纳米科学与技术的快速发展使高效治疗成为了可能。合适的纳米药物载体可以克服以上不同药物的内在负载和输运问题。近年来,各种纳米载体如脂质体、介孔硅、纳米凝胶、胶束、聚合物等被开发出来并广泛地用于负载造影剂和药物等进行肿瘤的诊断和治疗。然而,构建稳定、高效、安全的载体用于肿瘤的高效治疗依然存在着巨大的挑战。聚酰胺-胺树状大分子由于其独特的物理化学特性如结构规整、内部空腔和表面大量官能团等,使其作为纳米载体在肿瘤的诊断和治疗中备受青睐。然而,其外部大量的氨基使其对正常细胞具备一定毒性,通常需要进行表面修饰改善其生物相容性。此外,作为基因载体,其自身还存在刚性不足的问题,通常需要在其内部包裹金属纳米颗粒以保证暴露出足够DNA结合位点,使其具有较高的DNA压缩能力。与生命活动息息相关的元素磷,以其独特的生物学特性逐渐被用于纳米材料领域。在树状大分子结构中（核心、分支单元、内部分支、脊骨和表面）引入含磷单元（如六氯环三聚磷腈和硫代磷）预计可以综合两种材料的优势,使其既具有传统树状大分子高度支化、对称的结构和高度均一的分子量分布,又具有磷元素引起的生物学特性,如良好的生物相容性。因此,本论文拟设计一系列离子型含磷树状大分子用于基因药物的负载和金属离子的络合、构建两亲性树冠大分子形成胶束用于疏水抗癌药物负载,并探索负载药物的含磷树状大分子在肿瘤高效治疗的应用前景,为开发新型稳定、安全、高效药物载体提供新的设计思路和理论基础。本论文的主要研究内容如下:（1）第二章中,基于不同代数的含磷树状大分子,制备了多种不同表面修饰的阳离子型含磷树状大分子,系统化地研究了其作为基因载体在基因治疗的治疗效果,并筛选出具有最佳转染效率的基因载体。首先,以编码绿色荧光蛋白的质粒DNA为报告基因,通过体外基因转染实验,研究了含磷树状大分子的代数和表面官能基团种类对基因转染效率的影响,筛选出具有最佳转染效率的基因载体:表面修饰有质子化吡咯烷的第一代含磷树状大分子（1-G1）。然后,以1-G1为载体负载具有抑癌基因p53的质粒,研究了其在体外和体内的基因治疗效果。实验结果显示,1-G1能够有效地转染质粒DNA并使其在细胞内部进行转录和翻译,表达的p53蛋白具有良好的生物学活性且能够有效地引起细胞周期阻滞,但对正常组织器官没有毒副作用。（2）第三章中,在优化了代数的含磷树状大分子中引入金属离子及烷基长链,制备了金属离子型含磷树冠大分子用于肿瘤的金属化疗药物治疗。我们以六氯环三聚磷腈为内核,首先通过取代和缩合反应制备得到具有疏水烷基长链的含磷树冠大分子,而后在其表面修饰配位基团并络合Au（III）或Cu（II）,得到金属离子型含磷树冠大分子,最后对其治疗效果进行了评价。结果显示,在络合相同金属离子（Au（III）或Cu（II））条件下,随着烷基链长度的减少,对细胞的毒性有所增加;经材料（10μM）处理后,可以明显地观察到4T1细胞内出现了颗粒状的凋亡小体并发生S期阻滞;用Au（III）取代Cu（II）可以显着地提高金属离子型含磷树冠大分子的抗增殖活性,同时经络合有Cu（II）的含磷树冠大分子处理后的细胞显示出Caspase-3非依赖性细胞凋亡,而络合有Au（III）的含磷树冠大分子组的细胞则显示Caspase-3依赖性细胞凋亡。（3）第四章中,以第二章优化的阳离子含磷树状大分子为基础引入疏水烷基长链,制备了阳离子型两性含磷树冠大分子（1-C12G1）,并形成胶束负载化疗药物阿霉素（DOX）、复合基因药物mi R-21抑制剂,用于三阴性乳腺癌的化疗和基因治疗的体外协同治疗。我们以六氯环三聚磷腈为内核,首先通过取代和缩合反应制备得到具有十二氧基苯甲酸的含磷树冠大分子,而后在其表面修饰吡咯烷并质子化,得到两性含磷树冠大分子并形成胶束负载化疗药物和基因药物,评价其体外对三阴性乳腺癌的协同治疗效果。结果显示,1-C12G1具有良好胶束的稳定性和药物负载能力（DOX包封率最高为99.81%;载药量最高为82.1%）。此外负载化疗药物和基因药物的1-C12G1@DOX/mi R-21i复合物在不同生理盐水和细胞培养液中均具有良好的稳定性且该复合物在酸性条件具有良好的药物缓释效果。同时该复合物中的DOX和mi R-21i对三阴性乳腺癌细胞表现出协同治疗效果。
陈前智[2]（2020）在《AGK在结直肠癌发生发展中的作用和机制探讨》文中提出甘油酰基激酶（acylglycerol kinase,AGK）是一种脂质激酶,它催化磷脂酸和溶血磷脂酸的形成,参与磷脂的合成,也可作为细胞信号分子调节各种恶性过程,如肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成。但AGK在结直肠癌中的作用及机制研究很少,目前也少有研究对AGK在肿瘤相关表型的作用进行深入阐述。本研究以结直肠癌患者病理标本、结直肠癌细胞系、裸鼠等为研究对象,发现AGK能够抑制结直肠癌的细胞增殖、促进其细胞衰老。在结直肠癌标本中AGK在肿瘤组织的表达量显着低于相应的癌旁正常黏膜组织。AGK稳定低表达的细胞系的细胞增殖水平明显高于对照组细胞,而其细胞衰老水平显着低于对照组,并且在体内实验中亦可得到相似结果。进一步的机制研究发现,AGK可以结合p53并使其发生磷酸化,从而抑制MDM2介导的p53泛素化降解,同时AGK也可通过PINK1/Parkin信号通路抑制p53溶酶体途径的降解,进而促进了p21的转录激活,从而影响细胞增殖及细胞衰老。本研究揭示了AGK/p53/p21轴在结直肠癌细胞中的重要作用,为肿瘤的防治策略提供了新的视角和方法。
俎廷建[3]（2020）在《高表达ATF3人真皮成纤维细胞抑制皮肤黑色素瘤细胞生长迁移的作用与机制研究》文中研究表明背景与目的皮肤黑色素瘤是起于皮肤表皮基底层的黑色素细胞的皮肤恶性肿瘤。黑色素瘤极易发生转移,是皮肤三大恶性肿瘤中最致命的一种。临床上对于黑色素瘤,尤其是发生转移的皮肤黑色素瘤病例的治疗一直是一个很棘手的问题。黑色素瘤细胞通常是由被激活的细胞外信号调节激酶（ERK）途径进行调节,该信号由BRAF激活突变所诱导。BRAF是RAF家族的一种蛋白激酶,其功能位于RAS下游,通过磷酸化MEK激活ERK来帮助刺激细胞生长和存活。临床上用于治疗皮肤恶性黑色素瘤的BRAF抑制剂可短暂有效,但是大多数患者会产生耐药性。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）指的是肿瘤在发生发展过程中所处的局部环境,构成这一局部环境的细胞成分复杂,包括但不限于免疫细胞、血细胞、内皮细胞、脂肪细胞和细胞基质。肿瘤基质是肿瘤微环境的重要组成部分,主要由成纤维细胞和细胞外基质构成。在过去的几十年里,越来越多的研究成果证实TME在决定疾病进展和治疗结果方面的作用变得越来越明显。肿瘤细胞与微环境之间的相互作用机制非常复杂,但可分为两大类:即接触式和非接触式途径。其中接触式途径涉及细胞-细胞和细胞外基质粘附分子的接触依赖性机制。而在非接触式途径中,诸多可溶性分子,如生长因子,趋化因子和细胞因子,以及可溶性的亚细胞器（包括微泡和外泌体）等在整个过程中起到至关重要的作用,最终,这些相互作用通过分泌和旁分泌机制,完成与恶性肿瘤细胞的相互作用。肿瘤微环境肿瘤基质细胞中最主要的细胞成分为成纤维细胞。最近,越来越多的相关研究成果显示,肿瘤基质组织与肿瘤抗药性的产生有很大关系,提示癌症治疗应该包括靶向基质细胞来抑制肿瘤的策略。ATF3（activating transcription factor 3,ATF3）为 ATF/CREB 家族重要成员之一。作为重要的转录因子,ATF3在不同组织中表现的功能可能存在差异。ATF3基因在肿瘤发展中可能会表现出促癌基因和抑癌基因正反两方面作用。本课题组前期研究结果显示在人表皮角质形成细胞中,上调ATF3表达水平会抑制p53基因依赖的细胞衰老,从而促进皮肤鳞状细胞癌的发生发展。人真皮成纤维细胞中亦有ATF3基因表达,但对其功能的研究甚为少见,目前为止只有一篇报道指出低表达ATF3的成纤维细胞可转化为癌症相关成纤维细胞表形,并最终促进了皮肤鳞状细胞癌的发展。但是人真皮成纤维细胞ATF3与皮肤黑色素瘤之间的关系尚未见报道。为填补这一空白,本研究首先拟通过对皮肤黑色素瘤临床病例标本进行检测,明确ATF3在临床黑色素瘤基质细胞中表达情况。随后利用ATF3过表达和敲除等手段,借助共培养体系和条件培养基等方法,通过体外体内实验检测原代人真皮成纤维细胞对皮肤黑色素瘤细胞生长与迁移等生物学行为的影响,并针对一系列指标进行检测以明确机制。最后本研究将尝试验证药物诱导ATF3增高表达的人真皮成纤维细胞对人皮肤黑色素瘤细胞的影响,以期将来为皮肤黑色素瘤的治疗提供新的思路和方案。方法1.对皮肤恶性黑色素瘤临床病例标本ATF3表达水平的检测首先收集病理诊断为皮肤黑色素瘤的临床病例肿瘤石蜡标本,利用免疫组织化学染色技术对石蜡切片进行染色,后利用RNAscope原位杂交染色技术,对免疫组织化学染色结果进行验证。随后利用免疫荧光双重染色技术,检测人正常真皮成纤维细胞、人皮肤良性黑色素痣以及人皮肤黑色素瘤肿瘤基质组织中成纤维细胞ATF3表达水平,并对结果进行统计学分析。2.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响体外及体内实验检测首先分离原代人真皮成纤维细胞并培养。利用已有针对人ATF3基因过表达和CRISPR/Cas9基因敲除的慢病毒和逆病毒来制备相应的病毒,并用病毒感染人真皮成纤维细胞已达到ATF3过表达及敲除。利用qRT-PCR以及Western Blot等技术对ATF3表达效果进行验证。利用共培养体系,以及收集ATF3不同表达水平的成纤维细胞条件培养基来培养黑色素瘤细胞,然后利用CCK-8、细胞克隆形成实验、transwell以及细胞划痕实验等方法,检测ATF3过表达或敲除的人真皮成纤维细胞对皮肤黑色素瘤生长与迁移能力的影响。采用8周nude/nude裸鼠,随机分为二组,每组三只,将ATF3过表达的人真皮成纤维细胞与皮肤黑色素瘤细胞混合,利用裸鼠皮下成瘤实验检测其对黑色素瘤细胞体内成瘤能力的影响。3.