一、卵泡直径和卵丘细胞对牛卵母细胞体外受精后发育潜力的影响（论文文献综述）
李瑞哲[1]（2021）在《低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制》文中提出牦牛（Bos grunniens）是青藏高原及其毗邻地区的特色畜种,对当地农牧民的生产生活具有重要的意义,被誉为“高原之舟”。牦牛繁殖的季节性明显,繁殖效率较低,严重制约了产业发展。利用胚胎体外生产等现代繁殖生物技术,能够提升牦牛的繁殖潜力,是提高牦牛产业效率的途径之一。卵母细胞是现代繁殖生物技术的基础材料,卵母细胞质量影响着后续胚胎质量。在人、牛、山羊和小鼠等物种上的研究表明,体外成熟过程中氧分压影响卵母细胞的质量和发育能力,而在牦牛上相关研究还较少。为此,本研究在分析不同氧分压和抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力影响的基础上,分别从卵母细胞和卵丘细胞转录组层面探讨了低氧影响牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的机制。主要研究结果如下:1.不同氧分压对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响研究了5%和20%O2对牦牛卵母细胞体外成熟率,卵母细胞ROS水平和GSH含量,孤雌胚胎和体外受精（IVF）胚胎发育的影响。结果表明:5%O2提高了卵母细胞体外成熟率（P<0.05）和GSH含量（P<0.05）,降低了卵母细胞ROS水平（P<0.01）,提高了孤雌囊胚和IVF囊胚质量。2.不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响研究了卵母细胞成熟液中添加半胱胺、褪黑素、白藜芦醇和维生素C对牦牛卵母细胞体外成熟率,卵母细胞ROS水平、GSH含量和线粒体分布,以及IVF胚胎发育的影响。结果表明:（1）半胱胺提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）;（2）褪黑素提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）、GSH含量（P<0.05）、线粒体均质分布比例（P<0.05）和IVF胚胎卵裂率（P<0.05）,降低了卵母细胞ROS水平（P<0.05）;（3）白藜芦醇和维生素C均提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）和降低了卵母细胞ROS水平（P<0.05）。3.不同氧分压对牦牛卵母细胞转录组的影响对5%和20%O2成熟培养的牦牛MⅡ期卵母细胞,分别进行单细胞转录组测序。鉴定出120个差异表达基因,其中37个基因在5%O2组上调,主要参与缺氧反应、细胞周期/细胞分裂、染色质构象与重塑和细胞骨架,83个基因在5%O2组下调,主要参与能量代谢、蛋白合成、氧化还原平衡和卵丘细胞调控。GO分析表明:上调基因（5%O2 vs 20%O2,下同）富集于核质、以DNA为模板的正向转录调控、ERK1和ERK2级联反应等7个条目;下调基因（5%O2 vs 20%O2,下同）富集于线粒体、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、胞浆大核糖体亚单位和外泌体等7个条目等。KEGG分析表明:上调基因富集于缺氧诱导因子-1信号转导、神经营养因子信号转导、粘附斑、微丝细胞骨架调控和PI3K-Akt信号转导等11个通路;下调基因富集于氧化磷酸化等4个通路。4.不同氧分压对牦牛卵丘细胞转录组的影响对5%和20%O2成熟培养的牦牛COCs,分别收集卵丘细胞,进行转录组测序。鉴定出270个差异表达基因,其中229个基因在5%O2组上调,主要参与缺氧反应、糖酵解、免疫/炎性反应和细胞凋亡,41个基因在5%O2组下调,主要参与抗凋亡和抗炎。GO分析表明:上调基因富集于缺氧反应、糖酵解过程、ATP代谢过程、炎症反应等26个条目;下调基因富集于蛋白同二聚化活性和受体结合2个条目。KEGG分析表明:上调基因富集于神经活性配体-受体互作、c AMP信号通路、糖酵解/糖异生等9个通路;下调基因没有得到富集。本研究分析了不同氧分压和抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及不同氧分压对牦牛卵母细胞和卵丘细胞转录组的影响,得出以下结论:与20%O2培养相比,5%O2培养时牦牛卵母细胞受到的氧化应激减少,卵丘细胞向卵母细胞提供能量代谢底物的能力增强,有利于牦牛卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育。研究结果为继续深入研究氧分压对牦牛卵母细胞成熟、发育能力及卵丘细胞-卵母细胞互作的影响及其作用机制提供了参考数据。
李昊[2]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中进行了进一步梳理肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
莫显红[3]（2014）在《内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究》文中认为生物体细胞内钙稳态对于维持细胞正常机能至关重要。钙稳态受到多种因素的影响,钙稳态失衡可导致细胞内钙浓度异常性升高,即钙超载,从而影响钙信号调控作用,导致细胞及细胞器功能异常,严重时可诱导细胞损伤或凋亡。冷冻保存作为刺激因素可导致卵母细胞内钙稳态失衡,但这种失衡机制及其与冷冻损伤的关系尚不清楚。因此,本研究在玻璃化冷冻保存成熟牛卵母细胞前阻断内质网钙通道,探明介导钙稳态失衡的主要钙通道及其作用机制。此外,本文探讨了LIF（leukemia inhibitory factor,LIF）在牛卵母细胞体外成熟与发育中的调控作用。为提高卵母细胞冷冻保存效率,获得更多高质量体外操作用卵母细胞具有较高的理论意义。在玻璃化冷冻保存卵母细胞前,用内质网Ca2+-ATPase（SERCA）阻断剂毒胡萝卜素（TG）预处理,解冻后的存活率显着降低（p<0.05）;用IP3R特异性的膜渗透性抑制剂10μmol/L2-APB预处理10 min,存活率显着升高。冷冻前用2-APB预处理,解冻后卵母细胞CG异常分布比例（42.40%）显着低于冷冻对照组（51.81%,p<0.05）,胞内GSH含量显着升高,活性氧（ROS）水平显着降低;孤雌激活卵裂率（61.45%vs.87.83%）和囊胚率（25.95%vs.47.31%）显着高于冷冻对照组。玻璃化冷冻保存前用2-APB预处理卵母细胞,解冻后内质网（ER）重组（ER皮质区簇状分布）明显恢复;内质网应激蛋白GRP78和CHOP的表达显着下调;且与细胞凋亡相关蛋白细胞色素C（cytC）,caspase-9及caspase-3的表达量显着降低。在IVM培养液中添加25 ng/mL LIF,分别培养卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）和裸卵（denuded oocytes,DOs）,与对照组相比,核成熟率显着提高（72.53%vs.81.23%;60.59%vs.70.04%）;同时,LIF 可显着提高皮质颗粒（cortical granule,CG）迁移率、胞内谷胱甘肽（GSH）水平及受精相关蛋白CD9的表达。体外受精后,LIF处理组的卵裂率（66.52%vs.76.03%）、囊胚率（25.82%vs.35.35%）和囊胚细胞数（67.52 vs.80.75）均显着提高（p<0.05）。LIF相关信号通路MAPK3/1和JAK/STAT3检测结果显示:MAPK3/1和STAT3磷酸化水平显着升高;用MEK抑制剂U0126处理卵母细胞,仅部分抑制了 LIF诱导的卵母细胞核成熟,但胞质成熟被完全抑制;用JAK/STAT3通路抑制剂JAK inhibitor处理卵母细胞后核成熟和胞质成熟均被完全抑制。本研究分别在IVM、IVC及全程（IVM+IVC）添加LIF检测其对早期胚胎发育的影响。IVM中添加LIF,孤雌激活卵裂率和囊胚率显着高于对照组,全程添加LIF囊胚率（57.19%）最高,且囊胚中多潜能基因POU5F1和NANOG表达量显着高于对照组。综上所述,玻璃化冷冻前用2-APB预处理牛卵母细胞,维持了胞内钙稳态平衡,提高了冷冻解冻后的存活率及卵母细胞的发育能力,降低了内质网应激蛋白及细胞凋亡相关蛋白的表达,可保护卵母细胞免受内质网过度应激引发的钙稳态失衡。此外,LIF通过激活MAPK和JAK/STAT3信号通路,可促进牛卵母细胞核质成熟。
