一、CHARACTER OF TUMOR ASSOCIATED PROTEIN RECOGNIZED BY MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST YUNNAN GEJIU LUNG CANCER（论文文献综述）
柳思琪[1]（2020）在《外周血肿瘤相关天然自身抗体与非小细胞肺癌发病的关系研究》文中进行了进一步梳理目的:肺癌在恶性肿瘤中的发病率与死亡率均位居前列,严重威胁着人类身心健康,实现肺癌的早期诊断对于肺癌患者的治疗和预后评估意义重大。目前临床工作中用于肺癌诊断的生物标志物众多,但其敏感性及特异性都不高,对于肺癌早期诊断和治疗仍有一定局限性。本研究组的前期研究中,已经筛选出一些与非小细胞肺癌相关的肿瘤抗原。本研究在此基础上进一步优化设计了一些新的肿瘤相关抗原,在单个抗原检测的基础上,探索进行肿瘤相关抗原的联合检测,以期寻找到对非小细胞肺癌早期诊断有高敏感性和高特异性的生物学标志物,并为非小细胞肺癌的治疗及预后评估提供一定的指导意义。方法:1.设计抗原多肽:从NCBI数据库检索HER2、MUC1、VEGFR1、ABCC5、MYC、TNF-α和POU5F1的完整氨基酸序列,利用生物信息学数据库和在线工具（http://www.iedb.org）设计并合成了7个线性抗原多肽,制备了9种抗体检测试剂盒,其中7种由单价抗原多肽制备而成,即HER2、MUC1、VEGFR1、ABCC5、MYC、TNF-α和POU5F1;另外2种分别由3个独立抗原多肽混合后制备而成,即HER2-MUC1-VEGFR1和CD25-MUC1-VEGFR1。其中CD25是在我们前期研究中发现的与非小细胞肺癌诊断和预后密切相关的生物标志物。2.检测血浆中天然自身抗体水平:选取211例未经任何抗癌治疗的首次诊断为非小细胞肺癌患者作为实验组研究对象,同期选取200例健康受试者作为对照组,利用ELISA方法检测并比较两组血浆中天然自身抗体水平。同时,将研究对象分别按照性别、年龄、肿瘤组织学类型及肿瘤分期进行分组,研究血浆中天然自身抗体水平与性别、年龄、肿瘤组织学类型及肿瘤分期的关系。3.筛选血浆:收集150例健康献血者的血浆,应用ELISA方法分别检测血浆中HER2、MUC1、VEGFR1天然自身抗体水平。选择天然自身抗体水平排名首位的健康献血者血浆命名为阳性组;选择天然自身抗体水平排名末位的健康献血者血浆命名为阴性组。上述两种血浆用于后期细胞培养。4.研究富含天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌细胞增殖的影响:应用富含和低含HER2、MUC1、VEGFR1天然自身抗体的血浆分别培养非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H2122,应用CCK-8测定两种细胞的增殖,计算细胞活度,研究富含三种天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌增殖的影响。5.检测非小细胞肺癌细胞中HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA的表达:分别提取A549和NCI-H2122的总RNA,应用实时定量PCR方法检测两种肿瘤细胞的HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA的表达。结果:1.成功设计并合成抗原多肽片段,序列如下:HER2: H-kllallppgaastqvctgtdm klrlpasp-OHMUC1: H-crynltisdvsvsdvpfpfsaqsgah-OHVEGFR1: H-dlklsctvnkflyrdvtwillrtvnnrtmhysi-OHABCC5: H-tstsgthrdredskfrrtrplecqdal-OHMYC: H-rvkldsvrvlrqisnnrkcfellptpplsps-OHTNF-α: H-cqlqwlnrranallangvelrdnqlv-OHPOU5F1: H-keleqfakllkqkritlgytqadvgltc-OHCD25: H-iyhfvvgqmvyyqcvqgyralhrgpaesve-OH2.天然自身抗体在非小细胞肺癌患者和健康对照组中的水平变化:（1）比较211例非小细胞肺癌患者和200例健康对照者血浆天然自身抗体水平,发现非小细胞肺癌患者血浆中抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平显着低于对照组（P<0.001）。（2）将非小细胞肺癌患者和健康对照组按照性别分组,分别进行分析,发现女性非小细胞肺癌患者,血浆抗MUC1、抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平均显着低于健康对照组（P<0.001）;男性非小细胞肺癌患者,血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平显着低于健康对照组（P<0.001）。（3）将非小细胞肺癌组和健康对照组按照年龄<60岁和≥60岁进行分组,发现非小细胞肺癌患者血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平在两个年龄组中均显着低于健康对照组（P<0.001）,抗VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平仅在<60岁组显着低于健康对照组（P<0.001）。（4）将非小细胞肺癌患者根据组织学病理类型分为腺癌及鳞癌两组,研究发现,与健康对照组比较,腺癌患者（124例）血浆中抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平均显着降低（P<0.001或P<0.05）,而鳞癌患者（87例）血浆中仅抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平显着降低（P<0.001或P<0.05）。（5）根据非小细胞肺癌临床分期,将非小细胞肺癌患者分为A组（I期和IIA期）、B组（IIB期）和C组（III期和IV期）三组。研究发现,与健康对照组比较,血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平在三组非小细胞肺癌患者中均显着降低（P<0.001）,抗VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平在早期和晚期非小细胞肺癌患者中均显着降低（P<0.001;P<0.05）,抗MUC1天然自身抗体（IgG）水平仅在早期非小细胞肺癌中显着降低（P<0.05）。3.ROC曲线分析发现,确定特异性为95.0%时,抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）对非小细胞肺癌诊断的敏感性分别为19.0%、19.0%和42.2%,抗CD25-MUC1-VEGFR1三种抗原多肽联合的天然自身抗体（IgG）对早期非小细胞肺癌的检测敏感性高达49.6%。4.Kaplan-Meier生存分析发现,非小细胞肺癌患者血浆抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗ABCC5、抗MYC、抗TNF-α、抗POU5F1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平与非小细胞肺癌患者总生存期无关（P>0.05）。5.体外细胞学研究发现,经过抗HER2天然自身抗体（IgG）阳性血浆处理组,NCI-H2122细胞活力显着低于阴性血浆处理组（P<0.05）,A549细胞活力高于阴性血浆处理组（P<0.05）;经过抗MUC1或抗VEGFR1阳性血浆处理组,NCI-H2122细胞活力均显着低于阴性血浆处理组（P<0.001）,A549细胞活力无显着差异（P>0.05）。6.肿瘤相关基因表达研究发现,NCI-H2122细胞中HER2、MUC1和VEGFR1基因mRNA表达水平均显着高于A549细胞（P<0.001）。结论:1.非小细胞肺癌患者血浆中抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平显着低于健康对照组,提示血浆抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平可作为非小细胞肺癌的生物标记。2.非小细胞肺癌患者血浆中抗CD25-MUC1-VEGFR天然自身抗体（IgG）对早期非小细胞肺癌诊断的敏感性最高,达到49.6%。因此,抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）联合检测有望成为非小细胞肺癌早期诊断新的生物标记。3.血浆中抗MUC1天然自身抗体（IgG）水平在早期非小细胞肺癌中显着降低,提示抗MUC1天然自身抗体（IgG）可能对早期非小细胞肺癌具有一定的诊断价值;在女性非小细胞肺癌患者显着低于健康对照组,提示抗MUC1天然自身抗体（IgG）水平可能对女性非小细胞肺癌患者具有一定的诊断意义。4.血浆中抗HER2和抗MUC1天然自身抗体（IgG）在肺腺癌患者中显着低于健康对照组,提示抗HER2和抗MUC1天然自身抗体（IgG）可能对肺腺癌具有一定的诊断价值。5.非小细胞肺癌患者血浆抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗ABCC5、抗MYC、抗TNF-α、抗POU5F1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平与非小细胞肺癌患者总生存期无关,对判断非小细胞肺癌患者预后无指导意义。6.富含抗HER2、抗MUC1或抗VEGFR1天然自身抗体的血浆可显着抑制NCIH2122细胞增殖。提示含有天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌可能具有潜在的治疗作用。7.NCI-H2122细胞HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA表达显着高于A549细胞,这就是为什么富含HER2、MUC1和VEGFR1天然自身抗体的血浆抑制NCI-H2122细胞增殖作用比A549细胞更强的原因。
