一、端粒酶与消化系肿瘤相关性研究进展（论文文献综述）
熊佳惠[1]（2020）在《基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制》文中研究指明目的:基于网络药理学的方法,探讨附子理中汤对于晚期胃癌的作用机制。方法:首先,通过TCMSP数据库、Drug Bank数据库和Pharm Mapper平台对附子理中汤所含化学活性成分进行筛选并获取其作用靶点,再利用GAD、OMIM及CTD数据库获得胃癌的相关靶点;然后,利用Draw Ven Diagram平台制作韦恩图,获得两者的交集靶点蛋白,通过Cytoscape3.5.1软件构建出蛋白互作图;再通过DAVID分析工具和KOBAS3.0软件对搜集到的靶点蛋白从生物过程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）和细胞组分（cellular component,CC）三个方向进行基因本体功能富集分析和KEGG通路分析;最后,利用PDB数据库、Systems Dock Web Site数据库集进行受体-配体的分子对接,并分析docking scores,验证附子理中汤治疗晚期胃癌的有效性。结果:从TCMSP数据库筛选出附子理中汤的147种化学成分,其中预测到4791个靶点,通过CTD、OMIM筛选出28006个与胃癌相关的靶点,最后韦恩图确定附子理中汤治疗晚期胃癌存在346个潜在靶标;其中附子理中汤与胃癌相互作用的关键靶标有TP53（肿瘤抑制蛋白p53）、AKT1（蛋白激酶B）、CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A）、STAT3（信号转导子与转录激活因子3）、BCL2L1（促生存因子）、JUN（核内癌基因）、CCND1（细胞周期素D1）、EGF（表皮生长因子）等,主要作用机制可能涉及2-Oxocarboxylicacid metabolism（2-氧羧酸代谢）信号通路和Propanoate metabolism（丙酸盐代谢）信号通路等分子通路,分子对接结果中表明STAT3对接分数最高,与附子理中汤有较好的结合性。结论:附子理中汤治疗晚期胃癌的关键靶点包括TP53（肿瘤抑制蛋白p53）、AKT1（蛋白激酶B）、CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A）、STAT3（信号转导子与转录激活因子3）、BCL2L1（促生存因子）、JUN（核内癌基因）、CCND1（细胞周期素D1）、EGF（表皮生长因子）等,其主要作用机制可能涉及2-Oxocarboxylicacid metabolism（2-氧羧酸代谢）信号通路和Propanoate metabolism（丙酸盐代谢）信号通路等分子通路等,靶点STAT3与附子理中汤有较好的结合性,可能在附子理中汤治疗晚期胃癌的过程中发挥着至关重要的作用。
史年刚[2]（2019）在《基于先天禀赋的肾阳虚体质大鼠模型构建与能量代谢调控机制研究》文中认为目的:根据中医“肾阳虚”和体质学说的理论内涵,设计构建肾阳虚体质大鼠模型,并通过评价模型大鼠棕色脂肪线粒体产能状态,研究下丘脑对棕色脂肪的调控机制验证肾阳虚体质模型造模成功,为中医肾阳虚及其体质研究提供一种适宜的实验动物模型。方法:（1）参照肖小河动物温度趋向性行为学智能检测系统原理搭建动物寒热趋向装置,根据中医“阳虚则寒”的理论筛选偏阳虚的老龄雌雄鼠作为亲本并交配传代,对孕鼠施以猫吓鼠“恐伤肾”、低温“寒伤阳”和黄柏水灌胃造模直至幼鼠出生,构建肾阳虚体质大鼠模型。（2）采用动物寒热趋向装置评价模型组和对照组幼鼠寒热趋向,并比较模型组和对照组的幼鼠出生体重,初步评价造模成功。（3）采用透射电镜观察各组棕色脂肪组织切片中线粒体超微结构,研究肾阳虚体质大鼠线粒体组织结构状态。（4）采用ELISA法测量各组脊间棕色脂肪ATP浓度,western blot法测定棕色脂肪组织中complex1-5浓度,研究肾阳虚体质大鼠模型棕色脂肪线粒体产能状态。（5）采用ELISA法测量各组棕色脂肪iNOS浓度,western blot法测定棕色脂肪组织中Fis-1/Drp-1,LC3a/LC3b和Opa-1浓度,研究棕色脂肪组织线粒体自身健康状态。（6）采用RT-PCR法测定各组棕色脂肪PGC-1α/AMPK-α2/UCP-1表达量,同法测定下丘脑NPY/NPY1R和POMC/MC4R表达量,研究肾阳虚体质大鼠下丘脑对棕色脂肪线粒体产能状态的调控机制。结果:（1）子代肾阳虚体质组幼鼠出生体重低于对照组,具有显着组间差异（P<0.01）;相比于对照组雄鼠,子代肾阳虚体质组雄鼠在40℃温控板上的停留率呈增高的趋势（P>0.05）。（2）与亲本母鼠组和对照组相比,子代肾阳虚体质组雌鼠与雄鼠棕色脂肪线粒体超微结构均显着偏弱,线粒体肿胀程度较严重,线粒体嵴排列稍紊乱,嵴断裂较多。（4）与亲本母鼠组相比,子代肾阳虚体质组棕色脂肪ATP浓度降低（P<0.05）,complex-1浓度显着降低（P<0.01）,complex-4浓度极显着降低（P<0.001）;其中,子代肾阳虚体质组雄鼠complex-1,4浓度显着降低（P<0.01）,子代肾阳虚体质组雌鼠ATP浓度和complex-1浓度降低（P<0.05）、complex-4浓度显着降低（P<0.01）。与对照组雄鼠相比,子代肾阳虚体质组雄鼠棕色脂肪complex-1浓度极显着降低（P<0.001）;与对照组雌鼠相比,子代肾阳虚体质组雌鼠棕色脂肪complex-1显着降低（P<0.01）。（5）与亲本母鼠组相比,子代肾阳虚体质组棕色脂肪iNOS浓度、Fis-1/Drp-1浓度和LC3a/LC3b浓度均升高（P<0.05）,Opa-1浓度极显着降低（P<0.0001）;其中,子代肾阳虚体质组雄鼠iNOS浓度显着升高（P<0.01）,Opa-1浓度显着降低（P<0.001）;子代肾阳虚体质组雌鼠Opa-1浓度显着降低（P<0.01）。与对照组雄鼠相比,子代肾阳虚体质组雄鼠iNOS浓度升高（P<0.05）,Opa-1浓度降低（P<0.05）;与对照组雌鼠相比,子代肾阳虚体质组雌鼠棕色脂肪Opa-1和Drp-1浓度显着降低（P<0.01）。（6）与亲本母鼠组相比,子代肾阳虚体质组雄鼠NPY表达量升高（P<0.05）。与对照组雄鼠相比,子代肾阳虚体质组雄鼠NPY表达显着升高（P<0.01）,PGC-1α表达显着降低（P<0.01）;与对照组雌鼠相比,子代肾阳虚体质组雌鼠UCP-1浓度升高（P<0.05）。结论:（1）肾阳虚体质模型鼠ATP产能下降,畏寒怯冷和低体重儿比例增加与肾阳虚体质临床表征相符,从宏观上论证造模成功。（2）肾阳虚体质模型鼠呼吸链酶代谢异常,呼吸链复合酶complex-1是评价肾阳虚体质模型能量代谢低下的关键指标之一。（3）肾阳虚体质模型鼠下丘脑作为线粒体能量代谢上游调控靶器官抑制了能量代谢,不仅使模型鼠能量代谢呈下降趋势,且从微观上论证造模成功。（4）肾阳虚体质大鼠棕色脂肪线粒体裂变和融合的自稳态失衡可作为肾阳虚模型构建成功的病理指征。（5）子代雌雄肾阳虚模型鼠存在肾阳虚性状差异,性激素是否促进或拮抗了造模因素,尚待进一步验证。
梁桑华[3]（2013）在《PinX1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用及其在细胞周期中的定位研究》文中进行了进一步梳理乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有130万妇女患乳腺癌,50万人死于乳腺癌,其发病率逐年上升,目前国内约有47万患者,成为妇女健康的最大威胁,在一些城市乳腺癌已成为妇女恶性肿瘤发病的首位。乳腺癌的治疗包括手术治疗、内分泌治疗、放射治疗、化学治疗和分子靶向治疗等方法。近年来虽然放疗及化疗在设备和技术上取得了很大的进步,但乳腺癌的5年生存率仍然不高。此外,放疗和化疗造成的局部及全身副作用导致病人的身心都承受极大的伤害,未能从根本上改善治疗效果。因此,探索乳腺癌的病因及新的安全有效的治疗方法成为乳腺癌治疗的瓶颈。恶性肿瘤的发生和侵袭转移过程受多层次、多因素调控,癌基因与抑癌基因作用的失衡是其中的关键环节之一。因此,寻找新的或进一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能,对阐明恶性肿瘤发生和演进机理、研发潜在治疗靶点具有重要意义。端粒,位于真核细胞染色体末端,是一种特殊的由富含G碱基的重复DNA序列与相关蛋白质组成的复合体,保护末端染色体不被降解和防止染色体末端融合,对维持细胞基因组的稳定性有重要作用。在大多数细胞中,端粒长度主要由一种特殊的RNA逆转录酶—端粒酶以及端粒相关蛋白调节,端粒相关蛋白通过直接或间接与端粒DNA相互作用来维持端粒结构和功能的稳定。由于存在末端复制问题,即随着细胞分裂,DNA每复制一次,都伴随有末端端粒的部分丢失。如此,端粒将发生进行性缩短,当端粒缩短到一定程度时,失去端粒保护的染色体将变得不稳定,致使细胞进入不安全状态,出现凋亡、死亡等改变。端粒酶可以不断补充DNA复制所造成的端粒丢失,因而端粒的长度并不会随着复制而发生进行性缩短,从而维系细胞稳定。端粒功能的缺失很可能导致细胞基因组的不稳定,使细胞进入不正常状态,正常细胞转化为癌细胞的风险也随之大大增加。近几年来,还有越来越多研究表明传统的端粒蛋白不仅仅定位在端粒末端,保护正常的端粒结构,有些还直接参与细胞有丝分裂进程的复杂调控,例如端粒相关蛋白TERF1（Telomeric repeat-binding factor1）, TERF1的蛋白表达量在整个细胞周期中呈现动态变化,此外,TERF1能够和微管,微管相关蛋白EB1以及一些重要的纺锤体检验点蛋白比如Madl, NekZ以及Plkl等相互作用。包括乳腺癌在内的绝大多数恶性肿瘤与端粒酶活性及其亚单位hTERT（human telomerase reverse transcriptase）活性增高有密切关系。随着对端粒酶研究的深入,以端粒酶为靶点,进行肿瘤靶向基因治疗成为有前景的治疗方法之一,因而,探寻端粒酶抑制剂成为新的热点研究之一。PinX1为2001年报导,应用酵母双杂交方法,以细胞周期蛋白Pin2为诱饵,在人类宫颈癌细胞中发现的一个能与端粒/端粒酶相互作用的保守核仁蛋白。人PinX1（PinX1, humanPinX1）基因定位于染色体的8p23,是一处在多种肿瘤中发生高频杂合缺失的区域。PinX1蛋白全长328aa,N-端（aa1-142）和C-端（aa254-328）各含一个hTERT结合位点。