亓美玉[4]（2011）在《牛卵母细胞体外受精及热应激条件下IGF-I对其影响的研究》文中提出随着胚胎工程技术的深入研究,牛卵母细胞体外受精技术的应用范围已越来越广泛,不仅为牛胚胎移植技术的商业化发展提供了更为廉价的胚胎来源,更为研究动物生殖机能、生殖细胞的体内发育机制以及解决现实生产中的外界应激因素对动物生殖机能的影响机制搭建了技术平台。热应激（heat stress）是世界范围内普遍存在的、对奶牛生殖力影响较大的环境因素,而IGF-I对胚胎早期发育则具有显着的促进作用,但IGF-I在牛卵母细胞体外成熟阶段的影响作用仍不明确。本研究首先对卵母细胞的体外成熟、体外受精及体外培养过程中的一些影响因素进行了科学实验,并利用成熟的牛卵母细胞体外受精技术对热应激（heat shock,HS）影响卵母细胞发育能力进行了细胞及分子水平的研究,并对引起人们广泛关注的IGF-I在卵母细胞体外成熟前后对卵母细胞发育能力的影响进行了多个组合的对比研究。主要研究结果如下：实验一、正常体温条件下牛卵母细胞体外成熟、受精及早期胚胎体外培养技术研究1)牛卵母细胞体外成熟因素研究屠宰场获取卵巢后的卵巢离体保存时间在6h以内时对卵母细胞的体外成熟率无影响,超过6h后成熟率下降；获卵卵泡直径在2mm以内时卵母细胞的体外成熟率较低（51.66±3.15）,直径大于2mm后,尽管成熟率随卵泡直径的增加而呈增加趋势,但卵泡直径在2-6mmm,7-8mmm及9-10mmm时的卵母细胞成熟率间并无显着差异（80.73±2.81,84.32±1.85,87.27±6.23,P>0.05）；A、B级COCs的卵母细胞成熟率较高（85.92±3.35 vs 82.47±3.24,P>0.05）,C级COCs的成熟率显着下将（60.26±5.46,P<0.05）,D级COCs的成熟率最低（18.23±4.15,P<0.05）。2)牛卵母细胞体外受精因素研究卵泡直径对卵母细胞体外受精后的卵裂率有较大影响,随卵泡直径增加而显着增加（P<0.05）。卵泡直径对囊胚率也有一定影响,当直径小于2mm时囊胚率仅为6.37±2.58,直径在2-8mmm之间时囊胚率显着增加（24.73±1.63,28.21±1.89,P>0.05）,直径在9-10mm的囊胚率显着高于除7-8mm外的其它各组（31.43±7.49,P<0.05）；体外受精前卵丘细胞完全保留或部分保留对卵裂率及囊胚率均无影响,但完全脱除卵丘细胞使卵裂率及囊胚率显着降低；精卵共孵育时间在8-18h之间的各时间段间对卵母细胞的发育能力无影响。3)牛早期胚胎体外培养因素研究每24h或48h对胚胎培养液进行半量更换对卵裂率及囊胚率的影响并不显着,与对照组的结果无差异,但在胚胎培养的第3天补充10%的FCS对囊胚的发育具有促进作用。实验二、热应激（HS）条件下IGF-I对牛卵母细胞体外发育能力的影响研究1)GV期牛卵母细胞在热应激条件下添加IGF-I对其发育能力的影响HS条件及IGF-I对IVM后卵母细胞胞质内皮质颗粒的分布、核成熟及核凋亡均未产生任何影响。2)热应激条件下牛卵母细胞体外成熟时IGF-I的添加对其发育能力的影响HS显着降低了IVF后的卵裂率（CvsHS为75.60±3.54 vs 56.55±5.24,P<0.05）,并降低了IVF后42h时超过2-细胞胚胎的比率（CvsHS为39.11±5.17 vs 22.66±4.99,P<0.05）。但IGF-I仅使LCR组中2-细胞胚胎与所有超过2-细胞的胚胎间的比率有降低趋势（3.42±0.53%vs 1.8±0.53%；P<0.1）；HS及IGF-I对IVM后胞质内皮质颗粒的分布未产生任何影响：HS显着增加了处于MⅠ期卵母细胞的比率（C vsHS为1.75±1.75 vs 39.34±5.39,P<0.05）,同时降低了MⅡ期卵母细胞的比率（C vsHS为57.9±13.27 vs 13.91±4.16,P<0.05）。HS组中处于晚期核成熟阶段（Telo I及MⅡ）的卵母细胞比率显着低于C组（P<0.01）, IGF-I在热应激条件下轻微增加了处于晚期核成熟卵母细胞的比率,但差异并不显着（P>0.05）；C组中TUNEL阳性卵母细胞的比率低于HS组（27.98±5.95 vs 47.944±14.24；P≤0.09）,在热应激条件下,IGF-I的添加使TUNEL阳性卵母细胞的比率降至对照组水平,但并无显着差异。热应激及IGF-I对4-细胞期胚胎中GAPDH及GDF9的表达水平无显着影响。
禹学礼[5]（2010）在《牛IVF胚胎培养与冷冻方法优化》文中提出牛IVF是动物繁殖生物技术领域的研究热点之一。近年来,国内外学者对此进行了大量研究,但由于一些关键技术尚不完善,使其总体生产效率不高,严重制约了该技术在生产中的应用。卵母细胞及胚胎的体外培养条件和冷冻方法不够完善是其主要的限制因素。因此,本课题拟通过对影响牛卵母细胞IVF后胚胎发育的培养条件和冷冻方法等相关因素之研究,优化卵母细胞和胚胎的培养条件和冷冻方法,建立一套更加有效、可操作性强的胚胎体外培养和冷冻体系,提高IVP胚胎的生产效率。1输卵管和颗粒细胞单层对牛体外受精胚胎发育的影响以屠宰场牛卵巢为实验材料,研究了输卵管细胞单层（OCM）和颗粒细胞单层（GCM）对牛卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和体外培养（IVC）后胚胎发育能力的影响。实验1:从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体（COCs）,并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3级:1级（≥4层）;2级（2～3层）;3级（0～1层）。然后,分别进行在IVM和IVC培养液中添加GCM （1×106个/ml）与不添加的对比实验。结果显示:添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率无明显影响（P>0.05）;但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组（P<0.05）。实验2:所有卵母细胞（包括COCs和裸卵）被随机分为3个组,在其IVM和IVC培养液中分别添加OCM、GCM或不添加体细胞（对照组）。结果显示:OCM和GCM组的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率均高于对照组（P<0.05）,而两实验组之间差异不显着。实验3:将取自每头牛的约20枚卵母细胞,分别置于不同大小的微滴（30μL,50μL,100μL和200μL）中培养、受精,结果表明,30μL和50μL组的囊胚发育率明显高于100μL和200μL组（P<0.05）。2卵泡及卵泡液对牛卵母细胞体外受精后发育的影响以屠宰场牛卵巢为材料,研究了卵泡大小和卵泡液对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。实验1:按照卵泡大小将COCs分为4个实验组:>8 mm组、2～8 mm组、腔前卵泡（PF）卵母细胞组和混合（将前三种卵母细胞混合）组。结果表明,卵泡大小直接影响卵母细胞受精后的发育,同时,源自不同大小卵泡的卵母细胞混合培养,可以促进未成熟的腔前卵泡内卵母细胞的发育。实验2:将源自优势卵泡（>8 mm）、小卵泡（2～8 mm）和混合（所有卵泡液混合）的牛卵泡液（BFF）,按照10%添加到成熟培养液中,3个实验组的卵裂率和囊胚率均高于没有添加BFF的对照组（P<0.05）,但添加10%的优势卵泡液使卵母细胞和胚胎发生粘连,易于造成丢失。实验3:与未添加BFF的对照组相比,成熟培养液中分别加入10%、20%和40%的混合BFF,均可明显促进卵母细胞受精后的发育（P<0.05）,但20%组和40%组出现卵母细胞间及胚胎间的粘连。因此,成熟培养液中添加10%的混合BFF较为适宜。3改进V形孔培养法对牛胚胎体外生产效果的影响研究目的在于探索三种不同培养方法对牛胚胎体外生产效果的影响。V形孔（WOW）培养微滴的制作方法是,在塑料培养皿的底部,相距1cm用加热的针头烫出V形孔,每个V形孔上覆盖一个20μL的培养微滴;改进的V形孔（mWOW）培养微滴制作方法与V形孔法基本相同,但V形孔间相距1mm,每15～20个V形孔上覆盖一个400μL的培养微滴。将卵母细胞和受精卵分别采用微滴（对照）、V形孔和改进的V形孔法进行体外培养,对照组每个微滴中植置入20～25枚卵母细胞或胚胎;二实验组每个V形孔中置入一个卵母细胞或胚胎。结果表明,mWOW组的卵裂率、囊胚率及第6d、7d、8d胚胎的总细胞数与微滴组差异不显着（P>0.05）,但明显高于WOW组（P< 0.05）;WOW组胚胎的孵化率低于mWOW组和对照组（P< 0.05）,但mWOW组与对照组差异不显着（P>0.05）。此外,三组中第6d、7d、8d获得囊胚的总细胞数均呈现逐渐下降趋势。结论:以TCM-199为基础培养液,用改进的V形孔法可以完成牛胚胎体外生产的全过程,且比V形孔法培养的胚胎具有更强的发育能力和更好的质量。体外培养时,发育越快的胚胎质量越高。4牛未成熟卵母细胞冷冻方法研究通过对比冷冻保护剂浓度变化和不同玻璃化冷冻方法对卵母细胞冷冻效率的影响,探索牛未成熟卵母细胞的冷冻方法。实验1:将COCs分别在不同玻璃化冷冻液VS1 （10% EG + 10% DMSO）、VS2（20% EG + 20% DMSO）、VS3（25% EG + 25% DMSO）中存留30s或60s,体外成熟22h后,成熟率与对照组没有明显差异（P>0.05）;但在VS3中存留60s时,成熟率明显下降（P<0.01）。说明当EG和DMSO浓度在冷冻液中各达到25%、作用时间增加到60s时,对卵母细胞有明显的毒性。实验2:在不同玻璃化冷冻液（VS1、VS2、VS3）中,采用OPS法冷冻COCs,解冻后再进行IVM、IVF和早期胚胎的IVC。结果表明,VS2组卵母细胞成熟率（67.9%）和囊胚率（5.4%）分别高于VS1组（61.1%; 0）和VS3组（63.6%; 3.6%）。实验3:分别采用细管法和开放式拉长细管（open pulled straw,OPS）法对未经成熟培养的卵丘卵母细胞复合体（COCs）进行玻璃化冷冻,解冻后再进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果表明,细管组和OPS组的解冻后COCs正常率分别为59.4%±4.3和77.9%±4.1（P<0.01）;成熟率分别为48.2%±5.3和66.0%±5.8（P<0.01）;卵裂率分别为18.5%±2.0和32.8%±1.4（P<0.01）;8-细胞阶段的成功率分别为14.8%±2.5和24.8%±1.5（P<0.01）;桑椹胚发育率分别为0和5.3%±1.1,明显低于未经冷冻的鲜卵组（21.0%±3.8;P<0.01）;囊胚发育率分别为0和4%±1.0,明显低于鲜卵组（P<0.01）。结论:以20%乙二醇和20%二甲基亚砜为冷冻保护剂,将室温下卵母细胞与冷冻液接触时间控制在30s以内,采用OPS法可以使未经成熟培养的牛COCs冷冻后获得桑椹胚和囊胚,但成功率低。5封闭式拉长细管法冷冻牛IVF胚胎研究本研究目的在于评价封闭式拉长细管（closed pulled straw,CPS）法对体外生产和体内获取牛胚胎的冷冻效果。在OPS玻璃化冷冻法的基础上,将其顶端热封以避免胚胎及冷冻液与液氮的直接接触,形成CPS玻璃化冷冻法。将体外生产或体内获取的牛桑椹胚和早期囊胚分别采用慢速冷冻法、OPS法和CPS法冷冻,解冻后对胚胎进行形态学鉴定,对形态正常胚胎分别进行体外培养24h和72h。结果表明:体外生产的牛胚胎,OPS组和CPS组的解冻后胚胎形态正常率分别为87.9%±5.2和85.4%±4.9,培养24h后的存活率分别为58.0%±6.8和56.3%±4.4,培养72h后的存活率分别为35.2%±6.0和34.9%±6.7,差异均不显着（P>0.05）;但OPS和CPS法上述三项指标均显着高于慢速冷冻法（对照组,P<0.05）。体内获取胚胎的实验结果（实验2）与体外胚胎（实验1）基本一致。结论:CPS玻璃化冷冻法适用于体外生产和体内获取的牛胚胎冷冻。这种方法不仅可以降低胚胎被液氮污染的风险,而且保留了OPS玻璃化冷冻的优点。
