一、鼠疫耶尔森氏菌质粒上重要毒力相关基因的克隆与表达（论文文献综述）
迟恒[1]（2020）在《食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究》文中指出小肠结肠炎耶尔森菌是重要的人畜共患病原菌,可引起肠道疾病、关节炎、肠系膜淋巴结炎等肠道外综合症,对人类健康构成了严重的威胁。目前食品小肠结肠炎耶尔森菌的检测方法主要为培养法,该方法步骤繁琐且周期较长,具有一定的局限性。研制快速、准确检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌的方法,在食品加工过程检测、保障食品安全中具有重要意义。本研究在克隆表达病原菌特异性蛋白的基础上,制备其特异性多抗免疫磁珠,并将免疫磁珠富集分离技术与荧光定量PCR检测技术结合,以期实现食品中小肠结肠炎耶尔森菌特异、灵敏、快速的检测。主要进展如下:1.小肠结肠炎耶尔森菌特异致病基因的克隆、表达与纯化:在对多株耶尔森菌菌株毒力基因检测、以及小肠结肠炎耶尔森菌特异致病性外膜蛋白基因ail和ompF生物信息学分析的基础上,构建了其原核表达载体,表达并纯化了浓度为5 mg/mL重组外膜蛋白Ail与OmpF。2.免疫磁珠的制备与参数优化:将重组外膜蛋白Ail与OmpF免疫成年雄性家兔,制备效价为1:3200的多克隆抗体。利用该多克隆抗体制备免疫磁珠,并优化免疫磁珠的制备参数,结果表明当25 μL浓度为10 mg/mL抗体与1 mg粒径为1.0-2.0 μm的羧基化磁珠在室温下振荡孵育6 h时,所制备的免疫磁珠偶联效率最好;且使用0.2 mg免疫磁珠捕获101-105CFU/mL小肠结肠炎耶尔森菌时,捕获效率接近80%,对非耶尔森菌的捕获效率低于10%,证明本研究制备免疫磁珠具有良好的特异性。3.小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株的构建以及吸附纯化兔抗血清:通过对pKD46质粒抗性改造,以及重叠PCR延长转化片段同源臂至500 bp的方式,基于Red重组系统成功获得小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株。将该菌株作为OmpF蛋白特异性多抗阳性血清制备的吸收菌株,提高检测的特异性,还可以将其作为本实验的阴性对照菌株。4.免疫磁珠捕获-荧光定量PCR（IMBs-qPCR）检测小肠结肠炎耶尔森菌方法的建立:通过在线软件设计小肠结肠炎耶尔森菌foxA的特异性引物;使用该引物建立荧光定量PCR标准曲线,确定检测最低限为64 CFU/mL;再加入沙门氏菌等干扰菌株,验证本检测方法具有良好的特异性;使用IMB s-qPCR方法检测人工污染牛奶、猪肉中的小肠结肠炎耶尔森菌,在菌液浓度为103-104 CFU/mL时,捕获率大于68%。该方法与培养法相对比,具有较高的一致性,且整个流程只需要12 h,极大缩短了检测时长。综上所述,本研究表达纯化小肠结肠炎耶尔森菌重组外膜蛋白并制备其特异性多克隆抗体,利用基因敲除突变菌株吸附除去血清中非特异性抗体。应用外膜蛋白抗体偶联的免疫磁珠对食品中小肠结肠炎耶尔森菌特异性捕获,并结合灵敏、特异的荧光定量PCR技术,建立IMBs-qPCR检测方法,提供了一种快速检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌的有效备选方法。
安森玲[2]（2019）在《两株鼠疫菌pMT1质粒整合入染色体位置的研究》文中认为目的将质粒电泳检测不到pMT1质粒而F1抗原阳性的两株鼠疫菌进行基因组测序及生物信息学分析,明确其pMT1质粒序列是否整合至染色体,整合位置和可能的整合机制,以及整合对F1抗原表达和生化特性是否有影响。方法通过提取鼠疫O-1和ST菌株的全基因组DNA,进行测序组装,获得全基因组序列及其圈图;通过与参考菌株基因组序列比较来描述基因组一般特征;通过序列比对（Blast/Mauve）确定整合位点,再通过引物设计和PCR扩增来验证整合位点;最后进行F1抗原检测和生化测定。结果O-1菌株基因组包括一个环状染色体（4.79Mb）,两个环状质粒（70.3Kb,9.6Kb）;O-1菌株染色体基因数目较CO92菌株多,染色体的插入序列（尤其是IS100和IS1541）较CO92菌株多;O-1菌株质粒（p CD1和p PCP1）与CO92菌株很相似,但O-1菌株无独立存在的pMT1质粒。pMT1质粒序列位于O-1菌株染色体中,从1429315至1526240,序列长度为96926bp;且整合位点被PCR扩增证实;O-1菌株pMT1质粒序列含有5个IS序列:2个IS100,2个IS1541A,1个IS285;pMT1序列的插入位点处于O-1染色体的非编码区,对插入点附近基因未造成影响。