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响分子机制的检测利用qRT-PCR技术,对过表达或敲除ATF3基因的人真皮成纤维细胞相应炎性因子等基因变化进行检测,筛选备选下游基因。利用ELISA技术,对条件培养基中相应炎性因子分泌蛋白水平变化进行检测,以验证qRT-PCR结果。利用候选基因相应的重组蛋白或者抑制剂,结合ATF3基因表达改变的人真皮成纤维细胞来源的条件培养基,再利用CCK-8、细胞克隆形成实验、transwell以及细胞划痕实验等方法,检测候选基因重组蛋白或抑制剂对皮肤恶性黑色素瘤细胞生长与迁移能力的影响。利用Western Blot技术,对经条件培养基和候选基因重组蛋白或者抑制剂处理的黑色素瘤细胞相应通路的蛋白磷酸化水平变化进行检测,明确具体信号通路。4.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响分子机制体内验证采用8周nude/nude雌性裸鼠,随机分为三组,每组三只。将经ATF3基因过表达的人真皮成纤维细胞与黑色素瘤细胞按比例混合,植入裸鼠背部皮下。对其中对2组实验组,增加候选基因重组蛋白或者抑制剂给药处理。3周后观察三组裸鼠肿瘤成瘤率、肿瘤体积以及肿瘤重量。5.药物诱导ATF3基因表达的人真皮成纤维细胞对黑色素瘤细胞生长的检测首先利用细胞培养、qRT-PCR以及Western Blot等技术,明确候选药物对人真皮成纤维细胞ATF3基因和蛋白表达水平变化的影响及其变化规律。其次收集经药物处理后的人真皮成纤维细胞条件培养基,利用CCK-8等技术检测其对黑色素瘤细胞生长能力的影响,并利用qRT-PCR以及ELISA等技术检测相应基因变化水平以及蛋白变化水平。最后将经药物预处理的人真皮成纤维细胞与皮肤恶性黑色素瘤细胞混合,利用随机两组8周龄nude/nude雌性裸裸鼠皮下成瘤实验检测其对黑色素瘤细胞体内成瘤能力的影响。以上实验至少重复3次。结果1.对皮肤恶性黑色素瘤临床病例标本ATF3表达水平的检测结果免疫组化和RNAscope原位杂交染色结果显示,在皮肤恶性黑色素瘤肿瘤基质组织中,ATF3呈低表达。免疫荧光双重染色结果显示,与人真皮组织和人皮肤良性黑色素痣基质组织相比,人皮肤黑色素瘤肿瘤基质组织中成纤维细胞ATF3表达水平呈低表达,且组间差异具有统计学意义。2.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响体内体外实验检测结果与对照组相比,与过表达ATF3人真皮成纤维细胞共培养能抑制黑色素瘤细胞生长与迁移,实验组与对照组结果差异具有显着统计学意义;与对照组相比,与CRISPR/Cas9基因敲除ATF3人真皮成纤维细胞共培养对黑色素瘤细胞生长与迁移无明显抑制和促进作用。与对照组相比,与过表达ATF3人真皮成纤维细胞条件培养基抑制黑色素瘤细胞生长与迁移,实验组与对照组结果差异具有显着统计学意义。与对照组相比,过表达ATF3人真皮成纤维细胞混合组黑色素瘤细胞裸鼠体内成瘤率与成瘤大小受到抑制,实验组与对照组结果差异具有显着统计学意义。3.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响分子机制的检测qRT-PCR检测结果显示,在过表达ATF3基因的人真皮成纤维细胞中,包括IL-6、IL-8、IL-1β、COX1-3等炎性因子mRNA水平显着降低;CRISPR/Cas9基因敲除ATF3人真皮成纤维细胞组与对应对照组相比,仅IL-6、IL-8mRNA水平出现增高,其他基因未见显着变化。ELISA检测结果显示,与相应对照组相比,过表达ATF3基因人真皮成纤维细胞条件培养基中,IL-6,IL-8蛋白含量水平显着降低,且差异具有统计学意义。CRISPR/Cas9基因敲除ATF3人真皮成纤维细胞组条件培养基与对应对照组条件培养基相比,IL-6,IL-8蛋白含量水平升高不显着。利用人重组白介素6（rhIL-6）对黑色素瘤细胞系进行处理结果显示,能够促进其生长与迁移。Western Blot结果显示,过表达ATF3基因的人真皮成纤维细胞条件培养基抑制黑色素瘤细胞STAT3蛋白磷酸化水平,rhIL-6的处理也能够促进黑色素瘤细胞STAT3蛋白磷酸化。结果表明过表达ATF3人真皮成纤维细胞主要通过调节黑色素瘤细胞IL-6/STAT3信号通路来抑制其生长与迁移。4.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响分子机制的体内验证裸鼠体内成瘤实验结果显示,与对照组相比,过表达ATF3人真皮成纤维细胞混合组黑色素瘤细胞裸鼠体内成瘤率与成瘤重量明显受到抑制,黑色素瘤细胞与过表达ATF3人真皮成纤维细胞混合组加rhIL-6给药组体内成瘤率及肿瘤重量则得到促进,表明高表达ATF3人成纤维细胞是通过抑制IL-6来抑制黑色素瘤的生长。5.药物诱导ATF3基因表达的人真皮成纤维细胞对黑色素瘤细胞生长的检测结果qRT-PCR及Western Blot结果显示苯乙双胍或环孢素A促进人真皮成纤维细胞ATF3基因及蛋白表达,同时抑制IL-6及IL-8的表达与分泌。苯乙双胍或环孢素A预处理人皮成纤维细条件培养基显着抑制黑色素瘤细胞体外生长。裸鼠体内成瘤结果显示,与对照组相比,与环孢素A预处理的人真皮成纤维细胞混合组黑色素瘤细胞裸鼠体内成瘤率与成瘤重量受到抑制。结论1.人皮肤恶性黑色素瘤肿瘤基质组织中成纤维细胞ATF3水平呈低表达。2.过表达ATF3基因抑制人真皮成纤维细胞多种炎性因子表达与分泌,特别是抑制IL-6的表达尤为显着。3.过表达ATF3人真皮成纤维细胞主要通过调节IL-6/STAT3信号通路抑制皮肤恶性黑色素瘤细胞生长与迁移。4.苯乙双胍或环孢素A可诱导人真皮成纤维细胞ATF3基因表达,同时抑制人真皮成纤维细胞炎性因子IL-6及IL-8的表达与分泌。5.苯乙双胍或环孢素A预处理诱导ATF3表达的人真皮成纤维细胞抑制皮肤恶性黑色素瘤细胞生长。
姚宏伟[4]（2020）在《白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究》文中提出肾细胞癌作为肾癌最常见的亚型,对放疗、化疗均不敏感,早期局限性肾细胞癌以手术切除为主。30%的患者被确诊为肾细胞癌时已经发生转移,并且一部分患者术后仍会发生转移,转移性肾细胞癌患者预后极差。目前分子靶向药物治疗肾细胞癌取得了一定的进展,但疗效并不令人满意,因此发展新的药物具有重要的临床意义。自然化合物是新的药物发展的宝贵资源,白藜芦醇（Resveratrol,Res）作为一种天然类化合物,分布于多种植物中。已有的研究显示Res能够通过引起细胞周期阻滞,诱导凋亡,抑制侵袭、转移等多种机制,对多种类型的肿瘤细胞体外具有抑制作用,并且在体内同样具有抗肿瘤活性。目前Res在肾细胞癌中的相关研究较少,并且由于Res复杂的药理活性,其作用机制尚不清楚。本研究观察Res对肾细胞癌的作用,并探讨相关的作用机制,为发展新的药物治疗肾细胞癌提供理论基础。第一部分白藜芦醇对人肾细胞癌786-O细胞的作用背景:研究显示Res对多种类型的肿瘤具有抑制作用,但在肾细胞癌中的作用目前研究较少,需进一步阐释。目的:探讨Res对人肾细胞癌的作用。方法:给予Res处理人肾细胞癌786-O细胞,使用CCK8检测细胞活性;流式细胞技术分析细胞凋亡及细胞周期;细胞划痕及transwell实验分析迁移及侵袭能力;Western blot检测MMP2（基质金属蛋白酶2）及MMP9（基质金属蛋白酶9）蛋白的表达;建立786-O细胞裸鼠移植肿瘤模型,观察Res体内对肾细胞癌生长的作用。结果:Res呈浓度及时间关系减少786-O细胞的活性。给予48 h的处理,20μM及40μM浓度的Res诱导细胞凋亡,10μM的Res对凋亡无明显影响,但引起S期周期阻滞。Res抑制786-O细胞的迁移及侵袭能力,并且下调MMP2及MMP9蛋白的表达。Res在裸鼠体内抑制移植肿瘤的生长,减少肿瘤的体积及重量。结论:Res在体外及体内对人肾细胞癌均具有抗肿瘤作用。第二部分白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞凋亡背景:细胞凋亡是一个主动过程,涉及一系列信号因子的激活、表达以及调控。积累的证据证实Res能诱导肿瘤细胞的凋亡,但由于其复杂的药理活性,诱导凋亡的具体分子机制仍需进一步的阐释。目的:体外探讨Res诱导786-O细胞凋亡的分子机制。方法:流式细胞技术检测线粒体膜电位、凋亡、caspase3活性及ROS（活性氧）水平;免疫荧光检测ROS及细胞色素C;Western blot分析GAPDH、COXⅣ、细胞色素C、PARP、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38及p-p38蛋白的表达。结果:Res下调786-O细胞的线粒体膜电位水平,促进细胞色素C的胞浆释放,上调caspase3活性,引起PARP蛋白的裂解。Z-VAD-FMK,一个pan-caspase抑制剂,显着抑制Res诱导的凋亡。进一步的实验显示Res促进786-O细胞ROS的产生,抗氧化剂NAC（N-乙酰半胱氨酸）能够改善线粒体膜电位,下调caspase3活性,减少PARP蛋白的裂解,抑制Res诱导的凋亡。最后我们发现Res通过ROS抑制ERK（细胞外信号调节激酶）,激活JNK（c-jun氨基末端激酶）及p38（p38丝裂原活化蛋白激酶）,SP600125（JNK抑制剂）对凋亡无明显影响,SB203580（p38抑制剂）减少Res诱导的786-O细胞凋亡。结论:1、Res引起线粒体损伤,激活caspase3导致786-O细胞凋亡。2、Res上调786-O细胞的ROS水平,升高的ROS促进凋亡。3、Res通过ROS激活p38,激活的p38促进Res诱导的786-O细胞凋亡。第三部分自噬抑制白藜芦醇诱导的人肾细胞癌786-O细胞凋亡背景:自噬作为进化过程中的保守机制,普遍存在于各种生物细胞中。当细胞受到各种压力,能够激活自噬,维持内环境的稳态,有利于细胞在压力环境下的存活;但在一些情况下,极度的自噬能导致损伤的进一步加重,促进细胞的死亡。