桑国俊[6]（2008）在《牛卵母细胞及体外胚培养技术研究》文中研究表明牛胚胎体外生产技术包括卵母细胞体外成熟、体外受精、体外培养及冷冻保存等环节。本试验对牛卵母细胞及体外胚培养技术进行了研究,比较系统地掌握了牛卵母细胞的操作技术,为该技术的深入研究和应用铺垫了良好基础。1、卵母细胞体外成熟技术（1）COCs级别对卵母细胞成熟的影响。选择A、B、C和D级COCs进行成熟培养。A级成熟率为63.81%,B级为47.81%,C级为2.01%,D级为0.00%,各级成熟率之间差异显着（p<0.01）,A、B级远高于C、D级。C级仅有个别发育成熟,D级未见成熟。因此,A、B级COCs是卵母细胞体外培养的主要资源,宜选择A、B级COCs进行成熟培养。（2）卵泡直径对卵母细胞成熟的影响。将卵泡分为3级:大卵泡（φ>8mm）、中卵泡（2mm≤φ≤8mm）和小卵泡（φ<2mm）。COCs成熟率分别为大卵泡组17.07%、中卵泡组61.82%、小卵泡组19.06%,中卵泡组显着高于大卵泡组和小卵泡组（p<0.01）,大卵泡组和小卵泡组差异不显着（p>0.05）。卵母细胞的成熟率与采集COCs时的卵泡直径关系密切,在卵母细胞体外培养过程中,宜选择卵巢发育正常的卵泡采集,不宜选择发育过大或过小的边际卵泡。2、牛卵母细胞体外受精技术（1）直接离心法对获能效果和卵母细胞受精率的影响。①二次离心沉淀液:对第一次离心的沉淀定容后继续离心后获得的沉淀进行活力、获能效果和受精率测定。洗涤精子最终活力为0.44;获能效果以10min时最高,为0.41,15min时为0.32,超活化以15min时最好;受精率为40.19%。②二次离心上清液:对第一次离心的上清液定容后继续离心后获得的沉淀进行测定。洗涤精子最终活力为0.56;获能效果以10min时最高,为0.59,15min时较低,为0.585,超活化也以15min时最好;受精率为43.21%。二次离心上清液的各项指标显着高于沉淀液（p<0.01）。从试验结果看,宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法,避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路,而直接对上清液进行离心处理,获得了理想的精子洗涤和获能效果。（2）不同温度对精子获能和卵母细胞受精的影响。将精子分别在20～24℃室温和38.5℃恒温（CO2培养箱）上浮60min、获能10～20min。①室温上浮法:超净工作台上浮60min,精子活力以45min时最高,达到0.68;对上浮45min的精子获能15min后进行体外受精,平均受精率41.40%。②恒温上浮法:CO2培养箱上浮60min,精子活力30min时最高,达到0.697;对上浮30min的精子获能15min后进行体外受精,平均受精率41.51%。精子获能后的超活化现象与室温法一致。二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显着（p>0.05）,恒温上浮法的效果略高于室温组。从可控角度考虑,还以恒温上浮法为宜。（3）精子浓度与受精的关系。使用不同浓度（低1.0×106、中1.5×106和高3.0×106个/ml）精子与卵子共同孵育。中浓度组平均受精率为47.34%,显着高于低浓度组的42.38%（p<0.05）和高浓度组的33.96%（p<0.01）;低浓度组的平均受精率显着高于高浓度组平均受精率（p<0.01）。本试验表明精子适宜浓度宜控制在（1.0～1.5）×106个/ml。3、牛体外受精胚胎培养技术（1）卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响。卵丘细胞组、卵丘细胞+bFF组和对照组的桑椹胚率分别为29.07%、34.99%和26.67%;囊胚率分别为8.51%、10.63%和7.24%。卵丘细胞+bFF组的桑囊率显着高于卵丘细胞组和对照组（p<0.01）。本试验通过添加卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养物质,较好地克服了2C发育阻滞。（2）培养液体积对胚胎发育的影响。分别用50μl和500μl培养液培养胚胎。50μl液滴的桑椹胚率为33.14%,囊胚率为9.07%,500μl液滴依次为36.23%和10.23%。大体积培养比微滴培养有优势,桑椹胚和囊胚率均较高（p<0.01）。本项试验中500μl的效果好于50μl。4、卵母细胞冷冻保存技术及解冻培养（1）程序化一步法冷冻时10%GL和10%EG对COCs冷冻效果的影响。COCs在液氮保存1周后解冻成熟培养。EG组成熟率为34.46%,桑椹胚率为11.18%,囊胚率为4.18%;GL依次为33.44%、10.56%和3.86%。EG组的成熟率比GL组高3.05%（p>0.05）,桑椹胚率高5.87%（p>0.05）,囊胚率高8.29%（p>0.05）。冷冻保护剂GL和EG均可用于COCs的冷冻保存,但EG的效果比较好。（2）玻璃化冷冻时麦管和OPS管对COCs冷冻效果的影响。以麦管和OPS管作为冷冻载体,二步法玻璃化冷冻COCs。对冷冻1周后的COCs解冻培养,麦管法成熟率为29.84%,桑椹胚率为9.34%,囊胚率为3.47%;OPS法依次为31.89%、9.66%和3.80%。OPS法的成熟率比麦管法高6.87%（p>0.05）,桑椹胚率高3.43%（p>0.05）,囊胚率高9.51%（p>0.05）。OPS管玻璃化冷冻的效果优于麦管法,但无统计差异,而麦管法宜于操作和储存,宜在实际操作中选用麦管法。（3）COCs冷冻方法的比较。COCs的4种处理方法在成熟培养、桑椹胚发育和囊胚发育方面的趋势基本一致,整体效果的优势序列为EG法>GL法>OPS管法>麦管法。玻璃化冷冻效果低于程序化一步法冷冻法。由于玻璃化冷冻的解冻处理程序复杂,建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法。5、小结通过牛卵母细胞体外培养技术试验的实施,比较系统地掌握了牛卵母细胞成熟培养、精子获能、体外受精和体外培养的技术环节和操作程序,利用共培养系统突破了2C发育阻滞,在精子获能方面建立了新的洗涤和获能方法。本研究的技术指标在同类研究中属于较高水平,在将后研究中将进一步探索和提高。
胡林勇[7]（2008）在《牛体外受精技术体系的优化研究》文中进行了进一步梳理自1982年第一头牛体外受精后代出生以来,虽然国内外学者对牛的体外受精（in vitro fertilization,IVF）技术进行了不断的完善,但是目前对于一些因素对IVF效率的影响还存争议。因此,有必要对牛的IVF体系进行优化研究。这不仅有助于进一步明确这些因素对IVF的影响,而且对于提高IVF胚胎生产效率及加速IVF技术在生产上的推广应用都有重要的意义。本研究在目前国内外体外受精研究的基础上,对牛卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）、IVF及早期胚胎的体外培养（in vitro culture,IVC）作了进一步的优化研究,并重点研究了葡萄糖对牛IVF及早期胚胎体外培养的影响。旨在建立一套经过优化的牛IVF技术体系。1.在卵母细胞体外培养中,比较了不同蛋白质添加物（胎牛血清,fetal bovine serum,FBS;新生牛血清,newborn calf serum,NCS;牛血清白蛋白,bovine serum albumin,BSA）以及表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）对卵母细胞IVM的影响。结果表明,与BSA相比,血清可以显着促进卵母细胞的成熟,而FBS对成熟效果要好于NCS。EGF添加量在20 ng/mL时即明显促进卵母细胞的成熟率,随着其浓度的增加,卵母细胞成熟率并未相应增加。2.在精子获能和受精中,不同公牛个体对体外受精卵裂率、8-细胞胚胎发育率及囊胚率均有明显影响,就体外受精卵裂率来讲,2号牛（62.3%）和3号牛（67.4%）显着高于5号牛（35.8%, P<0.01）。精子获能液中肝素的添加剂量对体外受精的影响仅表现在卵裂率的差异,50 ng/mL组的卵裂率（71.3%）显着高于10 ng/mL组（62.1%, P<0.05）。就卵裂率及囊胚率来讲,获能液和受精液中的葡萄糖添加与否对IVF无明显影响。3.受精卵体外培养时,无论在开始进行胚胎培养时就加入葡萄糖,还是先在不含葡萄糖的培养液中培养48 h后添加葡萄糖,5.6 mmol/L组的囊胚发育率均明显低于其他各组。这表明,在体外高浓度的葡萄糖会抑制牛IVF胚胎的体外发育。在培养开始时即加入3.0 mmol/L葡萄糖时,其8-细胞胚胎发育率低于不添加葡萄糖组（50.9% vs 60.6%, P<0.05）;而在培养48 h后加入3.0 mmol/L葡萄糖时,其8-细胞胚胎与不添加葡萄糖组无明显差异（59.8%, 59.3%, P>0.05）,这提示葡萄糖对胚胎发育的影响与其添加时期有关。在以FBS为蛋白质添加物时,添加1.5 mmol/L葡萄糖与否并未显着影响IVF胚胎的囊胚发育率;而在以BSA为蛋白质添加物时,添加1.5 mmol/L葡萄糖却明显促进了IVF胚胎的囊胚发育率（23.1% vs. 17.3%, P<0.05）。这说明葡萄糖对IVF胚胎体外发育的影响还与蛋白质添加物有关。另外,在培养液中添加1.5 mmol/L葡萄糖时,以FBS为蛋白质添加物组的囊胚发育率显着高于以BSA作为蛋白质添加物组（37.8% vs 23.1%,P<0.05）。这进一步说明FBS可以提高牛IVF体系的胚胎生产效率,在牛IVF体系中具有重要作用。