李瑞蕾[2]（2020）在《RBM47在非小细胞肺癌中的表达及作用机制研究》文中进行了进一步梳理肺癌（Lung cancer,LC）居全球癌性致死的原因第一位,其中约85%为非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）。NSCLC发病机理尚未明确,为防治工作增添许多困难。云南省位于西南边陲,局部区域如宣威、个旧肺癌高发,严重制约当地民生发展,亟需阐明NSCLC特异性的发病及发展机制。RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）是真核生物中负责转录后调控的关键分子。RBPs与mRNA结合时调控mRNA剪接、输出、定位、翻译和降解,进而参与肿瘤的发生。RBM蛋白是指包含RNA识别域（RNA recognitionmotif,RRM）的一组RNA结合蛋白。作为RBPs的重要组成部分,RBM蛋白逐渐成为恶性肿瘤诊治潜在靶点。RBM47作为新发现的RNA结合蛋白,其功能研究相关报道尚在起步阶段。令人感兴趣的是,RBM47在不同癌症中可能发挥截然相反的作用。RBM47高表达的乳腺癌患者倾向于获得较好的临床预后。RBM47与Dickkopf相关蛋白1 mRNA3’UTR结合,从而提高其表达水平,该蛋白通过拮抗Wnt来抑制乳腺癌的复发和生长。但是在肺癌中,RBM47的下调加速小鼠异种移植模型中肿瘤的形成和转移。因此RBM47在NSCLC中发挥的作用引起我们的极大关注。据此,课题组将在细胞水平进行细胞增殖活性、细胞周期进程及细胞迁移能力检测,在组织学水平进行NSCLC中RBM47表达检测,探讨RBM47与NSCLC的相关性,以期获得RBM47调控NSCLC增殖和迁移等恶性生物学行为的实验学依据,为云南省NSCLC的诊治提供新的靶标及新的策略。本课题首先应用IHC方法检测了RBM47在NSCLC组织的表达,结果提示RBM47与NSCLC的发生可能密切相关,临床特征分析显示RBM47与肺癌密切相关,且提示患者预后不佳。为了进一步探讨RBM47在NSCLC中的作用机制,我们运用shRNA慢病毒干扰载体敲减RBM47后发现肺癌细胞A549增殖受抑,细胞周期阻滞,细胞凋亡增加,迁移能力减弱。第一部分:RBM47在NSCLC中的表达及临床意义[目 的]RBM47作为新的RNA结合蛋白,其功能研究相关报道尚在起步阶段。令人感兴趣的是,RBM47在乳腺癌及肺癌可能发挥截然相反的作用。因此RBM47在NSCLC中发挥的作用引起我们关注。本部分运用IHC技术检测RBM47在NSCLC组织表达情况,并分析临床特征与RBM47的相关性,为进一步研究RBM47作为NSCLC潜在的治疗靶点提供科学依据。[方法]1.通过在线数据库分析,来自Gene Expression Omnibus的6个数据集探讨了RBM47表达与NSCLC的相关性;2.运用在线数据库The Kaplan Meier生存曲线分析RBM47表达与NSCLC预后的相关性;3.本研究共纳入175例完整手术切除的患者的175对NSCLC癌组织及邻近非肿瘤组织,免疫组化染色检测组织标本中RBM47蛋白表达水平;4.比较肿瘤组织与正常组织RBM47表达阳性率,探讨其与临床病理特征及预后的关系;5.分析宣威肺癌、非宣威肺癌与RBM47表达的相关性;6.绘制NSCLC患者的生存曲线,研究RBM4 7表达对NSCLC患者预后的影响。[结 果]我们对175对NSCLC患者的组织样本进行了 RBM47表达的研究。IHC数据显示,与匹配的邻近组织相比,RBM47在癌组织中表达更高。此外,三个GEO数据集的RBM47表达水平也升高,提示RBM47可能参与了 NSCLC的发生发展。接下来的研究发现,RBM47表达增强与NSCLC的病理类型显着相关,与NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤大小、pT分期、淋巴结转移或pTNM分期无关。随后,宣威NSCLC中RBM47的表达水平高于非宣威NSCLC,提示RBM47是宣威NSCLC中较为敏感的标志物。数据显示,总体及与非宣威NSCLC患者中,与低RBM47表达水平相比,高RBM47表达与不良预后相关。然而,对于宣威NSCLC患者,生存曲线显示出预后差异的趋势,但是未达到统计学意义。因为其数量差异影响了统计分析,RBM47不能作为预后因素。[结 论]综上所述,本研究发现RBM47在NSCLC组织中显着上调,是宣威NSCLC中较为敏感的标志物,RBM47的表达与病理类型显着相关。此外,RBM47表达水平的升高可能预示着NSCLC患者的不良预后。第二部分:RBM47在NSCLC中的作用机制研究[目 的]前期结果表明:RBM47在NSCLC组织中显着上调,是宣威NSCLC中较为敏感的标志物;RBM47的表达与病理类型显着相关,其表达水平的升高可能预示着NSCLC患者的不良预后。提示RBM47可能参与肺癌的恶性进程。肿瘤细胞具有增殖异常、细胞周期紊乱、凋亡减少及侵袭与迁移等共10个标记特点。研究发现RBPs参与肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的恶性显型。本部分探讨RBM47在NSCLC的作用,通过MTS实验、细胞周期检测、细胞凋亡检测方法,为以RBM47为基础的靶向NSCLC治疗策略提供理论和实验依据。[方法]1.Westernblotting方法检测RBM47在肺癌细胞系及肺上皮细胞中的表达水平;2.BM47-shRNA慢病毒干扰载体敲减NSCLC细胞A549中RBM47基因;3.MTS增殖实验、细胞克隆形成以及流式细胞周期检测技术研究RBM47与NSCLC细胞增殖的关系;4.流式细胞凋亡检测技术研究RBM47与NSCLC细胞凋亡的关系;5.Transwell实验研究RBM47与NSCLC细胞迁移的关系。[结 果]前期工作基础为我们进一步了解RBM47在非小细胞肺癌发生发展中的作用提供了依据。RBM47在NSCLC细胞系中普遍表达,这一结果与肺癌组织中RBM47高表达保持一致。我们研究小组成功构建了 RBM47-shRNA慢病毒干扰载体。在NSCLC细胞系A549中敲减RBM47后,RBM47蛋白表达下降,A549细胞增殖能力降低,细胞克隆形成减少,流式细胞检测发现细胞周期发生G0/G1期阻滞,细胞凋亡增加,细胞迁移能力减弱。[结 论]RBM47在NSCLC细胞系中普遍表达,敲减RBM47后,A549细胞增殖能力降低,细胞周期发生G0/G1期阻滞,细胞凋亡增加,细胞迁移能力减弱,提示:RBM47可能参与NSCLC细胞增殖、凋亡及迁移。RBM47作为转录后调控因子,目前在肿瘤中的研究尚处在起步阶段,RBM47在肺腺癌中的调控网络以及促增殖分子机制仍有待于进一步探索。
金丹[3]（2020）在《功能化DNA纳米探针用于外泌体检测及其监测中药活性成分调控肿瘤来源外泌体》文中进行了进一步梳理研究背景和目的作为中国传统文化的瑰宝,中医药以其独特的理论体系和良好而确切的临床疗效,几千年来为国人的健康事业作出了巨大的贡献。近些年来,随着人们健康观念的转变和医学模式的变更,中医药在各类疾病的预防和治疗上更展现出了独特的优势。肿瘤尤其是恶性肿瘤是危害人类生命和健康最严重的疾病之一。根据中医学理论,肿瘤的产生因为是阴阳失衡,气血不调,五脏之气机紊乱。中药治疗肿瘤是在辨证论治基础上,给予扶正固本、软坚散结、活血化瘀、理气行滞、清热解毒等方法进行整体观的治疗。近年来,随着中药抗肿瘤的实验研究和临床应用的深入开展,中药及其活性成分在肿瘤放化疗时的增效减毒、提高患者整体免疫机能、改善临床症状和提高生命质量等方面的作用日趋凸显,使得中药抗肿瘤越来越受到国际社会的认可和接受。现代临床研究者们从分子生物学和分子药理学的角度对中药抗肿瘤的机制进行了广泛的探索,发现中药抗肿瘤具有多靶点、多效应、多环节的特点,但其抗肿瘤的复杂机制尚不完全清楚,特别是中药对于肿瘤微环境、肿瘤的免疫逃逸和肿瘤耐药的调控,都有待更加深入地研究。外泌体广泛分布于人体各种体液中。作为细胞间物质交换和信息传递的信使,外泌体不仅参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,还介导了肿瘤细胞的免疫逃逸和耐药等过程。目前外泌体作为理想的液体活检标志物和药物载体已被用于多种肿瘤的诊断、监测和治疗。近些年来,亦有许多中药单体、复方和中药活性成分被发现能通过调控外泌体释放来发挥抗肿瘤作用,这使得外泌体有望成为肿瘤治疗新的靶点。因此,研究中药如何调控肿瘤来源的外泌体将具有十分重要的意义,而如何快速、准确地监测肿瘤外泌体在中药作用肿瘤时发生的变化是研究者们首先需要关注和探索的问题。当前报道的文献中主要是采用酶联免疫吸附实验（ELISA）和蛋白免疫印迹法（WB）等传统分析方法来检测外泌体。这些检测方法虽然经典可靠,但是灵敏度和特异性有限,实验所需要的仪器设备和试剂成本较高,而且操作步骤繁琐耗时。所以,发展简单快捷、准确可靠、灵敏特异且成本低廉的新技术和新方法来实施外泌体的检测分析显得尤为重要。由于具有灵敏度高、特异性好、快速、准确和方便的特点,生物传感检测已被广泛应用于环境卫生和临床医药等领域。目前已有多种生物传感技术用于外泌体的检测,如电化学、表面等离子共振、表面声波、场效应晶体管等。这些基于界面修饰的外泌体生物传感技术具有较高的灵敏度,但是其生物传感器件的制备通常需要复杂的纳米制备工艺或者繁琐的界面工程,并且大多数生物传感技术都以昂贵的抗体来作为外泌体的识别元件。然而,在临床常规实验室中,可靠有效且成本合理的外泌体检测仍然是个艰难的任务,主要问题在于缺乏足够简易和快速的测定平台。脱氧核糖核酸（DNA）是生物体内遗传信息的重要载体。随着DNA固相合成技术的发展,人工合成DNA的成本显着降低。体外合成的DNA可以作为功能性分子或纳米材料发挥很多重要的功能。DNA可作为核酸探针对其互补序列进行特异性识别,也能作为核酸适体来靶向识别结合包括小分子有机化合物、无机金属离子、蛋白质、多肽、微囊泡甚至细胞和组织在内的各种靶标。将DNA的生物识别属性与一些纳米材料（如氧化石墨烯、碳纳米管等）的优良传感特性和信号转导机制相结合,可通过各种常规实验室检测平台（如荧光分析、比色分析等）实现对包括外泌体在内的各种生物样本的高灵敏检测。值得注意的是,DNA本身还可利用互补链之间严格的碱基互补配对自组装形成结构有序、功能可控的DNA纳米材料,并可构建成为对外泌体具有信号响应功能和信号扩增功能的DNA纳米分子机器。鉴于外泌体的纳米尺度,功能化DNA组件和外泌体都限制在同一个纳米空间内,反应物有效浓度将得到极大的提高,能够实现检测信号的快速放大。本研究拟利用功能化DNA的生物识别特性,结合纳米材料和DNA纳米分子机器的信号转导功能和信号扩增功能,设计均相体系中基于荧光分析的纳米生物传感技术,用于外泌体及其表型分子的检测。采用此技术分析肿瘤来源的外泌体,不仅可以准确反映肿瘤发生时的外泌体丰度及表型特征,也可以实时监测各种药物作用肿瘤的过程中外泌体发生的变化,这对于研究中药抗肿瘤机制以及抗肿瘤效果均具有十分重要的意义。方法与结果本研究首先制备了基于DNase I催化的氧化石墨烯核酸适配体纳米探针,用于肿瘤外泌体的高灵敏检测和表型分析;然后构建了外泌体激活的无酶放大的多价DNA纳米分子机器实现了外泌体的超灵敏检测以及表型分子的双色检测,并可用于肿瘤的免疫治疗监测。在此基础之上,运用构建的传感器监测中药活性成分对肿瘤外泌体及外泌体PD-L1的调控。本课题的主要内容包括以下三个部分:第一部分:基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术用于外泌体定量和表型分析外泌体的膜表面及囊泡内携带有多种生物活性分子,多为核酸、蛋白质、多肽和脂质等。由于外泌体的分子特征可以精确地反映其生物来源,因此肿瘤外泌体正逐渐成为肿瘤诊断的新型标志物。然而体液中外泌体的分子表达谱精准分析和定量检测在技术上仍具有很大挑战。针对这一问题,构建了一种基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术用于肿瘤外泌体表型分析和检测。ExoAPP通过氧化石墨烯和靶向外泌体表面特定蛋白的适体荧光探针相结合形成“Off”纳米探针复合物。在DNase I参与下,核酸适体纳米复合物探针可反复识别目标外泌体,不断循环放大荧光信号“On”,从而可甄别外泌体表面标志物的细微变化,实现了5种不同来源外泌体的表型分析,揭示了外泌体的异质性。相比已报道的外泌体均相检测方法,ExoAPP的灵敏度至少提高了12个数量级,检测限达到1.6×105 particles/mL。这种高灵敏的ExoAPP技术还可监测药物诱导肿瘤细胞的上皮-间充质转变（EMT）。通过对前列腺癌患者血液样本外泌体表面的PSMA等标志物表达差异分析,ExoAPP可准确鉴别前列腺癌患者和健康人群,进一步证实PSMA等标志物在前列腺癌临床诊断中的潜力。