一、应用PCR方法鉴别绵羊致病性单核增多症李氏杆菌（论文文献综述）
沈达[1]（2021）在《江苏省部分规模化猪场肠道病原菌的临床检测及大肠杆菌的部分特性研究》文中研究表明致病性大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、产单核细胞李氏杆菌以及产气荚膜梭菌是兽医临床的肠道病原菌,对猪病的发生以及公共卫生具有一定影响,做好其临床监测具有重要价值。抗菌药物在猪细菌病的治疗过程中发挥了主要作用,但由于不合理的使用,使得细菌的耐药性不断增加,科学合理使用抗生素已经成为重要的产业需求。为了解规模化养殖场中重要病原菌的流行情况,采集了江苏省部分地区腹泻猪肛拭子493份。建立了 PCR方法对致病性大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、产单核细胞李氏杆菌以及产气荚膜梭菌进行了临床检测。结果发现:致病性大肠杆菌阳性样品301份（61%）、空肠弯曲杆菌阳性样品3份（0.6%）、产单核细胞李氏杆菌阳性样品2份（0.4%）、产荚膜梭菌阳性样品14份（2.8%）。该结果表明致病性大肠杆菌仍然是引起猪腹泻的主要病原。空肠弯曲杆菌、产单核细胞李氏杆菌以及产气荚膜梭菌虽然为低频率感染,但在公共卫生方面值得关注。对检测为致病性大肠杆菌阳性的样品进行细菌学分离,获得了301株大肠杆菌。通过常见菌毛、毒素、毒力岛等基因的检测,结果发现了分离株存在16种不同的毒力基因类型,分别为F18+Stx2e+125株（41.5%）、HPI+68株（22.6%）、Stx2e+30株（10%）、LT1+ST2+20株（6.6%）、F4+Stx2e+10株（3.3%）、LT1+ST1+10株（3.3%）、ST1+ST2+Stx2e+9株（3%）、F4+6株（2%）,F41+5株（1.7%）、ST2+4株（1.3%）、F5+3株（1%）,LEE+3株（1%）,LT1+3株（1%）、ST1+3株（1%）、F4+F5+F41+1 株（0.3%）,ST1+ST2+LEE+Stx2e+1株（0.3%）。进一步分析表明,HPI+大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌是1～15日龄仔猪腹泻的主要病原,Stx2e+的产肠毒素大肠杆菌则主要来自30日龄以上的腹泻仔猪。通过使用O抗原单因子血清对分离株进行O抗原型鉴定,确定了 151株致病性大肠杆菌的O抗原型,分别为O139（66.8%）、O107（11.9%）、O15（10.6%）、O45（2.6%）、O101（2.6%）、O54（1.3%）、O21（0.7%）、O138（0.7%）、O78（0.7%）、O141（0.7%）、O159（0.7%）、O111（0.7%）。其中O139抗原型主要见于 F18+Stx2e+株。为比较不同毒力因子型大肠杆菌的毒力差异,选取3株代表性分离株（F4+株,F41+Sxt2e+株,ST1+ST2+LEE+Stx2e+株）,以4周龄ICR小鼠进行半数致死量测定。结果显示,所试分离株的半数致死量分别为3.5×109 CFU/0.5 mL、1.9×109 CFU/0.5 mL、1.2×109 CFU/0.5 mL。表明致病性大肠杆菌的毒力与其携带的毒力基因呈现明显的相关性。通过对小鼠进行病理组织学观察,可发现攻毒组小鼠的小肠细胞轮廓不清晰、细胞坏死、肠黏膜脱落、炎性细胞浸润等明显病变,而对照组未发现病变。为兽医临床用药工作提供数据参考,对其中150株致病性大肠杆菌进行了抗生素耐药性测定。结果发现大部分分离株（83.3%）对6～8种抗生素具有耐药性,其中环丙沙星、阿米卡星、氨苄西林、强力霉素、头孢曲松、多粘菌素、新霉素、卡那霉素、阿莫西林、四环素、庆大霉素、磷霉素、复方新诺明的耐药比例分别为90.7%、87.3%、80.7%、78%、67.3%、57.3%、56.7%、52.7%、51.3%、50%、43.3%、12.7%、10.7%。进一步分析发现,不同日龄仔猪和不同地区的细菌耐药情况存在一定的差异,日龄越大的腹泻猪,其分离株耐药率越高,这或许与临床用药的频率以及不同地区用药的差异有关。
熊静禹[2]（2020）在《产单核细胞李氏杆菌的临床分离与FlaA单克隆抗体的制备》文中认为产单核细胞李氏杆菌（Listeria Monocytogenes,LM）,为革兰氏阳性细菌,为胞内寄生菌。不但能感染动物,也可以感染人类引发公共卫生问题。为做好江苏省肉羊的健康养殖、肉羊源相关病原的风险评估,该研究对江苏主要养羊地区进行了产单核细胞李氏杆菌的临床检测,并研制了针对产单核细胞李氏杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体。通过PCR方法,对2017-2019年江苏主要养羊地区采集的1036份羊源肛拭子样品进行临床快速检测,确定2份（0.19%）样品为产单核细胞李氏杆菌阳性;该结果表明了产单核细胞李氏杆菌在江苏的肉羊养殖中为低频率感染,流行率较低。取2份PCR检测阳样品用特异性培养基PALCAM琼脂进行细菌分离,获得2株疑似产单核细胞李氏杆菌（分别命名为JC8株、JC46株）。通过对分离株的质谱鉴定、生化分析,确定JC8株、JC46株细菌均为产单核细胞李氏杆菌。利用多重PCR对分离株进行血清型鉴定,2株分离株血清型均属于1/2a或3a型。生物被膜形成能力试验显示JC46株有弱生物被膜形成能力,JC8株无生物被膜形成能力。为指导江苏地区产单核细胞李氏杆菌感染的抗生素用药,对JC8株与JC46株细菌进行了药敏实验,结果表明2株细菌均对链霉素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、头孢拉定、林可霉素、罗红霉素以及阿奇霉素敏感,对多粘菌素和恩诺沙星耐药;JC8株对青霉素耐药,JC46株对青霉素敏感。FlaA为产单核细胞李氏杆菌的鞭毛蛋白,具有良好的抗原性,其抗体可用于该菌的检测。根据GenBank发布的FlaA基因（flaA）序列,设计1对特异性引物用于FlaA结构蛋白基因的扩增。使用PCR方法将其扩增并插入到pMD-18-T中进行克隆。经序列分析表明所扩增的FlaA结构蛋白基因与发表的序列一致。用BamH I与SamI将目的片段从pMD-18-T载体切出,并克隆至表达载体pGEX-6P-1;获得的质粒pGEX-6P-1-FlaA转化进大肠杆菌BL21（DE3）中。含有重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导表达后,在细菌裂解上清与沉淀中均表达,融合蛋白GST-FlaA（约55 kDa）。使用GST纯化柱纯化蛋白,用抗GST血清作为第一抗体,羊抗鼠IgG作为第二抗体进行Western-blot,结果显示融合蛋白可与抗GST血清发生反应。利用所得已纯化融合蛋白GST-FlaA作为免疫原,按照常规程序免疫6周龄BALB/c小鼠后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。通过间接ELISA筛选阳性细胞株,最终获得2株能够稳定分泌识别FlaA的单克隆抗体细胞株（3C4株和6F8株）。抗体亚类鉴定结果显示2株细胞产生的抗体亚类均为IgGl,轻链均为κ型。使用体内诱生法获得腹水,3C4株和6F8株细胞的腹水效价分别为1:256000、1:64000,且均能与FlaA包被抗原呈阳性反应,并与其他细菌无交叉反应。通过凝集试验,3C4株和6F8株单抗均能与产单核细胞李氏杆菌发生凝集反应。表明所制备的单抗可以用于产单核细胞李氏杆菌分离株的鉴定。