研究报道Res能通过多种途径影响自噬,发挥促存活或促死亡的作用,但在肾细胞癌中的作用并不清楚。目的:体外探讨自噬对Res诱导786-O细胞凋亡的影响。方法:流式细胞技术及免疫荧光检测Cyto-ID荧光分析细胞自噬体形成;western blot检测GAPDH、LC3BII、P62、S6、p-S6、AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK、BCL2、p-BCL2、Becline1以及PARP蛋白的表达;流式细胞技术检测细胞凋亡;si RNA干扰技术敲低Beclin1蛋白的表达,探讨自噬对Res诱导786-O细胞凋亡的影响。结果:Res上调786-O细胞自噬水平;Res诱导的自噬需要ROS,抗氧化剂NAC减少Res上调的自噬;Res对p-AMPK及p-S6蛋白的表达没有影响,JNK阻滞剂SP600125下调自噬,相反p38阻滞剂SB203580进一步促进Res诱导的自噬;自噬阻滞剂CQ（氯喹）进一步促进Res诱导的凋亡,上调PARP蛋白的裂解,并且Beclin1si RNA上调Res引起的PARP蛋白的裂解。结论:1、Res在786-O细胞中激活自噬。2、Res通过ROS-JNK路径激活自噬。3、自噬抑制Res诱导的786-O细胞凋亡。第四部分白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞衰老背景:细胞衰老是指细胞从生长状态进入不可逆转的生长停滞状态。在一定条件下,如化疗药物、电离辐射以及氧化损伤等因素可以诱导肿瘤细胞进入衰老。研究证实Res在体外能够诱导肿瘤细胞进入衰老,抑制肿瘤细胞的生长增殖,但是否能够引起肾细胞癌细胞的衰老迄今未见相关报道。目的:体外探讨Res对肾细胞癌786-O细胞衰老的影响。方法:流式细胞技术检测细胞周期,凋亡及ROS水平;免疫荧光分析p-H2AX;EDU增殖实验检测细胞增殖;SA-β-Gal染色检测细胞衰老;western blot检测GAPDH、p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1、p38、p-p38及p21蛋白的表达水平;荧光定量PCR检测IL-6、IL-8 mRNA的表达,ELISA分析IL-6、IL-8蛋白的分泌水平。结果:给予10μM的Res持续处理786-O细胞4 d,Res增加p-H2AX阳性的细胞,上调p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1及p21蛋白的表达,引起持续的S期周期阻滞,减少EDU阳性的细胞,增加SA-β-Gal染色阳性的细胞,诱导786-O细胞衰老,未引起明显细胞凋亡。Res诱导786-O细胞衰老需要上调的ROS,NAC降低Res上调的p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1及p21蛋白的表达,恢复细胞增殖,下调SA-β-Gal染色阳性的细胞。进一步来说,衰老的细胞上调IL-6、IL-8 mRNA以及蛋白分泌水平（衰老相关的分泌表型,SASP）,上调的IL-6、IL-8mRNA及蛋白分泌需要ROS激活的p38活性,SB203580（p38阻滞剂）抑制IL-6、IL-8 mRNA及蛋白分泌水平。结论:1、Res在体外能够诱导786-O细胞衰老。2、Res上调的ROS促进786-O细胞衰老。3、Res通过ROS-p38路径促进SASP。
林聪[5]（2020）在《PRMT1介导的组蛋白H4稳定性在细胞衰老中的作用和机制研究》文中指出细胞衰老是不可逆的细胞周期停滞过程。多种因素可以触发细胞衰老,包括端粒缩短、致癌信号传导、氧化应激和DNA损伤。衰老细胞的特征包括细胞周期停滞、激活DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）、增强衰老相关的分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype,SASP）、衰老相关的β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）活性提高和染色质结构变化。染色质结构的变化是通过改变其组成成分来介导的。例如,衰老的细胞显示出核小体的核心组蛋白H3和H4水平降低。已有研究表明,随着年龄的增长,在酵母和哺乳动物肝脏中,核糖体占有率的下降与基因表达的整体上调有关,而抑制核小体占有率的下降则延长了其寿命。这些研究表明衰老伴随组蛋白水平的改变。目前为止,组蛋白减少在细胞衰老中的作用和机制还远未阐明。PRMT1是哺乳动物细胞中一种重要的表观修饰酶,介导组蛋白H4第3位精氨酸的不对称二甲基化（H4R3me2as）,具有激活基因转录的作用。过去几十年的研究表明PRMT1与衰老密切相关。PRMT1可以甲基化DAF-16/FOXO,阻断AKT对其磷酸化,增加长寿相关基因的表达,从而延长秀丽隐杆线虫的寿命。在细胞水平,PRMT1功能缺失的细胞表现出细胞周期延迟,检查点激活,基因组不稳定和抑制细胞增殖。我们以前的研究也表明,敲低PRMT1会阻止乳腺癌细胞的生长并诱导细胞衰老。但是,PRMT1介导的H4R3me2as在细胞衰老中的作用仍然是未知的。我们本论文的研究发现,敲低PRMT1在诱导细胞衰老的同时,组蛋白H4的水平明显降低。随后,我们在Ras、Etoposide、H2O2诱导的细胞衰老中发现4种核心组蛋白均下调,而且组蛋白H4的下调要早于其他三种核心组蛋白,表明组蛋白H4下调可能是衰老的早期标志物。进一步的研究表明,组蛋白H4下调是由于其自身稳定性降低造成的;蛋白质免疫共沉淀证实组蛋白H4的泛素化水平并未发生改变,而蛋白酶体调节组分PA200与组蛋白H4的结合增强,表明PA200蛋白酶体途径介导组蛋白H4的降解。此外,我们发现PRMT1介导的H4R3me2as修饰的下调要早于组蛋白H4的降解;通过RNA干扰技术靶向PRMT1-3’UTR敲低内源的PRMT1,再外源过表达野生型的PRMT1抑制组蛋白H4的降解,而外源过表达酶活突变的PRMT1则没有;蛋白质免疫共沉淀和肽段pull down实验证实H4R3me2as修饰抑制PA200与组蛋白H4的结合,表明PRMT1介导的H4R3me2as修饰维持组蛋白H4的稳定。在分子机制方面,组蛋白H4的降解降低核小体占位,进而改变细胞内的基因表达网络,激活细胞周期抑制因子基因p21和GADD45A,SASP基因FGF2、MMP3、IL11和IGFBP7,抗凋亡基因BCL-XL和BCL-W的转录,最终导致细胞衰老。此外我们还发现,抗衰老药物二甲双胍、雷帕霉素和白藜芦醇能够抑制组蛋白H4降解,组蛋白H4的回复明显早于cyclinA2的回复、p21的降低以及SA-β-gal阳性细胞的比例下降,表明组蛋白H4可以作为抗衰老药物筛选的分子靶标。总之,本研究揭示了PRMT1介导的H4R3me2as通过调节组蛋白H4稳定性来调节细胞衰老的新功能。我们还发现组蛋白H4可以作为早期衰老指标和潜在的抗衰老药物筛选标志物,为衰老的早期鉴定和抗衰老药物筛选提供了重要理论基础。
史东宇[6]（2020）在《p400在小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞中的功能初探》文中认为p400（基因符号Ep400）被鉴定为新型腺病毒E1A结合复合物,属于SWR1类DNA依赖性染色质重塑ATP酶,含有SWI2/SNF2型的ATP酶结构域、SANT结构域、HAS结构域以及富含谷氨酰胺的结构域。p400在DNA损伤、组蛋白置换、细胞周期与着床后胚胎发育等过程中发挥重要作用。然而,当前对于p400在小鼠植入前胚胎发育过程中的功能所知甚少。因此,本研究重点探索p400在小鼠植入前胚胎发育过程中发挥的功能。一、检测小鼠各阶段植入前胚胎中p400的动态变化。收集小鼠合子（10h）、2-细胞（24h）、4-细胞（48h）、桑椹胚（72h）、囊胚（96h）五个时期的植入前胚胎与小鼠生发泡（germinal vesicle,GV）时期的卵母细胞,使用免疫荧光染色技术检测p400蛋白在植入前胚胎中的表达。显示p400在小鼠植入前胚胎各个时期均有表达,并且主要表达于细胞核中。随着小鼠植入前胚胎的发育,p400在受精前的GV时期至受精后的2-细胞时期表达量逐渐升高,4-细胞时期表达量降低,桑椹胚至囊胚时期再次升高,并且在囊胚时期达到最高表达量。接着通过实时荧光定量PCR检测p400的mRNA总量在小鼠植入前胚胎发育各个阶段的变化。以GV期卵母细胞的p400 mRNA表达量为对照,实时荧光定量PCR结果表明,合子时期p400表达量没有明显变化,2-细胞时期p400表达量上升,4-细胞时期下降且与GV期卵母细胞表达量相当,囊胚至桑椹胚阶段持续下降,在囊胚时期p400 mRNA表达量降至最低。二、构建Ep400基因敲除的细胞系。为更好的研究p400对小鼠植入前胚胎发育的影响,利用CRISPR-Cas9技术在小鼠胚胎成纤维细胞中敲除Ep400基因,探究其对细胞生长发育的影响。构建敲除载体,采用单位点与双位点的方法敲除Ep400基因。经过研究对比发现,在Ep400基因选取的外显子两侧设计sgRNA,进行双位点敲除,可以形成片段性删除,有效地对Ep400基因进行敲除。Ep400基因成功敲除后,筛选敲除Ep400基因的小鼠胚胎成纤维细胞单克隆细胞系。利用Ep400基因敲除的细胞系,探究p400对小鼠胚胎成纤维细胞生长的影响,进一步为探索p400对小鼠植入前胚胎发育的影响奠定基础。三、敲减Ep400基因对小鼠胚胎成纤维细胞增殖的影响。利用shRNA对Ep400基因进行敲减,通过CCK-8实验检测其对NIH 3T3细胞增殖能力的影响。结果表明,敲减Ep400基因,小鼠胚胎成纤维细胞从48h后表现出增殖能力下降。