丁向彬[8]（2008）在《牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究》文中研究指明体细胞核移植的成功说明了高度分化的细胞仍具有支持发育的全能性,卵母细胞胞质中存在着将分化体细胞重编程至多能胚胎细胞状态的全部因子。但是,体细胞核移植的成功率却非常低,而且克隆动物存在不同程度的发育缺陷。目前普遍认为,体细胞核移植的低成功率以及发育异常和供体细胞核的不完全表观遗传重编程有关。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是哺乳动物主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎的正常发育过程中具有显着的调控作用。本文对牛体外受精（IVF）胚胎和体细胞核移植（SCNT）胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行分析,找出体细胞克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异,研究表观遗传状态对克隆胚体外发育能力的影响。1.研究卵母细胞成熟培养液中添加表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对其体外发育的影响,精子的不同处理方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响以及细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30 ng/mL EGF可以显着提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率;精子经上浮法处理后可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞共培养可以显着提高受精后的囊胚发育率,可以用于牛IVF胚胎的体外培养。2.探讨了不同激活方法对牛核移植胚胎激活效果和体外发育的影响,以及细胞共培养体系对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,5μmol/L离子霉素联合2mmol/L 6-DMAP激活牛核移植胚胎的效果比较好,可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞饲养层共培养可以显着提高重构胚的囊胚发育率,比较适合作为体细胞核移植胚胎发育的共培养体系。3.采用免疫荧光染色技术,对牛IVF胚胎和SCNT胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行检测,研究克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异。结果表明,克隆胚胎各个发育阶段DNA甲基化水平均高于体外受精胚胎,其中2-细胞到桑椹胚阶段甲基化水平显着高于IVF胚胎,从头甲基化时间提前;克隆胚胎4-细胞到囊胚阶段乙酰化水平低于体外受精胚胎,其中8-细胞阶段乙酰化水平显着低于体外受精胚胎。与体外受精胚胎相比,牛核移植胚胎附植前各阶段存在异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式。4.用DNA甲基化酶抑制剂（5-aza-dC）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨DNA甲基化水平变化与克隆胚胎体外发育之间的关系。结果表明,低浓度的5-aza-dC（20nM,72h）处理供体细胞或者重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对克隆胚的表观遗传状态没有明显影响;而供体细胞和重构胚均用低浓度5-aza-dC（20nM,72h）处理可以显着提高囊胚发育率和囊胚细胞数,2-细胞阶段DNA甲基化水平降低,8-细胞阶段的DNA甲基化水平显着降低且与IVF胚胎相比差异不再显着,但组蛋白乙酰化水平没有明显改变。说明克隆胚胎DNA甲基化水平影响其体外发育,降低2-细胞和8-细胞阶段的DNA甲基化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。5.用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨组蛋白乙酰化变化与克隆胚胎体外发育的关系。结果表明,供体细胞经50nM TSA处理12h可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,而且2-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平升高;TSA处理重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对重构胚的表观遗传状态没有显着影响;供体细胞和重构胚均用低浓度TSA（50nM,12h）处理可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,8-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平显着增加且与IVF胚胎相比差异不再显着,但TSA处理对DNA甲基化水平没有明显影响。说明克隆胚胎组蛋白乙酰化水平影响其体外发育,增加2-细胞和8-细胞阶段组蛋白乙酰化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。6.联合应用5-aza-dC和TSA处理牛供体细胞和重构胚,研究两种试剂联合处理对重构胚发育的影响,以及对重构胚甲基化水平和乙酰化水平的影响。结果表明,5-aza-dC（20nM, 72h）联合TSA（50nM, 12h）处理供体细胞和重构胚可以更明显的提高克隆胚胎的体外发育能力,联合处理不但显着降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且显着增加了组蛋白的乙酰化水平,从而使克隆胚附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近与体外受精胚胎。说明异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式不利于克隆胚的体外发育,消除这种异常可以提高克隆胚的体外发育能力。进一步的实验表明,5-aza-dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。
马学海[9]（2007）在《牛体外成熟卵母细胞与性控精子体外受精的研究》文中指出本文研究牛卵母细胞的体外成熟培养、与性别分离精子体外受精及早期胚胎体外培养程序的优化,目的是为建立一套完善的牛性控胚胎体外生产体系,从而为该技术走出实验室,在实践中得以应用提供理论依据。同时为核移植、转基因等胚胎工程后技术的应用奠定基础。试验一研究牛卵母细胞体外成熟的培养方法,以提高牛卵母细胞的体外成熟率。通过添加不同激素、以及不同血清,比较不同浓度的激素水平,不同血清及其浓度对牛卵母细胞体外成熟的影响。以期找出在本实验室条件下,牛卵母细胞IVM所需要添加的适宜的激素浓度,血清种类及浓度。为进一步做IVF、IVC打下基础。结果表明,选用胞质均一致密,外围至少有3层以上卵丘细胞包裹的A级卵母细胞。添加10μg/mlFSH、10μg/mlLH、1μg/mlE2,成熟培养22～24h可显着提高卵母细胞体外培养的成熟率;与添加5%血清相比,添加10%的血清成熟效果更好,单独添加10%发情牛血清（OCS）能起到与10%胎牛血清（FCS）在外源激素参与下联合培养同等或者更好的效果。说明在牛细胞培养液中只添加10%OCS而不使用激素是完全可行的,在相同效果的前提下可大大降低成本。试验二研究不同精子获能添加物、不同精子密度、不同精子获能液对性别分离精子IVF的影响。目的是优化性控精液体外受精条件,筛选出简便、高效的获能处理方法。为提高体外成熟卵母细胞的受精质量和数量提供理论基础。研究表明受精液中同时添加一定浓度的肝素（l0μg/ml）与咖啡因（5mM）,能较好地促进牛分离精子体外获能与受精;精子密度在1.0×106个/ml左右比较适合牛分离精子IVF;用BO液和TALP液对牛性控精子进行获能和受精处理,其受精效果差异不显着（P>0.05）,但BO液对早期胚胎的发育影响较小。试验三通过优化培养程序,筛选培养液,以建立适合牛胚胎体外发育的培养体系。通过对共培养体系、不同早期胚胎培养液及分离精子和未分离精子IVF的研究表明,在牛早期胚胎培养过程中,在共培养条件下基础培养液选用配制简单的SOF或CR1,添加一定量的BSA,可获得较高的囊胚发育率和卵裂率。颗粒细胞与输卵管上皮细胞间对胚胎的发育并没有显着差异（P>0.05）,但两组均显着优于非共培养体系（P<0.05）。分离精子和未分离精子在共培养条件下的体外受精效果表明,两者的卵裂率和囊胚率差异不显着（P>0.05）,但未分离精子体外受精效果稍好于分离精子。