宋海港[3]（2020）在《江苏地区水禽源重要病原菌的临床检测及大肠杆菌的分子流行病学和部分特性研究》文中进行了进一步梳理近年来,水禽疫病并没有因为规模化程度的提高而降低,并且多种病原继发或并发使得细菌病病情更加复杂,加之部分地区药物敏感性监测、综合性防治措施和流行病学数据尚不完善,因而造成抗生素药物的乱用和滥用,在生产养殖中给水禽细菌病的预防和控制带来了严峻的挑战。为快速检测江苏地区水禽源的4种重要病原菌,根据大肠杆菌F1菌毛A亚基基因（fimA）与P菌毛C亚基基因（papC）、鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白（OmpA）基因（ompA）、产单核细胞李氏杆菌溶血素基因（hlyA）、沙门氏菌肠毒素基因（stn）,合成5对引物,建立了快速检测的PCR方法。于2017～2019年采集江苏10个地级市水禽规模养殖场的768份样品,其中包括临床健康肛拭子样品510份,临床发病水禽组织样品258份。运用PCR方法对4种水禽重要病原菌进行了检测,结果发现江苏地区水禽样品大肠杆菌F1菌毛基因与P菌毛基因的平均检出率分别为74.21%（570/768）和0.78%（6/768）,沙门氏菌平均检出率为5.60%（43/768）,鸭疫里默氏杆菌平均检出率为2.73%（21/768）,产单核细胞李氏杆菌平均检出率为7.42%（57/768）。表明江苏地区水禽细菌性疾病中大肠杆菌的发病率最高,产单核细胞李氏杆菌感染也不容忽视,该结果为水禽源细菌病的防控提供一定参考数据。大肠杆菌在水禽细菌病中极为重要,因此为了揭示大肠杆菌各个毒力基因的分布情况,对以上检出大肠杆菌阳性的355份肛拭子样品和213份组织样品,运用PCR方法检测其中所含有的大肠杆菌主要毒力因子的基因（温度敏感性血凝素基因Tsh、溶血素E基因hlyE）和大肠杆菌毒力岛基因（ETT2毒力岛ECs3703和ECs3737基因、HPI毒力岛irp2基因和LEE毒力岛eaeA基因）。通过大肠杆菌的分离纯化和鉴定,从肛拭子样品获得342株大肠杆菌,共有12种毒力基因组合,表型分别为F1+（217株）,F1+ETT2+（56株）,F1+HlyE+（3 株）,ETT2+HPI+（15 株）,F1+ETT2+HPI+（13 株）,F1+HPI+Tsh+（1 株）,F1+ETT2+HPI+Tsh+（7 株）,F1+E-TT2+LEE+Tsh+（8 株）,F1+P+ETT2+Tsh+（2 株）,F1+ETT2+LEE+Tsh+HlyE+（3 株）,ETT2+（6株）,F1+HPI+（11株）,从临床发病组织样品共获得206株大肠杆菌,共有13种毒力基因组合,分别为 F1+（13 株）,F1+ETT2+（39 株）,F1+HlyE+（2 株）,F1+E-TT2+HPI+（100 株）,F1+HPI+Tsh+（7 株）,F1+ETT-2+HPI+Tsh+（7 株）,F1+ETT2+LEE+Tsh+（5株）,F1+P+ETT2+Tsh+（4 株）F1+ETT2+LEE+Tsh+HlyE+（3 株）,ETT2+Tsh+（2 株）,Tsh+（7 株）,ETT2+HPI+（4株）,通过比较发现临床健康水禽和发病水禽分离株的基因组合共有15种,上面前10种基因组合是相同的,但比率不同,临床健康水禽致病性大肠杆菌肛拭子分离株中仅单一基因F1+菌株高达63.45%,其次是F1+ETT2+占比16.37%,而发病水禽致病性大肠杆菌组织分离株中占比率最高的基因组合为F1+ETT2+HPI+占比率高达48.54%,其次为 F1+ETT2+占比 1 8.93%。为分析水禽源大肠杆菌的药物敏感性,选取13种抗生素对以上地区获得的大肠杆菌进行药敏实验。结果显示,总体上临床健康与发病水禽源分离株对13种药物的敏感度差异不大,超过70%以上的水禽大肠杆菌分离株对强力霉素和四环素耐药,超过70%以上的水禽大肠杆菌分离株对磷霉素、多黏菌素B敏感。进一步分析发现,99.7%大肠杆菌分离株为多重耐药,最常见的耐药组合为强力霉素+四环素+新霉素+复方新诺明,不同地区、不同养殖场对药物的敏感度呈现一定的差异,但对强力霉素、四环素的耐药性具有普遍性。为了研究带有不同毒力因子的大肠杆菌的致病性差异,将分离已知毒力因子的大肠杆菌（F1+菌株、F1+ETT2+菌株和F1+ETT2+HPI+菌株）各一株,分别测定其对一周龄雏鸭的半数致死量（LD50）,结果表明,毒力基因为F1+ETT2+HPI+的致病性大肠杆菌分离株毒力最强（LD50 为 2.88×108 CFU/0.5 mL）,其次是F1+ETT2+菌株（LD50 为 6.92×108 CFU/0.5 mL）,F1+菌株毒力相对最弱（LD50为4.28×109 CFU/0.5mL）,测定结果表明,水禽源致病性大肠杆菌毒力强弱与其所含的毒力基因数量呈正相关,其含有的毒力基因越多,毒力就相对越强。
关玉婷[4]（2020）在《牛乳中三种致病菌基因快速检测方法的建立》文中研究说明乳品中包含了许多营养成分,是人们日常生活重要的食物品种,乳品的质量安全与消费者的健康及乳品行业的健康发展有直接关系。原料液态奶中细菌总数的多少和乳品中的致病菌直接影响着乳品的质量好坏,国标要求生乳的细菌总数不得超过2×106 cfu/mL,而巴氏乳中细菌总数不得超过1×105 cfu/mL,而沙门菌和金黄色葡萄球菌是引起食物中毒最常见的病原菌,国标方法对乳品中这两种致病菌的要求是不得检出,而国标方法对细菌总数及特定病原菌检测存在耗时长的缺点,不利于企业的筛查及现场检测,因此亟需一种快速高效的方法对乳品进行检测。乳品中的微生物主要包括细菌和酵母菌,根据本实验室前期研究,分析并确定了吉林省区域内乳品中的细菌组分。通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）获得了不同细菌的Ct值与细菌总数的对应关系,发现大肠杆菌16S的标准曲线值可以用以衡量乳品常见细菌的总数。本研究首先以此为基础,建立了乳品中细菌总数的qPCR检测方法。建立标准曲线,并通过确定Ct值判断乳品中细菌总数情况,对照国标方法对实际样品进行检测,确定了qPCR的准确性,更加快速高效地对乳品质量进行鉴定。本研究首先构建了重组质粒,并建立了qPCR标准曲线,确定了Ct值标准,能够快速对乳品中的细菌总数进行检测,检测时间在3 h以内完成,对实际样品的检测结果良好,准确率在95.83%左右,解决了国标方法不能快速、高效检测细菌总数的问题。此外,食品中致病菌的排查也作为本研究的探讨重点。本研究通过建立环介导恒温扩增方法（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）定性检测乳品中的沙门菌和金黄色葡萄球菌。首先,分别建立了沙门菌和金黄色葡萄球菌的单重LAMP检测方法,对反应条件进行优化;其次,建立了液态奶金黄色葡萄球菌和沙门菌两种食物中毒菌LAMP同步快速可视化检测方法;最后,按照国标要求组装了LAMP试剂盒,本研究通过设计并筛选出特异性引物,然后对不同条件的优化建立了单重LAMP检测方法分别对沙门菌和金黄色葡萄球菌进行过检测,并通过加标样品确定沙门菌检测低限为1.55×10-8ng/μL,金黄色葡萄球菌检测低限为7.8×10-6ng/μL。然后建立了两种菌同步LAMP检测方法,优化条件并组装试剂盒检测实际样品。检测结果与国标方法和PCR方法进行比较,试剂盒的灵敏度和特异性符合标准,检测可以在2 h内完成,检测结果可视化,仅仅使用简单的设备仪器,适合企业及大批量样品现场快速检测应用。
任静静[5]（2020）在《单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株构建及炎性因子对小鼠血脑屏障损伤作用研究》文中研究指明目的:本研究以临床分离的致绵羊脑炎单增李斯特菌（Lm90）为材料,在inlA、inlB缺失基础上缺失inlJ构建三基因缺失株（Lm90-ΔinlABJ）,分析其部分生物学特性及对小鼠和绵羊的致病作用;应用Lm90感染小鼠,分析小鼠血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）通透性变化及发生损伤的可能作用机制,并构建体外BBB模型进一步验证炎性因子对小鼠BBB损伤的影响作用,为进一步研究单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,L.monocytogenes）的致病机理及防控李斯特菌病提供参考,也为进一步开展其它细菌性脑膜炎病原菌感染中枢神经系统的研究提供一定借鉴。方法:（1）用Primer 5.0软件设计引物,PCR扩增inlJ基因上、下游同源臂,采用重叠延伸PCR获得缺失inlJ的融合片段ΔinlJ;构建重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ,经电转化至Lm90-ΔinlAB感受态细胞,在温度及氯霉素双重压力下实现同源重组;筛选重组Lm90-ΔinlABJ,并检测其遗传稳定性。（2）采用细菌学方法对比分析Lm90-ΔinlABJ、Lm90-ΔinlAB及Lm90的生长特性、培养特性,并就细菌对细胞的侵袭能力和动物致病力等差异进行分析。（3）以致绵羊脑炎单增李斯特菌（Lm90）感染小鼠,通过临床症状观察、病理组织学检查、细菌回收等试验对小鼠感染模型进行评估,应用伊文思蓝法（Evan’s blue,EB）、蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）及免疫组化法分析小鼠感染后BBB通透性变化及紧密连接蛋白（Tight junctions,TJ）表达变化,并测定炎性因子水平,以探寻小鼠BBB损伤的可能作用机制。