第二部分:基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术用于外泌体表面标志物的双色分析和抗PD-1免疫治疗监测受到细胞内高效运行的分子机器的启发,我们将外泌体与核酸适体的多价识别与Toehold介导的链置换循环反应相结合,构建了一种由外泌体激活的具有多价循环放大效应的DNA纳米分子机器（ExoADM）,可实现超灵敏的外泌体检测和外泌体表面标志物的双色分析,并可用于抗PD-1免疫治疗监测。ExoADM包含三个核心部件:可对外泌体表面标志物产生响应的识别探针、包含两个Toehold区域的信号探针以及可驱动链置换反应循环进行的燃料探针。外泌体通过其表面标志物与识别探针中的特异适体发生多价结合,释放识别探针中的引发链;引发链侵入信号探针,通过结合Toehold区域Ⅰ,驱动链的分支迁移释放出猝灭链,解放荧光报告基团,并暴露出隐藏的Toehold区域Ⅱ;燃料探针通过结合Toehold区域Ⅱ,启动Toehold介导的链置换循环反应,发生连续的分支迁移和多价回收。基于信号探针中的荧光信号转导机制,单个分子识别事件可引发ExoADM连续释放大量荧光报告基团,实现信号放大,为外泌体分析提供了一个超灵敏（3.3×104 particles/mL）、高特异的无酶催化生物传感平台。此外,两种靶向不同外泌体表面标志物的ExoADM可以协同运行,实现外泌体的双色表型分析。利用双色策略,我们可以同时追踪由IFN-γ和白藜芦醇分别诱导PC-3细胞引起的外泌体PD-L1和外泌体CD63表达的动态变化。我们还发现PD-L1和CD63在循环外泌体上的表达水平可以很好地区分肿瘤患者与健康人群。更重要的是,循环外泌体PD-L1水平可以反映肿瘤患者对不同治疗措施（如放疗、化疗和抗PD-1免疫治疗）的治疗反应,有助于指导抗PD-1免疫治疗,并揭示外泌体PD-L1在临床诊断和治疗监测方面的潜力。第三部分:基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术监测中药活性成分调控肿瘤细胞外泌体及外泌体PD-L1的研究在上述工作基础上,选取四种中药活性成分:白藜芦醇、紫草素、桔梗皂苷D和紫杉醇,分别作用于非小细胞肺癌A549细胞。在分析了这四种药物对A549细胞增殖和凋亡的影响的基础上,采用ExoADM监测了中药活性成分对肿瘤细胞外泌体释放及外泌体PD-L1的调控。首先采用CCK-8法、流式细胞术和Western blotting技术分析了四种中药活性成分对非小细胞肺癌A549细胞的细胞增殖和凋亡的影响。结果表明,四种药物在一定浓度范围内能够抑制A549细胞增殖,且呈时间浓度依赖性;流式凋亡检测和凋亡相关蛋白的免疫印迹分析证实四种药物有诱导A549细胞凋亡的作用。接下来从四种药物分别处理A549细胞48 h后的细胞上清中分离提取外泌体,并采用ExoADM技术检测外泌体CD63和PD-L1水平。结果表明,这些药物在抑制肿瘤细胞增殖促进其凋亡的同时,也影响了细胞内外泌体合成、内容物装配和转运释放等相关的信号路径,可诱导或抑制外泌体的胞外释放及影响外泌体携带的生物信息分子的表达。在选用的四种中药活性成分中,除了紫草素可以轻度抑制A549细胞的外泌体释放,其他三种均表现出对外泌体释放的诱导增强作用。与此同时,这四种药物均不同程度地促进了外泌体PD-L1的表达。我们用NTA法、BCA法和Western blotting技术进一步验证了我们的实验结果。这提示我们,当这四种中药活性成分被用于临床非小细胞肺癌治疗时,在抑制原发肿瘤病灶细胞增殖的同时,可能会通过上调外泌体PD-L1水平来激活外泌体介导的PD-L1/PD-1路径,促进肿瘤发生免疫逃逸和转移;也有可能通过上调肿瘤的PD-L1水平来提高免疫抑制剂治疗的敏感性,这提示我们联合应用中药活性成分治疗将成为肿瘤免疫治疗的一个重要发展方向。我们的实验结论进一步证实了中药对肿瘤细胞增殖的抑制效应,同时也揭示了中药对肿瘤外泌体及其携带的信号分子调控的复杂性,体现了中药对肿瘤的多靶点、多效应、多环节的调控特点。结论1.发展了一种基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术,实现了肿瘤外泌体的高灵敏定量检测和外泌体蛋白达谱分析,为基于外泌体的肿瘤液体活检提供了一种简单、快速、可靠的生物传感平台。2.发展了一种基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术,实现了无酶催化的超灵敏外泌体检测和外泌体双色表型分析,并将其应用于肿瘤免疫治疗（抗PD-1）的监测。3.白藜芦醇、紫草素、桔梗皂苷D和紫杉醇对A549细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。4.采用ExoADM技术监测了中药活性成分对肿瘤细胞外泌体及外泌体PD-L1的调控。紫草素可以抑制A549细胞外泌体的释放,白藜芦醇、桔梗皂苷D和紫杉醇均可诱导A549细胞外泌体释放;四种中药活性成分均不同程度地促进A549细胞外泌体PD-L1的表达。
张新宇[4]（2019）在《A-Raf激酶结合蛋白的系统识别及ACBD3在环境相关的肺癌发生中的作用机理研究》文中研究表明肺癌是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一。在2018年全球约有210万人被诊断患有肺癌,并且有180万人因肺癌而死亡。随着世界范围内工业化和环境污染的加剧,肺癌的发病率逐年增加。肺癌的发生与环境密切相关,云南省宣威市和个旧市是我国肺癌高发地区之一,吸烟、使用烟煤和锡矿开采可能是这些地区肺癌高发的主要因素。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占所有肺癌的80%左右。肿瘤的转移和复发成为非小细胞肺癌治疗中的主要难题。目前大部分肺癌患者在确诊时病情已经发展至中晚期阶段,且患者整体预后较差。靶向治疗和免疫疗法已经成为未来肺癌治疗的主要方向。细胞内信号转导的异常可导致癌症等疾病的发生。因此,对肺癌细胞信号传导网络复杂性的进一步了解,发现新的诊断和治疗靶点已成为肺癌治疗中急需解决的问题。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路参与调控增殖,分化和存活等诸多细胞过程。该通路中核心成员的过度表达或异常激活是诊断癌症的常见指标,并且可促进肿瘤的发生和发展。Raf（rapidly accelerated fibrosarcoma）家族激酶A-Raf,B-Raf和C-Raf是MAPK通路中的关键蛋白,它们是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）和Ras（rat sarcoma）的下游信号分子。A-Raf的基础激酶活性远低于其他Raf激酶,它的表达分布也不如其他Raf激酶广泛。这导致对B-Raf和C-Raf的生物学功能研究较为透彻,而对A-Raf的研究具有局限性。因此对于A-Raf功能调控的全面解析就显得尤为重要。细胞内蛋白之间的相互作用是调控细胞过程的基础。目前对A-Raf的结合蛋白没有系统的鉴定和分析,这阻碍了对A-Raf激酶功能的进一步研究。因此在实验室前期对B-Raf和C-Raf结合蛋白分析的基础上,我们通过免疫共沉淀和质谱等蛋白质组学手段对静息状态下A-Raf的结合蛋白进行鉴定。我们研究发现:（1）鉴定得到132个A-Raf的结合蛋白,其中126个蛋白为首次发现。通过western blotting验证,这些蛋白有92%的阳性结合率;（2）分析表明A-Raf通过与结合蛋白的相互作用参与调控细胞凋亡,RNA分解代谢和细胞粘附;（3）A-Raf结合蛋白的功能完全覆盖肿瘤的十大特性,表明A-Raf在癌症的发生过程中具有调控作用。这些研究确定了A-Raf的潜在调节因子,并为其生物学功能的系统性了解提供了基础。为了进一步探究结合蛋白对三种Raf激酶功能差异的影响,我们对三种Raf激酶在血清饥饿和表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）刺激条件下的结合蛋白进行了系统比较。我们鉴定得到了近400个新的结合蛋白,其中有些蛋白与三个Raf激酶均相互作用,而有的蛋白仅与一种或两种Raf激酶结合。在血清饥饿条件下比较三种Raf激酶的结合蛋白发现了163个共同的蛋白,表明Raf激酶在无活性状态下具有相同的功能。相反,在EGF刺激的条件下仅鉴定得到87个共同的结合蛋白,表明Raf激酶被激活时通过特定的结合蛋白发挥不同的功能。部分A-Raf结合蛋白参与单一受精和精卵识别,提示A-Raf通过与其他蛋白相互作用在生殖过程中发挥作用。比较分析结合蛋白谱可以确定Raf激酶之间的差异,有利于发现新的功能和调节机制。酰基辅酶A结合结构域蛋白3（acyl-coenzyme A binding domain containing 3,ACBD3）作为一种多功能的高尔基体蛋白参与调控类固醇生成、病毒复制、细胞凋亡、亨廷顿舞蹈症等多种细胞功能和疾病。实验发现ACBD3与Raf激酶相互作用。我们选取在癌症中高表达的ACBD3作为研究对象,探究其在非小细胞肺癌发生中的作用机理。研究发现ACBD3在H1299细胞中可以促进细胞增殖、迁移、上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）等。体内裸鼠成瘤实验表明敲除ACBD3可以显着降低肿瘤形成的能力。ACBD3的表达量与细胞对顺铂（cisplatin,CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）的敏感性呈正相关。对细胞信号通路的研究发现,随着ACBD3表达量的增加,B-Raf激活性磷酸化位点S445的磷酸化程度增加,下游ERK的磷酸化程度也显着增加。总结,我们从互作蛋白质组水平探究了A-Raf结合蛋白的功能,成功鉴定得到126个新的A-Raf结合蛋白,全景解析了A-Raf的结合蛋白谱。比较不同培养条件下Raf家族激酶结合蛋白谱揭示了每个激酶功能的相似性和特异性。探究了Raf激酶结合蛋白ACBD3在肺癌发生中的作用,初步确定ACBD3可以促进肿瘤的发生,为肺癌的临床治疗提供了新的研究靶点。