ST菌株基因组包括一个染色体（4.67Mb）,两个质粒（70.3Kb,9.6Kb）;ST菌株染色体基因数目较CO92菌株多,染色体的插入序列（尤其是IS1541）较CO92菌株多;ST菌株质粒（p CD1和p PCP1）与CO92菌株很相似,但ST菌株无独立存在的pMT1质粒。pMT1质粒序列位于ST菌株染色体中,从960704至1058866的位置,序列长度为98163bp;且整合位点被PCR扩增证实;ST菌株pMT1质粒序列含有5个IS序列:3个IS100,1个IS1541A,1个IS285;pMT1序列的插入位点处于ST染色体的非编码区,对插入点附近基因未造成影响。7株菌株染色体插入序列数总体比较,差异无统计学意义（c2=13.227,P=0.778）。4株菌株F1抗原检测平均阳性滴度值经单因素方差分析差异有统计学意义（F=6.698,P<0.05）。分别两两比较结果ST,O-1,1409分别与EV76菌株的平均阳性滴度值差异有统计学意义（P<0.05）,其余菌株间的平均阳性滴度值差异均无统计学意义（P=1.000）。生化鉴定结果O-1和ST菌株可以分解麦芽糖和阿拉伯糖,不分解甘油、蜜二糖、鼠李糖,可以还原硝酸盐生成亚硝酸盐,可以通过氧化过程形成硝酸,甲基红试验阳性,VP试验阴性,H2S试验阳性,毒力因子之一P因子试验阴性;苯丙氨酸依赖。结论本研究确定O-1和ST菌株的pMT1质粒整合至染色体,而且是完整序列整合。O-1和ST菌株染色体特征与CO92有差异,且插入序列偏多。IS1541A和IS100介导的同源重组可能是pMT1质粒整合至染色体的原因。且整合对附近基因未造成影响;整合对F1抗原表达和生化特性基本没有影响。
张海鹏[3]（2019）在《云南省2017年新分离鼠疫菌表型与基因型研究》文中认为[目的]了解云南省新发鼠疫疫情所分离鼠疫菌的表型及基因型特征、并对其进行溯源分析,藉此查明新发鼠疫疫情的性质及来源,为制定针对该疫源地科学地防控策略提供科学依据。[方法]1.表型测定:进行阿拉伯糖、密二糖、鼠李糖、麦芽糖及甘油的发酵实验,脱氮实验,VW毒力因子检测,色素沉着因子检测及营养需求来测定鹤庆鼠疫菌的表型特征。2.基因型测定:通过差异区段（Different region,DFR）分型、规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPRs）分型与可变数目串联重复序列（MLVA）分型（12+14策略）方法来判定新分离鼠疫菌的基因型别,同时以云南既往代表菌株信息为参照,利用BN6.6软件进行溯源分析。[结果]1.丽江菌株、剑川菌株与鹤庆菌株生化特性,均发酵阿拉伯糖、麦芽糖、甘油且脱氮阳性,生物型属于古典变种型;其他表型均为VW+菌株、色素沉着因子阳性,营养需求类型为苯丙氨酸依赖、谷氨酸不依赖型。2.2017年云南省新分离15株鼠疫菌DFR型别一致均为DFR 01、02、13、23四个位点上缺失,其余位点不缺失,与丽江菌株有相同的DFR型别,为Genomovar05型。3.2017年云南省新分离15株鼠疫菌CRISPR分型中,YPa排序为“a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7”,YPb为“b1-b2-b3-b4”,YPc为“c1-c2-c3”,与丽江菌株有着相同的型别为基因簇Ca7。4.鹤庆菌株位于丽江野鼠鼠疫簇内,为同一种MLVA基因型,与HQ1只在位点M22有差异,与位于整个丽江野鼠鼠疫簇的核心位置的丽江菌株2006-7号同源。[结论]鹤庆菌株、玉龙菌株与剑川菌株属于同一种生物型,均为古典变种型鼠疫耶尔森菌,毒力因子与营养需求等表型均一致。2017年云南省新分离15株鼠疫菌鼠疫菌株在CRISPRs分型与DFR分型上与丽江野鼠疫源地菌株一致,而MLVA（14+12）溯源分析表明,鹤庆菌株来源于丽江菌株的进一步分化,是丽江疫源地进一步向南扩散的结果,鉴于此种类型鼠疫菌的高致病性,应加强对该疫源地持续监测,并做好鼠间疫情的处置,降低其传播到人的风险。