PinX1是迄今为止发现的最强力的端粒酶抑制因子,PinX1的端粒酶抑制作用通过其本身与hTERT和hTR直接作用来实现,尽管如此,Pinx1在酵母中的同源物Gno1p中是否具有端粒酶抑制作用目前还存在争议。高表达PinX1C-端片断对细胞端粒酶活性有显着抑制作用,缩短端粒长度并抑制端粒酶阳性癌细胞生长。因此,PinX1被认为是细胞内在的端粒酶抑制因子和潜在的抑癌基因,但PinX1对细胞端粒酶/端粒的具体调控机制及在肿瘤中的意义仍不清楚。此外,PinX1还被证明可以与端粒蛋白TERF1相互作用,有研究表明,PinX1在端粒阳性肿瘤中可以增强TERF1在核仁的定位,但其具体作用发生机制还未被具体阐明。虽然PinX1被认为是强的端粒酶抑制因子和潜在的抑癌基因,但是PinX1在肿瘤中的发挥的具体作用和作用机制仍存在争论。国内外都有研究表明,PinX1在胃癌和肝癌中表达量明显下降,但在前列腺癌中却未发现有下降的异常表达。同是在肝癌组织中,有学者发现PinX1可以发挥调节端粒酶长度的作用,但对癌的形成并无影响。甚至有研究表明,在急性白血病中,端粒酶的长度与PinX1表达量呈正相关的关系。PinX1可能在不同的肿瘤中参与的作用机制不同,所以发挥的作用也各有差异。关于PinX1与乳腺癌发生发展的关系,大多数学者倾向于认为PinX1在乳腺癌中具有抑癌作用,但该结论仍未得到一致认同,存在较大的争论。本文主要研究该基因在乳腺癌中的表达情况,分析其对乳腺癌细胞MCF-7增殖情况和细胞周期的影响,观察PinX1蛋白在不同周期中的定位和检测其在不同周期的表达量变化,结合文献查找,推测其在MCF-7细胞周期调控中发挥的作用。本文研究的内容主要包括一下四个部分：第一部分：针对PinX1的CDS区设计合成引物。从外周血单个核细胞（PBMCs）中提取总RNA,通反转录PCR扩增获得目的基因片段。EcoR I/XhoI双酶切及T4连接酶连接将其插入PDsRedl-Cl质粒克隆微点中。通过质粒PCR及双酶切筛选并鉴定出阳性重组质粒,DNA送测序鉴定Pinx1序列的保真性,将成功构建的PDsRed1-C1-Pinx1真核表达载体转染癌细胞株MCF-7,以合适浓度G418进行筛选,获得稳定表达细胞。荧光定量PCR和Western-Blot验证Pinx1在稳定表达系中的表达情况。第二部分：通过细胞增殖（MTT法）,细胞集落形成,计算后期染色体桥（anaphase-bridge）检测PinX1对乳腺癌细胞MCF-7的增殖,凋亡以及细胞周期的影响。第三部分：稳定表达系MCF-7细胞爬片后固定,DAPI染色,荧光显微镜下观察不同周期中Pinx1的定位；饥饿法收集不同周期的细胞,提取总RNA并逆转录成cDNA,荧光定量PCR检测不同周期中Pinx1的表达量。推测Pinx1在乳腺癌细胞MCF-7细胞中参与调节细胞周期的机制。上调Pinx1基因表达可以显着抑制MCF-7细胞的增殖,anaphase-bridge的计算结果从侧面证实Pinx1对MCF-7细胞增殖的抑制作用。Pinx1的定位观察实验发现了Pinx1在不同周期定位的差异,对Pinx1在不同周期的表达量检测揭示了Pinx1在不同细胞周期呈动态表达。本研究运用RT-PCR成功克隆其基因片段,构建得到PDsRed1-C1重组表达载体,转染MCF-7乳腺癌细胞进行持续、稳定表达。在MCF-7细胞中上调表达Pinx1,通过增殖,凋亡以及anaphase-bridge检测实验证实了Pinx1对MCF-7细胞增殖的抑制作用。Pinx1定位分析和荧光定量PCR表明Pinx1在细胞周期中表达量和定位都呈动态变化,结合已有研究初步推断Pinx1可能与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PLK1（Polo-like kinase1）结合并被PLK1介导经泛素途径降解,从而调控细胞周期进程。这些都为将来进一步探讨Pinx1在乳腺癌中参与何种细胞通路从而抑制其增殖和调控其细胞周期的研究奠定了基础。
于秀石[4]（2012）在《PINX1与肝癌临床病理特性的相关性研究》文中研究指明研究背景肿瘤发生浸润和转移是复杂而有序的多阶段生物学过程,受多个基因的调控,许多研究发现肿瘤的基因组存在遗传不稳定性,容易发生微卫星不稳定（microsatellite instablility, MSI）和杂合性缺失（loss of heterozygosi ty, LOH）。Pinx1（Pin2/TRF1-interacting protein）是近年来在人及酵母细胞中发现的定位于染色体8p23这一位点的新端粒酶／端粒调控因子,这一位点处在多种肿瘤的高频杂合缺失区域,体外实验和体内裸鼠成瘤实验发现肿瘤细胞中PinX1或PinX1-TID的过表达能抑制端粒酶活性,使端粒缩短［17］。而内源性PinX1的缺失则可增加端粒酶活性并延长端粒,也可增加裸鼠的肿瘤发生。在肾癌、卵巢癌和肺癌等研究中发现,Pinx1在癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织,说明PinX1基因可能参与控制细胞增殖。将PinX1基因导入SMMC-7721肝癌细胞后发现该细胞的生长受到明显的抑制,说明PinX1基因对肝癌细胞的生长是有抑制作用的,但关于PinX1基因在肝癌中的表达和遗传不稳定性与肝癌临床病理关系的研究还鲜见报导,本文研究PinX1基因在肝癌中的LOH和MSI及PinX1蛋白的表达情况,分析其与肝癌临床病理特性之间的关系,为阐明PINX1基因如何影响肝癌发生发展及研究抑癌基因在肿瘤中的作用机制提供理论依据。研究目的研究Pinx1基因D8S277位点在肝癌中的微卫星不稳定（MSI）和杂合性缺失（LOH）,以及这种遗传不稳定性在肝癌中对Pinx1蛋白表达的影响。阐明Pinx1基因遗传不稳定性以及Pinx1蛋白表达变化与肝癌发生、发展的关系,揭示Pinx1基因在肝癌中作为抑癌基因是怎样影响肝癌发生发展,为研究抑癌基因在肿瘤中的作用机制提供理论依据。研究方法（1） Pinx1蛋白的表达采用Envision免疫组织化学染色的方法进行检测。（2）Pinx1蛋白表达检测后采用Image-pro Plus计算机图像分析软件进行分析。（3）石蜡包埋的肝癌组织DNA基因提取,采用苯酚-氯仿抽提法。（4） Pinx1基因D8S277位点的DNA基因提取后采用PCR-单链构象多态性（SSCP）方法进行扩增,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及常规银染检测MSI及LOH。（5）采用SPSS软件对数据进行相关性统计分析。研究结果1)肝癌Pinx1基因微卫星D8S277位点LOH的检出率为35.71%（10/28）,与肿瘤的分化程度有无淋巴结转移、有无包膜浸润及分期之间均不具有差异（P>0.05）。2)MSI的检出率为10.71%（3/28）,与肿瘤的分化程度有无淋巴结转移、有无包膜浸润及分期之间均不具有差异（P>0.05）。3)Pinx1阳性蛋白在癌周正常组织高表达,在肿瘤组织中低表达或不表达,Pinxl阳性蛋白在肝癌患者肿瘤组织中的检出率为32.14%（9/28）,与肝癌患者的有无淋巴结转移、肿瘤的分化程度及分期之间不具有相关性（P>0.05）,但与肿瘤包膜浸润之间具有相关性（P<0.05）4)Pinxl蛋白表达与微卫星D8S277位点的LOH及MSI之间不具有相关性（P>0.05）。结论在肝癌组织中存在Pinxl蛋白表达的下降,Pinx1蛋白的表达与肿瘤包膜浸润之间具有相关性,是抑制肿瘤发展的影响因素, Pinx1基因微卫星D8S277位点的MSI及LOH,与Pinxl蛋白表达及肝癌相关病理特性之间未见相关性,可能不是影响Pinx1蛋白表达及肝癌发生发展的主要机制,可能还存在其他影响机制。Pinx1可能在抑制肝癌发生、发展中起到一定的重要作用。
向发良,黄赞松[5]（2011）在《苦参素抗肝癌作用研究》文中指出苦参素是生物碱类药物,在临床上主要用于慢性肝炎等疾病的治疗。近年来,苦参素抗肝癌的治疗已逐渐受到广大学者的关注。苦参素抗肝癌作用机制主要包括抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞分化、促进肝癌细胞凋亡、抑制端粒酶活性、阻滞细胞周期进展、调节宿主免疫功能、抑制肝癌血管内皮细胞增殖、逆转肝癌细胞多耐药性。现就苦参素抗肝癌的作用机制、实验研究和临床应用进行综述。
焦河玲[6]（2011）在《苦豆碱抗结肠癌的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景结直肠癌（Colorectal Carcinoma, CRC）是现今世界上最常见的恶性肿瘤之一。在西方发达国家,其发病率居恶性肿瘤的第2位。中国每年新发病例已超过17万,发病递增速度为世界平均数的两倍,是中国发病率排第四位的恶性肿瘤性疾病。如何有效的预防和治疗CRC,是医学界关注的重要课题之一。该病的治疗随着手术技术、以氟尿嘧啶类药物为基础的联合化疗以及放疗等治疗手段的不断完善而不断更新,为患者带来新的希望。但是西医治疗过程中使用的化学合成抗肿瘤的药物普遍存在价格昂贵、毒副作用大的缺点。因此,寻找高效、低毒的药物仍是目前CRC治疗中有待解决的问题。中药苦豆子（Sophora Alopecuraides, L.）是豆科（Legum inosae）槐属多年生草本植物,目前发现,苦豆子中富含喹诺里西啶（Quinlizidine）类生物碱。此类生物碱为含氮的有机碱性化合物,抗癌作用明显,是近年来抗肿瘤药物研究的重点之一,其中苦参类生物碱如苦参碱、氧化苦参碱等之前已有抗肿瘤的多种报道。本课题组在研究中发现,槐定碱对结直肠癌有较好抑制作用,苦豆子总生物碱对溃疡性结肠炎亦具有良好治疗作用,由于溃疡性结肠炎与CRC具有显着相关性,因此本课题拟对苦豆子中的苦豆碱（ALO）进行抗结直肠癌的研究,观察其体内外作用。研究目的1.通过体外抗肿瘤实验,观察ALO对消化系肿瘤细胞株及结肠癌细胞株体外增殖抑制的作用；采用多种方法明确ALO是否能诱导结肠癌细胞产生凋亡：2.采用昆明种S180肉瘤模型,观察ALO的体内抗肿瘤作用,并考察其对细胞因子的影响；3.采用人结肠癌移植瘤裸鼠模型,观察ALO治疗结肠癌的体内作用；并考察其对细胞因子的影响；4.研究ALO诱导结肠癌细胞凋亡的分子作用机制：明确ALO是否对凋亡调控分子IL-6/JAK-STAT家族表达水平产生影响；寻找其诱导结肠癌细胞凋亡的相关信号转导通路或靶点。研究意义1.