赵开亮[7]（2020）在《Mdm2-p53信号通路调控及p53抑制肿瘤转移的机制研究》文中指出p53作为一个重要的抑癌蛋白,其蛋白水平在细胞内需要受到严格的调控。作为体内最为关键的p53负调因子,E3泛素连接酶Mdm2能够结合并催化p53发生多聚泛素化修饰,进而促使p53通过蛋白酶体途径降解。在我们的研究中,我们鉴定了 MARCH7是Mdm2一个新的相互作用蛋白。有意思的是,和传统E3泛素连接酶介导底物降解的作用不同,MARCH7作为一个E3泛素连接酶能够稳定Mdm2的蛋白水平。MARCH7也能够通过稳定Mdm2,进而促进p53多聚泛素化和蛋白降解。在分子机制上,我们发现MARCH7能够在体内外特异性地催化Mdm2形成K63-依赖的多聚泛素链,进而抑制Mdm2的自身泛素化和降解。在功能上,MARCH7能够通过调控p53的表达水平,从而控制细胞增殖、细胞凋亡、克隆形成以及裸鼠移植瘤生长。我们的这一工作揭示了一种全新的Mdm2蛋白稳定性调控模式,并表明MARCH7是Mdm2-p53通路的一个重要调控因子。p53作为抑癌蛋白在肿瘤发生发展过程中起着关键的调控作用。虽然p53抑制肿瘤转移的功能已被人们逐渐认识,然而其潜在的分子机制目前仍然不是很明确。在我们的另一项研究中,我们鉴定了一个新的受p53转录上调的靶基因WDR63。在功能上,WDR63能够抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,并在小鼠体内抑制肿瘤的肺转移。在分子机制上,WDR63能够和微丝成核关键因子Arp2/3复合体发生相互作用,并抑制Arp2/3介导的分支状微丝的聚合过程。更为重要的是,WDR63能够介导p53的肿瘤转移抑制功能。另外,与正常组织相比,肺腺癌和肺鳞癌中的WDR63呈现低表达的状态;WDR63在肺腺癌和肺鳞癌中的表达水平和p53的突变状态具有显着相关性;WDR63的低表达和肺鳞癌的恶性程度也具有很好的相关性。这些研究结果不仅拓展人们对Arp2/3介导的微丝聚合在肿瘤转移中的功能及调控机制的认识,还暗示WDR63在p53抑制肿瘤转移的过程中发挥了重要的介导作用。
戴月娣[8]（2020）在《KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究》文中研究说明胰腺导管癌是一种恶性程度高、病程短、进展快、预后极差的恶性肿瘤,具有复杂的基因组环境。KLF2是Krüppel样因子家族的重要成员,文献报道在多种恶性肿瘤组织中表达下调,与恶性肿瘤关系密切。但是KLF2与胰腺癌的关系未见报道,关系不明确,结合既往研究我们推测KLF2可能协同其他分子参与异常信号通路调节,导致胰腺癌发生、发展。本研究旨在探讨KLF2对胰腺癌细胞生物学行为影响及其机制。第一部分KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响研究目的探讨KLF2对胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老的生物学行为影响。研究方法免疫组化法、Western Blot、RT-PCR法对52例胰腺导管癌组织和配对正常胰腺组织KLF2水平进行检测,观察胰腺癌组织KLF2表达变化,探讨KLF2与胰腺癌发生的关系。真核表达载体转染KLF2至BXPC3和Suit2细胞株,构建稳定生长过表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞;RNA干扰的病毒载体感染细胞株,构建稳定生长并低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞。Boyden chamber实验检测过表达和低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的迁移能力,结晶紫法检测过表达和低表达KLF2细胞的增殖生长能力。Lipofectamine 2000载体转染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的过表达KLF2细胞;RNA干扰病毒载体感染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的低表达KLF2细胞。SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2对HPAC和SW1990细胞衰老影响。荧光素酶基因标记低表达KLF2的BXPC3细胞注入裸鼠心脏,检测肿瘤转移光子数变化;裸鼠皮下种植过表达KLF2的SW1990细胞,测定肿瘤大小计算肿瘤体积,处死小鼠测肿瘤重量;观察KLF2表达对肿瘤体内生长和转移的影响。分离PDX-Cre KrasG12D（KC）小鼠胰腺组织,建立胰腺癌类器官,Lipofectamine 2000作为载体建立过表达KLF2的类器官,体外观察过表达KLF2对胰腺癌类器官生长影响。研究结果与正常胰腺组织相比,胰腺导管癌组织中KLF2 m RNA水平下降、KLF2免疫组化染色阴性增多、KLF2蛋白水平下调。敲减KLF2的BXPC3和Suit2细胞克隆形成和迁移能力增强,低表达KLF2的HPAC细胞和SW1990衰老细胞比例减少,低表达KLF2的BXPC3细胞在裸鼠体内转移光子信号更多。高表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的克隆形成和迁移降低;高表达KLF2的HPAC和SW1990细胞衰老细胞比例更高;高表达KLF2的SW1990细胞裸鼠皮下移植瘤体积更小、重量更轻。高表达KLF2的胰腺癌类器官生长大小更小、数量少。研究结论KLF2低表达与胰腺导管癌发生相关。KLF2高表达能够抑制胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并诱导细胞衰老,抑制胰腺癌干细胞生长;KLF2低表达能够促进胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并抑制细胞衰老。第二部分KLF2抑制胰腺癌的机制研究研究目的探讨KLF2调控胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老等生物学行为改变的机制。研究方法采用报告基因检测法分析过表达KLF2对β-catenin/TCF转录活性及其信号通路下游部分靶基因影响,探讨KLF2通过调控β-catenin/TCF信号抑制胰腺癌机制。Western Blot法及q PCR法测定KLF2变化对细胞衰老标记物p21蛋白及m RNA表达变化,阐明KLF2通过诱导胰腺癌细胞发生衰老抑制胰腺癌。免疫沉淀后质谱法鉴定KLF2的结合蛋白,纯化GST-KLF2融合蛋白进行GST pull-down实验,探讨内源性FOXO4与KLF2的相互作用;免疫共沉淀检测外源性FOXO4是否与KLF2形成复合物,探讨外源性FOXO4与KLF2的相互作用。敲减FOXO4检测KLF2变化,结合敲减KLF2检测FOXO4变化,Western Blot法检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对p21表达影响,SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对细胞衰老影响,探讨KLF2与FOXO4通过调控衰老抑制胰腺癌机制。过表达KLF2的HPAC细胞分别敲减FOXO4或p21,SA-β-Gal染色软琼脂实验观察衰老细胞克隆形成,观察敲减FOXO4和p21对细胞衰老的挽救作用。芯片实验检测KLF2和FOXO4与p21启动子的结合,Flag分别标记KLF2的AD、ID和ZF结构域后转染SW1990细胞,免疫沉淀Western Blot法检测KLF2与FOXO4结合的结构域,定位KLF2发挥抑制功能的结构区域。研究结果KLF2过表达可抑制氯化锂（Li Cl）诱导的Topflash报告基因激活,KLF2过表达可与β-catenin/TCF结合直接抑制其转录活性,也可下调β-catenin/TCF下游c-Jun、c-Myc、cyclin D1和Snail基因表达,抑制β-catenin/TCF信号通路。过表达KLF2诱导衰老特异标记物p21蛋白和m RNA水平显着升高;敲减KLF2后的胰腺癌细胞衰老减少,p21蛋白和m RNA水平降低。KLF2可与内源性FOXO4相互作用,与外源性FOXO4形成复合物,KLF2和FOXO4可通过与p21启动子结合协同诱导p21蛋白表达,共同诱导胰腺癌细胞衰老。敲减FOXO4和p21对KLF2诱导细胞衰老具有挽救作用。KLF2的AD区介导KLF2与FOXO4的相互作用,ID和ZF不能协同FOXO4诱导p21的表达,并且与FOXO4的共表达可能抑制FOXO4单独诱导p21表达作用,提示ID和ZF突变体为负调节因子。研究结论KLF2可直接与β-catenin/TCF结合抑制其转录活性、也可通过抑制其下游基因表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路后抑制胰腺癌。KLF2还可直接诱导p21表达,或与FOXO4结合协同诱导p21表达,诱导胰腺癌细胞衰老抑制胰腺癌。KLF2结构域的AD区与FOXO4绑定起正调节作用,ID和ZF突变体与FOXO4结合起负调节作用。调低FOXO4和p21表达能挽救KLF2诱导的胰腺癌细胞衰老。
