一、野生小鼠体外受精技术实验初探（论文文献综述）
王芳[1]（2021）在《利用单碱基编辑系统构建早衰症非人灵长类模型》文中认为如何做到抵抗衰老,延年益寿是人类发展历史上经久不衰的话题。机体的衰老可分为正常衰老和病理性衰老。在病理性衰老中,属于单碱基突变的罕见遗传病的早衰症（HGPS,Hutchinson-Gilford progeria syndrome）一直受到研究者的重点关注。早衰症的致病原因是位于人类一号染色体上负责编码细胞核核纤层蛋白的LMNA基因的编码区域的第1824位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶。核纤层蛋白在维持细胞结构,有丝分裂,染色体凝集等方面发挥重要作用。LMNA（c.1824C>T）的突变会导致lamin A/C的m RNA发生错误剪切,引起毒性蛋白progerin的积累,最终诱发早衰症。另外,LMNA（c.357-2A>G）的突变会引起LMNA基因2号外显子缺失诱发扩张型心肌病（DCM,Dilated cardiomyopathy）。因为非人灵长动物与人类在遗传背景上具有高度的相似性,所以成功构建出非人灵长类动物疾病模型可以极大地推动人们对于遗传疾病致病机理与基因治疗的研究进程。作为CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系统的衍生物,单碱基编辑器由单切Cas9酶（nick Cas9,n Cas9）和脱氨酶组成。目前单碱基编辑器可分为两个大类,诱导胞嘧啶突变为胸腺嘧啶的胞嘧啶单碱基编辑器和诱导腺嘌呤突变为鸟嘌呤的腺嘌呤单碱基编辑器。与传统的利用同源重组引入碱基突变相比,单碱基编辑器具有易操作,效率高的优势。本研究前期通过显微注射的手段分别将胞嘧啶单碱基编辑系统和腺嘌呤单碱基编辑系统注射到食蟹猴胚胎,获得LMNA（c.1824C>T）的HGPS食蟹猴胚胎模型和LMNA（c.357-2A>G）的DCM食蟹猴胚胎模型,成功建立了非人灵长类胚胎靶向基因位点的单碱基编辑方法学。后期,通过移植经过BE4max编辑的食蟹猴胚胎,本研究成功获得了5只存在LMNA（c.1824C>T）突变的新生小猴。通过蛋白检测相关实验,本研究证实HGPS模型猴全身多组织表达早衰progerin蛋白。临床表型观察证实HGPS模型猴在刚出生时和临床早衰患儿一样并无异常,但随着时间推移,早衰症小猴逐渐表现出脱发,骨骼发育异常,生长发育滞后等临床病症。组织病理学分析证实了HGPS模型猴出现皮肤老化,脂肪代谢异常和动脉粥样硬化早期症状。转录组分析数据显示HGPS模型猴的上调差异基因主要集中在免疫应答及细胞因子与细胞因子受体相互作用通路。相较于已有的HGPS动物模型,本研究构建的HGPS模型猴更全面且较高水平地模拟了临床早衰症患儿。综上所述,本论文研究证实了单碱基编辑器在构建非人灵长类动物疾病模型上的可行性和安全性。并且,本研究构建出的HGPS模型猴将为后续早衰症的机制研究和治疗,以及正常衰老的机制研究提供强有力的平台。
曹兰蕊[2]（2021）在《MAPK信号通路及转录因子TCF12在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的功能研究》文中认为哺乳动物卵泡生长过程中,卵母细胞转录翻译活跃,胞质中转录并积累大量的母源性m RNA和蛋白质,至卵母细胞生长完全,染色质凝集为染色体,卵母细胞转录沉默。卵母细胞减数分裂恢复、成熟及合子基因组激活前的胚胎发育都受胞质中的母源物质调控,但母源转录本的调节机制及功能研究一直存在很多空白。MPF和MAPK信号通路在调控减数分裂细胞周期进程中发挥重要作用,MPF由CDK1和cyclin B1两部分组成,MAPK信号通路由MOS、MEK1/2和ERK1/2三级激酶组成。MPF和MAPK信号通路的激活分别依赖母源Ccnb1（编码cyclin B1蛋白）和Mos转录本翻译激活。母源m RNA的胞质腺苷酸化通常由ERK1/2磷酸化降解CPEB1所介导,但MPF调控减数分裂恢复和MOS蛋白积累发生在MAPK信号通路激活前,且MPF和MAPK的活性互相影响,Ccnb1和Mos m RNA翻译激活的机制一直不清楚。另一方面,碱性螺旋环螺旋转录因子家族是真核生物中广泛分布的一类转录因子,参与生长发育等诸多生理过程。E protein是其中的一个重要分支,由其中TCF4、TCF3以及TCF12共同组成。纯合突变Tcf12会造成严重的产后致死。我们以小鼠为模式生物分别研究了MAPK信号通路对细胞周期相关转录本翻译激活的调控机制以及TCF12介导的母源转录本积累在雌性生殖中的功能。本研究发现Ccnb1含长3’-UTR转录本减数分裂恢复后的翻译激活依赖ERK1/2活性。在减数分裂恢复前已经有少量ERK1/2激活,提前激活GV期卵母细胞的MAPK信号通路能促进Ccnb1的翻译和减数分裂成熟。抑制或激活CDK1活性同样影响Ccnb1翻译,说明二者均参与调控Ccnb1long 3’-UTR转录本的翻译激活。CDK1促进CPEB1发生磷酸化,但CPEB1降解只受ERK1/2调控。另外,Mos翻译同样受ERK1/2和胞质腺苷酸化元件调控。即卵成熟过程中,激活的ERK1/2协同CDK1以正反馈的方式调控母源m RNA翻译激活,推动细胞周期进程。另外,我们利用在原始卵泡的卵母细胞中特异性表达的Gdf9-Cre,我们研究了转录因子Tcf12介导的母源转录积累对雌性生殖的作用。研究发现,TCF12是一种特异性在生长阶段卵母细胞细胞核中表达丰富的转录因子。TCF12通过功能结构域识别结合靶基因,调控靶基因转录活性。母源性敲除Tcf12的雌鼠几乎不育。Tcf12虽然不参与调控减数分裂细胞周期过程,对受精及植入前胚胎发育必需。一方面,Tcf12通过调控生长阶段Astl的表达影响皮质颗粒的定位,保障受精作用正常发生。另一方面,Tcf12可能通过调控Arpp19表达稳定蛋白磷酸酶活性。Tcf12敲除造成有丝分裂过程中对PP2A活性的抑制作用不足,受精卵的有丝分裂细胞周期延长。母源敲除Tcf12的二细胞存在过度的组蛋白H3K27三甲基化修饰,合子基因组不能正常激活,发育过程中敲除胚胎会逐渐失去发育潜能。这些结果阐明了Tcf12介导的母源效应对早期胚胎发育的影响。本研究不仅揭示了卵成熟过程中激酶对细胞周期相关母源转录本的翻译激活作用,还证明了转录因子介导的母源积累对生育力维持的重要作用,系统地研究了卵母细胞生长成熟及早期胚胎中的转录组调节以及这些调节方式对雌性生殖的重要作用,为临床上不孕不育问题及辅助生殖技术进步提供新的理论依据。
于梦汝[3]（2020）在《体外助孕受精和胚胎发育异常的临床及基因筛查相关研究》文中研究指明第一章体外受精异常患者的临床相关研究第一节体外受精患者无可移植胚胎的原因分析研究目的:体外受精（in vitro fertilization,IVF）和/或卵子胞质内单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）无可移植胚胎包括以下几种情况:卵母细胞激活失败、卵母细胞受精异常（即受精失败和多精受精）、受精卵分裂停滞和胚胎质量差。导致受精异常的因素多为卵子和/或精子的结构及功能紊乱。本章节拟对无可移植胚胎患者的临床资料进行回顾分析,以探究IVF和/或ICSI患者无可移植胚胎的发生原因及相关因素。研究方法:本研究纳入接受IVF和/或ICSI治疗的241例无可移植胚胎患者作为研究对象;选择同期就诊,首次行IVF和/或ICSI助孕鲜胚移植,并获得足月活产儿的1048例患者作为对照。收集患者数据,运用统计学方法比较无可移植胚胎组与对照组的一般资料和临床数据,并通过二元logistic回归分析可能对无可移植胚胎产生影响的相关因素。研究结果:我们发现体外受精无可移植胚胎的患者中包括完全受精失败、部分受精失败、受精卵非2PN受精、卵裂障碍及胚胎质量差的患者分别为33例（13.7%）、38 例（15.8%）、40 例（16.6%）、49 例（20.3%）和 81 例（33.6%）。无可移植胚胎组与对照组相比,夫妻双方一般情况、病史、临床特征、促排方案和助孕结局均有统计学差异。相比于对照组,无可移植胚胎组女方较为年轻（31.21±3.96 vs 32.1±4.28,P<0.05）,无排卵/排卵障碍、子宫内膜异位症、复发性流产史/人工助孕失败史和不明原因所致不孕的患者比例高（9.54%vs 2.77%,P<0.05;4.98%vs 3.15%,P<0.05;12.97%vs 5.91,P<0.05;和 7.88%vs 1.81%,P<0.05）,男方因素导致不孕的患者比例低（10.37%vs 30.06%,P<0.05）,AFC较少[12（9-18）vs 14（11-18）,P=0.004],但仍处于正常范围。