明确苦豆碱抗结直肠癌作用,为开发治疗结直肠癌的新型靶向制剂提供依据,以期进一步开发利用价廉、丰富的苦豆子资源,对人民健康、生态环境、经济发展大有裨益。2.采用现代实验方法对其药理学作用给予新的论释,为中药及其有效成分抗癌机制提供科学实证,也为结直肠癌的治疗开拓更为广阔的思路,对弘扬祖国传统医药具有重要意义。研究方法1.采用MTT法、光学及荧光显微镜观察、Hoechst 33258染色、电镜观察、荧光双染及凝胶电泳检测ALO体外抑制结肠癌细胞株SW480增殖及诱导其产生凋亡的作用。2.观察ALO对小鼠的急性毒性作用,观察其对S180肉瘤小鼠的抑瘤作用及细胞因子的能影响；观察ALO对人结肠癌移植瘤裸鼠模型的抑制作用并测定其有关细胞因子水平。3.流式细胞仪检测凋亡细胞的比例；荧光实时定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、BaX、STAT3、STAT5的水平；免疫印迹法检测（?）JAK-STAT家族蛋白表达水平。主要研究结果1.MTT法检测ALO对消化系肿瘤细胞株及SW480细胞生长的影响ALO对五种肿瘤细胞株均有不同程度的增殖抑制作用；SW480细胞生长增殖抑制率随着时间和浓度的增加而增加,呈一定的时间-剂量-效应关系。对ALO作用48h的抑制率进行Probit回归分析,结果显示其IC50为1.52169mg/ml。2.形态学方面观察加药后细胞的凋亡变化光学显微镜及荧光显微镜观察细胞：ALO作用后,细胞外形变圆,折光性增强,皱缩或脱落漂浮于培养基中；贴壁生长的细胞变得稀疏、部分细胞皱缩,胞质中颗粒增多并可见细胞膜出泡。Hoechst 33258染色可见典型的凋亡形态学改变：核染色质聚集、核碎裂、胞质浓缩,被染成明亮的蓝色荧光。电镜下可见ALO处理后,细胞皱缩,胞体缩小,细胞膜表面微绒毛消失,凋亡小体出现；DNA-Ladder结果,对照组细胞DNA没有出现片段化,1.5mg/mlALO作用细胞48h后基因组DNA开始降解,出现模糊的梯状条带,72h可见非常典型的“梯状条带”；0.8 mg/mlALO作用细胞48h、72h基本形成典型条带。结果显示,低浓度长时间的作用使基因组DNA片段化更为突出。3.小鼠急性毒性结果小鼠急性毒性实验给药后,各组小鼠出现短暂自主活动减少,双目紧闭,蜷缩,随后即出现兴奋、跳跃；较低剂量组动物在半小时后状态恢复如常,活动自如；高剂量组小鼠有不同程度神经系统症状,部分小鼠给药1小时内出现死亡。对各组小鼠死亡数目进行Probit回归分析,确定其灌胃给药LD50为515.43451mg/kg,其95%可信区间为937.27360mg/kg-29296.59335mg/kg。4.ALO对S180荷瘤小鼠的抑制作用及细胞因子的影响昆明种小鼠接种S180肉瘤细胞后,各组小鼠精神状态良好,活动正常,荷瘤组瘤重达到1.50±0.32g,说明肿瘤移植成功,CTX组、ALO-H组及ALO-L组小鼠肿瘤平均重量明显低于肿瘤模型组,差异有统计学意义（P均<0.01）,三组的肿瘤抑制率分别为69.3%和47.3%及39.4%,该结果说明,ALO对S180荷瘤小鼠肿瘤生长具有一定抑制作用。荷瘤组血清IL-6及VEGF含量升高,与空白对照组比较有显着性差异（P=0.000）,CTX组、ALO高剂量和ALOL低剂量则含量降低,与荷瘤模型组相比差异具有显着性（P均<0.01）,但各给药组无统计学差异（P值均大于0.05）说明各给药组均能降低血清IL-6及VEGF水平。5. ALO对人结肠癌移植瘤裸鼠模型的抑制作用SPF级BALB/c裸鼠皮下接种人结肠癌细胞株SW480,成瘤后,分组给药,结果显示ALO高、低剂量组及生理盐水组裸鼠精神状态均良好,活动正常；ALO各组瘤块生长缓慢,移植瘤的重量和体积增长显着低于阴性对照组（P<0.01）。ALO高剂量组和CTX组抑瘤率分别为60.41±7.90%及68.67±3.48%,且ALO高剂量组与CTX组相比,数值没有显着性差异（P>0.05）。说明ALO对人结肠癌移植瘤裸鼠模型有一定抑制作用。6.ALO抗结肠癌机制研究6.1流式细胞术检测凋亡：流式散点图可见SRI作用24h及48h后第3,4象限凋亡细胞数增多,凋亡率分别达到20.15±0.78%和29.98±1.22%,与阴性对照组比较具有显着性差异（P<0.01）。6.2实时荧光定量检测凋亡相关基因：结果显示ALO处理细胞后,与阴性对照组比较,Bcl-2、STAT3、STAT5基因表达水平显着降低（P<0.05）,而BaX表达显着升高（P<0.05）。Bcl-2、STAT3、STAT5的表达与细胞凋亡及BaX的表达呈负相关。6.3免疫印迹法检钡（?）JAK-STAT家族蛋白表达：使用ALO作用于SW480细胞不同时间,结果显示0.75 mg/ml,1.5mg/ml不同浓度的ALO作用于细胞24h、48h后,高、低剂量组JAK-STAT家族蛋白表达与正常组比较有不同程度下降,并且p-STAT3的表达亦是下降,与阴性组比较差异具有显着性（P=0.000）,而各组组间比较没有差异（P值均大于0.05）,提示ALO可能通过影响JAK-STAT家族蛋白表达,从而抑制STAT3的磷酸化。结论1.ALO能够显着抑制结直肠癌细胞株SW480的体外增殖并诱导其产生凋亡。其抑制增殖作用呈现一定的时间-剂量-效应关系；其作用48h的IC50为1.52169mg/ml；经ALO作用后,细胞出现凋亡形态学改变和DNA片段化。2.ALO能够抑制荷S180肉瘤昆明种小鼠的肿瘤生长,并具有调节细胞因子的作用。ALO在整体实验条件下具有一定的毒性,该药对昆明小鼠一次性灌胃给药的LD50为515.43451 mg/kg。3.ALO能够抑制裸鼠接种人结肠癌移植瘤模型的肿瘤生长,具有明确的治疗结直肠癌的作用,并且能改善细胞因子IL-6及VEGF的表达。4.ALO能够增加结肠癌细胞SW480中促凋亡因子BAX基因的表达,下调JAK-STAT通路中STAT3, STAT5及Bc1-2基因；。5.ALO能够使结肠癌细胞SW480中的JAK1, JAK2, JAK3, STAT1, STAT3, STAT5, STAT6表达量明显下降,p-STAT3表达也显着降低,推测STATS蛋白可能是通过IL-6/JAK-STAT3途径参与CRC的发病过程,而ALO可能通过抑制IL-6/JAK-STAT3信号通路,减少Bcl-2、VEGF等下游促炎因子、血管生成因子的表达,调节细胞因子网络平衡,来诱导细胞产生凋亡从而抑制肿瘤生长。6.结合文献研究及实验结果,推测ALO抗结肠癌的机制之一为：ALO→SW480→IL-6/JAK-STAT3信号通路→抑制STAT3磷酸化→下游基因Bc1-2,BAX,VEGF→诱导凋亡,抑制血管生成→抑制肿瘤生长。此推断还需进一步实验证明。
彭林辉[7]（2011）在《携带mIFN-γ基因的溶瘤病毒治疗消化系恶性肿瘤的实验研究》文中提出背景：综合治疗已经成为肿瘤治疗的一项基本原则,但是目前尚无十分令人满意的治疗方法,因此,仍在不断探索新的治疗方法。作为新的肿瘤治疗方法必须要有新的作用机制,且与目前已有的方法不存在交叉耐受。病毒治疗就是因为拥有上述特性而在近年来的肿瘤治疗中受到越来越多的关注。腺病毒具有宿主细胞范围广泛,可感染分裂和非分裂终末分化细胞,致病性低、基因组完全清楚,易于操作、不整合到染色体中,无插入致突变性、病毒滴度较高、易于纯化和制备等诸多优点而在病毒治疗中研究最多。但是由于腺病毒靶向肿瘤细胞特异性差及在某些细胞中转染效率低下等问题,仍需要进一步改造。在改造中主要是利用肿瘤生物学行为上的一些异常表现,或是对病毒的基因组进行缺失突变,或是以肿瘤／组织特异性启动子／增强子为“开关”对一些在病毒的生活周期中至关重要的基因进行调控,期望因而克服了腺病毒本身的不足,能够靶向肿瘤细胞增殖,杀死肿瘤细胞,而不损害正常细胞。目前在国际上增殖型腺病毒以ONYX-015为研究得最早也最为成功。ONYX-015是E1B-55kD缺失的腺病毒,它利用多数人类肿瘤细胞p53功能不良而正常细胞p53阳性的特点,可以特异地杀伤p53缺失或变异的肿瘤细胞。在其联合常规化疗（5-Fu、顺铂）治疗30例复发的头颈部肿瘤患者的临床实验中,临床有效率达到了63%,这是迄今最为有效的肿瘤生物治疗之一。目前已在包括头颈部肿瘤、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等十多种肿瘤及十五个肿瘤临床中心应用。但作为单剂的治疗效果仍不佳,只有20%左右,Ⅲ期临床试验中结果也不理想。理论上,ONYX-015可以在肿瘤细胞增殖、裂解肿瘤细胞,其释放出来后又继续感染周围的肿瘤细胞,疗效可以逐步放大,直至杀灭所有肿瘤细胞。但在实际应用中由于肿瘤和病毒在生物学性状上十分复杂,其疗效影响因素众多。①在肿瘤细胞中特异性增殖仍不理想。早期的实验结果表明ONYX-015在P53突变的肿瘤细胞内特异性增殖,而在野生型P53及正常细胞不增殖；但随着实验进一步深入,ONYX-015并非在所有P53突变细胞增殖,而在野生型P53细胞不增殖,它在部分P53正常的细胞中也能增殖。②对肿瘤细胞作用广谱性不强,腺癌中p53功能异常的细胞只有34-70%。③肿瘤内部的肿瘤细胞异质性的差异、肿瘤组织内部的出血、坏死、纤维化甚至在许多情况下还有一些正常的细胞夹杂其间（有时可达50%）,均不利于病毒的扩散。④在70-80%正常成人体内存在有腺病毒的中和抗体,影响病毒弥散及再感染的过程。⑤转染率不够高。因此,我们从两方面对腺病毒进一步改造。（1）提高病毒对肿瘤细胞的特异性和广谱性。我们选择了目前被认为是最广谱、最特异的肿瘤分子标记——端粒酶。端粒酶与肿瘤无限增殖的特性有关,在85%以上的肿瘤中为阳性（消化系恶性肿瘤细胞中80%-100%阳性）,而在绝大多数的正常细胞中为阴性。人端粒酶逆转录酶（hTERT）对端粒酶的活性起着关键的调控作用。hTERT启动子只有在端粒酶阳性的细胞中有转录活性。因此,腺病毒在hTERT启动子的调控下具有在肿瘤细胞特异性增殖,而正常细胞不能增殖的能力。（2）以增殖腺病毒为载体携带的抗癌基因,利用基因治疗杀灭部分对病毒不敏感的肿瘤细胞,增强病毒对肿瘤的杀伤作用。在抗癌基因筛选中,我们选择了γ-干扰素（IFN-γ）.这是由于IFN-γ具有以下优点：①促进机体肿瘤监督的免疫活性,抑制癌前基因、癌基因的表达,IFN-γ自身及其诱导的巨噬细胞产生的IL-2,可诱导Thl细胞功能,增强细胞毒性T细胞的产生,从而发挥抗肿瘤效应；③上调肿瘤相关抗原的表达,增加肿瘤细胞对MHC限制的CD8+细胞毒T细胞溶瘤的敏感性；④可以抑制新生血管的产生,起到抑制肿瘤生长的作用；⑤通过诱导Th2向Thl分化,从而减少病毒抗体产生,使病毒不仅可以通过血流弥散全身各部位肿瘤,而且使病毒可以反复使用。