陈艳[5]（2019）在《miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究》文中研究表明[目的]分析miR-32、ITGA6的表达水平之间的相关性以及与NSCLC患者临床病理参数的相关性,并通过体外、体内实验研究miR-32靶向调节ITGA6表达在NSCLC生长和转移中的作用及其机制,为临床NSCLC诊治提供新的分子标志物和潜在的重要靶点。[方法]1、qPCR技术检测NSCLC患者癌组织、配对远端对照肺组织中miR-32的表达水平,收集整理患者临床病理参数。2、采用 miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors、pGpU6/GFP/Neo-miR-32,通过脂质体瞬时转染NSCLC细胞,荧光显微镜和qPCR评价转染效果;采用CCK实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell侵袭实验研究miR-32对NSCLC细胞增殖能力、成瘤能力、迁移和转移能力的影响。3、采用生物信息学分析软件（PITA、RNA22、TargetScan、picTar、miRanda、microT）和在线数据库分析miR-32潜在的靶基因;构建野生型和突变型ITGA6 3’UTR,与miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors共转染297T,进行双荧光素酶报告基因检测;miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors 通过脂质体瞬时转染 A549 和XWLC-05细胞后,qPCR和Western blot技术检测miR-32、ITGA6的表达水平;分析qPCR检测NSCLC患者肿瘤组织中miR-32与ITGA6表达水平之间的相关性;采用免疫组织化学技术检测NSCLC患者癌组织、配对远端对照肺组织中ITGA6、ITGB4的表达水平,收集整理患者临床病理参数;采用MTS实验、软琼脂克隆实验、Transwell体外侵袭和迁移实验等体外实验研究整合素α6β4对NSCLC细胞增殖能力、成瘤能力、转移和迁移能力的影响;采用裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠肺原位移植瘤模型,体内实验研究整合素α6β4在NSCLC生长和转移中的作用。4、通过慢病毒感染构建具有GFP和LUC标记稳定表达miR-32、miR-NC的A549细胞,并采用qPCR和Western blot技术检测miR-32、ITGA6表达水平,评价筛选结果;通过皮下注射GFP标记的实验组（LV-miR-32）、对照组（LV-miR-NC）的A549细胞,构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察裸鼠一般情况,测量裸鼠体重、瘤体大小。接种肿瘤细胞后22天时处死裸鼠,测量瘤体重量和大小,肿瘤组织一部分速冻,进行qPCR检测miR-32表达,另一部分10%中性甲醛固定,进行HE染色;通过尾静下注射LUC标记的实验组（LV-miR-32）、对照组（LV-miR-NC）的A549细胞,构建SCID小鼠肺转移模型。接种肿瘤细胞后30天进行小动物活体成像,并处死小鼠,肺组织固定后进行HE染色。5、miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors及其阴性对照通过脂质体瞬时转染A549 和 XWLC-05 细胞,qPCR 和 Western blot 技术检测 miR-32、ITGA6、FAK、pFAK、E-cadherin、Vimentin、SLUG 表达水平。并通过 Rescue 实验,qPCR 和Western blot 技术检测 miR-32、ITGA6、FAK、pFAK、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin、Vimentin、SLUG 表达水平,进一步研究 miR-32 在 NSCLC进展中的作用机制。[结果]1、miR-32在94例NSCLC组织中的相对表达量为0.79（0.14,1.71）,而在配对远端对照肺组织中的相对表达量1.00（0.37,3.65）,差异具有统计学意义（P<0.01）;miR-32在37例宣威NSCLC组织中的相对表达量明显低于配对远端对照肺组织（P<0.05）,而37例宣威NSCLC组织中miR-32相对表达量与57例非宣威NSCLC比较,差异无统计学意义（P>0.05）;miR-32的表达水平与患者年龄、性别、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、病理类型之间均没有相关性（分别P>0.05）。2、qPCR结果显示,miR-32在NSCLC细胞中的表达水平低于正常支气管上皮细胞16HBE,差异有统计学意义（分别P<0.01）。转染miR-32-5p mimics、pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC 细胞中 miR-32 的表达水平均高于阴性对照组（分别P<0.001）。CCK实验结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549、XWLC-05细胞增殖明显受到抑制（分别P<0.001）,而转染miR-32-5p inhibitors的A549、XWLC-05细胞增殖率明显高于其阴性对照inhibitors NC（分别P<0.001）。平板克隆形成实验结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549、XWLC-05、H157细胞克隆数明显低于阴性对照组miR-NC（分别P<0.001）。划痕实验结果显示,转染 pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC细胞伤口愈合速度明显慢于阴性对照组（分别P<0.001）。Transwell侵袭实验结果显示,转染 pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC侵袭细胞数明显低于阴性对照组（分别P<0.001）。3、4 个数据库（PITA、TargetScan、miRanda、microT）预测 ITGA6 具有 miR-32的结合位点;双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-32-5p mimics可明显抑制野生型ITGA6 3’UTR质粒荧光素酶活性（P<0.001）,而突变型ITGA6 3’UTR质粒活性则无明显变化（P>0.05）。相反,miR-32-5p inhibitors则可明显促进野生型ITGA6 3’UTR质粒荧光素酶活性（P<0.001）;qPCR结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549和XWLC-05中miR-32表达水平均明显高于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.05）,而ITGA6表达水平均明显低于阴性对照组（分别P<0.01）。转染miR-32-5p inhibitor的A549和XWLC-05中miR-32表达水平则均明显低于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.05）,而ITGA6的表达水平均明显高于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.01）;Western blot 结果显示,转染 miR-32-5p mimics后,A549和XWLC-05中ITGA6蛋白的表达水平均低于阴性对照组。NSCLC肿瘤组织中miR-32和ITGA6的相对表达呈现负相关关系（r=-0.34,P<0.001）;整合素α6β4在NSCLC肿瘤组织中的表达均高于配对远端对照肺组织（分别P<0.05,P<0.001）。整合素α6β4的表达均与NSCLC患者复发转移密切相关（分别P<0.01）;整合素α6β4在NSCLC细胞株中均有表达。抑制整合素α6β4表达的实验组H460SM细胞软琼脂克隆形成率、迁移率、侵袭率均低于与阴性对照组（分别P<0.05）;抑制ITGA6、ITGB4表达的实验组裸鼠皮下移植瘤体积小于阴性对照组（分别P<0.05）;抑制ITGA6、ITGB4表达的的实验组SCID小鼠肺癌原位移植瘤转移率低于阴性对照组（分别P<0.05）。4、qPCR和Western blot技术检测稳定表达miR-32和miR-NC的A549细胞中miR-32、ITGA6的表达,结果显示实验组（A549/LV-miR-32）miR-32的表达均明显高于对照组(（A549/LV-miR-NC）,而ITGA6的表达则均明显低于对照组（分别P<0.001）。裸鼠皮下移植瘤模型结果显示,与对照组(（A549/LV-miR-NC）比较,实验组（A549/LV-miR-32）小鼠皮下移植瘤增长趋势明显受到抑制,差异有统计学意义（P<0.01）。实验组移植瘤离体肿瘤重量、肿瘤体积均小于对照组（分别P<0.01,P<0.05）。qPCR结果显示,实验组移植瘤离体肿瘤miR-32表达水平明显高于对照组（P<0.01）。SCID小鼠尾静脉注射肺转移模型实验结果显示,对照组肺脏肿瘤结节数明显多于实验组（P<0.001）。5、瞬时转染 miR-32-5p mimics 的 A549 和 XWLC-05 细胞中 ITGA6、pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、Vimentin表达水平均低于阴性对照组,E-cadherin则高于阴性对照组（分别P<0.05）,而瞬时转染miR-32-5p inhibitors的A549和XWLC-05细胞中ITGA6、pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、Vimentin 表达水平均高于阴性对照组,E-cadherin则低于阴性对照组阴性对照组（分别P<0.05）;与miR-NC和过表达对照质粒瞬时共转染比较,miR-32-5p mimics和过表达对照质粒瞬时共转染A549和 XWLC-05 细胞,ITGA6 蛋白及其下游 pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、p-AKT、p-ERKl/2表达水平降低,E-cadherin表达水平升高而Vimentin、SLUG表达水平降低（分别P<0.00l,P<0.0l）。与miR-32-5p mimics和过表达对照质粒瞬时共转染比较,miR-32-5p mimics和ITGA6过表达质粒瞬时共转染A549和XWLC-05细胞,可部分逆转由于miR-32-5p mimics所造成的ITGA6蛋白表达的抑制,增加下游 pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、p-AKT（ser473）、p-ERK1/2（pT202/Y204）磷酸化蛋白表达水平,增加Vimentin、SLUG表达,降低E-cadherin表达。[结论]1、miR-32在NSCLC肿瘤组织中呈低表达,提示miR-32在NSCLC发生发展中可能发挥抑癌miRNA的作用。2、过表达miR-32可抑制NSCLC生长和转移。3、整合素α6β4信号通路可促进NSCLC生长和转移。ITGA6是miR-32新的靶基因。miR-32可抑制ITGA6表达,抑制整合素α6β4信号通路的活化,抑制AKT、ERK激活,降低SLUG的表达,进而抑制NSCLC的侵袭和转移。