与对照组相比,无可移植胚胎组采取的促排卵方案中长方案所占比例较低（41.91%vs 51.53%,P<0.05）、拮抗剂方案所占比例较高（28.22%vs 19.66%,P<0.05）,且HCG日获得直径大于14mm的卵子数少[8（5-12）vs 10（7-12）,P<0.05]。无可移植胚胎组的男方年龄略小（31.94±4.63 vs 32.95±5.23,P=0.033）;精液指标好:精液浓度和前向运动精子百分率分别为4.65±1.58 vs 3.76±1.83（P<0.05）和[40（30-45）vs 10（1-37）,P<0.05]。无可移植胚胎组获卵数、形成2PN受精卵数和卵裂数均明显少于对照组,分别为[8（4-13）vs 10（7-13）,P<0.05]、[4（2-7）vs 7（5-10）,P<0.05],和[2（1-5）vs 6（4-9）,P<0.05]。而无可移植胚胎组的非2PN受精卵数多于对照组[1（0-3）vs 1（0-2）,P<0.05]。通过二元Logistic回归,分析预测因素对无可移植胚胎的影响。经校正后,发现复发性流产史/人工助孕失败史（OR=3.007,95%confidence interval[CI]:1.406-3.606,P=0.007）、不明原因不孕史（OR=4.594,95%CI:1.566-13.478,P=0.005）、拮抗剂方案促排（OR=1.953,95%CI:1.038-3.675,P=0.083）和非 2PN 受精卵数（OR=1.300,95%CI:1.114-1.516,P=0.001）等因素与无可移植胚胎结局呈强正相关;卵裂数（OR=0.716,95%CI:0.599-0.857,P<0.001）和优胚数（OR=0.200,95%CI:0.154-0.26,P<0.001）与无可移植胚胎结局呈负相关。结论:本研究探讨了无可移植胚胎发生的原因及其相关因素,发现胚胎质量差者为无可移植胚胎结局的主要原因。有复发性流产史/人工助孕失败史和不明原因不孕史的患者、应用拮抗剂方案促排的患者,非2PN受精比例高的患者,及卵裂数和优胚数少的患者发生无可移植胚胎的风险增加。第二节IVF患者受精失败的原因及行补救性ICSI的妊娠结局分析研究目的:体外受精失败发生的主要原因可概括为以下两类:精子不能成功结合或注入卵母细胞;卵母细胞内部结构异常或激活异常而导致的受精停滞。而ICSI的原理是让精子绕过生物屏障机械穿透卵母细胞膜,因此对于受精失败患者可采取的补救方式首选ICSI。本节旨在探讨IVF受精失败患者的临床特征和发生原因,及补救性ICSI对其妊娠结局的改善情况。研究方法:本研究纳入844例IVF周期受精失败患者和13442例受精正常患者作为研究对象,回顾性分析两组的异同,并对行补救性ICSI后的妊娠结局指标进行统计分析。研究结果:与对照组相比,受精失败组的原发不孕患者、男方因素和不明原因所致不孕患者的比例较高,具有统计学差异（69.11%vs 49.00%,P<0.05;6.39%vs 2.63%,P<0.05;37.04%vs 27.37%,P<0.05）。受精失败组男方的前向运动精子百分率低于对照（37.42±15.80 vs 42.92±14.44,P<0.05）。对比两组的促排卵数据,我们发现受精失败患者的短方案应用比例低（17.28%vs 21.15%,P<0.05）,HCG日子宫内膜偏厚（1.13±0.16 vs 1.10±0.20,P<0.05）。比较两组的实验室数据后发现,受精失败组获卵数、IVF所获2PN受精卵数和优胚数显着少于对照组,分别为[11（8-15）vs 12（8-16）,P<0.05]、[0（0-1）vs 7（4-11）,P<0.05]和[3（2-4）vs 4（2-6）,P<0.05]。通过分析比较实施补救性ICSI后受精失败组与对照组的妊娠结局,发现二组的临床妊娠率、早期流产率和活产率均无显着性差异（53.15%vs 53.43%,P=0.931;14.07%vs 14.95%,P=0.778;48.26%vs 45.38%,P=0.452）,但D3优胚率和着床率低于对照组（42.11%vs 55.29%,P<0.05;33.73%vs 38.73%,P<0.05）。结论:本研究结果提示原发性不孕、不明原因不孕、前向运动精子百分率低及促排卵后获卵数少可能导致体外受精失败的发生。补救性ICSI手段可有效挽救该类患者的助孕结局。第二章IVF受精失败和多精受精患者中的IZUMO1R基因突变筛查研究目的:第一章的研究提示少部分不孕患者在接受体外受精治疗时会出现异常受精的情况。既往研究发现与精子表面IZUMO1蛋白相结合的卵膜蛋白JUNO（IZUMO1R）参与了精卵识别及多精受精的膜关闭过程。因此,本研究对体外异常受精患者的IZUMO1R基因的全外显子进行测序,期望为临床诊疗提供参考。研究方法:本研究募集IVF治疗中发生完全/部分受精失败的患者215例,多精受精患者330例,和正常受精患者300例作为研究对象。提取其外周静脉血DNA,对IZUMO1R基因的外显子及其侧翼序列进行PCR扩增并测序,分析测序结果。研究结果:异常受精患者的IZUMO1R基因的测序结果显示:2例受精失败患者中发现位于第4外显子的非同义SNP rs76779571（c.510T T>G,p.His170Gln）;3例多精受精患者中发现位于第1外显子的非同义SNP rs61742524（c.9C>G,p.Cys3Trp）,位于启动子区域的同义 SNP rs76781645（c.-18G>T）和位于第2内含子的同义SNP rs377369966（c.329+8G>T）。其中错义突变c.510TT>G编码的氨基酸参与GPI锚定受体的构成,Polyphen-2软件预测结果显示,该突变可能具有致病风险。在多精受精患者中发现的非同义SNPc.9C>G（p.Cys3Tr）,经预测可能无致病性。结论:本研究发现的IZUMO1R基因错义突变可能与受精失败和多精受精的发生相关。第三章WEE2基因突变在受精失败发病机制中的作用研究第一节反复体外受精失败患者中的WEE2基因突变筛查研究目的:5-10%的女性不孕是由遗传因素引起的,如染色体畸变、单/多基因突变和多态等。由WEE2基因编码的蛋白激酶WEE2又称WEE1B,隶属WEE激酶蛋白家族,参与调控卵母细胞从减数分裂转换为有丝分裂的进程,WEE2基因的纯合突变可能导致卵母细胞受精失败。因此,本研究对体外受精治疗中表现为反复体外受精失败的患者进行WEE2基因测序,期望为这些患者提供可能的分子遗传学诊断依据。研究方法:本研究纳入行体外受精治疗中反复出现异常受精的25例患者作为研究对象,提取其外周静脉血DNA,对WEE2基因的外显子及其侧翼序列进行测序分析。研究结果:分析25例反复受精失败者的测序结果发现,1例患者携带WEE2基因的复合杂合突变[c.416 C>T（p.Thr139Ile）和 c.585G>C（p.Lys195Asn）],1例患者携带WEE2基因的纯合突变[c.821G>A（p.Arg274His）]。以上3个变异位点在不同物种间高度保守,经疾病数据库预测3个变异点均具有致病性。结论:WEE2的纯合错义突变及复合杂合突变与反复体外受精失败有关,本研究扩展了WEE2基因的突变谱,为反复体外受精失败患者的临床诊疗提供了新的参考。第二节Wee2基因敲除小鼠的模型研究研究目的:Wee2基因参与哺乳动物卵母细胞的成熟及受精过程,是卵母细胞减数分裂成熟促进因子（maturation-promoting factor,MPF）和细胞静止因子（cytostatic factor,CSF）调控通路的重要分子。在我中心的前期研究中发现WEE2基因纯合及复合杂合突变与反复体外受精失败的发生有关,但携带该基因变异患者的卵母细胞减数分裂进程表型不一。小鼠的Wee2基因与人类该基因序列高度同源。因此,为进一步探究WEE2基因变异在体内的作用机制,我们构建Wee2基因敲除小鼠模型,探索Wee2基因敲除后小鼠的表型及其对卵母细胞发育和受精功能的影响。研究方法:本研究采用CRISPR/Cas9技术获得的C57BL/6品系Wee2基因敲除小鼠作为研究对象,鉴定其基因型,检测Wee2--雌鼠不同组织器官中Wee2基因mRNA水平的转录情况,观察杂Wee2+/-和We e2-/-雌鼠的生育力,并通过小鼠卵巢切片HE染色对比Wee2+/-和Wee2-/-雌鼠的卵巢及卵母细胞的形态。研究结果:本研究繁育出Wee2+/-和Wee2-/-小鼠,检测发现Wee2-/-雌性小鼠的Wee2基因的mRNA的表达明显降低。Wee2-/-雌鼠的生育力与Wee2+/-相比略有下降,但每窝产仔数和子代存活率无显着性差异。对8周龄Wee2+/-和Wee2-/-雌鼠的卵巢组织切片行HE染色,观察发现二者的卵巢及卵母细胞形态无明显差异。结论:研究结果提示Wee2基因敲除雌性小鼠的生育力及卵巢和卵母细胞形态无显着改变。