但在既往IFN-γ肿瘤治疗的临床试验中,其疗效并不理想。这是由于IFN-γ采用原核表达,体内半衰期短,仅为15分钟,需要给患者高半剂量反复注射方能取得一定的疗效,往往副作用严重。而我们应用增殖病毒携带Y-干扰素作为治疗基因。理论上腺病毒在hTERT启动子调控下只在端粒酶阳性的肿瘤细胞细胞中增殖,而目的基因的拷贝随着病毒的增殖得以扩增,大量表达有抗癌活性的剂量依赖型的细胞因子IFN-γ,在肿瘤局部形成高浓度,从而在不增加毒性的情况下协同腺病毒充分发挥抗肿瘤活性。目的：在前期研究中我们将小鼠的IFN-γ基因成功能克隆入hTERT启动子调控的增殖型腺病毒载体中,建成了CNHK300-Mγ。本实验以ONXY-015、CNHK300和AdEasy-Mγ（携带mIFN-γ的非增殖病毒）作为对比,系统地研究了CNHK300-Mγ体外和荷瘤动物模型中对消化系肿瘤的抑瘤效应和治疗基因mIFN-γ的表达情况,为消化系恶性肿瘤的病毒一基因治疗和针对端粒酶为靶点的治疗策略提供新的思路。方法：1、溶瘤病毒CNHK300-Mγ对消化系恶性肿瘤细胞的体外实验研究：以ONXY-015、CNHK300和AdEasy-Mγ为参照对象,采用病毒增殖实验评估CNHK300-Mγ在常见消化系恶性肿瘤细胞株和正常成纤维细胞株中的增殖能力；采用的细胞病理效应（CPE）和细胞活力检测（MTT）评估CNHK300-Mγ对消化系恶性肿瘤细胞株和正常成纤维细胞株的杀伤能力；采用Western Blot试验和ELSA试验来检测CNHK300-Mγ和AdEasy-Mγ感染消化系恶性肿瘤细胞株和正常成纤维细胞株后mIFN-γ表达的差异。2、溶瘤病毒CNHK300-Mγ治疗肝癌动物模型的研究：采用SMMC-7721裸鼠肝癌动物模型和Hepal-6小鼠肝癌动物模型进行瘤内注射病毒治疗,测量肿瘤大小,观察与ONXY-015、CNHK300、AdEasy-Mγ和对照组的抑瘤差异；进行动物血清mIFN-γ的检测,评估CNHK300-Mγ和AdEasy-Mγ表达治疗基因的差异；进行肿瘤常规HE染色检查和免疫组化检查肿瘤组织中腺病毒外壳蛋白Hexon表达情况、代表微血管密度的阳性细胞和代表免疫状态的LCA+、CD 4、CD8的表达情况。结果：1、溶瘤病毒CNHK300-Mγ对消化系恶性肿瘤细胞的体外实验研究1)病毒增殖实验发现：CNHK300-Mγ在正常成纤维细胞株BJ和MRC-5中增殖能力很低,最高只有100左右；而在消化系恶性肿瘤细胞株HepG2、SMMC-7721、PANC-1、HT29、SGC-7901中增殖能力明显增强,均超过25000倍；后者是前者的248-1259倍之间。CNHK300-Mγ和ONYX-015在正常细胞株中增殖能力相似,但在消化系恶性肿瘤细胞株中增殖能力明显增强,在HepG2细胞株中是后者的5倍,在其余肿瘤细胞株中是后者的27～～313倍。2)细胞病理效应（CPE）发现：CNHK300-Mγ对肿瘤细胞株有强大的杀伤能力,在MOI值为1时均基本杀灭；而正常细胞株至MOI值为100时才有部份杀伤力,明显低于肿瘤细胞株中。3)MTT试验也有类似CPE的结果：CNHK300-Mγ对消化系恶性肿瘤细胞株有明显的杀伤作用,当MOI在1以下时可以杀伤半数的各种肿瘤细胞,而对正常细胞均在200以上。与ONYX-015相比,在肿瘤细胞中有更强的杀伤力,ONYX-015的IC50所需的的MOI值分别是CNHK300-Mγ数倍至近百倍,在HepGⅡ、SMMC-7721、PANC-1、HT29、SGC-7901中分别为4.16、93.7、23.91、72.95和8.63倍,但在正常细胞中两者IC50值相近。4) Western Blot和mIFN-γ的表达量的测定：肿瘤细胞受CNHK300-Mγ感染后均有大量mIFN-γ的表达,随着感染的时间延长,mIFN-γ的表达量均有较明显上升。同一种肿瘤细胞受CNHK300-Mγ感染后mIFN-γ的表达量明显高于受AdEasy--Mγ感染的,差值在141-1245倍之间（3天时）和614-5150倍之间（：7天时）。2、溶瘤病毒CNHK300-Mγ治疗肝癌动物模型的研究1)应用CNHK300-Mγ治疗后,可使肿瘤增长明显缓慢,肿瘤体积的大小与ONXY-015、CNHK300、AdEasy-Mγ和PBS对照组均差异显着。裸鼠肝癌SMMC-7721动物模型抑瘤率在CNHK300-Mγ、CNHK300、ONXY-015、AdEasy-Mγ分别为73.32%、42.88%、19.86%和6.76%。（CNHK300-Mγ与ONYX-015、AdEasy-Mγ和PBS对照组的P值均小于0.001,CNHK300和CNHK300-Mγ之间为0.029）；Hepal-6小鼠肝癌动物模型中抑瘤率在CNHK300-My、CNHK300、AdEasy-Mγ分别为90.32%、61.94%和57.66%。（CNHK300-My与CNHK300、AdEasy-Mγ和PBS对照组的P值均小于0.001）。2)血清中mIFN-Ο表达量检测,证实CNHK300-Mγ治疗后1周内,mIFN-γ表达量呈成倍升高的趋势。CNHK300-Mγ组在治疗结束后3天,7天分别为231±101pg/ml和1733±191pg/ml; AdEasy-Mγ组在治疗结束后3天为20±10pg/ml,第7天未检测到。3)在SMMC-7721肝癌动物模型中,免疫组化检测肿瘤组织Hexon的表达情况,发现CNHK300-My治疗组和CNHK300治疗组的肿瘤细胞内有阳性表达,对照PBS组无阳性表达。HE染色发现CNHK300-My组与对照组相比肿瘤中央有较多坏死。vWF免疫组化染色,显示代表微血管密度的阳性细胞数目CNHK300-Mγ组、CNHK300组、AdEasy-Mγ组和PBS处理组分别为81.0±6.2、、129.4±9.93、152.8±9.8和183.3±15.3,四组间P小于0.001。4)在Hepal-6动物模型中,肿瘤组织的LCA+、CD 4和CD8的表达在不同组间结果如下：CNHK300-Mγ组分别为577.800±76.741,343.250±51.331和207.750±19.172, AdEasy-M Y分别组为241.800±44.779,124.750±40.277和100.750±12.420,PBS照组分别为122.4±26.121,74.250±17.308,74.000±9.661。CNHK300-Mγ治疗组与AdEasy-Mγ组和PBS对照组的差异明显,具有统计学意义,P值均小于0.001。结论：1、hTERT启动子调控的溶瘤病毒CNHK300-M Y在端粒酶阳性的消化系恶性肿瘤细胞株HepG2、SMMC-7721、PANC-1、HT29、SGC-7901中均能够大量增殖制并杀灭肿瘤细胞,均强于ONXY-015,而在端粒酶阴性的正常成纤维细胞株BJ、MRC-5中增殖很弱,杀伤力也AdEasy-Mγ近似,显示CNHK300-Mγ比ONYX-015在正常细胞中进一步减毒。2. CNHK300-Mγ感染消化系恶性肿瘤细胞后均有大量mIFN-γ的表达,荷瘤鼠瘤内注向后能在血清中检测到,均与AdEasy-Mγ差异显着,这提示与非增殖型腺病毒相比,利用增殖型腺病毒携带治疗基因,能使治疗基因有更好的表达。3、SMMC-7721裸鼠肝癌动物模型和Hepal-6小鼠肝癌动物模型应用CNHK300-M Y治疗后,肿瘤增长明显缓慢,与ONXY-015、CNHK300、AdEasy-Mγ相比,CNHK300-Mγ是有更强抑瘤作用的新型溶瘤病毒。4、肿瘤组织Hexon染色提示CNHK300-Mγ瘤内注射后能在病毒能局部增殖、复制。肿瘤组织中微血管密度明显下降,LCA+、CD 4和CD8的表达明显增加,提示CNHK300-Mγ治疗肿瘤不仅有病毒增殖杀灭肿瘤而且通过大量表达有抗瘤作用的mIFN-γ,发挥基因抗瘤作用,CNHK300-Mγ能发挥病毒治疗和基因治疗的双重作用。
葛莲英[8]（2010）在《端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究》文中研究表明在我国,消化道恶性肿瘤中大肠癌发病占有很高的比率。目前以手术治疗为主的综合治疗仍存在局限性,疗效不尽人意。因此,能否找到一个有效的分子治疗靶点,是丰富大肠癌治疗方法和最终应用于临床提高综合疗效的关键。有研究表明,大肠癌标本中端粒酶活性表达高达85%以上,而正常组织表达仅5%左右。端粒酶全酶由端粒酶RNA （hTR）、端粒酶相关蛋白（TPI）和端粒酶催化亚基（hTERT）三部分组成。hTR和TPI在正常组织和肿瘤组织均有表达,与端粒酶活性无相关性。而hTERT与端粒酶的活性相一致,hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素,与肿瘤的关系尤为密切,因此将端粒酶作为肿瘤分子靶点的研究是极有意义的研究领域。本研究从本院临床收集30例大肠癌组织、癌旁组织及正常大肠组织,通过对端粒酶活性的检测,探讨端粒酶与大肠癌的相关性,并进一步验证端粒酶催化亚基（hTERT）的表达是否与端粒酶活性一致。同时回顾性分析本院178例大肠癌患者病理标本中hTERT表达水平和临床病理学参数之间的相关性；通过临床随访资料分析,阐明影响大肠癌患者生存预后的风险因素,明确hTERT能否作为判断大肠癌预后的标志物及作为大肠癌治疗的分子靶点。通过RNAi沉默技术,观察hTERT沉默对大肠癌细胞生长增殖和凋亡的影响,最终阐明hTERT基因RNAi沉默技术对大肠癌靶向治疗的可行性。本研究将从细胞、分子和整体水平上,为开展大肠癌hTERT基因靶向治疗提供实验和临床依据。第一部分端粒酶与大肠癌相关性研究第一章端粒酶活性与大肠癌相关性研究目的探讨端粒酶与大肠癌相关性,进一步验证端粒酶催化亚基（hTERT）的表达是否与端粒酶活性一致。方法运用PCR-TRAP-ELISA及免疫组织化学方法对大肠癌组织及其癌旁组织、大肠正常组织各30例检测端粒酶活性、hTERT的表达水平,并研究端粒酶与临床病理学特征之间的关系。结果（1）端粒酶阳性检出率在大肠癌组织、癌旁组织、大肠正常组织分别为83.33%13.33%3.33%,癌组织中检出率明显高于其他组织（P<0.05）。（2）大肠癌组织端粒酶活性随组织分化程度变低而升高,低分化大肠癌组织中的端粒酶阳性表达率高于中分化及高分化大肠癌（P<0.05）。