刘发扬[9]（2020）在《Ipr1的转录调控及其通过p53调控Irgm1的机理研究》文中研究表明位于小鼠1号染色体结核超敏感位点的胞内病原体抗性基因1（Ipr1基因）在机体对抗胞内病原体（如结核杆菌）感染的过程中起重要作用。其同源基因位于牛2号染色体以及人2号染色体的SP110（Ipr1）基因,能够抑制结核杆菌在宿主细胞中的增殖。研究发现,SP110的单核苷酸多态性和宿主是否易感结核密切相关。在胞内病原体感染时,Ipr1/SP110被激活并参与细胞免疫的过程中,与Ipr1类似,免疫相关的GTP酶家族M蛋白1（Irgm1）在病原体入侵引起的自噬调控中具有十分重要的作用。Ipr1与Irgm1都属于结核抗性基因,迄今为止,Ipr1以及Irgm1在宿主细胞中的调控方式尚不清楚。因此研究Ipr1以及Irgm1在细胞内的表达调控对理解机体对抗胞内病原体的机理具有重要作用。本研究结合生物信息学分析、分子生物学、生物化学及细胞生物学研究方法与技术,深入探究了Ipr1基因的上游调控机制及其通过p53调控下游靶基因Irgm1的机制。主要研究结果如下:1.通过对NCBI数据库中DNA病毒,RNA病毒以及多种结核杆菌菌株处理的免疫相关细胞（THP-1,RAW264.7等）的转录组数据进行分析,发现诺如病毒,乙型肝炎病毒,仙台病毒,甲型流感病毒,结核杆菌北京株,标准株（H37Rv）能够激活Ipr1或SP110的表达。除此之外,依托泊苷和阿糖胞苷分别在U937,A673细胞中激活SP110的表达。同时,有研究证明,DNA病毒,H37Rv,依托泊苷以及阿糖胞苷都能够激活细胞内c GAS-IRF3通路。2.c GAS-IRF3通路参与调控Ipr1的表达。通过比对多个物种Ipr1启动子上顺式作用元件,发现ISRE位点在Ipr1的转录调控中起到了关键作用。c GAS-IRF3通路激活剂ISD能够激活Ipr1的表达。而Ipr1核心启动子区上的ISRE突变后,Ipr1核心启动子失去对ISD的应答。过表达IRF3能够显着的激活Ipr1的转录。凝胶阻滞实验和染色质免疫共沉淀实验证明了IRF3可以结合到Ipr1的启动子区上,进而发挥调控Ipr1基因表达的功能。3.Ipr1参与ISD诱导的Irgm1表达调控。Irgm1是调控细胞自噬的关键基因。当使用ISD处理RAW264.7细胞时,Irgm1的m RNA和蛋白质水平显着提高。Irgm1基因的转录起始位点上游470bp到下游462bp是其核心启动子区。ISD处理能够显着激活该段启动子的转录活性。当干扰Ipr1后,Irgm1的表达受到了显着的抑制。过表达Ipr1能够提高Irgm1的启动子活性。4.p53参与Irgm1的表达调控。通过Irgm1的启动子区域顺式作用元件预测发现,在Irgm1的启动子上含有p53的识别位点。该位点的突变显着下调Irgm1的启动子活性。当使用Act D,ISD处理细胞或在细胞中过表达p53后,p53位点突变的启动子活性显着低于野生型。使用Act D,ISD处理细胞或在细胞中过表达p53都能够激活Irgm1基因的转录。5.Ipr1通过与Rpl11,Mdm2的互作调控p53的稳定性。在静息状态下,p53与Mdm2结合并通过泛素化而降解。对Ipr1,Mdm2以及p53互作蛋白的聚类分析发现,Rpl11与Ipr1,Mdm2以及p53都存在相互作用。Co-IP证明Ipr1与Rpl11,Mdm2存在蛋白水平上的相互作用。未过表达Rpl11的情况下,Ipr1对Mdm2与p53的相互作用无显着影响。当体系中加入Rpl11后,过表达Ipr1加强了Rpl11与Mdm2的互作,同时Mdm2与p53的互作受到了显着的抑制。过表达Ipr1可以显着减少泛素化p53的含量。这些结果说明Ipr1通过Rpl11调控Mdm2和p53的互作。本研究阐明了胞内病原体抗性基因Ipr1的上游调控机制以及Ipr1通过p53蛋白调节下游靶基因Irgm1的机制。已有报道证明胞内病原体如结核杆菌的入侵能够激活p53通路,但其详细机理仍然没有被解释清楚。c GAS-IRF3通路作为近几年发现的与细胞免疫直接相关的通路,与p53通路也存在密切联系。通过对Ipr1基因上下游调控机制的研究,本研究证明c GAS-IRF3通路调控Ipr1的表达;Ipr1蛋白能够增强Rpl11和Mdm2蛋白的相互结合,从而促进Mdm2-p53蛋白复合体的分离,降低泛素化p53蛋白水平;p53参与自噬相关基因Irgm1的表达调控。本研究通过对Ipr1功能的研究,将参与细胞免疫反应的c GAS-IRF3通路与调控细胞自噬基因Irgm1表达的p53通路联系在一起,丰富了细胞内信号通路交互联系的理论研究。
周强[10]（2020）在《DNA损伤与修复在多聚鸟苷酸干预小鼠矽肺纤维化中的作用及机制研究》文中研究表明背景矽肺（Silicosis）是由于吸入粉尘引起的一种以肺组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病,其表现为肺组织结构的破坏,并以结节性纤维化为主要病理。虽然目前认为矽肺可防可治,但是现有的治疗药物,未能有效的延缓疾病进展[1]。因此,明确矽肺纤维化的发生机制,尤其是在矽肺的发病早期制定新的有效的治疗策略已成为当务之急。研究发现,多聚鸟苷酸（polyguanylic acid,PolyG）是一种具有G-四联体（G-quadruplex,G4）结构的胶原样结构巨噬细胞受体（macrophage receptor With Collagenous Structure,MARCO）的特异性配体,之前研究表明其能有效抑制矽肺纤维化。此外在肿瘤研究中发现多种具有G-四联体的药物可有效抑制DNA损伤与修复的相关蛋白--核仁素（Nucleolin,C23）的表达,但其在矽肺中调控核仁素的作用机制尚不清楚。为此本研究进一步探讨DNA损伤与修复在PolyG抗矽肺纤维化中的作用及机制,为阐明矽肺发病机制、寻找药物靶点及矽肺病防治提供理论依据。目的通过吸入式气管滴注法构建C57BL/6小鼠矽肺模型,探讨:（1）DNA损伤与修复相关信号通路在二氧化硅诱导矽肺纤维化中的作用;（2）DNA损伤与修复在PolyG干预矽肺纤维化中的分子机制。方法将48只无特定病原体（specific pathogen free,SPF）的4周龄的雄性C57BL/6小鼠适应性饲养一周后,按体重随机分成正常对照组、二氧化硅组、二氧化硅+PolyG组,每组16只。二氧化硅组与二氧化硅+PolyG组的小鼠均采用吸入式无创造模方式,将50mg/ml的二氧化硅悬浊液50μl一次性滴注进小鼠气管建立矽肺模型,对照组以相同方式滴注同体积的无菌生理盐水。在造模当天,给予干预组小鼠PolyG（2.5mg/Kg）干预。分别于造模后第28天和第56天处死小鼠,每组8只。取小鼠的右肺下叶固定在4%的多聚甲醛中,用于后续HE染色及Masson染色;取右肺上叶制备肺匀浆,通过Western蛋白免疫印记法检测核仁素（nucleolin,C23）、α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、γ-H2AX、损伤特异性DNA结合蛋白2（Damage Specific DNA Binding Protein 2,DDB2）、核糖核苷酸还原酶调节性TP53诱导亚基M2B（Ribonucleotide Reductase Regulatory TP53 Inducible Subunit M2B,p53R2）、生长停滞和DNA损伤诱导α蛋白（Growth Arrest And DNA Damage Inducible alpha,GADD45α）的表达。提取小鼠左肺组织中RNA,逆转录为cDNA后,通过qPCR检测Ⅰ型前胶原（CollagenⅠa1）、Ⅲ型前胶原（CollagenⅢa1）、共济失调毛细血管扩张突变基因（Ataxia Telangiectasia Mutated gene,ATM）、P53、P21以及细胞周期蛋白cyclinD1、细胞周期素依赖性激酶4/6（CDK4/CDK6）等基因在mRNA水平的表达。结果1.不同时间各组小鼠肺组织病理变化:HE染色显示,矽肺模型组肺泡内浸润细胞数量明显多于对照组;此外,还可发现肺泡结构破坏和肺间质增厚。且与28天相比,56天组的肺纤维化程度更加明显。Masson染色可见,矽肺模型组中蓝色胶原与对照组比较明显增加,而PolyG干预组显示纤维化明显缓解。2.不同时间各组小鼠肺组织中γ-H2AX、Vimentin和α-SMA蛋白表达变化:矽肺模型组的小鼠肺组织中Vimentin和α-SMA的表达均高于同期的生理盐水组（P<0.05）,PolyG干预组中Vimentin和α-SMA的表达相较于同期的矽肺模型组均降低（P<0.05）;在二氧化硅暴露后的第56天,矽肺模型组的小鼠肺组织中γ-H2AX的表达量相较于同期生理盐水组,表达升高（P<0.05）,同样γ-H2AX蛋白在PolyG干预组小鼠肺组织中的表达量减少（P<0.05）。3.不同时间各组小鼠肺组织中CollagenⅠa1、CollagenⅢa1和DNA损伤修复相关基因的mRNAs表达规律:在不同时间点,矽肺模型组的小鼠肺组织中CollagenⅠa1、CollagenⅢa1、ATM、P53和P21的转录水平相较于生理盐水对照组均升高（P<0.05）,PolyG干预组小鼠肺组织中上述基因的转录水平均低于矽肺模型组（P<0.05）。4.各组小鼠肺组织中核仁素与DNA修复相关蛋白的表达:在各个时间点,矽肺模型组的小鼠肺组织中核仁素蛋白的表达均高于生理盐水组（P<0.05）,PolyG干预组的表达均低于矽肺模型组（P<0.05）。而GADD45α蛋白在矽肺模型组小鼠肺组织中的表达均低于同期的生理盐水组和PolyG干预组（P<0.05）5.不同时间各组小鼠肺组织中cyclinD1与CDK4/6的mRNAs在小鼠肺组织中表达:在28天的时间点,矽肺模型组的小鼠肺组织中cyclinD1的转录水平相较于生理盐水对照组均升高（P<0.05）。而在56天的时间点,矽肺模型组的小鼠肺组织中cyclinD1的转录水平相较于生理盐水对照组降低（P<0.05）。此外,CDK6的mRNA水平只在28天的时间点,矽肺模型组与干预组之间未见统计学差异（P>0.05）。而CDK4的转录水平在56天相较于其它两组未见统计学差异（P>0.05）。结论1.二氧化硅可以诱导小鼠肺组织的DNA损伤标志蛋白γ-H2AX和核仁素表达升高,DNA损伤修复基因ATM、p53和p21的mRNA水平表达上调,提示核仁素介导的DNA损伤修复信号通路可能在矽肺纤维化过程中发挥着重要作用;2.PolyG干预能够下调γ-H2AX与核仁素表达,同时上调GADD45α的表达,调控矽肺小鼠肺组织DNA损伤修复的转录与翻译,并发挥抗矽肺纤维化作用。研究对尘肺病防治具有重要的理论意义和切实的实用价值。