康宇[4]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中研究说明哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
王芳[5]（2020）在《孕酮脂联素受体7在小鼠生殖中的作用》文中研究表明背景:孕酮-脂联素受体7（progestin–adiponectin Q receptor 7,PAQR7）是一类新命名的膜受体家族PAQR的孕酮受体亚群中的重要家族成员。PAQR7最初在海鳟鱼卵巢中克隆。它具有典型的G蛋白偶联受体的7次跨膜结构,与抑制性G蛋白偶联,调控腺苷酸环化酶活性,作为孕酮膜受体参与孕酮介导的卵细胞成熟。PAQR7也存在于海鳟鱼精子中,与一种嗅觉相关的兴奋性G蛋白(Golf)偶联,介导孕酮诱导的精子超活化运动。这些结果说明PAQR7在鱼类生殖中扮演重要角色。此外,PAQR7在小鼠和人的生殖组织中高表达,但其在哺乳动物生殖中的作用尚不清楚。实验目的:本文旨在利用小鼠PAQR7基因敲除模型揭示PAQR7在小鼠生殖中的作用。实验方法:1.通过实时荧光定量PCR检测PAQR7在小鼠各种组织的表达情况。2.通过免疫印迹检测PAQR7在小鼠精子、睾丸和卵巢中的表达情况。3.通过PAQR7抗体检测其对小鼠精子运动和体外受精的影响。4.通过（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/cas9,CRISPR/cas9）基因编辑技术构建PAQR7全身性敲除的C57/BL6J小鼠,通过基因型鉴定,实时荧光定量PCR和免疫印迹以及免疫荧光验证敲除结果。5.对PAQR7敲除小鼠进行表型鉴定:（1）不同基因型小鼠进行合笼,观察其生育表型;（2）通过体外受精技术检测生育表型;（3）计算机辅助分析仪检测小鼠精子运动相关参数;（4）对睾丸,精子,卵巢进行形态学观察,天平称量睾丸,卵巢质量;（5）苏木素-伊红组织化学染色评估其生殖组织生理状态;（6）酶联免疫分析检测雌鼠外周血中激素水平的变化。6.实时荧光定量PCR分别检测雌性和雄性不同基因型小鼠PAQR7家族中孕酮亚家族成员以及孕酮受体家族的表达情况。7.实时荧光定量PCR分别检测雌性和雄性不同基因型小鼠中生殖相关基因表达情况。实验结果:1.实时定量PCR结果表明PAQR7在小鼠睾丸和卵巢中高表达。2.通过免疫印迹在小鼠睾丸、卵巢和精子的总蛋白和膜蛋白中均能检测到PAQR7。3.PAQR7特异性抗体能够抑制小鼠精子前向运动（P<0.05）,显着降低体外受精成功率（P<0.05）。4.利用CRISPR/cas9基因编辑技术成功构建了全身性PAQR7敲除小鼠。纯合敲除小鼠PAQR7-/-缺失了PAQR7基因的第三个外显子中812bp,导致移码突变翻译提前终止,预测翻译蛋白质缺失39-345氨基酸序列（野生型PAQR7具有345氨基酸）。5.（1）合笼结果显示PAQR7-/-雄鼠生育能力未受影响,但PAQR7-/-雌鼠与野生型雄鼠或PAQR7-/-雄鼠合笼后的平均胎数与平均每胎只数均显着下降（P<0.05）;（2）体外受精的结果显示PAQR7-/-雌鼠卵与野生型雄鼠精子或PAQR7-/-雄鼠精子在体外受精过程中受精率显着降低（P<0.05）;（3）计算机辅助精子分析仪检测结果显示PAQR7-/-雄鼠精子浓度,总活力,前向运动率、运动速率、头部侧摆幅度均显着下降（P<0.05）;而摆动性显着升高（P<0.05）;（4）睾丸,卵巢以及精子的形态学结果显示PAQR7-/-雄鼠睾丸质量显着降低（P<0.05）,睾丸系数下降（P<0.05）,卵巢变小,精子折尾畸形明显,折尾率显着高于野生型小鼠（P<0.05）;（5）苏木素-伊红组织化学染色结果显示PAQR7-/-雄鼠睾丸的部分曲细精管出现空腔,PAQR7-/-雌鼠卵巢内有腔卵泡数量减少,原始卵泡,黄体数量升高,大部分卵泡呈现闭锁和凋亡状态;（6）PAQR7-/-雌鼠血清中抗穆勒氏管激素和雌二醇激素显着低于野生型小鼠,孕酮和卵泡刺激素的水平与野生型相比没有统计学差异（P>0.05）。6.实时荧光定量PCR结果显示PAQR7-/-雄鼠睾丸中孕酮受体PGRMC1、PGRMC2、NENF表达量显着升高（P<0.05）,CYB5D2显着降低（P<0.05）,PAQR家族孕酮受体亚家族成员PAQR5、PAQR6、PAQR8、PAQR9的表达量显着降低（P<0.05）,孕酮核受体PGR表达量没有统计学差异;PAQR7-/-雌鼠卵巢中孕酮受体相关蛋白PGR、NENF、PAQR5、PAQR6、PAQR8、PAQR9的表达量对比野生型显着升高（P<0.05）,PGRMC1、PGRMC2、CYB5D2没有统计学差异。7.PAQR7-/-雄鼠睾丸中精子发生,运动及形态相关基因Spata25、Tex19.2、Znrf4、Tssk6、InsI3表达量显着降低（P<0.05）;PAQR7-/-雌鼠卵巢中卵泡生长,卵巢发育以及正常受精密切相关基因DMC1、POU5F1、GDF-9、ZP3、SYCP3、NOBOX表达量显着降低（P<0.05）。结论:PAQR7在小鼠生殖过程中起到非常重要的作用,对小鼠精子发生,形态,运动以及卵巢功能的维持至关重要。
陈莹[6]（2020）在《Trpv1通道在斑马鱼精子中的表达与功能研究》文中指出精子对环境因素的变化非常的敏感。而离子通道作为细胞膜上能够对外界环境刺激做出反应的关键蛋白质分子,在精子功能的调控中扮演了非常重要的角色。在许多物种中,例如哺乳动物、海胆等,通过离子通道调节精子功能的研究在雄性生殖领域已经得到了人们越来越多的关注。然而,鱼类精子中功能性离子通道的鉴定与研究却非常有限。本研究发现钙通道抑制剂能够抑制斑马鱼精子的运动,而钾通道抑制剂却对其精子运动没有抑制效果。进一步的研究发现,斑马鱼精子的运动不仅受到瞬时电位香草素受体（Trpv1）拮抗剂钌红的抑制,而且在活力较低时还能够被该通道的激动剂2-APB恢复运动,提示在斑马鱼精子中可能存在有功能性的Trpv1通道。而Western blot和免疫荧光的结果,则证实了 Trpv1通道主要表达分布于斑马鱼精子的颈部和尾部。与此同时,体外受精的结果表明,使用Trpv1通道的抑制剂抑制斑马鱼精子的运动能够降低其受精率。由于本研究中的药理学实验使用的并非是Trpv1通道的特异性抑制剂和激动剂,因此,为了证实上述实验结果的可靠性,本研究希望通过构建trpv1-/-纯合子斑马鱼模型能够对上述结果做进一步的验证。在斑马鱼trpv1基因第五外显子上选取了敲除靶点GGCGGTGGATGTCAGGGAGA,利用Crispr/cas9技术成功构建了trpv1+/-斑马鱼模型,并通过该模型,从431尾trpv1+/-斑马鱼交配得到的后代中筛选获得了 17尾trpv1-/-斑马鱼纯合子(6雄11雌。Western blot和免疫荧光结果证明,在trpv1-/-斑马鱼精子上,Trpv1通道的表达缺失;而药理学实验结果则表明,Trpv1通道的抑制剂和激动剂对trpv1-/-斑马鱼精子的运动没有显着的抑制或者激活效应;并且,对trpv1-/-斑马鱼精子施加钌红亦对其精子的受精率没有显着影响。上述实验结果证实,Trpv1通道的确对斑马鱼精子激活后的运动具有调节作用。综上所述,本研究通过筛选获得的trpv1-/-斑马鱼模型,证实了 Trpv1通道的活性对于斑马鱼精子激活后运动的维持具有重要作用,抑制该通道活性亦将对斑马鱼精子的受精能力产生影响。本研究是为数不多的有关离子通道调节淡水鱼类精子功能的研究,将丰富对淡水鱼类,尤其是对斑马鱼这种淡水硬骨鱼类模式生物的雄性生殖生理机制的认识和了解,并为淡水鱼类的人工繁殖和精子冻存提供新的调控目标。
管彤,徐渴[7]（2020）在《野生小鼠的实验动物化及研究进展》文中指出开展野生小鼠实验动物化以丰富现有实验小鼠品系的基因库,对遗传学、医学等生命科学和人类健康具有重要意义,国内外学者对此进行了不懈的努力。本文拟就野生小鼠实验动物化的重要意义、国内外实验动物工作者近交化培育的成果及对野生来源实验小鼠的研究进展进行阐述。