（4）原代分离培养新生小鼠脑微血管内皮细胞（Mouse brain microvascular endothelial cells,MBMEC）及星型胶质细胞（Astrocyte cells,AC）,并经形态学及免疫荧光鉴定;后应用共培养技术建立小鼠体外BBB模型,通过液面试漏实验、跨内皮细胞电阻（Trans-endothelial electronic resistance,TEER）、辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase permeability,HRP）测定以及WB检测TJ表达变化对BBB模型进行评价。后利用感染Lm90的RAW264.7细胞产物及白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）模拟L.monocytogenes感染导致的体内炎性环境作用于体外BBB模型,应用TEER和HRP通透率测定试验验证炎性因子对体外BBB模型通透性的影响,通过qRT-PCR、WB及细胞免疫荧光,分析炎性因子对BMECs间紧密连接的影响,并与小鼠体内感染试验相互验证。结果:（1）成功构建了重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ,结合电转化及同源重组技术成功构建了可稳定遗传的inlJ基因缺失株Lm90-ΔinlABJ。（2）inlJ基因缺失不影响L.monocytogenes的生长速度,Lm90-ΔinlABJ体外培养与Lm90-ΔinlAB及Lm90均无差异;细胞感染试验表明Lm90-ΔinlABJ对MBMEC的黏附率和侵袭率分别为2.54%、0.22%,与Lm90相比差异具有统计学意义（P<0.05）;与Lm90-ΔinlAB相比,黏附率与侵袭率均无显着差异（P>0.05）;小鼠感染试验显示Lm90-ΔinlABJ的LD50较Lm90-ΔinlAB升高了0.3个对数数量级,较Lm90升高了1.6个对数数量级;载菌量测定试验表明感染72 h后Lm90-ΔinlABJ在肝和脾中的载菌量较Lm90-ΔinlAB分别下降0.57、0.26个对数数量级,相比Lm90则分别下降1.02、0.96个对数数量级,表明缺失株毒力下降。绵羊感染试验表明Lm90-ΔinlABJ依然具有致病力,可引起绵羊脑炎。（3）Lm90在小鼠脑中定殖具有时间依赖性,感染后EB法测定结果提示感染初期小鼠BBB通透性未发生明显变化,当小鼠严重发病、濒临死亡时通透性显着增加;WB和免疫组化显示Lm90感染可下调Occludin和Claudin-5表达来增加BBB通透性;ELISA测定结果表明小鼠感染后,脑匀浆及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达上调,结合小鼠BBB通透性的变化,推测小鼠感染后BBB表现损伤,通透性增加,可能是炎性因子上调表达导致了紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5下调表达。（4）成功分离得到了小鼠原代BMECs及AC,形态学观察BMECs呈典型的铺路卵石样,AC有细长突触,胞质较浅,且二者经免疫荧光鉴定均正确。BMECs与AC共培养后,液面试漏实验为阳性;TEER值在72 h趋于稳定且在96 h达到403Ω·cm-2;HRP通透性测定结果与TEER结果具有一致性;WB检测显示细胞间紧密连接蛋白高表达;Lm90感染可诱导RAW264.7细胞炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达上调,且感染Lm90的RAW264.7产物及IL-1β均可下调BMECs紧密连接蛋白的表达而使BBB的通透性增加,体外试验结果与体内相符。结论:本研究成功构建了三基因缺失株Lm90-ΔinlABJ且遗传稳定性良好,生物学特性研究结果显示inlA、inlB、inlJ缺失对其生长无显着影响作用,缺失株对细胞的侵袭力及小鼠致病性明显下降,但仍有致病力,依然可导致绵羊脑炎;Lm90感染小鼠后,BBB通透性在感染初期无明显变化,在小鼠感染后期及濒临死亡时增加明显,且BBB表现出损伤作用,其可能机制是炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）上调表达,引起了紧密连接蛋白（Occludin、Cludin-5）下调表达,且体外试验结果进一步予以了证实。
皮志媛[6]（2015）在《伊犁地区绵羊单增李氏杆菌病病原的分离鉴定及其快速检测技术的研究》文中研究表明李氏杆菌病（Listeriosis）是一种危害严重的食源性人畜共患传染病,单核细胞增多性李氏杆菌（Listeria monocytogenes,LM）简称单增李氏杆菌是导致其引发疾病的主要病原菌。现已证实该菌可感染40多种动物,主要可引起人和动物出现败血症、流产、脑膜炎等症状。近几十年,随着李氏杆菌病在世界范围内的不断暴发,已受到广泛关注。因此对各地区的绵羊进行单增李氏杆菌的分离鉴定,并建立单增李氏杆菌病的快速检测技术,对单增李氏杆菌病的预防和治疗具有重要的意义。根据国家标准（GB4789.30-2010）对伊犁部分地区（昭苏县、尼勒克县、霍城县、察布查尔县）羊场的绵羊、青贮饲料进行随机采样,通过培养特性、生化特性对分离株进行鉴定。利用伊犁地区绵羊体内分离鉴定的单增李氏杆菌作为平板凝集抗原,与标准阳性血清进行平板凝集试验,建立平板凝集检测方法,并通过特异性试验和符合性试验进行验证。结果从绵羊体内及青贮饲料中分离出14株单增李氏杆菌,表明抽查地区羊场的绵羊体内和青贮饲料中均存在一定程度的感染或污染。平板凝集试验确定平板凝集抗原最佳工作浓度为7×109CFU/m L,通过特异性试验证验该方法具有很好的特异性,符合性试验的总符合率为93.4%。研究结果表明伊犁地区的绵羊有发生单增李氏杆菌病的潜在威胁,建立的平板凝集方法可较为快速、准确的检测单增李氏杆菌病。以上研究结果可为伊犁地区绵羊的单增李氏杆菌病预防和监控提供科学的理论依据。
徐云明[7]（2013）在《单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌LAMP方法的建立》文中认为单核细胞增多性李斯特氏菌（李氏杆菌）和小肠结肠炎耶尔森氏菌（耶氏菌）均是嗜冷性、人兽共患性、食源性致病菌。李氏杆菌可在0～40oC生长繁殖，通过污染食物而感染机体，致死率高达33%左右。耶氏菌在2～40oC范围均可生长繁殖，在0oC时可缓慢生长。这两种嗜冷致病菌在食品加工和冷藏过程中，对食物具有很强的污染能力，特别是对肉制品冷链生产处理过程更具危害性。目前，无论在发达国家还是发展中国家这两种菌危害都很广泛，是严重危害公共卫生安全的致病菌。因此，建立这两种菌快速的检测方法对保障食品卫生安全具有重要意义。本实验利用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，建立既可分别检测李氏杆菌和耶氏菌，又可同步联检的快速检测方法。LAMP方法操作简单、快速，且具有高特异性和高灵敏性，根据目的基因片段六个区域设计2对引物，即一对外引物（outer-primers，B3和F3）和一对内引物（inner-primers，BIP和FIP）。本实验以李氏杆菌hly基因和耶氏菌outL基因作为靶标基因，分别设计LAMP引物，以提取的李氏杆菌和耶氏菌基因组DNA（gDNA）作为检测模板，对反应体系内的Mg2+、三磷酸脱氧核甘酸（dNTPs）、甜菜碱、外内引物比、反应温度和时间等条件进行优化，分别建立李氏杆菌LAMP检测方法、耶氏菌LAMP检测方法、以及李氏杆菌耶氏菌同步联检LAMP方法。并通过人工污染肉样检测实验分析其在肉制品检样中的最低检测限。结果表明，李氏杆菌LAMP检测方法：总反应体系25μL，含有2.5μL10×thermpol reactionbuffe r、1μL Bst DNA polymerase（8U）、2μL gDNA、6mM Mg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM两个外引物（1:1）、1.0μM两个内引物（1:1）、65oC反应60min。李氏杆菌基因组最低检测限是77.5fg/μL，人工污染肉样菌落最低检测限是77CFU/mL。耶氏菌LAMP检测方法：总反应体系是25μL包括2.5μL10×thermpol reaction buffer、1μL Bst DNA polymerase（8U）、2μL gDNA、5mMMg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM两个外引物（1:1）、0.8μM两个内引物（1:1），63oC反应60min。耶氏菌基因组最低检测限是48.5fg/μL，人工污染肉样菌落最低检测限是80CFU/mL。李氏杆菌耶氏菌联检LAMP方法：总反应体系是25μL包括2.5μL10×thermpol reaction buffer、1μL Bst DNApolymerase（8U）、2μL gDNA、6mM Mg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM李氏杆菌和耶氏菌外引物（1:1）、1.0μM李氏杆菌内引物（1:1）、0.8μM耶氏菌内引物（1:1），65oC反应60min。李氏杆菌基因组最低检测限是82.4fg/μL，人工污染肉样菌落最低检测限是84CFU/mL；耶氏菌基因组最低检测限是56.7fg/μL，人工污染肉样菌落最低检测限是87CFU/mL；李氏杆菌和耶氏菌混合基因组（1:1）的检测限是69.4fg/mL，人工污染肉样菌落（1:1）最低检测限是94CFU/mL。结果显示，本研究建立的李氏杆菌和耶氏菌LAMP检测方法为保障肉品冷链生产食品卫生安全，进一步研制李氏杆菌和耶氏菌快检试剂盒奠定基础。