赵文淘[6]（2019）在《DCUN1D1促进个旧矿工肺鳞癌增殖和侵袭的机制研究》文中进行了进一步梳理肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率高居首位。肺癌以鳞癌和腺癌为主,其中肺鳞癌治疗手段单一,缺乏包括靶向药物在内的针对性的有效治疗药物,预后差。云南个旧是中国最大的锡工业基地,锡矿工人的肺癌发病率和死亡率是正常人群的20多倍,位居全世界榜首,个旧锡矿矿工肺癌（简称个旧矿工肺癌）一直都是全球高发肺癌研究的热点之一[1]。令人关注的是,流行病学的研究结果提示氡子体、砷暴露是导致个旧矿工肺癌高发的重要危险因素,且病理类型以鳞癌为主（鳞癌占71.2%,腺癌仅占9%）[2-4],提示个旧矿工肺癌可能有其特殊的发病机制,这也使得个旧矿工肺癌成为很好的研究化学致癌物致癌的人体模型。然而,令人遗憾的是,个旧矿工肺癌发病机制至今未阐明。因此,深入探讨个旧矿工肺癌的驱动基因和发病机制,将为肺鳞癌、特别是砷化物等化学致物致癌的防治提供新的干预靶点。本研究经过基因芯片筛选出在个旧矿工肺癌的癌组织中高表达的基因DCUN1D1,经免疫组化验证后进一步研究该基因在肺鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡方面的生物学功能,通过Western blotting信号通路及可能作用靶点筛选初步探讨其作用机制。通过本研究得出以下结论:与其在非个旧矿工肺鳞癌癌组织中的表达相比,DCUN1D1在个旧矿工肺癌的癌组织中特异性高表达,而且随着个旧矿工肺癌患者的临床分期提高（I期、II期、III期）,DCUN1D1的阳性表达率也逐渐升高。DCUN1D1促进个旧矿工肺鳞癌细胞及ATCC肺鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭,该基因对肺鳞癌细胞凋亡无影响。增殖方面具体体现为:抑制DCUN1D1表达后细胞周期抑制因子p15、p16、p21、p27、p53的表达上调,细胞周期促进因子Cyclin E1的表达下调,导致细胞周期阻滞于G1期,细胞增殖能力减弱。从翻译后修饰的角度考虑,DCUN1D1作为可促进类泛素化过程的E3泛素连接酶,抑制DCUN1D1的表达后,可能导致了 p53的类泛素化修饰减弱,p53的转录活性增强,p53蛋白表达升高,p53进一步上调p21的表达,使得细胞周期阻滞于G1期,最终导致细胞增殖能力减弱。迁移及侵袭方面具体体现为:抑制DCUN1D1后EMT相关基因无明显变化,而基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达随DCUN1D1的降低而明显下调;结合既往文献报道结果及我们的研究结果,说明抑制DCUN1D1后肺鳞癌细胞的迁移及侵袭能力减弱与MMP-2的表达下调直接相关,而与EMT无关。结合DCUN1D1发挥转录因子的作用直接转录调控Hedgehog（HH）信号通路中关键分子Gli1表达的文献报道结果,及我们研究发现抑制DCUN1D1表达后Gli-1的表达也相应降低的结果,我们还推断DCUN1D1也极有可能直接转录调控Gli1的表达,通过HH信号通路而发挥促增殖、促侵袭转移的生物学作用。
谭乔燕[7]（2018）在《FGFR1特异结合多肽的筛选与应用》文中研究说明当前药物靶点的筛选主要集中在细胞膜受体和代谢相关的酶类等。成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast growth factor receptors,FGFRs）属于酪氨酸激酶家族成员之一,具有自身酪氨酸磷酸化活性,与其相应配体成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factors,FGFs）结合调节细胞增殖、分化、迁移和存活等。目前已发现4种FGFR,即FGFR1-4。骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是关节软骨老化、变性和继发的软骨增生,骨化为主要病理变化,以关节僵硬、功能障碍为主要临床表现的一种慢性疾病,是严重影响人民生活质量、国家经济和社会发展的重大问题。药物治疗主要围绕缓解疼痛、抑制炎症等方面,如口服甾体类抗炎镇痛药;物理治疗主要对持续性的疼痛采取关节腔内注射透明质酸、类固醇激素与富含血小板的血浆等,但这些治疗难以从根本上缓解OA的进展。全关节置换是晚期OA患者仅有的有效治疗措施,但到此阶段,患者生活质量已长时间受到严重影响,且并发症多。因此,深入研究OA退变的机制,寻找和开发有效防治OA退变的药物与措施是我国当前健康领域重大的战略需求。课题组前期利用他莫昔芬可诱导关节软骨特异性敲除Fgfr1小鼠模型,通过分析3种关节炎模型(衰老模型、抗原诱导的关节炎模型（Antigen-induced arthritis,AIA）、创伤诱导的内侧半月板不稳定模型（Destabilization of the Medial Meniscus,DMM）的关节病理及量化评分,结果显示关节软骨细胞敲除Fgfr1能够延缓衰老模型、AIA模型导致的关节软骨基质蛋白多糖的丢失并减轻DMM模型导致的关节软骨结构破坏。同时发现拮抗FGFR1的小分子化合物GL-141可阻止DMM模型诱导的OA的病理发展,达到保护关节软骨的目的。上述研究结果提示靶向抑制FGFR1可能是缓解或治疗关节软骨损伤和退变的新策略。当前在全球范围内,肺癌依然是人类癌症致死的重要原因。统计分析发现大于90%的肺癌患者都有吸烟史或曾长期使用烟草制品。不过,诸如氡气,石棉,空气污染物暴露以及慢性感染之类的其它因素也在肺癌的形成中起到一定的作用。另外,人们也发现了多种遗传性及获得性易感机制。根据组织病理学特点肺癌主要分为两类,即小细胞型肺癌（Small-cell lung carcinomas,SCLC）和非小细胞型肺癌（Non small-cell lung carcinomas,NSCLC）。过去25年间对肺癌的诊断和治疗有一些进步,但肺癌患者的预后仍不乐观。目前标准治疗方案对肺癌的效果十分有限,仅对一些极为局限的肺癌有较好的效果。有研究表明FGF2和FGFR1在多数肿瘤中高表达,并且与某些肿瘤的分期、分级、转移和预后密切相关。FGF2可通过自分泌和旁分泌作用刺激肿瘤细胞,FGFR1和FGF2结合后发生自身酪氨酸磷酸化,激活下游信号通路,从而促进肿瘤细胞增殖,促进肿瘤血管发生,对肿瘤发展、转移和预后起重要作用。提示靶向抑制Fgfr1可能是治疗肿瘤的新策略。本课题以FGFR1为靶蛋白,通过噬菌体展示技术筛选与FGFR1特异结合的12肽,研究其在缓解或治疗OA和延缓肺癌发生发展中的作用。经过三轮“吸附-洗脱-扩增”淘选,得到3个与FGFR1特异结合的12肽序列。多肽与FGFR1结合,通过MAPK信号通路抑制FGFR1及下游ERK1/2信号。进一步在小鼠膝关节行DMM手术,关节腔注射多肽R1-P1的小鼠关节软骨退变和基质丢失程度显着性降低,提示R1-P1多肽可以缓解DMM模型导致的小鼠关节炎表型。另外,体外建立鸡胚绒毛尿囊膜模型和Tube模型,R1-P2多肽处理可抑制血管发生。进一步在裸鼠皮下注射A549细胞建立在体成瘤模型,腹腔注射R1-P2多肽可显着减小成瘤组织块的体积和质量,提示R1-P2多肽可通过抑制细胞增殖和血管发生抑制肺癌发展。因此,FGFR1特异结合多肽可能是调节FGFR1活性的新型抑制剂,为进一步研制用于治疗OA和肺癌的高靶向性药物奠定了实验基础。研究方法:第一部分:噬菌体展示技术筛选与FGFR1特异结合的多肽1.以FGFR1为靶蛋白,噬菌体展示技术筛选随机12肽。2.ELISA检测阳性单克隆与FGFR1的亲和力及与FGF2的竞争洗脱率。3.基于氨基酸序列分析12肽的基本物理化学性质（网址:http://www.expasy.org/tools/protparam.html）。第二部分:FGFR1特异结合多肽R1-P1缓解OA的进展1.ELISA和分子对接分析多肽R1-P1和FGFR1的亲和力。2.IL-β1处理人股骨头全层软骨组织块,番红O染色检测多肽R1-P1存在或不存在情况下胞外基质着色情况。3.qRT-PCR分析小鼠原代软骨细胞中多肽R1-P1对软骨稳态维持相关基因表达的影响。4.WB分析小鼠原代软骨细胞中多肽R1-P1对FGFR1及其下游信号的影响。5.8周小鼠膝关节行DMM手术,术后连续4,8,12周关节腔注射R1-P1肽,小鼠关节软骨损伤组织学评估参考关节炎研究学会推荐方法进行评分。6.IHC和TUNTL法检测术后连续8周关节腔注射R1-P1肽对胞外基质代谢相关蛋白表达及软骨细胞凋亡的影响。第三部分:FGFR1特异结合多肽R1-P2抑制肺癌进程1.ELISA和分子对接分析多肽R1-P2和FGFR1的亲和力。2.WB分析A549和NCI-H460细胞中多肽R1-P2对FGFR1及其下游信号的影响。3.MTT法、TUNEL法、细胞划痕法和Transwell小室法检测多肽R1-P2对A549和NCI-H460细胞增殖、凋亡、迁移能力和侵袭能力的影响。4.在体建立裸鼠成瘤模型,腹腔注射多肽R1-P2检测对裸鼠成瘤的影响。5.体外建立Tube模型和CAM模型,检测多肽R1-P2对血管发生的影响。实验结果:第一部分:噬菌体展示技术筛选到3个与FGFR1特异结合的多肽1.经过三轮“淘选”,得到23个阳性噬菌体单克隆,进行DNA测序分析,得到3个与FGFR1结合的多肽序列,分别命名为多肽R1-P1,R1-P2和R1-P3。2.3种噬菌体单克隆与FGFR1均具有较高亲和力,且FGF2对这三种噬菌体单克隆与FGFR1的结合具有竞争作用。3.多肽R1-P1相对分子质量为1462.65,分子式为C68H91N19O16S1,不稳定系数为33.87,理论等电点为6.92,总平均亲水性为-1.350;多肽R1-P2相对分子质量为1388.50,分子式为C63H89N17O19,不稳定系数为25.22,理论等电点为6.74,总平均亲水性为-0.883;多肽R1-P3相对分子质量为1523.76,分子式为C72H106N20O17,不稳定系数为89,理论等电点为8.60,总平均亲水性为-1.483。第二部分:FGFR1新型抑制剂R1-P1多肽可缓解或治疗OA1.多肽与FGFR1形成FGFR1/R1-P1复合物,总体评分和C评分分别是7.87和5。另外,根据RMSD图,RMSD在70 ns后波动接近2.5 A,且R1-P1肽可通过氢键、静电和疏水相互作用稳定结合到FGFR1上。2.R1-P1肽与FGFR1有较高的结合OD450值,但与FGFR2和FGFR3的结合OD450值较低。随着R1-P1肽浓度增加到50和100 mM,与FGFR1的亲和力逐渐增强。另外,25和50 mM R1-P1多肽显着抑制FGF2激活的磷酸化ERK1/2活性。3.20 ng/ml IL-1β处理人股骨头软骨全层组织块,25和50 mM多肽R1-P1处理后能显着减少胞外基质丢失,并能显着减少释放到培养基中的GAG含量。4.IL-1β处理后,小鼠原代软骨细胞中基质分解代谢相关酶Adamts5和MMP13的mRNA表达水平显着增高,基质合成代谢相关基因Aggrecan和Col II的mRNA表达水平显着降低,多肽R1-P1处理后恢复胞外基质代谢相关基因稳态的维持。同时,R1-P1肽可降低小鼠原代关节软骨细胞MMP13的表达和增加Aggrecan的表达,并抑制FGFR1下游信号ERK1/2的磷酸化水平。5.DMM术后4周呈现OA样表型,软骨基质丢失和关节软骨破坏。DMM术后8周OA样表型更加显着。连续8,12周关节腔注射R1-P1肽可显着缓解DMM所致关节软骨基质丢失和关节软骨破坏。另外,H&E染色和滑膜组织学评分提示连续8,12周关节腔注射R1-P1肽可显着缓解DMM所致滑膜炎症。6.DMM术后8周关节软骨组织增加基质水解酶Adamts5和MMP13的表达,减少软骨细胞基质Aggrecan和Col II的合成,增加Col X阳性细胞比率和凋亡阳性细胞比率,连续8周关节腔注射R1-P1肽可显着缓解DMM所致关节软骨基质Aggrecan和Col II丢失和减少基质水解酶Adamts5和MMP13的表达,减少关节软骨组织Col X阳性细胞比率和凋亡阳性细胞比率。第三部分:FGFR1特异结合多肽R1-P2通过抑制细胞增殖和血管发生抑制肺癌进展1.多肽R1-P2分别以A、B链结合位点与FGFR1蛋白胞外段特异结合,且亲和力为1.538×10-77 M。2.FGF2激活A549和NCI-H460细胞的FGFR1活性及其下游ERK1/2信号的磷酸化水平,多肽R1-P2处理后显着抑制FGFR1的磷酸化水平及ERK1/2的磷酸化水平。3.体外细胞实验中,多肽R1-P2抑制FGFR1活性,包括降低A549和NCI-H460细胞的增殖活性,促进凋亡,并降低迁移能力和侵袭能力。4.裸鼠皮下注射A549细胞有显着的肿瘤包块形成,腹腔连续注射R1-P2多肽28 d显着抑制肿瘤包块的质量和体积。5.多肽R1-P2抑制血管发生和降低肿瘤组织中α-SMA,SM22和CD31的表达。结论:1.噬菌体展示技术筛选得到3个与FGFR1有较高亲和力的12肽序列。2.关节腔局部注射多肽R1-P1可缓解DMM引起的小鼠关节软骨退变。3.腹腔注射多肽R1-P2可通过抑制细胞增殖和血管发生抑制肺癌进展。