王二龙[4]（2019）在《斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究》文中提出渔用疫苗作为替代抗生素和化学药物进行鱼类细菌性疾病防治更为安全有效的防治方法,得到了世界各国的广泛重视。多联疫苗因其可预防多种疾病、减少接种次数、简化免疫程序等特点,已成为当今世界疫苗的研究和发展方向。鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）和鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）作为近年来斑点叉尾鮰养殖频发的两种细菌性疾病病原,给我国斑点叉尾鮰乃至整个水产养殖业的健康发展造成了严重危害。本研究以斑点叉尾鮰源E.ictaluri外膜蛋白OmpN2和Y.rucker外膜蛋白OmpF为研究对象,在对其进行分子克隆、生物信息学分析、原核表达和免疫原性分析基础上初步研究其作为疫苗候选目的抗原的潜力。通过添加多肽Linker接头序列、酶切连接、融合基因技术等分子生物学手段构建二联融合基因N2-F,通过分子克隆和原核表达制备二联基因N2-F亚单位疫苗。此外,采用海藻酸钠-壳聚糖等天然高分子复合物作为包被材料,研制二联基因N2-F口服微球疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式将二联基因N2-F亚单位疫苗和口服疫苗免疫接种斑点叉尾鮰,通过特异性抗体水平、非特异性免疫指标、免疫相关基因的表达和相对免疫保护率等方面综合评价其免疫保护效果并初步探讨其免疫保护机制,为生产上开发安全有效的多联疫苗,进行斑点叉尾鮰的鮰爱德华氏菌病和鲁氏耶尔森氏菌病的免疫防治提供参考。本研究具体内容包括以下几个方面:1.OmpN2与OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析通过对鮰爱德华氏菌外膜蛋白OmpN2基因和鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白OmpF基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行全面的分子特性分析和抗原表位预测,结果发现OmpN2和OmpF基因序列全长分别为1122 bp和1095 bp,分别编码373和364氨基酸序列,均具有革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,分别属于E.ictaluri和Y.rucker外膜孔蛋白,分别具有9个和12个潜在抗原决定簇区域,两者氨基酸序列相似性为65.96%,三维结构预测显示均为三聚体的空间构象,均与同一个模板有60%以上的相似性,表明两者在结构和功能上有一定的相似性,推测其作为疫苗候选抗原可能提供一定的交叉保护作用。2.OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析通过体外原核表达技术,成功诱导表达了去除信号肽后的目的重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF,大小分别约为56 kDa和55 kDa;细菌表面显色技术和间接免疫荧光分析显示,E.ictaluri和Y.ruckeri能分别与兔抗rtOmpN2抗体和兔抗rtOmpF抗体发生特异性结合反应,显示显示阳性反应信号,表明OmpN2和OmpF蛋白分别位于E.ictaluri和Y.ruckeri的菌体表面,是一种细菌表面抗原。Western bloting分析显示,rtOmpN2蛋白和rtOmpF蛋白能分别被兔抗E.ictaluri和兔抗Y.ruckeri抗体识别并发生特异性反应,表明OmpN2和OmpF蛋白不仅是E.ictaluri和Y.ruckeri的抗原之一,且具有良好的免疫原性,可用作基因工程疫苗候选目的抗原。3.融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析;通过添加多肽Linker接头序列和BamH I酶切位点连接法成功构建了N2-F融合基因,大小为2133 bp;通过体外原核表达,成功诱导表达了重组融合蛋白N2-F,大小约为96 kDa;Western blotting分析显示,N2-F能分别与兔抗6×His抗体、兔抗E.ictaluri抗体和兔抗Y.ruckeri抗体发生特异性反应,显示单一、明显条带,表明融合蛋白N2-F融合表达成功,且同时具有OmpN2和OmpF的蛋白构象,能被相应的抗体识别;细菌表面显色分析显示,E.ictaluri和Y.ruckeri均能与兔抗N2-F抗体发生特异性结合反应,显示阳性反应信号,表明融合蛋白N2-F同时具有OmpN2和OmpF的免疫原性,可用作研制同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的二联基因工程疫苗候选抗原。4.