（3）通过用免疫组化检测hTERT的表达与PCR-TRAP-ELISA法检测得端粒酶活性相比较,显示端粒酶活性与hTERT表达具有一致性,两法检测无显着差异。结论（1）大肠癌组织端粒酶阳性率明显高于癌旁组织及正常大肠组织,大肠癌组织中hTERT表达高于癌旁组织及正常组织。（2） hTERT的表达与端粒酶活性一致。第二章端粒酶催化亚基与大肠癌预后因素分析目的通过对178例大肠癌患者的临床资料回顾性分析,阐明hTERT表达水平与大肠癌临床病理特征及预后的关系,为大肠癌患者的预后评估提供一定的理论指导。方法选取有完整临床资料的178例大肠癌石蜡包埋组织标本及60例癌旁组织标本作为实验组,30例大肠正常组织石蜡包埋标本作为对照组。采用免疫组化的方法检测大肠癌组织中hTERT蛋白表达水平。查阅病例获得相关临床参数资料及随访资料,分析hTERT表达水平与大肠癌进展及临床预后的关系。结果（1） hTERT蛋白在大肠癌组、癌旁组与大肠正常组中阳性率分别为94.4%、6.67%、3.33%,其差异有统计学意义（P<0.001）;（2） hTERT在大肠癌组织中的表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤直径无关（P>0.05）,与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes分期、临床分期及远处转移有关（P<0.05）。（3）经多因素Cox模型分析,不同浸润深度、远处转移、淋巴结转移、hTERT表达4项指标是影响大肠癌患者术后预后的独立危险因子；hTERT表达水平与患者术后无瘤生存时间呈负相关。结论hTERT在大肠癌组织中呈高表达。经多因素Cox分析,大肠癌浸润深度、远处转移、淋巴转移、hTERT表达与大肠癌患者预后存在显着性相关,是影响预后的危险因子。大肠癌组织中hTERT高表达者预后相对较差,低表达者预后相对较好。第二部分RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的实验研究第一章hTERT基因shRNA真核表达载体的构建目的构建人端粒酶催化亚基（hTERT）基因shRNA真核表达载体质粒,为大肠癌RNAi介导的基因治疗打下基础。方法化学合成3条hTERT基因siRNA,通过脂质体转染大肠癌细胞SW480,48h后采用RT-PCR方法筛选出一条对hTERT mRNA有明显沉默作用的siRNA。将筛选出的siRNA设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链后,插入到pGPU6/GFP/Neo真核表达载体中,并进行酶切和测序鉴定。结果酶切和DNA测序证实构建的ShRNA已插入载体中。结论成功构建的hTERT基因shRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA,为进一步开展hTERT基因在人大肠癌细胞中的作用机制及体内外RNAi实验研究奠定了基础。第二章RNAi沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响目的观察hTERT基因对SW480细胞生物学特性的影响。方法将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA （hTERT-shRNA）用脂质体转染法导入SW480大肠癌细胞,含无效序列的pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA （NC-shRNA）作为阴性对照,单纯SW480细胞作为空白对照,等量转染试剂脂质体作为脂质体对照组,分别于转染后24h、48h、72h,在荧光显微镜下观察重组质粒转染效率和细胞形态学变化。采用MTT法检测各组细胞的生长增殖情况,RT-PCR法检测不同转染时间细胞hTERT mRNA的表达水平,免疫细胞化学法检测hTERT特异性蛋白表达；PCR-TRAP-ELISA法检测转染后48小时端粒酶活性；流式细胞仪检测转染后细胞周期分布,TUNEL法和透射电镜观察转染后细胞凋亡变化及线粒体膜电位（MMP）的改变检测。结果（1） hTERT-shRNA质粒转染24h、48h及72h比较,转染48h其转染效率明显高于24h和72h的转染效率,质粒与脂质体比例为1：2.5时,其转染效率显着高于其它各组,转染率达59%。（2）MTT检测结果显示：hTERT-shRNA质粒转染组对SW480细胞的生长增殖有明显抑制作用,于转染后第2d达到峰值,增殖率减少达28.22%,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（3）半定量RT-PCR结果显示,转染48小时的hTERT-shRNA组的hTERT mRNA表达量明显低于转染24h和72h组的表达量。转染48小时的hTERT-shRNA组和空白对照组、脂质体对照组、NC-shRNA组比较,其抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。（4）免疫细胞化学结果示：hTERT-shRNA组染色阳性细胞明显少于对照组。经病理图像分析软件进行灰度测量后比较发现,转染48h的hTERT-shRNA组较空白对照组灰度值下降约30.2%,同时和脂质体对照组和NC-shRNA组相比,差异均有明显统计学意义（P<0.01）。（5）PCR-TRAP-ELISA端粒酶活性检测显示：较空白对照组相比,hTERT-shRNA转染组细胞端粒酶活性下降了18.7%,与较其它三组之间差别均有显着性意义（P<0.05）。（6）流式细胞术检测：与对照组比较,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加。与NC-shRNA组比较,hTERT-shRNA组增殖指数（PI）下降14.2%,差别有显着学意义（P<0.05）。（7） TUNEL法检测：hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着多于对照组,因而其凋亡指数较其它组也明显增高,hTERT-shRNA组较空白对照组AI增高20%。（8）转染48h后透射电镜观察：可见凋亡细胞体积明显缩小,表面突起和微绒毛减少,甚至消失,染色质不均匀地地沿核膜下聚集。部分可见细胞核新月体,空泡形成增多。（9）与空白对照组相比,转染48h后线粒体跨膜电位（MMP）显示：hTERT-shRNA组线粒体Rhodamine123荧光强度明显增强（增加约24.2%）,MMP显着下降,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。结论RNAi沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480肿瘤细胞生长和增殖,并降低端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡。第三章RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌移植瘤的动物实验研究目的探讨重组pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA质粒对SW480细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法（1）经皮下接种SW480细胞株（1×107个细胞/只）建立裸鼠人大肠癌细胞移植瘤模型。（2）24只裸鼠随机地分为3组,每组8只。以瘤内接种pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA简称hTERT-shRNA)质粒组为实验组,以瘤内注射pGPU6/GFP/Neo-NC shRNANC （简称NC-shRNA）作为阴性对照,以瘤内注射生理盐水作为空白对照组。（3）观察各组裸鼠皮下肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤抑制率。（4）治疗结束后取标本进行病理学检查、hTERT mRNA及hTERT蛋白表达分析,端粒酶活性及组织凋亡检测。结果（1）所有裸鼠均于7天后可见皮下肿瘤形成。（2） hTERT-shRNA组裸鼠肿瘤生长较慢,生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组裸鼠肿瘤仍较快增大。（3）hTERT-shRNA组肿瘤组织切片HE染色,部分肿瘤可见大片坏死区,细胞结构消失。生理盐水组和NC-shRNA组肿瘤生长良好,细胞形态不规则,可见病理性核分裂相。（4）半定量RT-PCR检测hTERT mRNA水平,发现hTERT-shRNA组较生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义（P<0.01）。（5）免疫组化结果表明：hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT阳性细胞明显减少,蛋白表达下调。hTERT蛋白平均灰度较生理盐水组和NC-shRNA组分别降低19.9%和14%。（6）端粒酶活性检测表明,pGPU6/GFP/Neo-hTERT组较生理盐水组和NC-shRNA组端粒酶活性明显降低,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。端粒酶活性抑制率分别为48.5%和53.0%。（7）TUNEL法检测发现,hTERT-shRNA组肿瘤细胞凋亡明显多于对照组,AI（凋亡指数）较生理盐水组和NC-shRNA组增加29.4%,31.1%,差异有统计学意义（P<0.01）。结论hTERT基因的shRNA瘤内注射能延缓大肠癌细胞SW480裸鼠皮下移植瘤的生长,其机理可能是通过抑制hTERT mRNA和蛋白的表达、抑制端粒酶的活性、促进肿瘤细胞凋亡而发挥作用。