李科[8]（2014）在《四跨膜蛋白CD151对非小细胞肺癌侵袭和转移的影响》文中认为一、背景和目的肺癌作为一种严重威胁人类健康和生命的肿瘤性疾病之一,其发病率和死亡率均居全球恶性肿瘤之首。2008年,我国的肺癌发病率为38.8/105,预计到2020年,我国新增发病和死亡人数多的癌症仍是肺癌。2006年全国第三次死因回顾调查报告显示,恶性肿瘤在死因中高居第二位,占死因的22.32%,而在城市,恶性肿瘤高居死因第一位；肺癌是我国人民群众第1位肿瘤死因,占恶性肿瘤分类构成的22.7%。长期以来,肺癌是我国恶性肿瘤防控的重点之一。肺癌中80%为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）。尽管肺癌的早期诊断和规范化、个体化、综合性治疗都取得了长足进步,但仍有不到20%的非小细胞肺癌患者在初诊时有手术治疗的机会,而即使接受根治性手术治疗的患者,仍然有降将近50%的患者会复发。5年生存率仅为8%～10%。第三次全国死因调查结果表明：云南省宣威市（县）和个旧市是肺癌世界性高发地区之一,特别是女性肺腺癌的发病率和死亡率居世界首位,至今尚无肯定有效的治疗策略能帮助控制肺癌的死亡率,肺癌更是导致当地居民因病致贫和因病返贫的重要因素。肺癌发病机制复杂,是多基因、多因素、多阶段、多步骤发展的共同结果。云南高发的宣威肺癌无论其病因、发生、发展规律,均有其显着的地域性特点；且肿瘤的异质性是恶性肿瘤最为重要的生物学特征之一。30年左右的研究成果和资料虽然使得宣威肺癌在流行病学方面取得了一定的成绩,并通过环境控制等预防措施对少部分区域的发病率有所控制,但当地肺癌总体发病率和死亡率仍然居高不下,因此有必要积极探索其发生、发展机制；从而寻求有效治疗治疗策略,提出符合该地区肺癌的“个体化”综合治疗方案,改善宣威肺癌的预后。CD151是四跨膜蛋白TM4SF （Transmembrane4superfamily）成员之一,参与调控信号传导,细胞的激活、发展、增殖和运动、肿瘤侵袭与转移等多种生物学功能。很多临床研究表明,CD151蛋白在多种人类常见的恶性肿瘤中表达水平高于与之相对照的正常组织的表达水平,且与研究的这些肿瘤的预后关系紧密。本课题探讨CD151非小细胞肺癌中的表达及意义,并通过RNA干扰抑制CD151基因表达对来研究其对肺腺癌细胞A549细胞和宣威肺腺癌细胞XWLC-05细胞侵袭和转移的影响。二、方法1.应用免疫组化（SP）法检测经手术切除的非小细胞肺癌组织81例非小细胞肺癌和22例良性肺病变组织中CD151蛋白和整合素α3β1的表达,分析两者相关性；并结合临床资料进行分析。2. qRT-PCR法检测正常支气管上皮细胞株BEAS-2B、肺腺癌细胞株A549、云南宣威肺癌细胞株XWLC-05和云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC中CD151mRNA的相对表达量。3.构建了能高效抑制CD151基因表达的重组干扰质粒,并筛选出稳定转染干扰质粒的A549和XWLC-05细胞株。4.MTT实验研究CD151基因干扰前后对A549和XWLC-05细胞增殖能力的影响。5.划痕实验研究CD151基因干扰前后对A549和XWLC-05细胞的迁移能力的影响。6. Transwell研究CD151基因干扰前后对A549和XWLC-05细胞的侵袭和转移能力的影响。7.通过建立裸鼠动物实验模型,观察RNA干扰抑制CD151基因表达对A549和XWLC-05细胞裸鼠肺转移的影响。三、结果1.CD151蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达的阳性率为55.6%（45/81）,高于对照组的18.2%（4/22）,x2=9.70, P=0.002。整合素α3β1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达的阳性率为49.4%（40/81）,高于对照组的22.7%（5/22）,x2=4.8025,P=0.025。2.CD151蛋白表达与病理分型有关,肺腺癌中的表达高于肺鳞癌和其他（x2=7.068,P=0.029）；与性别、年龄、是否吸烟、T分期、N分期、TNM分期、细胞分化程度、患者PS评分无明显相关。整合素α3β1蛋白表达与病理分型有关,肺腺癌中的表达高于肺鳞癌和其他（x2=10.070,P=0.007）；与性别、年龄、是否吸烟、T分期、N分期、TNM分期、细胞分化程度、患者PS评分无明显相关。3.Cox回归分析表明CD151蛋白是影响非小细胞肺癌预后的独立危险因素（P=0.001）。CD151蛋白阳性表达的非小细胞肺癌较阴性预后差。4.CD151蛋白和整合素α3β1蛋白在非小细胞肺癌组织中表达呈正相关（r=0.458, P=0.000）。5. qRT-PCR结果显示,CD151mRNA在细胞株中的表达：BEAS-2B>A549> XWLC-05> YTMLC。6.RNA干扰抑制CD151基因表达可能对肺腺癌A549细胞和宣威肺腺癌XWLC-05细胞体外增殖无明显作用（P>0.05）。7.划痕实验和Transwell实验表明RNA干扰抑制CD151基因表达可能抑制肺腺癌A549细胞和宣威肺腺癌XWLC-05细胞体外迁移和侵袭作用（P<0.05）8.RNA干扰抑制CD151基因表达能减少A549细胞和宣威肺腺癌XWLC-05细胞裸鼠的肺转移病灶数（P<0.05）。四、结论1.CD151和整合素α3β1蛋白表达在非小细胞肺癌组织中均高于对照组,两者在非小细胞肺癌中表达呈正相关；CD151蛋白阳性表达预后差。联合检测CD151蛋白和整合素α3β1蛋白可能为判断非小细胞肺癌的生物学行为、预后提供参考依据。2.RNA干扰抑制CD151基因表达能抑制A549和XWLC-05的体外迁移、侵袭和转移。3.RNA干扰抑制CD151基因表达能减少A549细胞和宣威肺腺癌XWLC-05细胞裸鼠的肺转移。4.CD151可能成为抑制NSCLC侵袭和转移的潜在的治疗靶点之一。
方晓瑞[9]（2012）在《抗人肺癌单克隆抗体及其识别抗原的纯化》文中研究指明[目的]：用Protein A亲和层析柱从杂交瘤细胞株P35的培养上清中纯化出抗人肺癌单克隆抗体N-35,并以该抗体为配体制作免疫亲和层析柱获取其特异性识别的肺癌相关抗原N35蛋白。[方法]：有限稀释法对杂交瘤细胞P35进行克隆化培养,同时将处于对数生长期的云南个旧肺腺癌细胞GLC-82接种于96孔培养板,当肺癌细胞生长铺满孔底时对其固定、封闭；采集GLC-82免疫后的小鼠血,制备阳性血清,96孔肺癌细胞抗原板间接ELISA法对杂交瘤细胞株进行三次阳性克隆的筛选,对稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养、冻存,检测上清中抗体效价及亚型,免疫组化法鉴定单克隆抗体的组织特异性：收集足量培养上清用Protein A Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化mcAb N-35,鉴定纯化抗体纯度和免疫活性；用纯化后的的单抗与CNBr活化的SepharoseTM4B交联,制备免疫亲和层析柱；收集GLC-82细胞裂解液过柱,获取肺癌相关抗原N35蛋白,SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化后的抗原。[结果]：筛选出30余株稳定分泌单克隆抗体N-35的杂交瘤细胞株并分别冻存,其中一株上清抗体效价为1：102,亚类为IgG2a,能和肺癌细胞特异性反应；自行纯化出高纯度鼠抗人肺癌单克隆抗体N-35；并成功获取了其特异识别的肺癌相关抗原N35蛋白。[结论]：经三次克隆化培养及筛选后杂交瘤细胞P35亚克隆分泌抗体的阳性率达到100%：应用Protein A Sepharose CL-4B层析柱纯化的mcAb N-35效价高、纯度好；纯化后的抗体N-35与溴化氰活化的SepharoseTM4B有较高的交联率,自行制作的免疫亲和层析柱能有效工作；纯化所获肺癌相关N35蛋白可能为新的肿瘤相关抗原。
唐睿珠,李继梅,边莉,马丽菊,郝萍,王秦秦[10]（2010）在《肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定》文中指出目的制备出高效价的抗人肺鳞癌单克隆抗体。方法以云南个旧肺鳞癌细胞YTMLC-90免疫的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1、SP2/0细胞为亲代细胞,应用鼠-鼠杂交瘤技术建立杂交瘤细胞系。ELISA法筛选,有限稀释法克隆化培养,ELISA法测定抗体效价,双抗体夹心法鉴定Ig亚类,制备染色体,G iemsa染色计数染色体数目,ABC免疫组化法行不同组织细胞的交叉检测。结果获得3株稳定分泌抗YTMLC-90细胞抗体的杂交瘤细胞株S2D1、N2D1及N3C5。培养上清效价分别为1∶512、1∶284及1∶1 024,腹水效价分别为1∶105、1∶104及1∶104;Ig亚类分别为IgG1、IgG2a及IgG3;染色体众数在90110之间;3株抗人肺鳞癌单克隆抗体与其他组织细胞无交叉反应性。杂交瘤细胞体外传代培养6个月仍保持抗体稳定分泌。结论成功制备高效且特异的抗人肺鳞癌单克隆抗体。
二、CHARACTER OF TUMOR ASSOCIATED PROTEIN RECOGNIZED BY MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST YUNNAN GEJIU LUNG CANCER（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CHARACTER OF TUMOR ASSOCIATED PROTEIN RECOGNIZED BY MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST YUNNAN GEJIU LUNG CANCER（论文提纲范文）
（1）外周血肿瘤相关天然自身抗体与非小细胞肺癌发病的关系研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肺癌概述 |
| 1.1.1 肺癌流行病学 |
| 1.1.2 肺癌的危险因素 |
| 1.1.3 肺癌病理分型 |
| 1.1.4 肺癌分期 |
| 1.1.5 早期肺癌的诊断及筛查方法 |
| 1.1.6 肺癌治疗 |
| 1.2 肿瘤免疫 |
| 1.2.1 肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME) |
| 1.2.2 免疫耐受(immunologic tolerance) |
| 1.2.3 肿瘤免疫逃逸(tumor immune escape) |
| 1.3 天然抗体 |
| 1.3.1 天然抗体概述 |
| 1.3.2 IgM天然抗体的特点和作用 |
| 1.3.3 IgG和 IgA天然抗体的特点和作用 |
| 1.3.4 天然抗体与肿瘤 |
| 1.4 肿瘤抗原 |
| 1.4.1 肿瘤抗原概述 |