郑培栋[10]（2007）在《南阳黄牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精研究》文中研究指明本研究利用屠宰后南阳黄牛的卵巢,采用切割法收集卵巢上直径小于2mm卵泡中的卵母细胞,对所得的A、B级卵母细胞进行体外成熟、体外受精及受精卵体外培养研究,并探讨了相关影响因素,初步建立了南阳黄牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟培养及体外受精的体系。试验结果如下:1.分别采用切割法、剥离法、组织破碎法采集小腔卵泡卵母细胞,并将各组获得的小腔卵泡卵母细胞在成熟培养液中进行体外成熟培养。结果表明,三种方法的采卵数分别为8.63、10.96和12.04,采卵率差异不显着（p＞0.05）,三组小腔卵泡卵母细胞的体外成熟率和受精率以切割法为最高（28.57%,26.28%）,剥离法（25.71%,21.24%）,差异不显着（p＞0.05）,但是显着高于组织破碎法（18.57%,19.17%）（p＜0.05）。2.成熟培养液中分别添加0%（对照组,添加10%FCS）、10%、20%、30%牛卵泡液（BFF）对小腔卵泡卵母细胞进行体外成熟培养。结果表明,添加10%BFF组的成熟率和受精率（27.50%,26.67%）均显着高于添加30%BFF组（12.50%,16.67%）（p＜0.05）。添加10%BFF组的卵母细胞成熟率（27.50%）高于对照组（20.00%）,但差异不显着（p＞0.05）,受精率（26.67%）低于对照组（27.50%）,差异也不显着（p＞0.05）。添加20%BFF组的卵母细胞成熟率及受精率（25.00%,22.58%）均低于添加10%BFF组,差异不显着（p＞0.05）。3.将小腔卵泡卵母细胞分别体外成熟培养24～26h、26～28h、28～30h、30～32h。26～28h组的成熟率及受精率均高于其它三组（25.00%VS 23.33%,21.67%,20.00%）（22.11%VS 19.17%,21.11%,19.48%）,但差异不显着（p＞0.05）,培养24～26h组的受精率低于其它三组（19.17%VS 22.11%,21.11%,19.48%）,但差异不显着（p＞0.05）。4.成熟培养液中分别添加10%FCS、20%FCS、10%OCS、20%OCS对小腔卵泡卵母细胞进行体外成熟培养。结果表明,在分别添加FCS和OCS两组中,10%的血清浓度所得的卵母细胞成熟率及受精率（OCS:31.67%,28.00%）（FCS:28.33%,27.50%）均高于20%的血清浓度（OCS:23.33%,23.08%）（FCS:20.00%,20.95%）,但差异不显着（p＞0.05）且添加OCS所得的效果优于FCS。5.成熟培养液中分别添加A:10%FCS+GCM、B:10%OCS+GCM、C:10%OCS+LIF+GCM、D:10%OCS+LIF+BOECM进行小腔卵泡卵母细胞的体外成熟培养,结果表明,C、D两组的小腔卵泡卵母细胞成熟率及受精率（35.00%,34.21%）（32.50%,32.56%）均显着高于A组（22.50%,23.00%）（p＜0.05）。用颗粒细胞单层（GCM）进行共培养的C组小腔卵泡卵母细胞成熟率及受精率（35.00%,34.21%）均高于用输卵管上皮细胞单层（BOECM）进行共培养的D组（32.50%,32.56%）,但差异不显着（p＞0.05）。6.分别采用Percoll密度梯度离心法、上浮法、直接离心洗涤法对精液进行洗涤,用于南阳牛成熟小腔卵泡卵母细胞的体外受精。结果表明,上浮法洗涤精液所得的受精率及卵裂率（31.11%,28.57%）均高于Percoll密度梯度离心法（26.56%,25.00%）,但差异不显着（p＞0.05）。直接离心法的受精率及卵裂率（21.21%,14.28%）均显着低于上浮法（31.11%,28.57%）（p＜0.05）,其卵裂率也显着低于Percoll密度梯度离心法（25.00%）（p＜0.05）。7.在改良台氏液（mTyrode’s液）中分别添加10mg/l、20mg/l、30mg/l、、40mg/l、50mg/l的肝素进行精子的获能处理,然后进行体外受精。结果表明,五组的受精率呈升高趋势（20.45%,21.57%,23.81%,26.47%,27.91%）,但各组之间无显着差异（p＞0.05）。五组的卵裂率也逐渐升高,但添加10mg/l、20mg/l、30mg/l组之间差异不显着（p＞0.05）。添加40mg/l、50mg/l组的卵裂率显着高于添加10m/l组（p＜0.05）。8.用颗粒细胞单层（GCM）培养体系和输卵管上皮细胞单层（BOECM）培养体系进行受精卵的体外培养。结果表明,BOECM培养体系所得的受精率（28.99%）及4—细胞胚发育率（7.14%）均高于GCM培养体系（26.39%,5.26%）,但差异不显着（p＞0.05）。由此可知,输卵管上皮细胞单层和颗粒细胞单层均可用于南阳黄牛体外受精卵的体外培养。
二、卵泡直径和卵丘细胞对牛卵母细胞体外受精后发育潜力的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、卵泡直径和卵丘细胞对牛卵母细胞体外受精后发育潜力的影响（论文提纲范文）
（1）低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 哺乳动物卵母细胞成熟研究进展 |
| 1.1 卵母细胞的发育与成熟过程 |
| 1.2 卵母细胞与外界环境的物质、信息交流途径 |
| 1.3 卵母细胞成熟的分子调控机制 |
| 1.4 影响卵母细胞成熟和发育能力的因素 |
| 2 促进卵母细胞体外成熟和发育能力的措施 |
| 2.1 筛选发育能力较高的卵母细胞 |
| 2.2 增强卵丘细胞-卵母细胞互作 |
| 2.3 优化卵母细胞的培养环境与培养程序 |
| 3 氧分压和ROS对卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 4 牦牛卵母细胞体外成熟研究进展 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 不同氧分压对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试验试剂及其配制 |
| 1.3 试验耗材 |
| 1.4 试验仪器 |
| 1.5 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同氧分压对牦牛卵母细胞成熟率的影响 |
| 2.2 不同氧分压对牦牛卵母细胞ROS水平和GSH含量的影响 |
| 2.3 不同氧分压对牦牛孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.4 不同氧分压对牦牛IVF胚胎发育的影响 |
| 2.5 不同氧分压对牦牛IVF囊胚基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞成熟率的影响 |
| 2.2 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞ROS水平的影响 |
| 2.3 不同抗氧化剂对卵母细胞GSH含量的影响 |
| 2.4 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞线粒体分布的影响 |
| 2.5 不同抗氧化剂对牦牛IVF胚胎发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 单细胞测序分析不同氧分压对牦牛卵母细胞转录组的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 测序数据质量分析 |
| 2.2 比对分析 |
| 2.3 基因表达分析 |
| 2.4 差异表达基因GO分析 |
| 2.5 差异表达基因KEGG分析 |
| 2.6 差异表达基因验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 高通量测序分析不同氧分压对牦牛卵丘细胞转录组的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 测序数据质量分析 |
| 2.2 比对分析 |
| 2.3 转录本组装与新转录本预测 |
| 2.4 基因表达分析 |
| 2.5 差异表达基因GO分析 |
| 2.6 差异表达基因KEGG分析 |
| 2.7 差异表达基因验证 |
| 2.8 不同氧分压对卵母细胞和卵丘细胞转录组影响的对比分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论、创新与不足 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 不同氧分压条件下牦牛卵母细胞DEGs(5% O_2 vs20% O_2) |
| 附表2 不同氧分压条件下牦牛卵丘细胞DEGs(5% O_2 vs20% O_2) |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文章综述 |
| 第一章 钙稳态 |
| 1.1 钙稳态失衡 |
| 1.2 钙稳态失衡与内质网应激及细胞凋亡 |
| 第二章 玻璃化冷冻保存卵母细胞的研究 |
| 2.1 玻璃化冷冻 |
| 2.2 卵母细胞玻璃化冷冻损伤 |
| 2.3 牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展 |
| 第三章 牛卵母细胞的体外成熟的研究进展 |
| 3.1 牛卵母细胞体外成熟概况 |
| 3.2 影响牛卵母细胞体外成熟的因素 |
| 第四章 白血病抑制因子在哺乳动物生殖中的作用 |
| 4.1 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF) |
| 4.2 LIF调控卵母细胞减数分裂恢复及相关信号通路 |
| 4.3 LIF在哺乳动物早期胚胎发育中的作用 |
| 4.4 LIF在胚胎附植中的作用 |
| 第二部分 研究论文 |