常金荣[9]（2007）在《吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞的抗癌作用及机理研究》文中提出大肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。在我国，随着经济的发展，生活方式的改变，大肠癌的发病率也日趋增高，尽管采用了手术、化疗、放疗等多种治疗方法，但效果都不尽理想。现代研究者普遍认为：端粒酶的激活是肿瘤形成过程中的关键步骤。端粒酶已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点，因此目前有大量科学家致力于从端粒酶途径治疗大肠癌的研究。由于中药抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点，同时其毒副作用低，不易产生耐药性，日益受到人们的重视。近几年中药抑制端粒酶活性成为肿瘤治疗的热点之一。随着现代生物化学和分子生物学技术的发展，表型遗传学异军突起，已成为许多学科的研究前沿，在肿瘤发生发展方面的研究也逐渐引起了人们的广泛关注。诸多研究表明在肿瘤发生的过程中，除了DNA序列改变外，表型遗传修饰在肿瘤形成过程中具有重要作用。主要包括DNA甲基化和组蛋白乙酰化。其中DNA甲基化是目前研究的最多、也是最深入的一种表型遗传修饰表达机制。端粒和端粒酶与细胞增殖、分化、癌变及细胞凋亡有关，多种转录因子参与端粒酶逆转录酶（hTERT）的调节。近年来的研究发现DNA甲基化对端粒酶活性的调节具有重要的作用。本研究所对以吴茱萸、黄连、青黛为主药的加味左金丸及其主要成分吴茱萸碱、小檗碱、靛玉红防治胃肠癌的药理作用和临床研究已进行了多年，研究表明，加味左金丸能降低MNNG诱发大鼠胃及十二指肠癌的发生，减轻病理损伤；小檗碱可以明显抑制BGC823、MGC803等胃癌细胞的增殖，降低集落形成率、细胞分裂指数及软琼脂集落形成能力，促进细胞分化，降低肿瘤转移等，同时还可以抑制ras和c-erbB2基因的表达。临床方面，杨传标等观察了连黛胶囊（加味左金丸）治疗30例中晚期胃肠肿瘤患者的疗效及其与中医证型的关系，结果表明连黛胶囊治疗胃癌、大肠癌在改善临床症状和提高生存质量方面有显着疗效，其中对热毒（湿热）证的临床症状疗效最好。我们的课题正是在此基础上，从端粒酶活性及其逆转录酶的表型遗传修饰方面探讨加味左金丸对治疗大肠癌的分子药理机制。研究过程中发现，加味左金丸中的主要单体靛玉红的作用不太明显，故本研究在此基础上进一步研究吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌的抗癌作用机制。一．实验研究1．细胞培养条件的建立采用体外培养细胞的方法，研究了吴茱萸碱和小檗碱从端粒酶及其逆转录酶hTERT甲基化途径对HT29细胞的抗癌作用。选用的细胞为结肠腺上皮癌HT29细胞株，建立和稳定了整个研究工作中所需要的细胞培养条件。主要对细胞传代、细胞冻存和细胞复苏条件进行了优化，在此基础上，通过显微镜观察了细胞形态，采用了WST-8法测定了细胞生长曲线。结果显示，HT29细胞平铺于培养瓶底面积超过瓶底80％时，即可以比例1：2传代；按5×106细胞加入冻存液1ml这样的密度冻存；复苏时，液氮罐中取出的细胞，于38℃迅速在1～2min内解冻，细胞接种次日贴壁良好。生长曲线显示，细胞以1×105／ml接种后2～3日生长旺盛，此时，细胞处于倍增期前后，适合实验。2．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞的生长抑制和细胞凋亡的作用首先在体外培养人结肠癌细胞株HT29细胞，采用WST-8方法测定吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞生长抑制作用，并筛选了两种药物作用的最佳时间、有效浓度。结果显示：经过筛选后，作用时间取72h，吴茱萸碱取7.5，15，30μM3个浓度，盐酸小檗碱取52.5，105，210μM3个浓度用于后续实验；吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞具有显着生长抑制作用，具有剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系；相差显微镜动态观察药物作用后，细胞出现胞体缩小，变圆，胞浆混浊，增殖变慢等生长受到抑制的形态方面的变化。采用Annexin V-FITC／PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡的变化，检测结果提示：吴茱萸碱和小檗碱能够诱导细胞凋亡，与空白对照组比较有显着差异性，随药物浓度的增加，凋亡率逐渐增加，表现为量效依赖性；荧光电镜下观察可见到细胞出现核固缩、核碎裂、染色体边集和凋亡小体等典型的细胞凋亡形态学特征。同时本研究还表明吴茱萸碱和小檗碱单独应用有抗大肠癌的作用，而二者合用对HT29细胞产生的抑制细胞增殖作用，与单药组吴茱萸碱的抑制率比较无显着差异性，说明吴茱萸碱和小檗碱对其生长抑制无明显的协同作用。3．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响端粒酶的激活是肿瘤形成过程中的关键步骤，它已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点。许多研究表明，端粒酶在大肠癌中高表达，通过观察吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响，探讨其对人结肠癌细胞的作用机制。本实验采用了原位TRAP方法测定端粒酶活性，结果表明吴茱萸碱和小檗碱作用HT29细胞72h后，端粒酶活性明显降低，且随药物浓度逐渐增大，抑制端粒酶活性的作用逐渐增强，呈剂量依赖性；而二者协同用药作用时，和正常对照组比较，端粒酶活性无明显变化，表明吴茱萸碱和盐酸小檗碱联合用药与单独作用无明显变化，进一步证明二者无明显协同作用。4．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶逆转录酶hTERTmRNA表达的影响端粒酶的活化与肿瘤的发生发展和衰老机制密切相关，而hTERT作为端粒酶的逆转录组分，与端粒酶活性的表达具有密切相关性，能够反映出端粒酶的活性，且多种肿瘤调控因子均通过对hTERT的调节来影响端粒酶的活性，是更加理想的端粒酶抑制靶点。所以我们应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法，检测人结肠癌HT29细胞中hTERT mRNA的表达水平，探讨其对大肠癌细胞端粒酶活性的影响及其抑癌机理。研究结果表明吴茱萸碱和小檗碱能够降低HT29细胞中的hTERT mRNA的表达，且随着药物浓度的增加，表达逐渐降低，具有剂量依赖效应。hTERT mRNA表达代表端粒酶活性，hTERT mRNA表达下降，提示端粒酶活性降低，由此可证明吴茱萸碱和小檗碱影响大肠癌端粒酶活性是通过降低hTERT表达这一途径来完成的。二．结论通过对细胞传代、冻存和复苏条件进行优化，建立了稳定的HT29细胞培养条件，为后续的实验研究奠定了良好的基础；吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌HT29细胞具有显着生长抑制作用，该抑制作用与诱导细胞凋亡相关；能够抑制HT29细胞端粒酶的活性；能够降低HT29细胞中端粒酶逆转录酶hTERTmRNA的表达，间接抑制端粒酶活性；二者无协同作用。三．不足之处虽然研究工作取得了部分阶段性成果，但由于研究方法不太成熟及时间等方面的原因，研究中也存在着一些不太满意的方面，主要有两个方面：一是由于研究方法不太成熟，关于端粒酶逆转录酶hTERT甲基化程度检测方面的实验未预期完成；另一方面，我们只是选取了加味左金丸的主要有效单体吴茱萸碱和小檗碱来研究其抑癌机理，并不能代表中药复方加味左金丸的抑癌作用，如果探讨中药复方的抑癌机理研究，需要运用中药血清药理学，它能够真实地反映药物在体内的整体作用，实现体外实验和体内实验的结合，使实验结果和在体实验有很好的一致性，并能够为临床治疗大肠癌提供实验依据。四．展望本论文是通过对细胞生长抑制、诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性和降低端粒酶逆转录酶hTERT基因表达这四个方面层层深入研究，证明了吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌HT29细胞的抑癌作用机理，为今后从转录因子c-myc、SP1等调控基因表达更深层面去研究中药抑癌的作用机制奠定了一定的基础，也为开发新药提供了实验依据。但本研究中表明，吴茱萸碱和小檗碱在HT29细胞生长抑制及端粒酶活性检测方面，二者无协同作用，可能通过其他机制参与了端粒酶活性的调节，有待以后进一步的深入研究。
刘华一[10]（2004）在《胃癌前期病变中医证治及相关基础研究》文中研究说明目的：探讨胃癌前期病变的中医证候学特点以及辨证论治规律，并从器官、细胞和分子水平等不同层次上研究益气（养阴）行消法治疗胃癌前期病变的机理。方法：1． 通过对上千例临床病例资料的分析及文献复习，筛选出与胃癌前期病变相关的60项症状及舌象脉象。制定出统一的胃癌前期病变中医证候学调查表，对300余例病理确诊的胃癌前期病变患者进行调查。2． 应用胃转安一、二号冲剂，对150患者进行临床治疗观察。3． 应用MNNG加雷尼替丁联合方法建立大鼠胃癌前期病变模型，动态观察胃癌前期病变发生、发展过程中端粒酶的激活及其与细胞增殖和细胞凋亡的关系以及中药胃转安方对其干预作用。结果：胃癌前期病变患者中的中医证候，本虚以气虚、阴虚为主；标实以血瘀、气滞、湿浊、热毒为主。其基本病机为本虚标实，虚实夹杂。根据慢性胃炎的临床流行病学调查结果及临床病例资料分析，总结出由慢性浅表性胃炎至慢性萎缩性胃炎直至出现肠腺化生和异型增生等胃癌前期病变，其中医演变规律是“因滞至虚，因虚夹邪”。采用益气（养阴）行消的胃转安一、二号治疗100例胃镜病理诊断的胃癌前期病变患者，其综合有效率为96％，高于对照组（胃复春片）的78％。在减轻临床症状，逆转异型增生及肠腺化生等胃癌前期病变等方面，均有较好疗效。动物实验证实，MNNG致胃癌前期病变造模过程中，模型组胃粘膜明显增生，表现异型增生的标本例数占总例数的70％，而中药组则腺体增生较轻。伴随组织学变化的发生，端粒酶可被激活，同时细胞增殖指数逐步升高，细胞凋亡指数逐步降低，中药干预组端粒酶活性与和自然恢复组比较有统计学意义；各组间细胞增殖指数比较有统计学意义，其排列顺序为：模型组＞自然恢复组＞中药组＞正常组；细胞凋亡指数各组间比较有统计学意义，排列顺序为正常组＞中药组＞自然恢复组＞模型组。结论：胃癌前期病变的病机属“本虚标实”，应用益气（养阴）行消的胃转安一、二号冲剂治疗，在缓解临床症状的同时，可有效逆转异型增生等胃癌前期病变，动物实验证实该方可减轻异型增生程度，阻断胃癌前期病变，并具有抑制端粒酶活性，抑制细胞增殖及促进细胞凋亡的作用。从细胞动力学角度证实了胃转安方对胃癌前期病变的阻断及逆转作用。