| 1.4.2 肿瘤抗原的筛选方法 |
| 1.4.3 抗原多肽和免疫信息学 |
| 1.5 本研究相关的抗原 |
| 1.5.1HER2 |
| 1.5.2 MUC1 |
| 1.5.3 VEGFR1 |
| 1.5.4 ABCC5 |
| 1.5.5 MYC |
| 1.5.6 TNF-α |
| 1.5.7 POU5F1 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.1.1 人体血浆样本来源 |
| 2.1.2 肺癌患者纳入及排除标准 |
| 2.1.3 样本预处理、分装与保存 |
| 2.1.4 细胞样本来源 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.3.1 实验试剂及试剂盒 |
| 2.3.2 常用实验试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 抗原的选择和设计 |
| 2.4.2 抗原合成 |
| 2.4.3 检测天然自身抗体在血浆中的水平-ELISA方法 |
| 2.4.4 筛选富含和低含天然自身抗体血浆 |
| 2.4.5 细胞培养 |
| 2.4.6 RNA提取 |
| 2.4.7 反转录获得cDNA |
| 2.4.8 实时定量PCR分析 |
| 2.4.9 CCK-8 细胞增殖实验 |
| 2.5 数据处理与分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 抗原的设计 |
| 3.2 肺癌组及健康对照组基本信息 |
| 3.3 肺癌组随访信息 |
| 3.4 血浆天然自身抗体水平分析 |
| 3.4.1 抗体水平正态性检验 |
| 3.4.2 抗体水平在NSCLC和健康对照中的差异 |
| 3.5 天然自身抗体水平与NSCLC患者生存期的关系 |
| 3.6 富含天然自身抗体的血浆对NSCLC细胞增殖的影响 |
| 3.6.1 富含天然自身抗体HER2 的血浆对体外培养的肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.6.2 富含天然自身抗体MUC1 的血浆对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.6.3 富含天然自身抗体VEGFR1 的血浆对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.7 HER2、MUC1和VEGFR1 m RNA在 NSCLC细胞中的表达 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 外周血天然自身抗体作为肿瘤生物学标志物的意义 |
| 4.2 肺癌患者外周血天然自身抗体水平变化的临床意义 |
| 4.2.1 抗HER2 IgG水平变化的临床意义 |
| 4.2.2 抗MUC1 IgG水平变化的临床意义 |
| 4.2.3 抗VEGFR1 IgG水平变化的临床意义 |
| 4.2.4 天然自身抗体联合检测水平变化的临床意义 |
| 4.2.5 其他天然自身抗体水平变化的临床意义 |
| 4.3 富含天然自身抗体血浆对NSCLC细胞的作用 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）RBM47在非小细胞肺癌中的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 RBM47在NSCLC中的表达及临床意义 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RBM47在NSCLC中的作用机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 RBM蛋白家族在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）功能化DNA纳米探针用于外泌体检测及其监测中药活性成分调控肿瘤来源外泌体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术用于外泌体定量和表型分析 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 实验所用仪器和设备 |
| 1.2 实验所用材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养以及外泌体的分离提取 |
| 2.2 外泌体的表征 |
| 2.3 外泌体和适体识别结合的表征 |
| 2.4 功能化的氧化石墨烯纳米适体探针的制备 |
| 2.5 外泌体的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 实验原理 |
| 3.2 外泌体的表征 |
| 3.3 ExoAPP检测外泌体表面蛋白的可行性 |
| 3.4 外泌体表面蛋白谱分析 |
| 3.5 上皮-间充质转变的监测 |
| 3.6 外泌体的定量检测 |
| 4 结论 |
| 第二章 基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术用于外泌体表面标志物的双色分析和抗PD-1免疫治疗监测 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 实验所用仪器设备 |
| 1.2 实验所用材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养以及外泌体的分离提取 |
| 2.2 外泌体的表征 |
| 2.3 外泌体和适体识别结合的表征 |
| 2.4 DNA纳米分子机器的构建 |
| 2.5 DNA分子机器的运转可行性实验 |
| 2.6 外泌体激活的DNA纳米分子机器(ExoADM)对外泌体表面分子的检测 |
| 2.7 血浆总PD-L1的ELISA检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 实验原理 |
| 3.2 外泌体的表征结果 |
| 3.3 DNA纳米分子机器检测外泌体的可行性 |
| 3.4 DNA纳米分子机器的优化 |
| 3.5 ExoADM定量检测外泌体 |
| 3.6 双色ExoADM检测用于外泌体表型分析 |
| 3.7 ExoADM用于实际样本分析和抗PD-1 免疫治疗指导 |
| 4 结论 |
| 第三章 基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术监测中药活性成分调控肿瘤细胞外泌体释放及外泌体PD-L1 的研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 实验所用仪器设备 |
| 1.2 实验所用材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养和外泌体提取 |
| 2.2 外泌体表征 |
| 2.3 CCK-8 法测定药物对细胞增殖的影响 |
| 2.4 细胞凋亡检测 |
| 2.5 双色ExoADM对外泌体CD63 和外泌体PD-L1 的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 四种中药活性成分对A549 细胞增殖的影响 |
| 3.2 四种中药活性成分对A549 细胞凋亡的影响 |
| 3.3 外泌体表征 |
| 3.4 中药活性成分对A549 外泌体释放的影响 |
| 3.5 Exo ADM 监测中药活性成分对 A549 外泌体 CD63 和 PD-L1 的调控 |
| 4 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录1 文献综述:中药对于肿瘤来源外泌体的调控作用研究 |
| 1 中药的起源和历史 |
| 2 肿瘤与外泌体 |
| 3 中药活性成分调控外泌体抗肿瘤 |
| 3.1 中药对肿瘤的作用和调控 |
| 3.2 抗肿瘤中药活性成分对外泌体的调控作用 |
| 4 外泌体检测对于中药抗肿瘤研究的意义 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 附录2 博士研究生期间获得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）A-Raf激酶结合蛋白的系统识别及ACBD3在环境相关的肺癌发生中的作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境与肺癌 |
| 1.1.1 环境对癌症的影响 |
| 1.1.2 环境对肺癌发生的影响 |
| 1.2 肺癌的治疗 |
| 1.2.1 早期肺癌的治疗 |
| 1.2.2 晚期肺癌的治疗 |
| 1.2.3 肺癌的靶向治疗 |
| 1.2.4 肺癌的免疫治疗 |
| 1.3 A-Raf激酶在癌症中的作用 |
| 1.3.1 MAPK通路 |
| 1.3.2 A-Raf激酶 |
| 1.3.3 癌症中的A-Raf突变 |
| 1.3.4 A-Raf激酶结合蛋白的研究进展 |
| 1.4 ACBD3 |
| 1.4.1 人源ACBP蛋白家族的分类 |
| 1.4.2 ACBD3 的功能研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 A-Raf激酶结合蛋白的获取、鉴定及分析 |
| 2.1 实验技术路线 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器及设备 |
| 2.2.3 实验试剂配制 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 质粒构建 |
| 2.3.3 构建诱导表达的VSV-A-Raf稳定细胞系 |
| 2.3.4 通过免疫共沉淀,质谱方法鉴定与VSV-A-Raf相互作用的蛋白 |
| 2.3.5 内源性A-Raf的免疫沉淀 |
| 2.3.6 Western blotting实验 |
| 2.3.7 非氨盐银染 |
| 2.3.8 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析 |
| 2.3.9 基因本体论(Gene Ontology,GO)聚类分析及KEGG pathway分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 构建可诱导表达VSV-A-Raf及 VSV-A-RafY296R突变的Flp-InT-Rex HEK293 细胞系 |
| 2.4.2 鉴定A-Raf和 A-Raf Y296R突变体的结合蛋白 |
| 2.4.3 通过western blotting验证鉴定得到的蛋白与A-Raf的结合情况 |
| 2.4.4 GO分析表明A-Raf结合蛋白参与多种生物过程和分子功能 |
| 2.4.5 A-Raf结合蛋白的KEGG分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 蛋白组学分析Raf家族激酶的不同和相似特性 |
| 3.1 实验技术路线 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器及设备 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 构建质粒 |