二、外源p21~(WAF1)转染对人成纤维细胞凋亡的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、外源p21~(WAF1)转染对人成纤维细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
（1）含磷树状大分子纳米载体的设计及其肿瘤治疗应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 含磷树状大分子的概况 |
| 1.2.1 经典含磷树状大分子的简介 |
| 1.2.2 以HCCP为内核的含磷树状大分子的构建 |
| 1.2.3 离子型含磷树状大分子的构建 |
| 1.3 离子型含磷树状大分子的生物学应用 |
| 1.3.1 阳离子型含磷树枝状大分子作为基因传递载体 |
| 1.3.2 阳离子型含磷树状大分子在神经退行性疾病中的应用 |
| 1.3.3 阴离子型含磷树状大分子与单核细胞的相互作用 |
| 1.3.4 金属离子型含磷树状大分子作为有效的抗肿瘤药物 |
| 1.4 本论文的研究目的、主要内容和创新点 |
| 1.4.1 本论文的研究目的 |
| 1.4.2 本论文的主要研究内容 |
| 1.4.3 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 第二章 阳离子型含磷树状大分子作为非病毒载体的优化及其在肿瘤治疗中的应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 2.2.2 阳离子型含磷树枝状大分子的合成与表征 |
| 2.2.3 阳离子型含磷树枝状大分子/pDNA复合物的制备与表征 |
| 2.2.4 细胞转染实验 |
| 2.2.5 体外基因治疗实验 |
| 2.2.6 体内基因治疗实验 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 阳离子型含磷树状大分子的合成与表征 |
| 2.3.2 阳离子型含磷树枝状大分子/pDNA-EGFP复合物的表征 |
| 2.3.3 细胞毒性实验结果 |
| 2.3.4 细胞转染实验结果 |
| 2.3.5 载体/pDNA-p53复合物的表征 |
| 2.3.6 细胞周期检测结果 |
| 2.3.7 实时定量反转录PCR及蛋白免疫印迹实验结果 |
| 2.3.8 体内基因治疗实验结果 |
| 2.3.9 生物安全性评价 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 金属离子型含磷树冠大分子的制备及其抗肿瘤特性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 3.2.2 金属离子型含磷树冠大分子的合成与表征 |
| 3.2.3 金属离子型含磷树冠大分子的稳定性实验 |
| 3.2.4 细胞吞噬实验 |
| 3.2.5 硫氧还蛋白还原酶活性表征 |
| 3.2.6 CCK-8法检测细胞毒性 |
| 3.2.7 细胞结构骨架观察 |
| 3.2.8 细胞周期分析 |
| 3.2.9 蛋白免疫印迹实验 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 金属离子型含磷树冠大分子的表征 |
| 3.3.2 金属离子型含磷树冠大分子的稳定性测试结果 |
| 3.3.3 金属离子型含磷树冠大分子的细胞毒性试验结果 |
| 3.3.4 4T1细胞对金属离子型含磷树冠大分子的吞噬实验结果 |
| 3.3.5 金属离子型含磷树冠大分子对4T1细胞中硫氧还蛋白还原酶活性的影响 |
| 3.3.6 金属离子型含磷树冠大分子对4T1细胞结构形貌及细胞周期的影响 |
| 3.3.7 金属离子型含磷树冠大分子对4T1细胞周期的影响 |
| 3.3.8 蛋白免疫印迹实验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 两亲性含磷冠大分子传递miR-21i和阿霉素用于三阴性乳腺癌的协同治疗研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 4.2.2 两性含磷树冠大分子的合成与表征 |
| 4.2.3 负载阿霉素纳米胶束的制备及表征 |
| 4.2.4 1-C12G1@DOX/miR-21i复合物的制备与表征 |
| 4.2.5 材料的水动力学直径和表面电势测定 |
| 4.2.6 药物缓释实验 |
| 4.2.7 细胞培养及细胞活性相容性实验 |
| 4.2.8 材料复合物的细胞吞噬实验 |
| 4.2.9 细胞凋亡实验 |
| 4.2.10 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.2.11 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 两性含磷树冠大分子的表征 |
| 4.3.2 1-C12G1@DOX复合物的制备与表征 |
| 4.3.3 1-C12G1@DOX/miR-21i复合物的制备与表征 |
| 4.3.4 复合物的细胞毒性实验结果 |
| 4.3.5 复合物的细胞吞噬实验结果 |
| 4.3.6 细胞凋亡实验结果 |
| 4.3.7 体外蛋白印迹实验结果评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 攻读学位期间的研究成果目录 |
| 致谢 |
（2）AGK在结直肠癌发生发展中的作用和机制探讨（论文提纲范文）
| 全文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:AGK 对结直肠癌细胞增殖及衰老的影响 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分:AGK 通过调控p53/p21信号轴影响细胞增殖及细胞衰老 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 细胞衰老与肿瘤的治疗策略 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 攻读博士期间发表期刊论文 |
| 附录二 中英文缩写对照表 |
| 附录三 常用试剂配制 |
（3）高表达ATF3人真皮成纤维细胞抑制皮肤黑色素瘤细胞生长迁移的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 ATF3基因在人皮肤恶性黑色素瘤基质组织中表达水平的检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 人真皮成纤维细胞ATF3在人皮肤恶性黑色素瘤生长与迁移中的作用及机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 诱导人真皮成纤维细胞ATF3表达的化合物抑制人皮肤恶性黑色素瘤生长研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 白藜芦醇对人肾细胞癌786-O细胞的作用 |
| 一、体外实验 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 二、体内实验 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞凋亡 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 自噬抑制白藜芦醇诱导的人肾细胞癌786-O细胞凋亡 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞衰老 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 白藜芦醇抑癌作用及相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 凋亡、自噬及衰老与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）PRMT1介导的组蛋白H4稳定性在细胞衰老中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 引言 |
| 一、细胞衰老 |
| (一)细胞衰老简介 |
| (二)细胞衰老的生物标志物 |
| (三)细胞衰老的诱因 |
| 二、染色质结构和组蛋白修饰改变调控衰老的机制 |
| (一)染色质结构改变与衰老 |
| (二)组蛋白修饰在衰老过程中的变化 |
| 三、精氨酸甲基转移酶 |
| (一)精氨酸甲基化修饰 |
| (二)PRMTs家族简介 |
| (三)精氨酸甲基转移酶PRMT1的功能 |
| 四、抗衰老药物的研究进展 |
| (一)二甲双胍的抗衰老作用 |
| (二)雷帕霉素的抗衰老作用 |
| (三)白藜芦醇的抗衰老作用 |
| 五、本论文研究内容及意义 |
| (一)立题依据 |
| (二)研究内容及意义 |
| 第二部分 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验仪器 |
| (二)试剂 |
| (三)试剂盒 |
| (四)抗体 |
| (五)质粒 |
| (六)细胞系 |
| 二、实验方法 |
| I、分子生物学实验方法 |
| (一)表达质粒的构建 |
| (二)干涉质粒的构建 |
| (三)质粒提取 |
| (四)RNA提取、反转录和Real-time RT-PCR |
| (五)免疫印迹(Western Blot) |
| (六)免疫共沉淀(Co-IP) |
| (七)染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP) |