二、端粒酶与消化系肿瘤相关性研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、端粒酶与消化系肿瘤相关性研究进展（论文提纲范文）
（1）基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1 文献研究 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 西医发病机制 |
| 1.3 晚期胃癌的中西医治疗概述 |
| 1.4 附子理中汤对晚期胃癌的作用 |
| 2 数据分析与成果讨论 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 晚期胃癌的中西医治疗进展 |
| 1 中西医对晚期胃癌的认识 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 西医发病机制 |
| 2 中西医治疗晚期胃癌 |
| 2.1 中医治疗 |
| 2.2 西医治疗 |
| 2.3 中西医联合治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于先天禀赋的肾阳虚体质大鼠模型构建与能量代谢调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 孕期干预建立肾阳虚体质模型的理论研究 |
| 1 “肾阳虚”的理论内涵是肾阳虚体质模型建立的前提 |
| 1.1 “虚”“寒”是肾阳虚的关键内涵 |
| 1.2 肾阳虚是当前多种重大慢性疾病发病与传变的病理基础 |
| 1.3 “肾在志为恐”导致恐伤肾的理论依据 |
| 1.4 肾阳虚证是肾阳虚体质进一步发展,可用于指导体质造模 |
| 2 基于先天禀赋采取老龄大鼠为亲本并采用孕期干预是构建肾阳虚体质模型的关键 |
| 2.1 父母体质状态是子代先天禀赋之源 |
| 2.2 孕期干预影响子代先天禀赋的研究源远流长 |
| 2.3 肾藏精不足是老龄群体的普遍体质状态 |
| 2.4 孕期干预以塑造子代表型是表观遗传学的重要运用 |
| 3 以线粒体为核心的下丘脑-棕色脂肪能量代谢调控机制是评估本模型的重要方面 |
| 3.1 富含线粒体并通过脂肪产能来调节机体能量代谢平衡是棕色脂肪的重要生理特点 |
| 3.2 PGC-1a/AMPK-a2/UCP-1 是棕色脂肪调控产热的重要机制 |
| 3.3 NPY/NPY1R和POMC/MC4R是下丘脑调控棕色脂肪产热的上游机制 |
| 3.4 线粒体自噬对维持线粒体自身健康状态至关重要:裂变与融合 |
| 4 定向挑选并不断固化肾阳虚表型的品种选育技术是本模型长期研究的理论依据 |
| 5 科学假说——“基于先天禀赋的孕期干预与肾阳虚性状定向选育能构建肾阳虚体质模型,并表现为产能代谢机制紊乱” |
| 第二章 子代肾阳虚体质大鼠模型构建 |
| 1 亲本阳虚体质大鼠筛选及评价 |
| 1.1 冷热板示差法亲本阳虚体质大鼠 |
| 1.2 对亲本阳虚体质大鼠作体貌性状评价 |
| 2 肾阳虚体质大鼠造模 |
| 2.1 恐伤肾(猫吓鼠)造模 |
| 2.2 低温(寒冷环境)造模 |
| 2.3 苦寒(盐制黄柏水灌胃法)造模 |
| 3 子代肾阳虚体质大鼠饲养及阳虚体质再筛选 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 出生体重是衡量个体先天禀赋的重要指征 |
| 5.2 低出生体重与新生儿发育在病理上的联系是国内外临床研究的热点 |
| 5.3 子代肾阳虚体质大鼠呈现低出生体重可作为评价本模型的重要指标 |
| 5.4 子代肾阳虚体质大鼠在40℃温控板停留率呈上升趋势初步论证模型构建成功 |
| 第三章 孕期干预造模的母子两代能量代谢差异性研究 |
| 1 样本采集与脊间棕色脂肪指数测量 |
| 2 外周棕色脂肪线粒体能量代谢能力比较 |
| 2.1 Elisa法对外周棕色脂肪组织ATP含量检测实验 |
| 2.2 电镜扫描法对外周棕色脂肪组织线粒体微观结构状态的评价 |
| 2.3 WB法对外周棕色脂肪组织线粒体产能相关酶学系统的评价 |
| 3 下丘脑与棕色脂肪基因表达对线粒体产能调控机制研究 |
| 3.1 RT-PCR法对棕色脂肪调控产能代谢基因表达量的研究 |
| 3.2 RT-PCR法对下丘脑调控产能代谢基因表达量的研究 |
| 4 外周棕色脂肪线粒体自稳态调控能力比较 |
| 4.1 Elisa法对外周棕色脂肪组织i NOS含量检测实验 |
| 4.2 WB法对外周棕色脂肪组织线粒体自噬水平相关蛋白的检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 实验结果总结 |
| 5.2 实验结果讨论 |
| 第四章 孕期干预造模对子代雌雄鼠肾阳虚程度的差异性研究 |
| 1 样本采集与脊间棕色脂肪指数测量 |
| 2 外周棕色脂肪线粒体能量代谢能力比较 |
| 2.1 Elisa法对外周棕色脂肪组织ATP含量检测实验 |
| 2.2 电镜扫描法对外周棕色脂肪组织线粒体微观结构状态的评价 |
| 2.3 WB法对外周棕色脂肪组织线粒体产能相关酶学系统的评价 |
| 3 下丘脑与棕色脂肪基因表达对线粒体产能调控机制研究 |
| 3.1 RT-PCR法对棕色脂肪调控产能代谢基因表达量的研究 |
| 3.2 RT-PCR法对下丘脑调控产能代谢基因表达量的研究 |
| 4 外周棕色脂肪线粒体自稳态调控能力比较 |
| 4.1 Elisa法对外周棕色脂肪组织i NOS含量检测实验 |
| 4.2 WB法对外周棕色脂肪组织线粒体自噬水平相关蛋白的检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 实验结果总结 |
| 5.2 实验结果讨论 |
| 第五章 子代肾阳虚体质大鼠与正常大鼠能量代谢差异研究 |
| 1 样本采集与脊间棕色脂肪指数测量 |
| 2 外周棕色脂肪线粒体能量代谢比较 |
| 2.1 Elisa法对外周棕色脂肪组织ATP含量检测实验 |
| 2.2 电镜扫描法对外周棕色脂肪组织线粒体微观结构状态的评价 |
| 2.3 WB法对外周棕色脂肪组织线粒体产能相关酶学系统的评价 |
| 3 下丘脑与棕色脂肪基因表达对线粒体产能调控机制研究 |
| 3.1 RT-PCR法对棕色脂肪调控产能代谢基因表达量的研究 |
| 3.2 RT-PCR法对下丘脑调控产能代谢基因表达量的研究 |
| 4 外周棕色脂肪线粒体自稳态调控能力比较 |
| 4.1 Elisa法对外周棕色脂肪组织i NOS含量检测实验 |
| 4.2 WB法对外周棕色脂肪组织线粒体自噬水平相关蛋白的检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 实验结果总结 |
| 5.2 实验结果讨论 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述:肾阳虚现代研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件一:大鼠肾阳虚体质评价量表 |
| 附件二:能量代谢调控相关基因溶解曲线图和扩增曲线图: |
| 附件三:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（3）PinX1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用及其在细胞周期中的定位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 乳腺癌 |
| 1.1.2 端粒与端粒酶 |
| 1.2 PinX1基因的研究进展 |
| 1.2.1 PinX1的生物功能 |
| 1.2.2 PinX1与肿瘤的关系 |
| 第二章 PinX1基因真核表达载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 过表达PinX1对MCF-7细胞株的影响分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 PinX1基因在不同细胞周期的表达量和定位分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 英文缩写词表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（4）PINX1与肝癌临床病理特性的相关性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目次 |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病例及临床资料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 缓冲液及溶液配制 |
| 1.5 DNA抽提及处理 |
| 1.6 聚合酶链反应 |
| 1.7 单链构象多态性分析 |
| 1.8 银染 |
| 1.9 MSI和LOH判断标准 |
| 1.10 Envision免疫组织化学染色 |
| 1.11 免疫组织化学图像判断标准 |
| 1.12 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色结果 |
| 2.2 LOH和MSI检测分析结果 |
| 2.3 PINX1蛋白免疫组织化学染色结果 |
| 2.4 PINX1蛋白与LOH及MSI关系 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：PINX1基因研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间主要科研成果 |
（5）苦参素抗肝癌作用研究（论文提纲范文）
| 1 抗肝癌作用机制研究 |
| 1.1 抑制肝癌细胞增殖 |
| 1.2 抑制端粒酶的活性 |
| 1.3 促进肝癌细胞凋亡 |
| 1.4 诱导肝癌细胞分化 |
| 1.5 阻滞细胞周期的进程 |
| 1.6 抑制肝癌的血管内皮细胞增殖 |