二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析与单价疫苗rtOmpN2和rtOmpF相比,二联疫苗N2-F分别显着性（P<0.05）增强了斑点叉尾鮰相应的血清抗体水平及血清溶菌酶、补体C3、总蛋白含量、SOD活性等非特异性免疫指标,提高了头肾和脾脏中免疫相关基因的表达量,对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的相对保护率（Relative Percent Survival,RPS）分别为76.67%和82.71%,均高于rtOmpN2（RPS为73.33%）和rtOmpF（RPS为75.86%）,表明N2-F不仅能同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri两种病原菌的感染,还提供了更高更好的免疫保护效果。5.二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析采用响应面分析法优化了海藻酸钠-壳聚糖复合微球的制备工艺,得到最优制备条件为:海藻酸钠浓度为1.58%,水油相比例为4.0:6.0,CaCl2浓度为8.60%,壳聚糖溶液浓度为0.82%,在此条件下,重组蛋白N2-F海藻酸钠壳聚糖复合微球疫苗的包封率为93.26%,粒径为4.35±1.08μm。通过对复合微球的理化性质进行分析发现,N2-F复合微球对溶液的温度,pH和离子强度均有不同程度的敏感性,在温度较高,碱性环境以及离子强度较高的溶液中,溶胀性增强;通过体外模拟胃肠液环境分析复合微球的释放性能,发现微球能在模拟胃液（酸性环境）中释放缓慢,在模拟肠液（碱性环境）中释放速率较快,既能保护目的蛋白在胃部不被胃酸降解破坏,又能保证目的蛋白在肠道释放以供吸收;通过Western blotting检测显示,复合微球释放的蛋白为目的蛋白抗原,且保持了良好的免疫原性。安全性检测表明复合微球的安全性好,可用作鱼用口服疫苗。6.二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析与单基因rtOmpN2和rtOmpF口服疫苗相比,二联基因N2-F口服疫苗分别显着性（P<0.05）增强了斑点叉尾鮰免疫后肠黏液和血清中相应的抗体水平及溶菌酶、补体C3、总蛋白含量、SOD活性等非特异性免疫指标,提高了头肾和脾脏中免疫相关基因的表达量,对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的相对保护率分别为73.33%和79.31%,分别高于rtOmpN2微球疫苗组（RPS为63.33%）和rtOmpF微球疫苗组（RPS为65.52%）,表明二联基因N2-F口服疫苗不仅能同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri两种病原菌的感染,还提供了更好的免疫保护效果。综上,通过构建二联基因N2-F,分别制备了二联基因N2-F亚单位疫苗和N2-F口服疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式免疫接种斑点叉尾鮰综合分析和评价其相应的免疫保护效果,结果显示,两种疫苗对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染均取得理想的免疫保护效果,表明本研究制备的二联基因N2-F亚单位疫苗和N2-F口服疫苗能有效增强斑点叉尾鮰的免疫能力,对抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri的感染起到较好的免疫防御和保护效果。其中二联基因亚单位疫苗的保护效果略优于二联基因口服疫苗,但结合水产养殖生产实践,口服免疫接种的二联基因口服疫苗更易被认可和接受。
叶成林[5]（2019）在《鼠伤寒沙门氏菌致病机制的研究》文中进行了进一步梳理【背景与目的】鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是导致肠道感染的重要人畜共患病原菌,是一种革兰氏阴性杆菌。鼠伤寒沙门氏菌主要通过污染的食物或水经粪口传播,经胃入肠后,在肠道内增殖,粘附于肠黏膜上皮细胞,进而侵入固有层,引起的症状轻至肠炎重至败血症和全身系统性播散引起的内脏损害。然而,鼠伤寒沙门氏菌在宿主体内播散的分子机制尚待进一步确定。有研究表明HIV的播散机制是通过与人抗原提呈细胞上表达的C型凝集素受体DC-SIGN（CD209a）相结合,从而劫持抗原提呈细胞促进病毒的播散。