张帆,安学芳,赵赫,李丽,肖宇宙[8]（2020）在《Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠体外受精实验研究》文中研究说明目的探索两种I型干扰素受体缺失对于小鼠体外受精的影响并对体外受精条件进行优化。方法对两种I型干扰素受体缺失小鼠（IFN-αR-/-、IFN-α/βR-/-）及背景野生型小鼠（C57BL/6）分别进行体外受精及胚胎移植,每组超排5只小鼠,3次重复,记录相关数据,分析干扰素受体缺失是否对小鼠体外受精存在影响。分别将两种I型干扰素受体缺失小鼠配子与C57BL/6小鼠配子进行体外受精杂交试验,每组5只小鼠,3次重复,探讨I型干扰素受体缺失对雌雄配子体外受精的影响。同时,优化体外受精条件,探索提高受精率技术方法,每组5只小鼠,三次重复。结果两种I型干扰素受体缺失小鼠平均体外受精率低于背景品系C57BL/6小鼠,组间差异具有显着性（P<0. 05）。干扰素α受体缺失小鼠体外受精率高于干扰素α、β受体双缺失小鼠体外受精率,组间差异具有显着性（P<0. 05）。两种I型干扰素受体缺失小鼠的精子与C57BL/6小鼠卵细胞体外受精率均高于其卵细胞与C57BL/6小鼠精子的体外受精率,组间差异具有显着性（P<0. 05）。通过延长精子获能时间至1 h或在获能液及受精液中加入1 mmol/L还原型谷胱甘肽（GSH）能够提高体外体外受精率,相应组间差异具有显着性（P<0. 05）。结论 I型干扰素受体缺失可能导致相应品系小鼠体外受精率降低,而且对卵细胞的影响较精子的影响更为显着,通过适当延长精子获能时间或改变获能及受精液成分,能够提高体外受精率。
黄向月[9]（2020）在《特异性KDM2A基因敲除小鼠模型的建立及其对雄性生殖的影响》文中认为精子发生与成熟是影响哺乳动物繁殖效率的主要因素之一。睾丸曲细精管中,雄性生殖细胞经历一系列分化步骤及形态变化形成成熟的雄性配子,此过程通常伴随着表观修饰的调控。组蛋白赖氨酸去甲基化酶是表观修饰的调节因子之一,参与配子形成及胚胎发育等过程。前期研究表明,多个KDMs家族成员参与精子发生及胚胎发育。KDM2A是KDMs家族成员之一,可通过调节H3K36甲基化水平和相关信号通路的表达,对细胞增殖、分化、凋亡和衰老起调控作用,进而影响发育和肿瘤形成。然而,目前关于KDM2A对于精子发生晚期的影响还未见报道。因此,本研究通过qRT-PCR（Real-time quantification PCR,qRT-PCR）、免疫组织化学染色、免疫荧光染色等技术分析KDM2A在睾丸和精子发育中的表达规律,并利用Cre-loxP系统建立精子细胞KDM2A特异性敲除小鼠模型;通过HE染色、体外受精、交配实验以及统计学分析方法比较KDM2A敲除后小鼠睾丸发育、精子成熟以及生育能力的表型变化。结果如下:1.对KDM2A进行组织表达谱分析发现,该基因mRNA在睾丸中高表达,且在睾丸发育中KDM2A的表达呈动态分布,其在睾丸发育前期的表达迅速升高,之后维持相对稳定;2.免疫组化结果显示,睾丸中KDM2A蛋白主要定位于支持细胞及除伸长形精子细胞之外的各级生精细胞中;免疫荧光结果显示,KDM2A蛋白主要定位于精子尾部;KDM2A蛋白在小鼠睾丸发育过程中的表达趋势与qRT-PCR结果吻合;3.建立敲除小鼠模型结果显示,成功获得精子细胞KDM2A特异性敲除（KDM2A cKO）小鼠,qRT-PCR和免疫组化技术等结果显示,敲除效率较高,与对照组差异极显着（P<0.01）;4.睾丸形态及组织结构比较结果显示,KDM2A cKO小鼠的体重、睾丸重量、睾丸系数、睾丸形态大小、组织结构、生精进程以及精子细胞数量与对照组相比,均无显着差异（P>0.05）;5.精子计数及IVF试验结果显示,KDM2A cKO小鼠附睾的精子数量与KDM2Afl/fl小鼠相比略有降低,但无统计学意义（P>0.05）,单个精子形态也无显着异常;将精子进行体外受精发现,受精卵的卵裂率与囊胚率均与对照组无明显差别（P>0.05）,揭示精子细胞KDM2A特异性敲除后对小鼠精子数量、质量和体外受精能力无显着影响（P>0.05）;6.交配实验结果显示,与对照组相比,KDM2A cKO雄鼠的平均产仔数和窝数均有下降,但无统计学差异（P>0.05）,表明KDM2A敲除后对雄性小鼠生育能力无显着影响。综上,本试验检测了KDM2A在小鼠睾丸发育及精子成熟过程中的表达谱及亚细胞定位;成功建立了KDM2A特异性敲除小鼠模型,获得精子细胞KDM2A cKO小鼠;通过对KDM2A cKO与KDM2Afl/fl小鼠的睾丸、精子、生育能力等方面检测发现两者均无显着差异,即KDM2A敲除后,雄性小鼠的生殖功能无明显变化。由此推测KDM2A在精子发生前期起重要调控作用,而在精子形成阶段可能不是必不可少的。此外,也可能是由于KDM2A蛋白的H3K36me1/2去甲基化功能在精子发生后期被其亚家族另一成员KDM2B蛋白所替代。因此,采用多基因敲除,即将其亚家族另一成员KDM2B同时在精子细胞中敲除的方法,来探讨该类蛋白的生物学功能及其对精子发生和雄鼠生育能力的影响是较好的途径。
沈娟[10]（2020）在《BPA与TCS对女性生殖的影响及相关分子机制研究》文中研究指明环境内分泌干扰物（Environmental Endocrine Disruptors,EEDs）是一大类可以使人正常内分泌系统功能发生改变的化合物,包括洗涤剂、增塑剂、多氯联苯、药物、农药及塑料等以及其生产过程中的副产品和污染物及其降解产物。因其存在的普遍性和生殖毒性而引起了人们的特别关注。其中双酚A（Bisphenol A,BPA）和三氯生（Triclosan,TCS）,是最常见的两种EEDs。BPA是由丙酮和苯酚合成的2,2-双丙烷,主要作为生产环氧树脂和聚碳酸酯塑料的材料。TCS（5-氯-2苯酚）是一种广谱抗菌剂,广泛应用于家庭、医疗保健和个人护理产品中。BPA和TCS在人体多种体液和组织中可以检测到,包括尿液、血清、卵泡液、唾液、肝脏、脂肪和胎盘组织,大部分吸收的BPA和TCS,在24小时内通过尿液从体内完全清除。研究报道BPA和TCS的化学结构与17β-雌二醇（E2）相似,可以通过与多种雌激素受体结合而表现出弱雌激素活性。然而目前关于BPA对人类生殖影响的人群流行病学研究的结果还存在很大争议。本课题组在2018年首次报道通过建立早孕小鼠染毒模型得出BPA通过ER/SGK1/ENa Cα通路,抑制ENa Cα的表达,从而影响小鼠子宫蜕膜化血管的生成并干扰子宫蜕膜化的进程,从而降低胚胎的种植率。已有研究结果显示TCS可能会导致小鼠胚泡植入中断,并改变胎盘雌激素合成,导致不良妊娠结局。由于缺乏有效的人类流行病学调查研究,TCS与女性生殖结局之间的关系还尚不清楚。体外受精-胚胎移植（in-vitro fertilisation and embryo transfer,IVF-ET）,既可以有效的治疗不孕不育,又能观察卵子成熟、受精、胚胎发育、着床、妊娠维持等女性生殖过程的关键环节,是评估EEDs对人类生殖早期的潜在影响的最佳体内模型之一。近期的一项人群流行病学研究报道,对256名妇女共进行了375个IVF新鲜胚胎移植周期（其中仅有7.1%的参与者因输卵管因素不孕）进行统计学分析后发现BPA暴露对卵巢促排卵结局、胚胎种植率、临床妊娠和活婴出生等IVF结局并没有不良影响,在这个研究中纳入人群的病因组成是杂乱多样,包括男性因素、女性因素（卵巢疾病、子宫疾病、子宫内膜异位症和卵巢储备功能降低）和不明原因不孕等,然而上述不孕因素均影响IVF的结局。因此,本研究的第一部分研究中以单纯输卵管因素不孕且行常规体外受精女性患者为研究对象,检测其取卵日尿液中BPA和TCS的浓度,采用多变量广义线性混合模型（Multivariable generalized linear mixed model）分别分析BPA和TCS与IVF病人促排卵结局和临床结局的相关性,探索BPA和TCS对女性早期生殖结局的影响。结合细胞缝隙连接（Gap junction,GJ）在卵子发育和成熟过程中发挥重要作用,而GJA1（Gap Junction Protein Alpha 1）作为一种跨膜蛋白是缝隙连接的重要组成蛋白。缝隙连接可以存在卵丘细胞最内层和卵母细胞之间,以及相邻的颗粒细胞之间。已有文献报道GJAl-/-的卵巢在体外进行培养,发现卵母细胞生长发生迟缓和卵泡生成受到抑制,GJA1基因已被确定为评估卵母细胞质量一个标志基因。因此,在第二部分研究中,收集取卵日卵泡穿刺液分离培养人颗粒细胞,分别建立BPA10ug/ml处理组和对照组细胞模型,经m RNA microarray生信分析,挑选差异基因GJA1,使用RT-PCR和Western blot分析GJA1分别在人颗粒细胞和KGN细胞的BPA处理后的表达情况;通过染毒小鼠卵巢免疫组化实验和人颗粒细胞免疫荧光实验分别在组织水平和细胞水平检测BPA处理后GJA1蛋白的表达,探索BPA暴露对GJA1表达的影响。