| 第一章 内质网钙通道对牛卵母细胞冷冻后存活率的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二章 2-APB对冷冻后卵母细胞发育能力的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三章 2-APB对冷冻后卵母细胞内质网应激和细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四章 LIF促进牛卵母细胞体外成熟及其作用机制 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第五章 LIF对牛卵母细胞发育能力和多潜能基因表达的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 博士期间发表的论文 |
（4）牛卵母细胞体外受精及热应激条件下IGF-I对其影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 牛卵母细胞体外成熟研究进展 |
| 1.1.1 卵泡与卵母细胞的生长发育 |
| 1.1.2 卵母细胞的成熟原理 |
| 1.1.3 卵母细胞的凋亡 |
| 1.1.4 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 卵母细胞体外受精研究进展 |
| 1.2.1 精子获能 |
| 1.2.2 影响卵母细胞体外受精的因素 |
| 1.3 早期胚胎体外培养研究进展 |
| 1.3.1 早期胚胎发育阻断 |
| 1.3.2 早期胚胎的体外培养体系 |
| 1.3.3 影响早期胚胎体外培养的因素 |
| 1.4 热应激条件下IGF-Ⅰ对雌性动物生殖系统的影响 |
| 1.4.1 热应激对雌性动物生殖系统的影响 |
| 1.4.2 IGF-Ⅰ对雌性动物生殖系统的影响 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 正常体温条件下牛卵母细胞体外成熟、受精及早期胚胎体外培养技术研究的实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验设计与统计分析 |
| 2.2 热应激条件下IGF-Ⅰ对卵母细胞发育能力的影响的实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验设计与统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 正常体温条件下牛卵母细胞体外成熟、受精及早期胚胎体外培养技术研究的实验结果与分析 |
| 3.1.1 牛卵母细胞体外成熟 |
| 3.1.2 牛卵母细胞体外受精 |
| 3.1.3 牛早期胚胎体外培养 |
| 3.2 热应激条件下IGF-Ⅰ对卵母细胞发育能力的影响的实验结果与分析 |
| 3.2.1 GV期牛卵母细胞在热应激条件下添加IGF-Ⅰ对其发育能力的影响 |
| 3.2.2 热应激条件下牛卵母细胞体外成熟时IGF-Ⅰ的添加对其发育能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卵巢体外保存时间对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.2 卵泡大小对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.3 COCs级别对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.4 卵丘细胞对卵母细胞体外受精的影响 |
| 4.5 精卵共孵育时间对卵母细胞体外受精的影响 |
| 4.6 半量换液或添加犊牛血清对早期胚胎发育能力的影响 |
| 4.7 热应激对卵母细胞成熟及发育能力的影响 |
| 4.7.1 热应激对卵母细胞发育能力的影响:2-细胞及4-细胞的发育 |
| 4.7.2 热应激对牛卵母细胞胞质及核成熟的影响 |
| 4.8 热应激条件下IGF-Ⅰ对牛卵母细胞的影响 |
| 4.8.1 IGF-Ⅰ对胚胎发育的影响 |
| 4.8.2 IGF-Ⅰ对卵母细胞成熟的影响 |
| 4.8.3 IGF-Ⅰ的抗凋亡作用 |
| 4.8.4 IGF-Ⅰ对胚胎基因表达的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）牛IVF胚胎培养与冷冻方法优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛卵母细胞体外受精研究进展 |
| 1.1.1 概况 |
| 1.1.2 与体细胞共培养的研究进展 |
| 1.1.3 胚胎培养中添加卵泡液的研究进展 |
| 1.1.4 牛胚胎体外培养方法研究进展 |
| 1.2 卵母细胞及胚胎冷冻方法研究进展 |
| 1.2.1 发展概况 |
| 1.2.2 冷冻原理 |
| 1.2.3 冷冻保存的方法 |
| 第二章 输卵管和颗粒细胞单层对牛体外受精胚胎发育的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 颗粒细胞对牛IVF 胚胎发育的影响 |
| 2.2.2 输卵管和颗粒细胞单层对牛IVF 胚胎发育的影响 |
| 2.2.3 培养微滴大小对IVF 胚胎发育的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 颗粒细胞对牛IVF 胚胎发育的影响 |
| 2.3.2 输卵管上皮细胞单层对牛IVF 胚胎发育的影响 |
| 2.3.3 培养微滴大小对IVF 胚胎发育的影响 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 卵泡及卵泡液对牛卵母细胞体外受精后发育的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验设计 |
| 3.1.4 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 卵泡大小对卵母细胞IVM、IVF、IVC 后发育潜力的影响 |
| 3.2.2 牛卵泡液(BFF)对卵母细胞IVM、IVF、IVC 后发育潜力的影响 |
| 3.2.3 BFF 浓度对牛卵母细胞IVM、IVF、IVC 后发育潜力的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 卵泡大小对卵母细胞IVM、IVF、IVC 后发育潜力的影响 |
| 3.3.2 牛卵泡液(BFF)对卵母细胞IVM、IVF、IVC 后发育潜力的影响 |
| 3.3.3 BFF 浓度对牛卵母细胞IVM、IVF、IVC 后发育潜力的影响 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 改进V 形孔培养法对牛胚胎体外生产效果的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同培养法对牛IVF 胚胎发育的影响 |
| 4.2.2 不同培养方法对囊胚总细胞数的影响 |
| 4.2.3 不同培养方法对囊胚孵化率的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 m WOW 法可以用于单个卵母细胞或胚胎的培养 |
| 4.3.2 不同培养法对IVF 胚胎囊胚总细胞数及囊胚发育率的影响 |
| 4.3.3 m WOW 法改进IVF 胚胎质量和发育率的原因 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 牛未成熟卵母细胞冷冻方法研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同玻璃化冷冻液对牛COCs 的毒性实验 |
| 5.2.2 不同玻璃化冷冻液对牛COCs 体外受精后发育能力的影响 |
| 5.2.3 不同冷冻方法对牛COCs 体外受精后发育能力的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 不同浓度玻璃化冷冻液对牛COCs 的毒性 |
| 5.3.2 不同浓度玻璃化冷冻液对牛COCs 体外受精后发育能力的影响 |
| 5.3.3 OPS 法比细管法更适于牛未成熟卵母细胞的冷冻 |
| 5.3.4 虽然牛GV 期卵母细胞的冷冻效率很低，但仍值得做进一步尝试 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 封闭式拉长细管法冷冻牛 IVF 胚胎研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 实验 1:三种不同冷冻方法对牛体外生产胚胎存活力的影响 |
| 6.2.2 实验 2:三种不同冷冻方法对牛体内获得胚胎存活力的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 CPS 法既可以减少液氮污染,又保留了 OPS 法快速降温的优点 |
| 6.3.2 CPS 法的冷冻速率略低于 OPS 法 |
| 6.3.3 体外生产的牛胚胎更适于采用玻璃化冷冻法 |
| 6.4 结论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）牛卵母细胞及体外胚培养技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一章 卵母细胞体外胚生产的原理与研究进展 |
| 1 卵母细胞体外成熟的原理和研究进展 |
| 2 卵母细胞体外受精与精子体外获能 |
| 3 早期胚胎体外培养的生物学原理与研究进展 |
| 4 小结与展望 |
| 第二章 卵母细胞低温保存研究进展 |
| 1 卵母细胞冷冻保存意义及其发展状况 |
| 2 卵母细胞低温冷冻保存的基本原理 |
| 3 卵母细胞在低温冷冻保存过程中的受损机制 |
| 4 冷冻方法 |
| 5 冷冻保护剂 |
| 6 解冻及脱除冷冻保护剂的方法 |
| 7 冷冻对卵母细胞造成的影响 |
| 8 影响卵母细胞冷冻效果的因素 |
| 9 展望 |