| 1.7 调节宿主免疫功能 |
| 1.8 逆转肝癌细胞多药耐药性 |
| 2 抗肝癌作用实验研究 |
| 2.1 体外实验研究 |
| 2.2 体内实验研究 |
| 2.2.1 苦参素预防或延缓大鼠肝癌发生 |
| 2.2.2 苦参素抗移植人肝癌作用 |
| 3 抗肝癌作用的临床应用研究 |
| 3.1 与放化疗药物联合应用可减轻放化疗的不良反应 |
| 3.2 苦参素与其他疗法联用提高疗效 |
| 4 总 结 |
（6）苦豆碱抗结肠癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 课题背景 |
| 一、结直肠癌的中西医研究现状及与炎症的关系 |
| 1.结直肠癌的流行病学研究 |
| 2.结直肠癌的病因病机研究 |
| 3.结直肠癌的现代治疗方法 |
| 4.中医的认识和治疗 |
| 5.展望 |
| 二、苦豆子生物碱抗癌研究现状 |
| 1.苦豆子总碱 |
| 2.苦参碱与氧化苦参碱 |
| 3.槐果碱 |
| 4.槐定碱 |
| 三、IL-6/JAK-STAT3信号通路与结直肠癌关系的研究进展 |
| 本研究工作基础及技术路线 |
| 技术路线 |
| 第二章 苦豆碱抗结肠癌的体外实验 |
| 2.1 苦豆碱对消化系肿瘤细胞株的增殖抑制作用考察 |
| 2.2 苦豆碱对人结肠腺癌细胞株SW480的增殖抑制作用 |
| 2.3 苦豆碱诱导人结肠癌细胞凋亡的体外实验 |
| 第三章 苦豆碱抗结肠癌体内实验 |
| 3.1 昆明种小鼠急性毒性实验 |
| 3.2 苦豆碱对S180荷瘤小鼠抑制作用及机制考察 |
| 3.3 苦豆碱对裸鼠人结肠癌移植瘤的抑制作用 |
| 第四章 苦豆碱诱导结肠癌细胞凋亡的机制研究 |
| 4.1 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 4.2 荧光实时定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、BaX、STAT3、STAT5 |
| 4.3 免疫印迹法检测JAK-STAT家族蛋白表达 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（7）携带mIFN-γ基因的溶瘤病毒治疗消化系恶性肿瘤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 病毒治疗的进展 |
| 1.2 端粒酶与肿瘤 |
| 1.3 干扰素-γ抗肿瘤进展 |
| 1.4 肿瘤治疗的新模式:基因病毒治疗 |
| 参考文献 |
| 第二章 携带mIFN-γ的溶瘤病毒治疗消化系恶性肿瘤细胞的体外实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 携带mIFN-γ基因的溶瘤病毒治疗肝癌的体内实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 博士期间发表和待发表论文 |
| 缩略词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（8）端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究（论文提纲范文）
| 主要名词的中英文对照缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 端粒酶与大肠癌相关性研究 |
| 前言 |
| 第一章 端粒酶活性与大肠癌相关性研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 端粒酶催化亚基与大肠癌预后因素分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 靶向hTERT基因的RNAi真核表达载体的构建和鉴定 |
| 技术路线 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 RNAi沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响 |
| 技术路线 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌移植瘤的动物实验研究 |
| 技术路线 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 研究的创新性 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 综述 |
| 综述1：大肠癌的治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述2：RNA干扰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞的抗癌作用及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 中药以端粒酶为靶点治疗大肠癌的研究进展 |
| 1.端粒及端粒酶 |
| 2.端粒酶与大肠癌的相关性 |
| 3.端粒酶在中药治疗大肠癌中的研究进展 |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 表型遗传修饰对大肠癌端粒酶的调节作用的研究 |
| 1 端粒和端粒酶 |
| 2 hTERT的甲基化调节 |
| 3 hTERT的乙酰化调节 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第三章 黄连和吴茱萸及其有效成分小檗碱和吴茱萸碱抗肿瘤的研究概况 |
| 1.黄连及其有效成分小檗碱抗肿瘤作用 |
| 2.吴茱萸及其有效成分吴茱萸碱抗肿瘤的作用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 研究目的、内容和意义 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究内容 |
| 3.研究意义 |
| 实验技术路线图 |
| 第二章 HT29细胞的培养 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.常用溶液的配制 |
| 3.实验方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞的生长抑制和细胞凋亡的作用 |
| 引言 |
| 1.实验材料与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学处理 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响 |
| 引言 |
| 1.实验材料与试剂的配制 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响 |
| 引言 |
| 1.实验材料和试剂的配制 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1.本实验研究结果表明 |
| 2.不足之处 |
| 3.展望 |
| 第三部分 附录 |
| 致谢 |
（10）胃癌前期病变中医证治及相关基础研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第一章 胃癌前期病变研究概况 |
| 第一节 问题的提出 |
| 第二节 研究背景 |
| 第三节 工作假说 |
| 第四节 研究思路和设计 |
| 第二章 胃癌前期病变中医证候学研究 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 结果 |
| 第三章 v益气(养阴)行消法对胃癌前期病变临床治疗研究 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第四章 益气(养阴)行消法对胃癌前期病变 |
| 第一节 胃癌前期病变与端粒酶活性关系及中药 |
| 千预作用的研究 |
| 第二节 胃癌前期病变与细胞增殖和细胞凋亡关系及 |
| 中药干预作用的动态研究 |
| 第五章 讨论 |
| 第一节 胃癌和胃癌前期病变 |
| 第二节 中医对胃癌前期病变的认识 |
| 第三节 益气养阴行消法治疗胃癌前期病变 |
| 第四节胃癌前期病变端粒酶活性及益气养阴行消法 |
| 对其干预作用 |
| 第五节益气养阴行消法对胃癌前期病变细胞增殖与 |
| 细胞凋亡的干预作用 |
| 第六节重视中医药对胃癌前期病变的防治研究 |
| 附图 |
| 后记 |
| 致谢 |
四、端粒酶与消化系肿瘤相关性研究进展（论文参考文献）
- [1]基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制[D]. 熊佳惠. 广西中医药大学, 2020(02)
- [2]基于先天禀赋的肾阳虚体质大鼠模型构建与能量代谢调控机制研究[D]. 史年刚. 成都中医药大学, 2019(04)
- [3]PinX1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用及其在细胞周期中的定位研究[D]. 梁桑华. 南方医科大学, 2013(03)
- [4]PINX1与肝癌临床病理特性的相关性研究[D]. 于秀石. 杭州师范大学, 2012(12)
- [5]苦参素抗肝癌作用研究[J]. 向发良,黄赞松. 医学综述, 2011(19)
- [6]苦豆碱抗结肠癌的作用及机制研究[D]. 焦河玲. 南方医科大学, 2011(04)
- [7]携带mIFN-γ基因的溶瘤病毒治疗消化系恶性肿瘤的实验研究[D]. 彭林辉. 南方医科大学, 2011(04)
- [8]端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究[D]. 葛莲英. 广西医科大学, 2010(10)
- [9]吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞的抗癌作用及机理研究[D]. 常金荣. 广州中医药大学, 2007(06)
- [10]胃癌前期病变中医证治及相关基础研究[D]. 刘华一. 天津中医学院, 2004(01)