| 3.3.2 细胞培养及EGF刺激 |
| 3.3.3 免疫共沉淀实验 |
| 3.3.4 FASP酶解 |
| 3.3.5 质谱分析 |
| 3.3.6 数据分析 |
| 3.3.7 Western blotting实验 |
| 3.3.8 PPI分析 |
| 3.3.9 GO聚类分析及KEGG pathway分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 鉴定在激活(EGF刺激)条件下和非激活(血清饥饿)条件下A-Raf,B-Raf和C-Raf的结合蛋白 |
| 3.4.2 系统分析在激活(EGF刺激)条件下和非激活(血清饥饿)条件下A-Raf,B-Raf和 C-Raf的结合蛋白 |
| 3.4.3 在激活(EGF刺激)条件下和非激活(血清饥饿)条件下对A-Raf,B-Raf和C-Raf的结合蛋白进行GO分析 |
| 3.4.4 在激活(EGF刺激)条件下和非激活(血清饥饿)条件下对A-Raf,B-Raf和C-Raf的结合蛋白进行KEGG分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 Raf激酶结合蛋白ACBD3 在肺癌发生中的作用研究 |
| 4.1 实验技术路线 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.3.1 ACBD3 敲除质粒构建 |
| 4.3.2 ACBD3 敲除细胞株构建 |
| 4.3.3 ACBD3 高表达质粒构建 |
| 4.3.4 ACBD3 高表达细胞株构建 |
| 4.3.5 细胞增殖实验 |
| 4.3.6 细胞克隆形成实验 |
| 4.3.7 化疗药物敏感性实验 |
| 4.3.8 细胞划痕实验 |
| 4.3.9 Transwell实验 |
| 4.3.10 细胞成球实验 |
| 4.3.11 qPCR |
| 4.3.12 ELISA检测CDK1/cyclinB表达水平 |
| 4.3.13 EMT实验 |
| 4.3.14 异种移植瘤实验 |
| 4.3.15 PI单染法检测细胞周期 |
| 4.3.16 免疫组化 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 TCGA数据库分析ACBD3 在肺癌中的表达情况 |
| 4.4.2 在H1299 细胞中构建ACBD3 敲除细胞株 |
| 4.4.3 成功在H1299 细胞中构建ACBD3 高表达细胞株 |
| 4.4.4 ACBD3 可以促进H1299 细胞增殖 |
| 4.4.5 ACBD3 可以增强H1299 细胞对顺铂和5-氟尿嘧啶的敏感性 |
| 4.4.6 ACBD3 促进H1299 细胞的迁移能力 |
| 4.4.7 敲除ACBD3 抑制H1299 细胞的肿瘤干性 |
| 4.4.8 ACBD3 对细胞周期的影响 |
| 4.4.9 ACBD3 促进H1299 细胞EMT的发生 |
| 4.4.10 ACBD3 促进H1299 细胞在裸鼠体内成瘤 |
| 4.4.11 ACBD3 通过与Raf激酶结合促进ERK磷酸化 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录 B |
（5）miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 肺癌研究概况 |
| 2. 上皮间质转化与肺癌进展 |
| 3. 整合素α6β4信号通路在肿瘤生长和转移中的作用及其机制 |
| 4. microRNA与肺癌相关性研究 |
| 5. ITGA6与miRNA |
| 6. miR-32与肿瘤相关性研究 |
| 第一部分 miR-32在非小细胞肺癌患者中的表达及其临床意义研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 miR-32对非小细胞肺癌生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 ITGA6作为miR-32直接靶基因的研究及其在非小细胞肺癌生长和转移中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 过表达miR-32抑制非小细胞肺癌生长和转移体内实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第五部分 miR-32靶向ITGA6抑制非小细胞肺癌生长和转移机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 MicroRNA与肺癌相关研究最新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）DCUN1D1促进个旧矿工肺鳞癌增殖和侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 基因芯片筛选及生物学功能筛选确定研究对象 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 个旧矿工肺癌、非个旧矿工肺癌组织及人肺鳞癌细胞株中DCUN1D1的表达谱 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 质粒构建、慢病毒生产及稳定抑制DCUN1D1肺鳞癌细胞株的建立 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四章 抑制DCUN1D1对肺鳞癌细胞体外及体内增殖功能的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第五章 抑制DCUN1D1对肺鳞癌细胞体外迁移、侵袭功能的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第六章 抑制DCUN1D1对肺鳞癌细胞凋亡的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第七章 抑制DCUN1D1后增殖、侵袭信号通路中关键蛋白的变化 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 全文总结 |
| 全文讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（7）FGFR1特异结合多肽的筛选与应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 噬菌体展示技术筛选FGFR1 特异结合的多肽 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 FGFR1 特异结合短肽在骨性关节炎中的作用与机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 FGFR1 特异结合短肽在肺癌中的作用与机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 关节软骨干/祖细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要成绩 |
| 致谢 |
（8）四跨膜蛋白CD151对非小细胞肺癌侵袭和转移的影响（论文提纲范文）
| 英文缩写词一览表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：CD151四跨膜蛋白和整合素α3β1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其意义 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分：RNA干扰抑制CD151基因表达对肺腺癌A549细胞和宣威肺腺癌XWLC-05细胞体外侵袭和转移的的影响研究 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 主要实验步骤及实验方法 |
| 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分：RNA干扰抑制CD151基因表达对肺腺癌A549细胞和宣威肺腺癌XWLC-05细胞裸鼠肺转移的实验研究 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 研究的创新性和特色 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）抗人肺癌单克隆抗体及其识别抗原的纯化（论文提纲范文）
| 英文缩略说明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（10）肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 动物免疫与细胞融合 |
| 1.3 筛选阳性克隆及亚克隆 |
| 1.4 亚类鉴定 |
| 1.5 杂交瘤上清和腹水抗体收集及效价测定 |
| 1.6 杂交瘤细胞染色体计数 |
| 1.7 组织细胞学交叉反应性检测 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 融合及克隆化 |
| 2.2 单克隆抗体的效价测定 |
| 2.3 抗体亚类鉴定 |
| 2.4 染色体计数 |
| 2.5 免疫组化结果 |
| 3 讨论 |
四、CHARACTER OF TUMOR ASSOCIATED PROTEIN RECOGNIZED BY MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST YUNNAN GEJIU LUNG CANCER（论文参考文献）
- [1]外周血肿瘤相关天然自身抗体与非小细胞肺癌发病的关系研究[D]. 柳思琪. 吉林大学, 2020(08)
- [2]RBM47在非小细胞肺癌中的表达及作用机制研究[D]. 李瑞蕾. 昆明医科大学, 2020
- [3]功能化DNA纳米探针用于外泌体检测及其监测中药活性成分调控肿瘤来源外泌体[D]. 金丹. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [4]A-Raf激酶结合蛋白的系统识别及ACBD3在环境相关的肺癌发生中的作用机理研究[D]. 张新宇. 昆明理工大学, 2019(06)
- [5]miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究[D]. 陈艳. 昆明医科大学, 2019
- [6]DCUN1D1促进个旧矿工肺鳞癌增殖和侵袭的机制研究[D]. 赵文淘. 南方医科大学, 2019(09)
- [7]FGFR1特异结合多肽的筛选与应用[D]. 谭乔燕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [8]四跨膜蛋白CD151对非小细胞肺癌侵袭和转移的影响[D]. 李科. 昆明医科大学, 2014(01)
- [9]抗人肺癌单克隆抗体及其识别抗原的纯化[D]. 方晓瑞. 昆明医科大学, 2012(11)
- [10]肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定[J]. 唐睿珠,李继梅,边莉,马丽菊,郝萍,王秦秦. 基础医学与临床, 2010(09)