| 第三章 牛卵母细胞体外成熟技术研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 分析讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 牛卵母细胞体外受精技术研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 分析讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 牛体外受精胚胎培养技术研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 分析讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 牛卵母细胞冷冻试验研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 分析讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的主要论文 |
| 导师简介 |
（7）牛体外受精技术体系的优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 牛体外受精技术研究进展 |
| 1.1 体外受精研究概况 |
| 1.2 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.2.1 卵母细胞体外成熟和调节机制 |
| 1.2.2 卵母细胞的获取 |
| 1.2.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.2.4 卵母细胞成熟的判定 |
| 1.2.5 影响卵母细胞成熟的因素 |
| 1.3 精子的体外获能 |
| 1.3.1 精子获能的机理 |
| 1.3.2 精子体外获能的方法 |
| 1.3.3 获能的基础培养液 |
| 1.3.4 影响精子体外获能的因素 |
| 1.4 体外受精 |
| 1.4.1 受精的机理 |
| 1.4.2 多精受精 |
| 1.4.3 影响IVF 的因素 |
| 1.5 受精卵的体外培养 |
| 1.5.1 发育阻滞 |
| 1.5.2 发育阻滞的克服 |
| 1.5.3 早期胚胎体外培养的方法 |
| 1.5.4 影响胚胎体外培养的因素 |
| 1.6 存在问题及前景展望 |
| 试验部分 |
| 第二章 血清及EGF 对牛卵巢卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同类型的血清或其替代物对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.2.2 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 公牛、肝素及葡萄糖对牛体外受精的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 来源于不同公牛的精子对IVF 的影响 |
| 3.2.2 肝素浓度对牛IVF 的影响 |
| 3.2.3 获能液和受精液中添加葡萄糖对牛IVF 的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 不同浓度葡萄糖对牛体外受精胚胎体外发育的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 IVF 胚胎培养时即添加不同浓度的葡萄糖对其体外发育的影响 |
| 4.2.2 IVF 胚胎培养48 h 后添加不同浓度的葡萄糖对其体外发育的影响 |
| 4.2.3 在不同蛋白添加物条件下葡萄糖对IVF 胚胎体外发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞体外成熟与体外受精的研究进展 |
| 1.1 卵泡卵母细胞体外成熟 |
| 1.1.1 卵母细胞成熟的机理 |
| 1.1.2 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.1.3 卵母细胞成熟的判断 |
| 1.1.4 卵母细胞的获取与分级 |
| 1.1.5 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 精子的体外获能与体外受精 |
| 1.2.1 受精作用机制 |
| 1.2.2 精子体外获能 |
| 1.2.3 体外受精 |
| 1.2.4 体外受精的影响因素 |
| 1.3 受精卵的体外培养 |
| 1.3.1 受精卵体外发育阻断 |
| 1.3.2 受精卵体外培养系统 |
| 1.3.3 影响体外受精卵体外发育的因素 |
| 1.4 小结与展望 |
| 第二章 哺乳动物细胞核移植的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 2.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 2.3 哺乳动物异种细胞核移植研究进展 |
| 2.4 哺乳动物细胞核移植的方法和程序 |
| 2.4.1 受体细胞的选择与去核 |
| 2.4.2 供体细胞的选择 |
| 2.4.3 细胞核的移植 |
| 2.4.4 重组胚的激活 |
| 2.4.5 重构胚的培养 |
| 2.5 哺乳动物核移植相关机理的研究进展 |
| 2.5.1 MPF 与核移植的关系 |
| 2.5.2 体细胞供体核的表观遗传重编程 |
| 2.6 影响哺乳动物核移植成功率的因素 |
| 2.6.1 核受体胞质对核移植的影响 |
| 2.6.2 核供体对核移植的影响 |
| 2.6.3 融合-激活方案对核移植的影响 |
| 2.6.4 核移植胚胎的体外培养对发育的影响 |
| 2.7 细胞核移植技术存在的问题和应用前景 |
| 2.7.1 细胞核移植技术存在的问题 |
| 2.7.2 细胞核移植技术的应用前景 |
| 第三章 牛卵泡卵母细胞体外受精的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 成熟液中添加EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.2.2 不同精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.2.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.3.2 精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.3.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 激活方法和共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.2.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 牛体细胞克隆胚胎DNA 甲基化和组蛋白乙酰化分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 抗5－甲基胞嘧啶抗体和抗组蛋白H3(acetyl K18)抗体特异性检测 |
| 5.2.2 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核DNA 甲基化水平比较 |
| 5.2.3 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核组蛋白乙酰化水平比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 DNA 甲基转移酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 5-aza-dC 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.2 5-aza-dC 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.3 体细胞和重构胚均用5-aza-dC处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 组蛋白脱乙酰化酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 TSA 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.2 TSA 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.3 体细胞和重构胚均用TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 5-aza-dC 联合 TSA 对牛核移植胚胎体外发育 及其表观遗传状态的影响 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 5-aza-dC＋TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 8.2.2 不同个体来源成纤维细胞作核供体，供体细胞和重构胚均用5-aza-dC＋TSA 处理后对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）牛体外成熟卵母细胞与性控精子体外受精的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、哺乳动物体外受精技术研究进展 |
| 1 体外受精技术研究进展 |
| 1.1 国内外体外受精技术的研究概况 |
| 1.2 性控精子体外受精研究概况 |