使用ELISA分别检测不同浓度BPA暴露后人颗粒细胞和KGN细胞的培养上清中孕激素的表达,分析BPA对细胞合成激素功能的影响。在KGN细胞中,通过使用小干扰siRNA下调GJA1基因的表达后,分析P450Scc、3β-HSD和Star表达在m RNA水平和蛋白水平的变化,探索GJA1是否参与性激素合成关键酶的表达调控。采用焦磷酸测序,对GJA1启动子区的一段富含Cp G岛的序列进行测序,分别对BPA处理组和对照组的甲基化状态进行评估,探索甲基化是否参与调控BPA诱导的GJA1的表达。通过过表达miR-206,探索miR-206在KGN细胞中的功能性作用。最后,通过双荧光素酶报告基因实验,证明miR-206是否通过靶向结合GJA1 3′UTR区,使GJA1的表达发生改变,从而为BPA对卵子发育潜在毒性影响提供科学证据。第一部分BPA与TCS在不孕女性尿液中的浓度及其与IVF结局相关性研究研究目的:观察BPA和TCS在IVF管性不孕女性取卵日尿液中的暴露水平和分布情况,了解BPA和TCS对女性早期生殖过程中潜在的毒性作用。材料和方法:1、通过选择从2013年9月至2016年10月期间,在浙江大学医学院附属妇科医院生殖医学中心接受常规IVF-ET治疗的管性不孕的女性患者351例为研究对象。收集其取卵日手术前的尿液。2、采用高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）来检测尿液中BPA和TCS的水平和分布情况。测定结果进一步使用尿液中肌酐（Creatinine,Cr）的浓度进行标准化,Cr的测定使用碱性苦味算法,用比色法定量。为了校正尿液中BPA和TCS浓度,分析采用Cr校正的BPA/TCS值(1*10-4mg/g Cr)。3、分析尿液中BPA和TCS浓度分组与人口学资料（如:年龄、BMI）和基础生殖指标相关性,采用Kruskal-Wallis检验分析连续型变量,采用卡方（chi-squared）检验分析计数型资料。分别对尿液BPA和TCS浓度分组间,采用均值±标准差/均值（95%置信区间）和频数（百分比）对各指标进行描述性统计。4、将尿液中BPA和TCS浓度从低到高排序,按照四分位法分成四个有序等级,将Q1作为对照组,其余组（Q2、Q3和Q4）分别与Q1进行比较,采用多变量广义线性混合模型（Multivariable generalized linear mixed model）分别分析BPA和TCS对于促排卵结局的相关性（Gn用量、内膜厚度、优势卵泡数、E2peak、获卵数、受精率、卵裂率和优胚率）。5、采用广义线性混合模型分别分析新鲜周期移植和首次冷冻周期移植的临床结局（生化妊娠、临床妊娠、着床率、流产率和活婴出生率）与BPA和TCS的相关性,协变量为年龄,BMI,基础FSH,基础E2和AFC。6、对于BPA和TCS的复合暴露与IVF结局的相关性使用带有交互项的广义线性混合模型进行分析。结果:1、BPA的检出率为83.4%（293/351）,浓度范围为:检测限（limit of detection,LOD）至12.86 ng/ml（49.282 ug/g Cr）,中位数（Q1-Q3）为0.720（0.246-2.021）ug/g Cr,最大值为12.862ng/ml,49.282*10-3mg/g Cr。2、统计显示:尿液中BPA浓度最高组（Q4）中的卵母细胞总数显着低于对照组（Q1）,且差异具有统计学意义。3、在协变量（年龄、体重指数、基础FSH、基础E2和AFC）校正和未校正的分析模型中,E2peak、内膜厚度、优势卵泡数、Gn用量、受精率、卵裂率和优胚率在BPA高浓度组和对照组之间差异均无统计学意义。4、新鲜周期中:在协变量（年龄、体重指数、基础FSH、基础E2和AFC）校正和未校正的分析模型中,在BPA最高浓度组（Q4）种植率显着低于对照组（Q1）,且差异具有统计学意义（p<0.05）,同时临床妊娠率和种植率的总体趋势p<0.05。然而无论是在有无协变量校正下,生化妊娠、流产和活婴出生率在BPA高浓度组和对照组之间差异均没有统计学意义。5、冷冻周期中:无论是在有无协变量校正下,生化妊娠、临床妊娠、种植和活婴出生率在BPA高浓度组和对照组之间差异均没有统计学意义。6、TCS的检出率为94.7%（286/302）,浓度范围为:检测限（limit of detection,LOD）至34.95ng/ml（49.282 ug/g Cr）,中位数（Q1-Q3）为0.894（0.316-3.048）μg/g Cr。7、在协变量校正（年龄、体重指数、基础FSH、基础E2和AFC）及未校正的分析模型中,E2peak、内膜厚度、优势卵泡数、Gn用量、获卵数、受精率、卵裂率和优胚率在TCS高浓度组和对照组之间差异均没有统计学意义。8、在新鲜周期和冷冻周期中:在校正（年龄、体重指数、基线FSH、基线E2和AFC）及未校正的模型中,无论是有无协变量校正下,生化妊娠、临床妊娠、种植、流产和活婴出生率在TCS高浓度组和对照组之间差异均没有统计学意义。9、尿液中BPA与TCS复合暴露,与IVF病人的促排卵结局和临床结局没有相关性。结论:1、BPA暴露可以影响IVF病人卵子的获取、胚胎种植和妊娠的发生。2、TCS暴露对IVF病人的促排卵结局和临床结局无明确影响效应。3、BPA和TCS复合暴露在促排卵和临床结局中均未发现具有协同或拮抗作用。第二部分探索BPA对人颗粒细胞GJA1表达的影响及相关分子机制研究研究目的:分析人颗粒细胞和KGN细胞缝隙连接蛋白基因和甾体激素合成关键酶相关基因表达的改变,探索BPA诱导的相关基因改变的调控机制。材料和方法:1、收集IVF病人取卵日的卵泡穿刺液,使用淋巴细胞分离液分离收获颗粒细胞,用含10%FBS的DMEM-F12培养基培养48h后,进行换液,BPA10ug/ml培养基和0.05%DMSO的培养基继续培养48h,收集细胞,提取总RNA,先行m RNAmicroarray检测（三个独立样本的生物学重复）,并对测序结果进行生物信息学分析,包括KEGG和GO聚类分析,挑选差异基因GJA1。应用RT-PCR和Western blot验证GJA1基因分别在经5种不同浓度的BPA（0.001ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml和10ug/ml）暴露48h的人颗粒细胞和KGN细胞中的表达情况;2、使用流式细胞分析仪和Western-blot分别检测人颗粒细胞在分离培养48h,经BPA（10ug/ml）处理48h后其细胞凋亡百分比和凋亡相关基因蛋白表达水平。3、通过细胞免疫荧光和免疫组化分别在BPA处理后的人颗粒细胞和染毒小鼠的卵巢中检测GJA1蛋白表达水平。4、通过使用小干扰siRNA在KGN细胞中低表达基因GJA1,观察激素合成关键酶P450Scc、Star和3β-HSD表达的变化。5、通过荧光定量RT-PCR和Western-blot方法分别对P450Scc、Star和3β-HSD观察在5种不同浓度的BPA（0.001ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml和10ug/ml）暴露48h后的人颗粒细胞和KGN细胞中的表达情况。6、通过焦磷酸测序的方法评估KGN细胞在BPA处理后基因GJA1启动子区的甲基化修饰水平的改变。7、KGN细胞常规培养,通过荧光定量PCR观察BPA10ug/ml处理组和对照组中miRNAs的表达,通过过表达miR-206,探索miR-206在KGN细胞中的功能性作用。8、在工具细胞293T中,使用双荧光素酶报告基因实验,验证miR-206与基因GJA1的结合靶点。结果:1、人颗粒细胞凋亡百分数在BPA暴露组和对照组之间差异没有统计学意义。蛋白水平:caspase3、bcl-2和bax的表达在BPA暴露组和对照组之间差异无统计学意义。2、在人颗粒细胞中m RNA水平和蛋白水平确认了GJA1基因分别在人颗粒细胞和KGN细胞的BPA暴露组中表达降低;3、人颗粒细胞免疫荧光实验和染毒小鼠卵巢免疫组化实验结果提示在BPA暴露情况下,GJA1蛋白表达均显着下降,差异具有统计学意义。4、人颗粒细胞和KGN细胞培养上清中孕激素随着BPA暴露浓度梯度的升高,其表达水平呈梯度下降,在BPA暴露较高浓度组差异具有统计学意义。5、在KGN细胞中,小干扰siRNA下调GJA1基因的表达后P450Scc和Star表达在m RNA水平和蛋白水平均显着下调,且差异具有统计学意义。6、BPA暴露后GJA1启动子区平均甲基化水平与对照组之间没有差异,然而在各个位点的甲基化水平的比较中发现,第4个Cp G岛的甲基化水平显着高于对照组,差异具有统计学意义。7、miR-206过表达可以使KGN细胞中GJA1基因在m RNA水平和蛋白水平表达降低,差异具有统计学意义。8、miR-206显着的降低了野生型293T细胞的相对荧光素酶活性,但是对突变型的293T细胞没有明显的影响。结论:1、BPA暴露与颗粒细胞凋亡无明显剂量-效应相关性。2、BPA暴露可以影响GJA1的表达,同时导致颗粒细胞合成孕激素能力下降,GJA1可能参与卵巢颗粒细胞激素合成关键酶的表达调控。3、启动子区的甲基化可能参与调控BPA诱导的GJA1的表达调控。4、miR-206通过靶向抑制BPA诱导的GJA1的异常表达,从而影响缝隙连接。