刘萍萍[8]（2013）在《产单核细胞李氏杆菌分子分型及侵袭相关基因研究》文中研究指明本研究依据国家标准（GB/T4789.30-2008），于2011年6月至2012年6月从上海市各大超市及菜市场的禽肉、畜肉、乳制品采集479份样品，分离得到34株产单核细胞李氏杆菌（7.1%）。多重PCR血清型分型结果为:34株分离株分为4类，1/2a&3a占76.47%，1/2c&3c占17.65%，1/2b、3b&7占2.94%，4b、4d&4e占2.94%。1/2a&3a是致病性较弱的血清型，占的比重较多（76.47%），而强致病性的血清型4b、4d&4e仅占2.94%。采用96孔微孔板法对菌株的生物被膜形成能力进行测定。实验结果表明100%的分离株能够形成生物被膜，其中，强生物被膜形成能力的菌株并不是致病性较强的4b型，而是致病性较弱的1/2a&3a型。采用MLST方法对34株菌株分型，分成8个型别：ST121，ST155，ST11，ST8，ST196，ST9，ST87，ST589。其中，LM19未得到相应型别。剩下33株中，ST121所占比重最大45.5%，然后依次是ST155（15.2%），ST11（12.1%），ST8（9.1%），ST196（6.1%），ST9（6.1%），ST87（3.0%），ST589（3.0%）。参考文献中产单核细胞李氏杆菌与英诺克李斯特菌的比较基因组学分析，选定lm1290，lm2027两个假定与侵袭和粘附相关的基因，研究其在LM致病过程中的作用。针对标准菌株10403s全基因组中lm1290，lm2027基因设计同源臂引物，SOE-PCR融合同源臂，并克隆至温敏型大肠-李氏杆菌穿梭质粒pKSV7，获得lm1290缺失同源重组质粒pK1290-B1-B2;以电转化方式将质粒pK1290-B1-B2导入10403s感受态细胞，经抗生素抗性筛选和温度敏感筛选后，PCR鉴定确认获得一株lm1290缺失突变株。构建好的pK2027-B1-B2电转菌株10403s感受态细胞，但是筛选未成功。鉴定野生株与lm1290缺失株生长曲线测定，RT-PCR检测毒力调控基因prf A的表达情况。通过细胞粘附和侵袭实验，以及生物被膜形成能力的测定，证明野生株和缺失株之间的侵袭能力变化关系。
蒋建军[9]（2011）在《缺失inlC2突变株增强单核细胞增多症李斯特菌对上皮细胞的内化作用的研究》文中研究表明单核细胞增多症李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM）是重要的人畜共患食源性病原菌,广泛存于自然环境和食品加工环境,耐酸、耐盐,低温下可繁殖,能引起人和动物的脑膜炎、败血症和胃肠炎,致死率达20-30%,给人及动物健康带来较大危害。不同来源的单核细胞增多症李斯特菌的毒力差异很大,自上世纪80年代以来李斯特菌的毒力因子一直是人们研究的热点。内化素C2（InlC2）是LM内化素家族中众多内化素的成员之一。它存在于主要的致病性李斯特菌菌株中,为LM所独有,常与iinlD等内化素基因形成基因簇,发挥其功能,近来研究表明,InlC2与InlA一起在李斯特菌病的体液免疫中发挥重要作用。为了解InlC2在单核细胞增多症李斯特菌感染宿主细胞过程中的作用以及与其他重要内化素的关系。我们从以下几个方面对其进行研究。研究结果如下：1、采用PCR的方法检测了134株来源不同的单核细胞增多症李斯特菌inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlE、inlG内化素的分布以及ascB-dapE内化素岛的内化素的构成情况,结果：除1/2b型的菌株S10不含inlA和inlB,其余都含有inlA和inlB。inlC存在于所有谱系Ⅰ、Ⅱ（121/121）和53.8%（7/13）谱系Ⅲ菌株。inlD存在于所有谱系Ⅰ100%（55/55）、谱系Ⅱ25.7%（17/66）和谱系Ⅲ69.2%（9/13）。inlE存在于所有谱系Ⅰ、Ⅱ（121/121）和谱系Ⅲ30.7%（4/13）。inlG在谱系Ⅰ中不存在（0/55）,谱系Ⅱ74.2%（49/66）和谱系Ⅲ30.7%（4/13）。134株中有110株（82.1%）含有inlC2。所有谱系Ⅰ（血清型1/2b和4b）都含有inlC2基因,除一个在inlGC2DE基因群中以外,其余都在inlC2DE中,在谱系Ⅱ中49株血清型1/2a的其中47株菌含有inlC2,在inlC2DE（17/47）或inlGC2DE（30/47）基因群中,16株血清型1/2c中仅有一株含有inlC2基因,存在于inlGC2DE基因群中,谱系Ⅲ中的13株菌其中6株inlC2存在于inlGC2DE（4/6）基因群或别的结构中（2/6）,此外,其余5个种无inlC2基因。结果表明：LM特有的内化素基因inlC2出现在所有谱系Ⅰ和大多数血清型1/2a的菌株中。谱系Ⅲ中存在相对较少。inlC2与其他内化素基因inlD、inlE,有时inlG一起在ascB-dapE内化素岛中组成不同的内化素基因簇。使ascB-dapE内化素岛具有较大的多态性,这可作为区分LM谱系/血清型的分子标志。2、PCR扩增inlC2基因两端的同源臂,融合后,使用同源重组的方法构建LM标准株681和L10的△inlC2缺失突变株。经氯霉素筛选突变株,旁侧引物扩增和测序方式验证获得△inlC2缺失突变株。3、通过LM681和L10与相应△inlC2突变株的生长培养、BALB/c小鼠增殖试验,ICR小鼠毒力试验,致死病理解剖和常规组织染色法,确定△inlC2突变株对LM毒力的影响。结果：亲本株与突变株生长培养结果之间差异不显着。在小鼠体内增殖试验中△inlC2突变株与亲本株之间差异明显,△inlC2突变株在脾脏中的存活数是亲本株的10倍（P<0.01）,在肝脏中是亲本株的7倍。ICR小鼠毒力试验LD50差异不显着。组织染色结果显示△inlC2突变株引起的病理变化比亲本株要明显,特别是在脑、脾脏和肝脏。结果表明：inlC2与单核细胞增多症李斯特菌对小鼠的致病能力的大小有关。△inlC2突变株对小鼠的致病力增强了。4、通过LM681、Ll0及其△inlC2突变株对Hela细胞的粘附、侵袭和细胞内的增殖试验,确定inlC2基因的缺失是否会影响LM对细胞的感染作用。结果：△inlC2突变株比它们的亲本株的对HeLa细胞的粘附能力增强1.3倍（P<0.05）,侵袭力约2.7倍（P<0.01）,细胞内增殖是亲本株的1.7倍。这些数据结果表明：inlC2基因的缺失增强了LM对HeLa细胞的内化作用。5、分别通过qRT-PCR（?）Iwestern blot评估inlA和inlB的转录和转录后水平,以确定单核细胞增多症李斯特菌△inlC2突变株内化作用的增强是否与inlA和inlB有关。结果：inlA和inlB的转录水平并没有增加,但产量却有很大提高。结果表明：inlC2基因的缺失增加了InlA的产量但没有改变inlA的转录水平,InlB也同样如此。6、通过qRT-PCR检测对比人工胃液（pH 2.5）和BHI中单核细胞增多症李斯特菌的inlA, inlB、inlC2、inlD和inlE转录水平。确定inlC2是否与感染有关。转录结果：在人工胃液中inlC2、inlA和inlB转录水平相对于在BHI中（pH 7：P<0.01）显着增加。相反inlD和inlE转录水平没有变化。结果表明：在人工胃液中inlC2被诱导表达,表明它可能是另外一个在感染中起作用LPXTG内化素基因,再者说明它的表达是单顺反子,独立于inlD和inlE外的单独表达。所有以上结果表明inlC2基因缺失增强了LM的致病性,LM的内化作用是以不同的内化素之间相互作用的复杂的网络结构来调节。并且可能与其他感染相关因子（例如分选酶A）与LPTGX基序支撑蛋白的易位有关。研究结果为深入探索单核细胞增多症李斯特菌的功能基因及其调控机制、致病性和环境适应性的分子机制等方面具有重要的理论与实践意义。