| (八)肽段pull down实验 |
| (九)微球菌核酸酶实验 |
| II、细胞生物学实验方法 |
| (一)细胞培养 |
| (二)细胞瞬时转染 |
| (三)慢病毒包装和侵染 |
| (四)衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验 |
| (五)免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| III、免疫组化(IHC) |
| IV、统计分析 |
| 第三部分 实验结果与分析 |
| 一、敲低PRMT1诱导成纤维细胞衰老以及组蛋白H4降低 |
| (一)敲低PRMT1 诱导人二倍体成纤维细胞IMR90 衰老以及组蛋白H4降低 |
| (二)敲低PRMT1 诱导人皮肤成纤维细胞CRL-1474 衰老以及组蛋白H4降低 |
| 二、组蛋白H4在细胞及个体衰老过程中优先降低 |
| (一)组蛋白H4在细胞衰老过程中优先降低 |
| (二)组蛋白H4在个体衰老过程中优先降低 |
| (三)组蛋白H4在静息状态和凋亡过程中无明显改变 |
| 三、PA200-蛋白酶体途径介导衰老过程中组蛋白H4的降解 |
| (一)H_2O_2处理或敲低PRMT1的IMR90细胞中H4的mRNA水平无变化 |
| (二)蛋白酶体途径介导组蛋白H4的降解 |
| (三)PA200蛋白酶体激活因子介导组蛋白H4的降解 |
| 四、PRMT1 介导的H4R3me2as修饰维持组蛋白H4 的稳定 |
| (一)PRMT1 介导的H4R3me2as修饰的下调要早于组蛋白H4 降解 |
| (二)PRMT1 介导的H4R3me2as修饰维持组蛋白H4 的稳定 |
| 五、组蛋白H4降解促进衰老相关基因表达 |
| (一)组蛋白H4降解促进核小体占位降低 |
| (二)组蛋白H4降解改变细胞内整体的基因表达网络 |
| (三)组蛋白H4降解激活细胞周期抑制子基因、SASP基因和抗凋亡基因表达 |
| 六、组蛋白H4可以作为潜在的抗衰老药物筛选标志物 |
| (一)抗衰老药物二甲双胍、雷帕霉素和白藜芦醇抑制组蛋白H4降解 |
| (二)组蛋白H4作为抗衰老药物筛选标志的优势 |
| 第四部分 讨论 |
| 一、PRMT1 介导的H4R3me2as维持组蛋白H4 的稳定性 |
| 二、PRMT1 介导的H4R3me2as与其他组蛋白修饰之间的crosstalk |
| 三、组蛋白H4降解与细胞衰老 |
| 四、组蛋白H4作为细胞衰老标志物和抗衰老药物筛选靶标的优越性 |
| 主要结论和创新点 |
| 一、主要结论 |
| 二、创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（6）p400在小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞中的功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 p400的研究进展 |
| 1 p400概述 |
| 2 p400的生物学功能 |
| 2.1 p400在早期胚胎发育方面的功能 |
| 2.2 p400在组蛋白置换中的功能 |
| 2.2.1 组蛋白在染色质中的功能 |
| 2.2.2 p400参与组蛋白调控 |
| 2.3 p400在细胞周期与凋亡中的功能 |
| 2.4 p400在DNA损伤修复过程中的功能 |
| 2.4.1 引起DNA损伤的原因 |
| 2.4.2 DNA损伤修复的方式 |
| 2.4.3 p400参与DSB修复过程 |
| 3 CRISPR-Cas9 技术概述 |
| 第二章 p400 在小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞中的功能探索 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验细胞与实验动物 |
| 2.1.2 实验载体及菌种 |
| 2.1.3 抗体及引物 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂的配置 |
| 2.2.1 体外受精相关试剂的配置 |
| 2.2.2 NIH3T3细胞培养液配制 |
| 2.2.3 大肠杆菌DH5α相关培养基配制 |
| 2.2.4 敲除载体构建相关溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 体外受精 |
| 2.3.2 NIH3T3细胞培养 |
| 2.3.3 质粒转化 |
| 2.3.4 提取质粒 |
| 2.3.5 细胞转染 |
| 2.3.6 总RNA提取 |
| 2.3.7 cDNA合成 |
| 2.3.8 荧光定量PCR |
| 2.3.9 CCK-8法测定细胞增殖 |
| 2.3.10 敲除载体构建 |
| 2.3.11 细胞全基因组DNA提取 |
| 2.3.12 Cruiser法鉴定基因敲除 |
| 2.3.13 PCR法鉴定基因敲除 |
| 2.3.14 突变类型检测 |
| 2.3.15 有限稀释法筛选单克隆细胞系 |
| 2.3.16 流式细胞计数分析细胞周期 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 实验结果分析 |
| 3.1 p400在植入前胚胎中的动态变化 |
| 3.2 p400在小鼠植入前胚胎发育过程中mRNA表达水平的变化 |
| 3.3 单位点敲除Ep400基因 |
| 3.3.1 Ep400敲除载体构建 |
| 3.3.2 Ep400敲除验证 |
| 3.4 双位点敲除Ep400基因 |
| 3.4.1 Ep400敲除载体构建 |
| 3.4.2 Ep400敲除验证 |
| 3.4.3 Ep400敲除突变类型检测 |
| 3.5 Ep400基因敲除的单克隆细胞系筛选 |
| 3.6 敲减Ep400 基因对NIH3T3 细胞增殖的影响 |
| 3.7 敲减Ep400 基因对NIH3T3 细胞周期的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 p400蛋白在植入前胚胎各阶段的表达 |
| 4.2 p400mRNA在植入前胚胎各阶段的表达 |
| 4.3 构建Ep400基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞 |
| 4.4 Ep400基因敲除的单克隆细胞系筛选 |
| 4.5 敲减Ep400 基因对NIH3T3 细胞增殖的影响 |
| 4.6 敲减Ep400 基因对NIH3T3 细胞周期的影响 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）Mdm2-p53信号通路调控及p53抑制肿瘤转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症与健康 |
| 1.2 p53与肿瘤 |
| 1.3 Mdm2与肿瘤 |
| 1.4 MARCH7研究进展 |
| 1.5 Arp2/3复合体研究进展 |
| 1.6 研究的内容与意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞及小鼠来源 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 质粒构建 |
| 2.3.1 目的条带扩增 |
| 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.3 PCR产物胶回收 |
| 2.3.4 目的片段双酶切及连接 |
| 2.3.5 转化及单克隆鉴定 |
| 2.3.6 大肠杆菌感受态制备 |
| 2.3.7 shRNA质粒构建 |
| 2.3.8 Axygen质粒小量提取试剂盒抽提质粒 |
| 2.3.9 碱法质粒粗提 |
| 2.4 蛋白质印记 |
| 2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.5.1 总RNA提取 |
| 2.5.2 RNA逆转录成cDNA |
| 2.5.3 实时荧光定量PCR |
| 2.6 质粒转染与病毒感染 |
| 2.6.1 质粒瞬时转染 |
| 2.6.2 病毒感染 |
| 2.7 免疫共沉淀 |
| 2.8 蛋白表达及纯化 |
| 2.9 体内外泛素化实验 |
| 2.9.1 体内泛素化实验 |
| 2.9.2 体外泛素化实验 |
| 2.10 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.11 免疫荧光实验 |
| 2.12 软琼脂克隆形成实验 |
| 2.13 裸鼠成瘤实验 |
| 2.14 GST pull-down实验 |
| 2.15 染色体免疫沉淀（CHIP)实验 |
| 2.16 Pyrene actin聚合实验 |
| 2.17 Actin负染电镜观察 |
| 2.17.1 Actin聚合反应 |
| 2.17.2 负染电镜观察actin分支情况 |
| 2.18 细胞迁移和细胞侵袭实验 |
| 2.19 单细胞追踪实验 |
| 2.20 体内肿瘤转移实验 |
| 2.21 数据重复性和统计分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 第一部分 MARCH7调控Mdm2-p53信号通路 |
| 3.1 MARCH7是Mdm2的互作蛋白 |
| 3.1.1 MARCH7与Mdm2在体内外相互作用 |
| 3.1.2 MARCH7与Mdm2结合的区段分析 |
| 3.2 MARCH7增加Mdm2的蛋白稳定性 |
| 3.2.1 MARCH7增加野生型Mdm2蛋白水平 |
| 3.2.2 MARCH7调节Mdm2稳定性 |
| 3.3 MARCH7促进Mdm2依赖的p53多聚泛素化和降解 |