二、野生小鼠体外受精技术实验初探（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、野生小鼠体外受精技术实验初探（论文提纲范文）
（1）利用单碱基编辑系统构建早衰症非人灵长类模型（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.基于CRISPR/Cas系统的靶向基因编辑 |
| 1.1 CRISPR/Cas9系统 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas9系统的发现 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas9系统的作用原理 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9系统的发展 |
| 1.2 CRISPR/Cas13系统 |
| 1.3 单碱基编辑系统 |
| 1.3.1 单碱基编辑系统的发展 |
| 1.3.2 单碱基编辑系统的应用 |
| 1.3.3 单碱基编辑系统的脱靶效应 |
| 2.衰老 |
| 2.1 衰老的概述 |
| 2.2 衰老的研究进展 |
| 3.基于LMNA突变引起的衰老相关疾病 |
| 3.1 衰老相关疾病 |
| 3.1.1 核纤层的概述 |
| 3.1.2 核纤层疾病的概况 |
| 3.2 Hutchinson-Gilford progeria syndrome |
| 3.2.1 HGPS的分子机制 |
| 3.2.2 HGPS的机理研究现状 |
| 3.2.3 HGPS的病理表型 |
| 3.2.4 HGPS的临床治疗 |
| 3.3 扩张性心肌病 |
| 3.3.1 DCM的分子机制 |
| 3.3.2 DCM机理研究现状 |
| 3.3.3 DCM的病理表型 |
| 3.3.4 DCM的临床治疗 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验主要试剂 |
| 1.2 实验主要仪器 |
| 2.主要实验方法 |
| 2.1 实验动物管理 |
| 2.2 细胞水平实验 |
| 2.2.1 gRNA的设计 |
| 2.2.2 gRNA质粒构建 |
| 2.2.3 原代成纤维细胞的建系和培养 |
| 2.2.4 胚胎干细胞的获取 |
| 2.2.5 细胞克隆扩增检测 |
| 2.2.6 SA-β-Gal染色 |
| 2.2.7 免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 2.3 胚胎水平实验 |
| 2.3.1 sgRNA的体外转录 |
| 2.3.2 单碱基编辑器的的体外转录 |
| 2.3.3 猴子受精卵的获取 |
| 2.3.4 受精卵的编辑、培养及移植 |
| 2.3.5 BstXI限制性内切酶酶切实验 |
| 2.3.6 胚胎RNA的提取及测序 |
| 2.4 个体水平实验 |
| 2.4.1 基因组的提取及普通测序 |
| 2.4.2 全基因组的测序及生物信息学分析拷贝数变异,重复序列和单核苷酸变异 |
| 2.4.3 差异基因分析 |
| 2.4.4 行为学分析 |
| 2.4.5 血液检测 |
| 2.4.6 蛋白免疫印迹(Western blot,WB) |
| 2.4.7 qPCR |
| 2.4.8 X射线检测 |
| 2.4.9 组织学染色 |
| 第三章 非人灵长类胚胎靶向基因位点的单碱基编辑方法学的建立 |
| T的单碱基突变'>1.Cytidine base editor(CBE)介导DNA上C>T的单碱基突变 |
| T)突变'>1.1 CBE介导HEK293T LMNA(c.1824C>T)突变 |
| T)突变'>1.2 CBE介导的食蟹猴胚胎LMNA(c.1824C>T)突变 |
| T)突变'>1.2.1 CBE可诱导食蟹猴胚胎LMNA(c.1824C>T)突变 |
| T)突变导致胚胎细胞核结构异常'>1.2.2 LMNA(c.1824C>T)突变导致胚胎细胞核结构异常 |
| 1.2.3 BE3可导致胚胎发育异常 |
| G的单碱基突变'>2.Adenine base editor(ABE)介导DNA上A>G的单碱基突变 |
| G)突变'>2.1 ABE可诱导食蟹猴胚胎LMNA(c.357-2A>G)突变 |
| G)突变'>2.1.1 ABE可诱导食蟹猴胚胎LMNA(c.357-2A>G)突变 |
| G)突变可引起LMNA2 外显子的剪切'>2.1.2 LMNA(c.357-2A>G)突变可引起LMNA2 外显子的剪切 |
| 2.1.3 ABE7.10和ABEmax均不会导致胚胎发育异常 |
| C)突变'>2.2 ABE介导的食蟹猴胚胎EGFP(c.199T>C)突变 |
| C)突变'>2.2.1 ABE介导的核移植胚胎EGFP(c.199T>C)突变 |
| 2.2.2 ABE可同时编辑多个位点 |
| 3.脱靶分析 |
| 3.1 BE3可导致大量新生突变 |
| 3.2 ABE很少引起新生突变 |
| 4.讨论与小结 |
| 第四章 单碱基编辑器构建非人灵长类早衰模型 |
| 1.构建早衰猴模型 |
| 1.1 HGPS模型猴的获取 |
| 1.2 HGPS模型猴全身多组织表达早衰蛋白 |
| 1.3 HGPS模型猴脱靶分析 |
| 1.3.1 HGPS模型猴的染色质稳定 |
| 1.3.2 HGPS模型猴SNV与野生猴无差异 |
| 1.4 HGPS模型猴模拟临床早衰症病症 |
| 1.4.1 细胞增殖能力减弱 |
| 1.4.2 HGPS模型猴生长受阻 |
| 1.4.3 HGPS模型猴的行动能力受限 |
| 1.4.4 HGPS模型猴的心血管异常 |
| 1.4.5 HGPS猴心脏功能受损 |
| 1.4.6 HGPS模型猴的皮肤异常 |
| 1.4.7 HGPS模型猴生理指标未见异常 |
| 2.HGPS早衰症机制初探 |
| 3.讨论与小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录B 实验动物伦理审批表 |
（2）MAPK信号通路及转录因子TCF12在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 卵母细胞生长与成熟 |
| 1.2 卵母细胞成熟过程中的信号传导 |
| 1.2.1 卵母细胞成熟促进因子 |
| 1.2.2 丝裂原激活的蛋白激酶信号通路 |
| 1.3 受精及卵裂 |
| 1.4 受精后基因组和蛋白组的活动变化 |
| 1.4.1 胚胎的第一次有丝分裂 |
| 1.4.2 表观遗传重编程与合子基因组激活 |
| 1.5 碱性螺旋环螺旋转录因子家族 |
| 1.5.1 bHLH转录因子家族特征及功能 |
| 1.5.2 Eprotein转录因子家族结构及功能研究进展 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验设备及试剂 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 常用试剂 |
| 2.2 动物实验 |
| 2.2.1 工具小鼠的获得与饲养 |
| 2.2.2 生殖力检测 |
| 2.2.3 卵母细胞的获取和体外培养 |
| 2.2.4 显微注射 |
| 2.2.5 雌鼠的超数排卵 |
| 2.2.6 受精卵获取与体外培养 |
| 2.2.7 体外受精 |
| 2.2.8 精子结合 |
| 2.2.9 孤雌激活 |
| 2.2.10 活细胞 |
| 2.3 形态学实验 |
| 2.3.1 免疫荧光染色 |
| 2.3.2 EdU染色 |