王慧[10]（2011）在《鸡奇异变形杆菌致病性相关毒素检测及PCR检测方法的建立》文中认为鸡奇异变形杆菌病是近年来国内新发现的一种急性热性细菌性传染病。本病的特征是呼吸困难、咳嗽、体温升高、腹泻。患病家禽主要表现为菌血症、败血症,一侧性或两侧性瘫痪或水样腹泻。各种日龄的鸡群都可感染本病,但以7周龄以下的雏鸡最易感。种鸡感染本病后可通过种蛋传给后代,从而造成雏鸡的大批死亡。此病十分容易造成爆发性流行疾病,因此对养殖业是一种潜在的威胁。奇异变形杆菌的致病机理与其本身所含的一些毒力因子密切相关,据推测这些毒力因子可能在鸡奇异变形杆菌的病理发生和免疫方面产生重要的作用。基于上述目的本研究选取了奇异变形杆菌内毒素、热稳定性肠毒素和气管细胞毒素进行研究,初步了解奇异变形杆菌的致病机理,为研究鸡奇异变形杆菌的保护性抗原提供重要依据。目前,有关奇异变形杆菌的检测通常采用传统的细菌分离培养、生化试验和血清学试验等多个步骤,其检测周期长、操作繁琐、灵敏度低,不适应奇异变形杆菌的快速检测。近年来发展起来的分子生物学方法克服了传统检测方法的不足。因此本研究建立了奇异变形杆菌的PCR和多重PCR检测方法,为该抗原的快速检测提供技术依据,以做到更好的控制该病的发生与蔓延。本研究主要包括三部分:一、鸡奇异变形杆菌相关毒素的检测及其致病性研究本试验精提了奇异变形杆菌内毒素和粗提了热稳定肠毒素,通过动物试验研究其致病性。同时建立起鸡胚气管环模型,验证气管细胞毒素的存在及其对气管纤毛上皮的致病作用。结果表明:奇异变形杆菌内毒素可使动物呈急性败血症病变。分离的8株奇异变形杆菌有1株为ST阳性,注射ST后的乳鼠运动迟缓、食欲不振,剖检可见肠水肿,肠腔积液等。奇异变形杆菌P5、P8株分别作10-8.5、10-8.3倍稀释,可使SPF鸡胚气管环接种0.1mL后50%出现气管环纤毛脱落,气管环粘膜出现凹陷、空洞,初步验证了气管细胞毒素的存在及奇异变形杆菌对气管纤毛的损伤机理。二、奇异变形杆菌分离株的23S rRNA序列分析本试验通过PCR反应扩增7株鸡奇异变形杆菌和1株兔奇异变形杆菌的23S rRNA基因片段（1045bp）,经克隆测序,与GenBank中收录的奇异变形杆菌、普通变形杆菌以及其它相近属的23S rRNA基因序列进行同源性比较,并由此构建系统进化发生树。本实验室保存的7株鸡奇异变形杆菌核苷酸序列与GenBank中收录的奇异变形杆菌核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与兔奇异变形杆菌核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,与普通变形杆菌的核苷酸序列同源性为95.4%～96.2%,而与其它相近属同源性只有92.9%～93.4%。结果显示,23S rRNA基因序列分析可以作为鉴定奇异变形杆菌的一种快速、简便、准确的方法。三、多重PCR检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用本试验根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因（ureR）、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因（invA）和单核细胞增生性李氏杆菌编码溶血素O（LLO）的hlyA基因分别设计了三对特异性引物,对单基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立引物浓度、Tm值、模板量的L16（43）正交试验,优化单管多重PCR扩增条件,建立了快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生性李氏杆菌的稳定的单管多重PCR方法。结果显示,三种目的菌在105cfu/ml均可同时扩增出较清晰条带（奇异变形杆菌和单核细胞增生性李氏杆菌在104cfu/ml浓度下仍然可见到条带）,比单基因PCR低一个稀释度,并且人工模拟试验和市售食品试验检测结果稳定。表明该多重PCR检测方法操作简单、快速、特异性强和灵敏度高,能够实现对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生性李氏杆菌三种食源性致病菌的快速诊检和监控。
二、应用PCR方法鉴别绵羊致病性单核增多症李氏杆菌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用PCR方法鉴别绵羊致病性单核增多症李氏杆菌（论文提纲范文）
（1）江苏省部分规模化猪场肠道病原菌的临床检测及大肠杆菌的部分特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1. 致病性大肠杆菌概述 |
| 2. 空肠弯曲杆菌概述 |
| 3. 产单核细胞李氏杆菌概述 |
| 4. 产气荚膜梭菌概述 |
| 5. 大肠杆菌的耐药性概述 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 研究一 规模化猪场四种肠道病原菌的PCR检测 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 猪源致病性大肠杆菌的分离鉴定及其毒力测定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 猪源致病性大肠杆菌药物耐药性试验 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）产单核细胞李氏杆菌的临床分离与FlaA单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 第一章 产单核细胞李氏杆菌的临床检测及其耐药性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 参考菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 样品的采集与处理 |
| 2.3 细菌DNA模板的制备 |
| 2.4 快速PCR检测方法的确立 |
| 2.5 样品快速检测 |
| 2.6 阳性株的纯培养 |
| 2.7 细菌的质谱鉴定 |
| 2.8 生化鉴定 |
| 2.9 细菌的血清型多重PCR鉴定 |
| 2.10 生物被膜形成能力分析 |
| 2.11 细菌的药物敏感性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR检测方法的确立 |
| 3.2 样品的快速检测结果 |
| 3.3 细菌的纯培养与分离 |
| 3.4 细菌的质谱鉴定结果 |
| 3.5 生化鉴定 |
| 3.6 细菌血清型多重PCR结果 |
| 3.7 细菌的生物被膜形成能力分析 |
| 3.8 细菌的药物敏感性结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 产单核细胞李氏杆菌FlaA的原核表达及抗原性鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 工具酶及试剂 |
| 1.3 设备与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 PCR模板的制备 |
| 2.3 产单核细胞李氏杆菌flaA的PCR扩增 |
| 2.4 flaA的克隆与筛选 |
| 2.5 flaA原核表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.7 重组蛋白的纯化及其抗原性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 产单核细胞李氏杆菌flaA的PCR扩增 |
| 3.2 原核表达载体鉴定 |
| 3.3 重组菌pGEX-flaA诱导表达的SDS-PAGE分析 |
| 3.4 重组蛋白的纯化及抗原性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 产单核细胞李氏杆菌FlaA单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和蛋白 |
| 1.2 细胞和实验动物 |
| 1.3 细胞培养基及基本试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 饲养细胞的制备 |
| 2.3 骨髓瘤细胞SP2/0的制备 |
| 2.4 脾淋巴细胞的制备 |