| 3.3.1 MARCH7调节Mdm2-p53信号轴 |
| 3.3.2 MARCH7通过Mdm2调节p53多聚泛素化和降解 |
| 3.3.3 MARCH7调节p53转录活性 |
| 3.4 MARCH7催化Mdm2形成K63连接的多聚泛素化 |
| 3.4.1 MARCH7增强Mdm2 C464A多聚泛素化 |
| 3.4.2 MARCH7能够促进Mdm2 K63连接的多聚泛素链形成 |
| 3.5 MARCH7以p53依赖的方式调节细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤发生 |
| 3.5.1 MARCH7以p53依赖的方式调节细胞增殖 |
| 3.5.2 MARCH7调控Mdm2本底水平控制p53对DNA损伤的响应 |
| 3.5.3 MARCH7调控p53介导的细胞凋亡 |
| 3.5.4 MARCH7调控p53介导的肿瘤发生 |
| 3.6 讨论 |
| 第二部分 WDR63介导p53抑制肿瘤转移 |
| 4.1 WDR63抑制细胞迁移、细胞侵袭和肿瘤转移 |
| 4.1.1 WDR63抑制细胞划痕愈合和迁移 |
| 4.1.2 WDR63抑制细胞侵袭 |
| 4.1.3 WDR63抑制肿瘤转移 |
| 4.1.4 WDR63不影响细胞增殖、凋亡和周期阻滞 |
| 4.2 WDR63是p53直接的转录靶标 |
| 4.2.1 p53正向调控WDR63的表达 |
| 4.2.2 p53直接转录调控WDR63 |
| 4.3 WDR63与Arp2/3复合体相互作用 |
| 4.3.1 WDR63与Arp2在体内外相互作用 |
| 4.3.2 WDR63是Arp2/3复合体的新型结合蛋白 |
| 4.4 WDR63抑制Arp2/3介导的actin聚合 |
| 4.4.1 WDR63抑制Arp2/3介导的actin聚合 |
| 4.4.2 WDR63与VCA竞争结合Arp2/3复合体 |
| 4.5 WDR63通过Arp2/3复合体抑制细胞迁移和细胞侵袭 |
| 4.5.1 WDR63通过Arp2/3抑制细胞迁移和细胞侵袭 |
| 4.5.2 与Arp2/3复合体结合是WDR63抑制细胞迁移和细胞侵袭必须的 |
| 4.6 WDR6介导p53抑制细胞迁移、细胞侵袭和转移功能 |
| 4.7 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文及取得的成果 |
（8）KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 KLF2抑制胰腺癌的机制研究 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 衰老与恶性肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 博士期间发表的论文 |
| 参与的科研项目 |
| 致谢 |
（9）Ipr1的转录调控及其通过p53调控Irgm1的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 结核抗性基因及相关信号通路的研究进展 |
| 1.1 结核病概述 |
| 1.1.1 结核病的发现以及重要发展回顾 |
| 1.1.2 结核病的现状 |
| 1.1.3 结核杆菌与宿主细胞之间的相互作用 |
| 1.1.4 结核病的宿主导向治疗 |
| 1.2 Ipr1和Irgm1的研究进展 |
| 1.2.1 Ipr1基因的研究进展 |
| 1.2.2 Irgm1的研究进展 |
| 1.3 小鼠巨噬细胞内信号通路的调控和功能 |
| 1.3.1 cGAS/STING/TBK/IRF3信号通路 |
| 1.3.2 cGAS通路在免疫调控中具有重要作用 |
| 1.3.3 p53信号通路 |
| 1.4 本研究的立项意义和内容 |
| 试验研究 |
| 第二章 IRF3调控Ipr1表达的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 乙型肝炎病毒、诺如病毒、仙台病毒以及流感病毒激活SP110/Ipr1的表达 |
| 2.2.2 H37Rv以及北京株激活Sp110/Ipr1的表达 |
| 2.2.3 依托泊苷和阿糖孢苷激活细胞中Sp110/Ipr1的表达 |
| 2.2.4 ISD激活Ipr1的表达 |
| 2.2.5 ISD处理激活Ipr1启动子区域的转录活性 |
| 2.2.6 Ipr1启动子区域具有高度保守性 |
| 2.2.7 小鼠Ipr1启动子区域含有ISRE,Statx以及Rel |
| 2.2.8 ISRE在Ipr1、 的转录激活中具有重要作用 |
| 2.2.9 IRF3特异性结合Ipr1启动子区的ISRE |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 Ipr1调控Irgm1表达的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 ISD激活RAW264.7细胞中Irgm1的表达 |
| 3.2.2 敲降Ipr1引起Irgm1的下调 |
| 3.2.3 参与调控Irgm1的microRNA预测 |
| 3.2.4 NUDR和 Ipr1的SAND结构域氨基酸组成相似 |
| 3.2.5 Ipr1 影响TNF-α和Irgm1的启动子活性 |
| 3.2.6 Ipr1 不能结合TTCG基序 |
| 3.2.7 Ipr1慢病毒表达载体的构建 |
| 3.2.8 稳定表达Ipr1的RAW264.7细胞系验证 |
| 3.2.9 ChIP数据质量检测 |
| 3.2.10 Ipr1在基因组上的结合位置 |
| 3.2.11 Ipr1的结合位点统计 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 p53调控Irgm1表达的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Irgm1启动子核心区域的确定 |
| 4.2.2 Irgm1启动子区域顺式作用元件预测 |
| 4.2.3 人IRGM基因启动子区域分析 |
| 4.2.4 ActD激活Irgm1的表达 |
| 4.2.5 ADR激活Irgm1 的表达 |
| 4.2.6 p53上调Irgm1的启动子活性 |
| 4.2.7 干扰p53抑制ISD诱导的Irgm1的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 Ipr1通过Rpl11和Mdm2调控p53 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Ipr1参与细胞内信号通路的调控 |
| 5.2.2 ISD处理导致RAW264.7细胞的G1-G0阻滞 |
| 5.2.3 干扰Ipr1下调ISD诱导的p21表达 |
| 5.2.4 Ipr1,p53以及Mdm2 的互作蛋白统计 |
| 5.2.5 Ipr1,p53以及Mdm2 通过核糖体蛋白联系在一起 |
| 5.2.6 Ipr1与Npm1,Rpl11和Mdm2存在相互作用 |
| 5.2.7 Ipr1 通过Rpl11调控Mdm2和p53的相互作用 |
| 5.2.8 ISD提高Mdm2和Ipr1,Rpl11的互作 |
| 5.2.9 Ipr1降低p53蛋白泛素化水平 |
| 5.2.10 ISD THP-1细胞系中SP100和IRGM的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 创新之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）DNA损伤与修复在多聚鸟苷酸干预小鼠矽肺纤维化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:DNA损伤与细胞周期对砂肺纤维化的影响 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、外源p21~(WAF1)转染对人成纤维细胞凋亡的影响（论文参考文献）
- [1]含磷树状大分子纳米载体的设计及其肿瘤治疗应用[D]. 陈亮. 东华大学, 2020
- [2]AGK在结直肠癌发生发展中的作用和机制探讨[D]. 陈前智. 华中科技大学, 2020(02)
- [3]高表达ATF3人真皮成纤维细胞抑制皮肤黑色素瘤细胞生长迁移的作用与机制研究[D]. 俎廷建. 山东大学, 2020(08)
- [4]白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究[D]. 姚宏伟. 苏州大学, 2020(06)
- [5]PRMT1介导的组蛋白H4稳定性在细胞衰老中的作用和机制研究[D]. 林聪. 东北师范大学, 2020(01)
- [6]p400在小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞中的功能初探[D]. 史东宇. 内蒙古大学, 2020(01)
- [7]Mdm2-p53信号通路调控及p53抑制肿瘤转移的机制研究[D]. 赵开亮. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [8]KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究[D]. 戴月娣. 苏州大学, 2020(06)
- [9]Ipr1的转录调控及其通过p53调控Irgm1的机理研究[D]. 刘发扬. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [10]DNA损伤与修复在多聚鸟苷酸干预小鼠矽肺纤维化中的作用及机制研究[D]. 周强. 新乡医学院, 2020