| 2.3.3 EU染色 |
| 2.3.4 5mc和5hmc染色 |
| 2.3.5 组织石蜡包埋与切片 |
| 2.3.6 苏木精-伊红染色 |
| 2.3.7 免疫组织化学染色 |
| 2.4 分子与生化实验 |
| 2.4.1 基因组提取 |
| 2.4.2 基因型鉴定 |
| 2.4.3 载体构建 |
| 2.4.4 体外转录 |
| 2.4.5 组织RNA逆转录 |
| 2.4.6 微量样品RNA逆转录 |
| 2.4.7 实时定量PCR |
| 2.4.8 绝对实时定量PCR |
| 2.4.9 微量转录组测序 |
| 2.4.10 微量蛋白质谱 |
| 2.4.11 多聚腺苷酸尾部实验 |
| 2.4.12 免疫印迹实验 |
| 第三章 MAPK信号通路正反馈促进母源转录本翻译激活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 母源Ccnb1转录本有3种不同长度的 3’-UTR |
| 3.3 MAPK信号通路促进卵成熟中Ccnb1long 3’-UTR转录本的翻译激活 |
| 3.4 激活的ERK1/2 促进卵成熟中mRNA翻译激活和减数分裂成熟 |
| 3.5 卵成熟中Ccnb1 mRNA的翻译激活需要CDK1的活性 |
| 3.6 ERK1/2 促进卵成熟中其上游激酶MOS的翻译激活 |
| 3.7 ERK1/2 促进卵成熟中Ccnb1long 3’-UTR及Mos转录本胞质腺苷酸化 |
| 3.8 总结和讨论 |
| 第四章 转录因子TCF12在受精及早期胚胎发育中的功能 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 TCF12在卵母细胞和植入前胚胎中的定位与表达模式 |
| 4.3 母源Tcf12维持雌性生殖力 |
| 4.4 母源Tcf12对卵母细胞减数分裂进程的影响 |
| 4.5 母源Tcf12保障受精及植入前胚胎发育有序进行 |
| 4.6 母源Tcf12影响卵母细胞生长阶段部分母源转录本的积累 |
| 4.7 Tcf12通过调控卵母细胞生长阶段的Astl表达影响皮质颗粒定位 |
| 4.8 敲除Tcf12的卵母细胞受精后的第一轮有丝分裂细胞周期延长 |
| 4.9 TCF12保障卵母细胞受精后合子基因组正常激活 |
| 4.10 敲除Tcf12的二细胞晚期胚胎存在过度的H3K27me3修饰 |
| 4.11 敲除Tcf12的植入前胚胎失去发育潜力 |
| 4.12 Tcf12对早期胚胎发育的维持是真正的母源效应 |
| 4.13 总结与讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一:抗体信息 |
| 附录二:引物序列 |
| 作者简历 |
（3）体外助孕受精和胚胎发育异常的临床及基因筛查相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一章 体外受精异常患者的临床相关研究 |
| 第一节 体外受精患者无可移植胚胎的原因分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图及附表 |
| 第二节 IVF患者受精失败的原因及行补救性ICSI的妊娠结局分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 第二章 IVF受精失败和多精受精患者中的IZUMO1R基因突变筛查 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图及附表 |
| 第三章 WEE2基因突变在受精失败发病机制中的作用研究 |
| 第一节 反复体外受精失败患者中的WEE2基因突变筛查 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图及附表 |
| 第二节 Wee2基因敲除小鼠的模型研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情祝表 |
| 英文论文 1 |
| 英文论文 2 |
（4）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（5）孕酮脂联素受体7在小鼠生殖中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 哺乳动物精子发生、成熟和受精相关功能 |
| 1.3 哺乳动物卵巢功能与卵母细胞成熟 |
| 1.4 类固醇激素孕酮对哺乳动物受精过程的调控 |
| 1.5 PAQR7 作为孕酮受体调控哺乳动物受精过程 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验小鼠 |
| 2.1.2 主要仪器设备与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠合笼 |
| 2.2.2 体外受精(in vitro fertilization) |
| 2.2.3 基因型鉴定 |
| 2.2.4 TRIzol法提取RNA |
| 2.2.5 RNA逆转录 |
| 2.2.6 PCR |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR) |
| 2.2.8 计算机辅助精子分析仪测小鼠精子活力、浓度以及运动参数 |
| 2.2.9 免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.10 免疫荧光 |
| 2.2.11 石蜡切片 |
| 2.2.12 苏木素-伊红组织化学染色 |
| 2.2.13 小鼠外周血中激素水平检测 |
| 2.3 数据处理与统计分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 小鼠生殖组织中存在PAQR7 转录本和蛋白 |
| 3.2 PAQR7 特异性单克隆抗体能抑制小鼠精子前向运动和体外受精成功率 |
| 3.3 PAQR7 敲除以及结果验证 |
| 3.4 检测PAQR7 敲除对小鼠生育的影响 |
| 3.4.1 合笼检测PAQR7 敲除对小鼠生殖的影响 |
| 3.4.2 体外受精检测PAQR7 敲除对小鼠生育的影响 |
| 3.5 PAQR7 敲除对雄性生殖的影响 |
| 3.5.1 PAQR7 敲除影响雄性小鼠睾丸指数及精子生成 |
| 3.5.2 PAQR7 敲除对睾丸结构的影响 |
| 3.5.3 PAQR7 敲除对小鼠精子形态及运动的影响 |
| 3.5.4 PAQR7 敲除对折尾精子运动的影响 |
| 3.5.5 PAQR7 敲除影响孕酮受体及精子功能相关基因表达 |
| 3.6 PAQR7 敲除对雌鼠生殖的影响 |
| 3.6.1 PAQR7 敲除对雌鼠卵巢指数的影响 |
| 3.6.2 PAQR7 敲除对雌鼠卵巢结构的影响 |
| 3.6.3 PAQR7 敲除影响雌鼠卵巢激素水平 |
| 3.6.4 PAQR7 敲除影响孕酮受体及卵巢功能相关基因表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
（6）Trpv1通道在斑马鱼精子中的表达与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 精子功能调控的概述 |
| 1.2 鱼类精子运动具有特殊性 |
| 1.2.1 鱼类精子运动的影响因素 |
| 1.2.2 鱼类精子运动的时间 |
| 1.3 离子通道在成熟精子中的功能 |
| 1.3.1 离子通道的种类 |
| 1.3.2 精子正常功能的发挥需要离子通道的调节 |
| 1.3.3 鱼类精子中离子通道的研究现状 |
| 1.4 TRP通道家族 |
| 1.4.1 TRPV通道家族的功能 |
| 1.4.2 TRPV1通道的功能 |
| 1.5 以斑马鱼为模型进行雄性生殖生理学研究具有现实意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 实验相关溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 精子的获取 |
| 2.2.2 卵子的获取 |
| 2.2.3 精子活力的评估 |
| 2.2.4 western blot检测Trpv1蛋白的表达 |
| 2.2.5 trpv1~(-/-)斑马鱼模型的构建和筛选 |