| 2 牛卵母细胞体外成熟培养 |
| 2.1 卵母细胞体外成熟研究进展 |
| 2.2 卵母细胞的成熟过程及调节机制 |
| 2.3 卵母细胞体外成熟标志 |
| 2.4 卵母细胞的获取 |
| 2.5 卵母细胞体外成熟的影响因素 |
| 3 分离精子的获能和体外受精 |
| 3.1 精子分离的原理 |
| 3.2 分离精子的体外获能（capacitation） |
| 4 早期胚胎体外培养的研究进展 |
| 4.1 胚胎早期发育阻滞(block of development) |
| 4.2 影响早期胚胎体外发育的因素 |
| 5 存在问题与前景 |
| 第二章 试验研究 |
| 实验一 牛卵母细胞体外成熟的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 促性腺激素对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.2 雌二醇对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.3 不同血清及其不同浓度对牛卵母细胞成熟的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 促性腺激素与卵母细胞体外成熟 |
| 3.2 雌二醇与卵母细胞体外成熟 |
| 3.3 不同血清及其不同浓度对牛卵母细胞成熟的影响 |
| 4 结论 |
| 实验二 获能液及精子密度对性控精子IVF 的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 获能液中肝素和咖啡因的添加对卵母细胞IVF 影响 |
| 2.2 不同精子密度对牛卵母细胞IVF 的影响 |
| 2.3 不同受精液对牛卵母细胞IVF 的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 获能液中咖啡因和肝素的添加对卵母细胞IVF 影响 |
| 3.2 不同性控精子密度对牛卵母细胞IVF 的影响 |
| 3.3 不同受精液对牛性控精子IVF 的影响 |
| 4 结论 |
| 实验三 牛性控IVF 胚胎体外培养条件的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 体细胞共培养对牛IVF 胚胎体外发育的影响 |
| 2.2 不同受精卵培养液在共培养系统下对早期胚胎体外发育的影响 |
| 2.3 分离和未分离精子在共培养条件下的受精和胚胎发育情况比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 体细胞共培养对牛IVF 胚胎体外发育的影响 |
| 3.2 不同受精卵培养液在共培养系统下对早期胚胎体外发育的影响 |
| 3.3 分离和未分离精子的受精和胚胎发育情况的比较 |
| 4 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（10）南阳黄牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1.文献综述 哺乳动物小腔卵泡卵母细胞体外成熟及体外受精的研究进展 |
| 1.1 小腔卵泡卵母细胞的体外成熟 |
| 1.1.1 小腔卵泡卵母细胞的获取与分级 |
| 1.1.2 卵母细胞成熟的机理 |
| 1.1.3 卵母细胞成熟的分子调控机理 |
| 1.1.4 卵母细胞的成熟判断 |
| 1.1.5 影响小腔卵泡卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 精子的体外获能 |
| 1.2.1 精子获能机理 |
| 1.2.2 精子的预处理 |
| 1.2.3 精子的体外获能方法 |
| 1.2.4 获能精子的检测 |
| 1.2.5 精子体外获能的影响因素 |
| 1.3 卵母细胞的体外受精 |
| 1.3.1 受精机理 |
| 1.3.2 影响卵母细胞体外受精的因素 |
| 1.4 受精卵的体外培养 |
| 1.4.1 早期胚胎的发育阻断 |
| 1.4.2 受精卵的体外培养方法 |
| 1.4.3 影响体外受精卵体外发育的因素 |
| 1.5 小结与展望 |
| 2.引言 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 卵巢的采集与保存 |
| 3.1.2 主要仪器、设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 操作液 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 小腔卵泡卵母细胞的采集 |
| 3.2.2 小腔卵泡卵母细胞的成熟培养 |
| 3.2.3 精子的洗涤及体外获能处理 |
| 3.2.4 小腔卵泡卵母细胞的体外受精 |
| 3.2.5 受精卵的体外培养 |
| 3.2.6 颗粒细胞饲养层的制作 |
| 3.2.7 输卵管上皮细胞饲养层的制作 |
| 3.2.8 统计分析 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 小腔卵泡卵母细胞的采集 |
| 4.2 小腔卵泡卵母细胞的成熟培养 |
| 4.2.1 采集方法对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 4.2.2 不同浓度的牛卵泡液(BFF)对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 4.2.3 培养时间对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 4.2.4 不同种类及浓度的血清对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 4.2.5 不同培养系统对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 4.3 精子的体外获能与体外受精 |
| 4.3.1 不同精液洗涤方法对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 4.3.2 肝素浓度对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 4.4 受精卵的体外培养 |
| 4.4.1 体细胞共培养体系对南阳牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 5.讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 采集方法对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 5.1.2 不同浓度的牛卵泡液(BFF)对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 5.1.3 培养时间对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 5.1.4 不同种类及浓度的血清对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 5.1.5 不同培养系统对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与发育潜力的影响 |
| 5.1.6 不同精液洗涤方法对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 5.1.7 肝素浓度对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 5.1.8 体细胞共培养体系对南阳牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 5.2 结论 |
| 5.3 创新点 |
| 5.4 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附表.常用溶液配方 |
| 附图:实验照片 |
| 作者简介 |
四、卵泡直径和卵丘细胞对牛卵母细胞体外受精后发育潜力的影响（论文参考文献）
- [1]低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制[D]. 李瑞哲. 甘肃农业大学, 2021
- [2]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [3]内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究[D]. 莫显红. 中国农业大学, 2014(02)
- [4]牛卵母细胞体外受精及热应激条件下IGF-I对其影响的研究[D]. 亓美玉. 东北农业大学, 2011(02)
- [5]牛IVF胚胎培养与冷冻方法优化[D]. 禹学礼. 西北农林科技大学, 2010(10)
- [6]牛卵母细胞及体外胚培养技术研究[D]. 桑国俊. 甘肃农业大学, 2008(08)
- [7]牛体外受精技术体系的优化研究[D]. 胡林勇. 西北农林科技大学, 2008(11)
- [8]牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究[D]. 丁向彬. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [9]牛体外成熟卵母细胞与性控精子体外受精的研究[D]. 马学海. 石河子大学, 2007(06)
- [10]南阳黄牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精研究[D]. 郑培栋. 河南农业大学, 2007(10)