| 2.5 细胞融合 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.7 腹水的制备及其效价的测定 |
| 2.8 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.9 单克隆抗体的纯化 |
| 2.10 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体稳定性检测 |
| 2.12 单克隆抗体的初步应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的确定 |
| 3.2 间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞 |
| 3.3 腹水效价的测定 |
| 3.4 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.5 单克隆抗体的纯化 |
| 3.6 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.7 单克隆抗体稳定性鉴定 |
| 3.8 单克隆抗体的初步应用 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）江苏地区水禽源重要病原菌的临床检测及大肠杆菌的分子流行病学和部分特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 水禽生产养殖过程中常见的致病菌 |
| 1.1 大肠杆菌 |
| 1.2 鸭疫里默氏杆菌 |
| 1.3 产单核细胞李氏杆菌 |
| 1.4 沙门氏菌 |
| 2、大肠杆菌主要毒力基因 |
| 2.1 大肠杆菌菌毛 |
| 2.2 溶血素 |
| 2.3 温度敏感性血凝素 |
| 2.4 毒素 |
| 2.5 毒力岛 |
| 3. 大肠杆菌耐药性 |
| 3.1 大肠杆菌的耐药机制 |
| 3.2 耐药基因的转移方式 |
| 3.3 多重耐药的产生和对策 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 水禽源常见致病菌PCR检测与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 水禽源大肠杆菌菌毛基因PCR检测 |
| 2.2 水禽源沙门氏菌的PCR检测 |
| 2.3 水禽源鸭疫里默氏杆菌的PCR检测方法的建立 |
| 2.4 水禽源产单核细胞李氏杆菌PCR检测方法建立 |
| 2.5 临床样品的PCR快速检测 |
| 3 讨论 |
| 第二章 水禽源大肠杆菌的分离鉴定及其分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 致病性大肠杆菌分离鉴定 |
| 2.2 致病性大肠杆菌分离株毒力基因分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 水禽致病性大肠杆菌药物敏感性分析及毒力测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 药物敏感性试验 |
| 2.2 生长曲线的测定结果 |
| 2.3 半数致死量(LD50)试验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）牛乳中三种致病菌基因快速检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 乳制品概况及检测方法研究 |
| 1.1 乳制品的种类与特点 |
| 1.2 乳制品中的微生物污染 |
| 1.3 国内外乳制品微生物限量标准对比 |
| 1.4 微生物检测方法 |
| 第2章 金黄色葡萄球菌及沙门菌研究进展 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌研究进展 |
| 2.2 沙门菌污染 |
| 2.3 乳品中金黄色葡萄球菌及沙门菌检测 |
| 第3章 荧光定量PCR检测方法和环介导恒温扩增方法的原理及进展 |
| 3.1 QPCR和 LAMP的原理特点 |
| 3.2 QPCR和 LAMP引物设计 |
| 3.3 QPCR和 LAMP结果分析 |
| 3.4 QPCR和 LAMP检测特点 |
| 3.5 QPCR和 LAMP的应用进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 乳品中细菌总数荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 沙门菌环介导恒温扩增检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 金黄色葡萄球菌环介导恒温扩增检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 双重环介导恒温扩增检测方法的建立及试剂盒组装 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 试剂盒的组装 |
| 4.4 试剂盒检测 |
| 4.5 结果 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株构建及炎性因子对小鼠血脑屏障损伤作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的及意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 单增李斯特菌概述 |
| 2.2 单增李斯特菌的生物学特性 |
| 2.3 单增李斯特菌的致病力 |
| 2.4 单增李斯特菌感染的致病机理 |
| 2.5 单增李斯特菌的毒力因子及调控因子 |
| 2.6 单增李斯特菌侵染中枢神经系统研究进展 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 3.1 主要研究内容 |
| 3.2 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株的构建 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 引物设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 inlJ上、下游同源臂的扩增及融合 |
| 2.2 inlJ缺失片段的克隆与测序 |
| 2.3 重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ的构建 |
| 2.4 Lm90-ΔinlAB感受态细胞的制备 |
| 2.5 电转化及Lm90-ΔinlABJ缺失株的筛选与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 inlJ基因上下游臂的扩增及SOE-PCR结果 |
| 3.2 重组质粒pKSV7-ΔinlJ的双酶切鉴定 |
| 3.3 电转后阳性转化子筛选与鉴定 |
| 3.4 同源重组子的筛选与鉴定 |
| 3.5 缺失株的遗传稳定性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验二 单增李斯特菌Δinl ABJ缺失株部分生物学特性研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 缺失株培养特性及生长曲线测定 |
| 2.2 缺失株溶血特性测定 |
| 2.3 细胞黏附、侵袭及胞内增殖能力测定 |
| 2.4 小鼠存活试验 |
| 2.5 半数致死量(LD50)测定 |
| 2.6 小鼠组织载菌量测定 |
| 2.7 绵羊感染试验 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 培养特性 |
| 3.2 生长曲线测定 |
| 3.3 溶血测定 |
| 3.4 细胞侵袭及胞内增殖 |
| 3.5 缺失株对小鼠的毒力试验 |
| 3.6 小鼠LD50测定 |
| 3.7 小鼠组织载菌量测定 |
| 3.8 绵羊感染试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验三 单增李斯特菌对小鼠血脑屏障损伤及其可能机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及实验动物 |