| 2.2.6 免疫荧光分析 |
| 2.2.7 斑马鱼精子的体外受精实验 |
| 2.2.8 精子RNA的提取与检测 |
| 2.2.9 qPCR |
| 2.2.10 数据的统计分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 斑马鱼精子运动相关功能性离子通道的筛选 |
| 3.2 Trpv1通道在斑马鱼精子中表达 |
| 3.3 Trpv1通道的抑制剂能够降低斑马鱼精子活力 |
| 3.4 抑制Trpv1通道活性能够降低斑马鱼的体外受精率 |
| 3.5 trpv1~(-/-)斑马鱼模型的构建 |
| 3.5.1 trpv1~(+/-)斑马鱼模型的构建 |
| 3.5.2 trpv1~(-/-)斑马鱼模型的筛选 |
| 3.6 利用trpv1~(-/-)斑马鱼模型验证Trpv1通道对斑马鱼精子运动的调节功能 |
| 3.6.1 Trpv1通道在斑马鱼精子中的表达与定位 |
| 3.6.2 trpv1~(-/-)精子不受Trpv1通道抑制剂、激活剂的影响 |
| 3.6.3 trpv1~(-/-)斑马鱼精子的受精率与野生型斑马鱼无显着差异 |
| 3.7 trpv1~(-/-)精子活力与野生型精子类似的可能性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录 |
（7）野生小鼠的实验动物化及研究进展（论文提纲范文）
| 1 野生小鼠实验动物化的意义 |
| 2 野生小鼠实验动物化工作进展 |
| 3 野生小鼠实验研究进展 |
（8）Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠体外受精实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验分组 |
| 1.2.2 麻醉剂的配置与使用 |
| 1.2.3 雌鼠超排及取卵 |
| 1.2.4 雄鼠精子采集与质量测定 |
| 1.2.5 体外受精 |
| 1.2.6 受体准备 |
| 1.2.7 早期胚胎形态学观察与统计 |
| 1.2.8 胚胎移植 |
| 1.2.9 体外受精条件的优化 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 两种I型干扰素受体缺失雄鼠精子参数分析 |
| 2.2 两种I型干扰素受体缺失小鼠体外受精率分析 |
| 2.3 移植产仔率分析 |
| 2.4 配子杂交实验分析 |
| 2.5 体外受精条件优化结果分析 |
| 2.5.1 不同采卵时间对体外受精效果的影响 |
| 2.5.2 不同精子密度对体外受精效果的影响 |
| 2.5.3 不同获能时间对体外受精效果的影响 |
| 2.5.4 获能液及受精液中加入还原型谷胱甘肽对体外受精的影响 |
| 3 讨论 |
（9）特异性KDM2A基因敲除小鼠模型的建立及其对雄性生殖的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精子发生及其影响因素 |
| 1.1.1 睾丸发育 |
| 1.1.2 精子发生 |
| 1.1.3 精子发生中的经典Wnt信号通路 |
| 1.1.4 影响精子发生的遗传因素 |
| 1.2 表观修饰 |
| 1.2.1 DNA甲基化 |
| 1.2.2 组蛋白修饰 |
| 1.3 组蛋白赖氨酸去甲基化酶 |
| 1.3.1 KDMs家族介绍 |
| 1.3.2 赖氨酸去甲基化酶KDM2A |
| 1.3.3 KDM2A与病理学相关 |
| 1.3.4 KDM2A与发育生理学相关 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 特异性敲除精子细胞KDM2A小鼠模型构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 构建KDM2A~(fl/+)小鼠 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 小鼠交配策略及饲养管理 |
| 2.2.2 基因型鉴定 |
| 2.2.3 小鼠睾丸及精子的收集 |
| 2.2.4 样本总RNA提取和cDNA合成 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.2.6 制备睾丸组织石蜡包埋切片 |
| 2.2.7 睾丸免疫组织化学染色 |
| 2.2.8 小鼠精子免疫荧光染色 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 KDM2A~(fl/+)编辑小鼠的建立 |
| 2.3.2 小鼠KDM2A组织表达谱 |
| 2.3.3 小鼠发育过程中KDM2A的表达 |
| 2.3.4 小鼠睾丸中KDM2A的定位 |
| 2.3.5 小鼠精子中KDM2A的定位 |
| 2.3.6 小鼠精子敲除KDM2A模型的建立 |
| 2.3.7 敲除效率验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 KDM2A对小鼠雄性生殖功能的影响 |
| 3.1 试验耗材 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要耗材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 睾丸脏器系数比较 |
| 3.2.2 睾丸组织HE染色及组织学观察 |
| 3.2.3 精子计数 |
| 3.2.4 体外受精能力检测 |
| 3.2.5 体内生育力测定 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 精子细胞KDM2A敲除对睾丸脏器系数及形态学的影响 |
| 3.3.2 精子细胞KDM2A敲除对睾丸发育及精子细胞的影响 |
| 3.3.3 精子细胞KDM2A敲除对精子数量的影响 |
| 3.3.4 精子细胞KDM2A敲除对精子受精能力的影响 |
| 3.3.5 精子细胞KDM2A敲除对生育力的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）BPA与TCS对女性生殖的影响及相关分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 BPA与TCS在不孕女性尿液中的浓度及其与IVF结局相关性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 探索BPA对人颗粒细胞GJA1 表达的影响及相关分子机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 双酚A和三氯生对女性生殖影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学习期间所取得的科研成果 |
四、野生小鼠体外受精技术实验初探（论文参考文献）
- [1]利用单碱基编辑系统构建早衰症非人灵长类模型[D]. 王芳. 昆明理工大学, 2021(02)
- [2]MAPK信号通路及转录因子TCF12在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的功能研究[D]. 曹兰蕊. 浙江大学, 2021(01)
- [3]体外助孕受精和胚胎发育异常的临床及基因筛查相关研究[D]. 于梦汝. 山东大学, 2020(04)
- [4]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [5]孕酮脂联素受体7在小鼠生殖中的作用[D]. 王芳. 南昌大学, 2020(08)
- [6]Trpv1通道在斑马鱼精子中的表达与功能研究[D]. 陈莹. 南昌大学, 2020(01)
- [7]野生小鼠的实验动物化及研究进展[J]. 管彤,徐渴. 实验动物科学, 2020(03)
- [8]Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠体外受精实验研究[J]. 张帆,安学芳,赵赫,李丽,肖宇宙. 中国实验动物学报, 2020(03)
- [9]特异性KDM2A基因敲除小鼠模型的建立及其对雄性生殖的影响[D]. 黄向月. 西南民族大学, 2020(01)
- [10]BPA与TCS对女性生殖的影响及相关分子机制研究[D]. 沈娟. 浙江大学, 2020(01)