| 1.2 主要实验器材 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠感染试验 |
| 2.2 感染小鼠BBB通透性测定 |
| 2.3 脑组织取材、固定及切片制作 |
| 2.4 HE染色及免疫组化 |
| 2.5 组织样品RNA、蛋白提取 |
| 2.6 cDNA模板制备 |
| 2.7 SYBR Green法荧光定量PCR |
| 2.8 蛋白质免疫印迹 |
| 2.9 细胞因子测定 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同感染剂量小鼠存活率 |
| 3.2 感染小鼠眼观症状 |
| 3.3 小鼠脑组织细菌回收及鉴定 |
| 3.4 小鼠脑病理组织学观察 |
| 3.5 小鼠脑组织载菌量测定 |
| 3.6 感染小鼠BBB通透性变化 |
| 3.7 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达变化 |
| 3.8 ZO-1、Occludin、Claudin-5 免疫组化测定 |
| 3.9 单增李斯特菌感染促进TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验四 炎性因子对体外血脑屏障模型损伤的影响作用研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞 |
| 1.2 主要试验器材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞的分离培养 |
| 2.2 脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞的免疫荧光鉴定 |
| 2.3 体外血脑屏障模型的构建 |
| 2.4 体外血脑屏障模型的评估 |
| 2.5 WB检测体外血脑屏障模型紧密连接蛋白表达 |
| 2.6 小鼠巨噬细胞复苏及培养 |
| 2.7 单增李斯特菌感染RAW264.7 细胞 |
| 2.8 qRT-PCR检测细胞因子的表达 |
| 2.9 ELISA检测细胞因子的表达 |
| 2.10 单增李斯特菌感染RAW264.7 细胞后上清制备 |
| 2.11 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物对BBB通透性的影响 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鼠脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞形态学观察 |
| 3.2 鼠脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞免疫荧光鉴定 |
| 3.3 跨内皮细胞间电阻(TEER)测定 |
| 3.4 液面试漏试验 |
| 3.5 辣根过氧化物酶(HRP)通透性测定 |
| 3.6 紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表达 |
| 3.7 单增李斯特菌感染可诱导RAW264.7 细胞炎性因子的表达 |
| 3.8 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物可影响BBB的通透性 |
| 3.9 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物可调节BMECs紧密连接蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 结论 |
| 第四章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（6）伊犁地区绵羊单增李氏杆菌病病原的分离鉴定及其快速检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 李氏杆菌生物学特性 |
| 1.2 李氏杆菌检测方法的研究 |
| 1.3 研究的目的及意义 |
| 第2章 伊犁部分地区绵羊的单增李氏杆菌分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 单增李氏杆菌平板凝集快速检测技术的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌LAMP方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 单核细胞增多性李斯特氏菌的研究现状 |
| 1.1 李斯特菌的分类 |
| 1.2 李氏杆菌的生物学特征 |
| 1.3 李氏杆菌血清型分类 |
| 1.4 李氏杆菌的致病因子 |
| 1.5 李氏杆菌流行病学研究 |
| 1.6 李氏杆菌检测方法研究现状 |
| 第2章 小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究现状 |
| 2.1 耶尔森氏菌的分类 |
| 2.2 耶氏菌生物学特征 |
| 2.3 耶氏菌血清型分类和生物型分类 |
| 2.4 耶氏菌的致病因子 |
| 2.5 耶氏菌的流行病学研究 |
| 2.6 耶氏菌检测方法研究现状 |
| 第3章 环介导等温扩增技术的研究现状 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 单核细胞增多性李斯特氏菌 LAMP 检测方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 小肠结肠炎耶尔森氏菌 LAMP 方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 LAMP 方法同时检测李氏杆菌和耶氏菌 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）产单核细胞李氏杆菌分子分型及侵袭相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 产单核细胞李氏杆菌的简介 |
| 1.2 产单核细胞李氏杆菌毒力基因的研究进展 |
| 1.2.1 溶血素蛋白（listeriolysin O，LLO） |
| 1.2.2 PrfA 调控蛋白 |
| 1.3 产单核细胞李氏杆菌的分子生物学鉴定研究近况 |
| 1.3.1 基于 PCR 的鉴定 |
| 1.3.2 基因芯片鉴定技术 |
| 1.3.3 ATP 快速发光检测技术 |
| 1.4 产单核细胞李氏杆菌分子分型的研究近况 |
| 1.4.1 扩增片段长度多态性分析（AFLP） |
| 1.4.2 随机扩增多态性 DNA(RAPD)分型法 |
| 1.4.3 多位点序列(multilocus sequence typing，MLST)分型法 |
| 1.4.4 脉冲场电泳分型技术（PFGE） |
| 1.4.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分型 |
| 1.5 产单核细胞李氏杆菌生物被膜的研究进展 |
| 第二章 产单核细胞李氏杆菌分离鉴定及生物学特性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 标准菌株 |
| 2.2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.3 分离菌株样品来源 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 分离菌株 |
| 2.3.2 血清型分型 |
| 2.3.3 生物被膜形成能力分析 |
| 2.3.4 MLST 分型 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 分离得到的 LM 及分布情况 |
| 2.4.2 产单核细胞李氏杆菌的血清型分型 |
| 2.4.3 生物被膜形成能力分析 |
| 2.4.4 产单核细胞李氏杆菌的 MLST 分型 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 lm1290 基因缺失株构建及生物学特性分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 质粒与菌株 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 lm1290 和 lm2027 同源臂的融合 |
| 3.3.2 同源臂 B1-B2 和 pKSV7 载体连接 |
| 3.3.3 电转化 LM 及缺失株的筛选鉴定 |
| 3.3.4 野生株与缺失株的生物学特性鉴定 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 lm1290 和 lm2027 同源臂的融合 |
| 3.4.2 同源臂 B1-B2 和 pKSV7 载体连接并鉴定 |
| 3.4.3 电转化 LM 及缺失株的筛选鉴定 |
| 3.4.4 野生株与缺失株的生物学特性鉴定 |
| 3.4.5 小结 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）缺失inlC2突变株增强单核细胞增多症李斯特菌对上皮细胞的内化作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一:不同来源单核细胞增多症李斯特菌InlC2的检测及ascB-dapE内化素岛结构组成 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果与讨论 |
| 试验二:单核细胞增多症李斯特菌ΔinlC2缺失突变株的构建 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 试验三:单核细胞增多症李斯特菌ΔinlC2对小鼠的致病性的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 试验四:单核细胞增多症李斯特菌ΔinlC2突变株对Hela细胞的粘附、侵袭和增殖试验 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果与讨论 |
| 试验五:单核细胞增多症李斯特菌ΔinlC2突变株InlA与InlB表达水平的检测 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（10）鸡奇异变形杆菌致病性相关毒素检测及PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 鸡奇异变形杆菌的研究现状 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 临诊症状和病理变化 |
| 1.1.4 发病机理 |
| 1.1.5 致病性 |
| 1.1.6 诊断 |
| 1.1.7 防制 |
| 1.1.8 公共卫生意义 |
| 1.2.23S rRNA 的研究进展 |
| 1.2.1 23S rRNA 基因技术的应用 |
| 1.2.2 23S rRNA 基因检测技术存在的局限性 |
| 1.3.多重PCR 的研究进展 |
| 1.3.1 常规PCR 技术 |
| 1.3.2 多重 PCR 的原理及特点 |
| 1.3.3 多重PCR 技术检测 |
| 1.3.4 多重PCR 的最新进展 |
| 1.4.本研究的内容、目的及意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 奇异变形杆菌致病性相关毒素的提取及其检测 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株 |
| 2.1.1.2 实验动物 |
| 2.1.1.3 仪器设备 |
| 2.1.1.4 主要试剂及溶液、培养基配制 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 奇异变形杆菌内毒素的制备及其生物学特性检测 |
| 2.1.2.2 奇异变形杆菌热稳定性肠毒素的制备及乳鼠灌胃试验 |
| 2.1.2.3 奇异变形杆菌鸡胚气管环感染试验 |
| 2.2 奇异变形杆菌分离株的23S rRNA 序列分析 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 菌株 |
| 2.2.1.2 工具酶与主要试剂 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 试验所用溶液及其配制 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 23S rRNA 基因PCR 引物的设计与合成 |
| 2.2.2.2 细菌DNA 的准备 |
| 2.2.2.3 PCR 反应体系及电泳 |
| 2.2.2.4 目的条带的回收 |
| 2.2.2.5 定量及连接 |
| 2.2.2.6 连接产物的转化 |
| 2.2.2.7 重组克隆细菌的扩增及质粒的提取 |
| 2.2.2.8 测序 |
| 2.2.2.9 序列同源性比较及系统进化树构建 |
| 2.3 多重PCR 检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.1.1 菌株 |
| 2.3.1.2 工具酶及主要试剂 |
| 2.3.1.4 试验所用溶液及其配制 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.2.1 扩增的目的基因及引物设计 |
| 2.3.2.2 细菌的培养和模板的制备 |
| 2.3.2.3 单一PCR 扩增及特异性和敏感性分析 |
| 2.3.2.4 单管多重PCR 反应体系的优化 |
| 2.3.2.5 多重PCR 特异性和敏感性测定 |
| 2.3.2.6 人工模拟样品的检测和市售食品的验证 |
| 3. 结果 |
| 3.1 奇异变形杆菌致病性相关毒素的提取及其检测 |
| 3.1.1 奇异变形杆菌内毒素精致品制备及生致病性结果 |
| 3.1.2 乳鼠灌胃试验结果及致病性检测 |
| 3.1.3 正常气管环组织的培养物及各毒株TOC-ID50 的计算 |
| 3.2 奇异变形杆菌分离株的23S rRNA 序列分析 |
| 3.2.1 PCR 扩增结果 |
| 3.2.2 目的DNA 克隆鉴定 |
| 3.2.3 23S rRNA 序列同源性比较及系统发育分析 |
| 3.3 多重PCR 检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用 |
| 3.3.1 单一PCR 扩增和核甘酸序列分析 |
| 3.3.2 单一PCR 敏感性分析 |
| 3.3.3 单管多重PCR 的扩增及其条件的优化 |
| 3.3.4 多重PCR 特异性和敏感性测定结果 |
| 3.3.5 人工模拟试验和市售食品试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 奇异变形杆菌致病性相关毒素的提取及其检测 |
| 4.2 奇异变形杆菌分离株的23S rRNA 序列分析 |
| 4.3 多重PCR 检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 个人简介 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
四、应用PCR方法鉴别绵羊致病性单核增多症李氏杆菌（论文参考文献）
- [1]江苏省部分规模化猪场肠道病原菌的临床检测及大肠杆菌的部分特性研究[D]. 沈达. 扬州大学, 2021
- [2]产单核细胞李氏杆菌的临床分离与FlaA单克隆抗体的制备[D]. 熊静禹. 扬州大学, 2020(04)
- [3]江苏地区水禽源重要病原菌的临床检测及大肠杆菌的分子流行病学和部分特性研究[D]. 宋海港. 扬州大学, 2020(04)
- [4]牛乳中三种致病菌基因快速检测方法的建立[D]. 关玉婷. 吉林大学, 2020(08)
- [5]单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株构建及炎性因子对小鼠血脑屏障损伤作用研究[D]. 任静静. 石河子大学, 2020(08)
- [6]伊犁地区绵羊单增李氏杆菌病病原的分离鉴定及其快速检测技术的研究[D]. 皮志媛. 新疆农业大学, 2015(03)
- [7]单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌LAMP方法的建立[D]. 徐云明. 吉林大学, 2013(08)
- [8]产单核细胞李氏杆菌分子分型及侵袭相关基因研究[D]. 刘萍萍. 中国农业科学院, 2013(02)
- [9]缺失inlC2突变株增强单核细胞增多症李斯特菌对上皮细胞的内化作用的研究[D]. 蒋建军. 石河子大学, 2011(06)
- [10]鸡奇异变形杆菌致病性相关毒素检测及PCR检测方法的建立[D]. 王慧. 山东农业大学, 2011(08)