我们前期的研究发现,敲除脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）O抗原表达基因的鼠伤寒沙门氏菌突变株,暴露出核心寡糖后也可以与DC-SIGN（CD209a）相结合。但野生型的鼠伤寒沙门氏菌O抗原覆盖了其核心脂多糖。在本研究中,我们通过被巨噬细胞吞噬后失去O抗原的鼠伤寒沙门氏菌与CD209的相互结合侵袭抗原提呈细胞,以及观察鼠伤寒沙门氏菌播散至小鼠的局部淋巴结、脾脏、肝脏的情况,进而证明鼠伤寒沙门氏菌能像HIV一样,可以通过与CD209的相结合,利用抗原提呈细播散至淋巴结、脾脏和肝脏,从而引起宿主感染。【方法】1.体外实验检测经巨噬细胞RAW264.7吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白Pgt E的纤维蛋白溶酶原激活功能用小鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7吞噬鼠伤寒沙门氏菌后裂解得到释放的鼠伤寒沙门氏菌LT2（ST-treated）,通过纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测ST-treated和未被处理过的鼠伤寒沙门氏菌LT2（ST）的Pgt E对纤维蛋白溶酶原的活化作用。2.体外实验检测经巨噬细胞吞噬后释放的和未处理过的鼠伤寒沙门氏菌对人和鼠的抗原提呈细胞的侵袭能力1)纯化人肠道组织中的树突状细胞,用ST-treated和ST侵袭人肠道树突状细胞,表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。2)将表达绿色荧光蛋白的质粒p Ac GFP1转入鼠伤寒沙门氏菌,用ST-treated和ST侵袭小鼠腹腔巨噬细胞,表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护实验和流式细胞术检测侵袭能力。3.体外实验检测经巨噬细胞吞噬后释放的和未处理过的鼠伤寒沙门氏菌对CHO、CHO-m SIGNR1以及CHO-h DC-SIGN的侵袭能力用ST-treated和ST侵袭CHO、CHO-m SIGNR1以及CHO-h DC-SIGN稳转细胞,26℃孵育的假结核耶尔森菌、表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。4.细胞侵袭抑制实验用甘露寡糖与CHO-m SINR1和CHO-h DC-SIGN稳转细胞孵育,加入ST-treated,以26℃孵育的假结核耶尔森菌和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。5.动物体内感染实验检测细菌在体内的播散将质粒p BR322和表达O抗原的质粒p AY100.1转入鼠伤寒沙门氏菌,通过灌胃途径感染C57BL/6J小鼠,4天后取小鼠脏器研磨,观察细菌在小鼠体内播散情况。6.动物体内感染实验检测小鼠生存率1)通过灌胃途径,用携带p BR322的鼠伤寒沙门氏菌（ST-p BR322）和携带p AY100.1的鼠伤寒沙门氏菌（ST-p AY100.1）,观察小鼠存活率。2)ST-p BR322灌胃感染给予甘露寡糖或未给予甘露寡糖的C57BL/6J小鼠,观察细菌对小鼠存活率的影响。3)通过腹腔注射途径,用ST-p BR322和ST-p AY100.1感染C57BL/6J小鼠,观察细菌对小鼠存活率的影响。【结果】1.经巨噬细胞系RAW264.7吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌会暴露其核心寡糖鼠伤寒沙门氏菌拥有外膜蛋白PgtE,然而其激活纤维蛋白溶酶原的功能受到O抗原的抑制。鼠伤寒沙门氏菌经过巨噬细胞系RAW264.7处理后,Pgt E具有激活纤维蛋白溶酶原的活性。p AY100.1在鼠伤寒沙门氏菌中可以稳定表达O抗原,转入质粒p AY100.1的鼠伤寒沙门氏菌无论是否经巨噬细胞吞噬后释放,Pgt E活性均较低,说明巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌会暴露其核心寡糖。2.经巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌具有更强的侵袭人和小鼠的抗原提呈细胞的能力经过巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌暴露核心寡糖后,我们检测它和抗原提呈细胞之间的相互作用。实验表明,ST-treated比ST对小鼠原代腹腔巨噬细胞和人肠道固有层树突状细胞的侵袭能力更强。说明经巨噬细胞吞噬后,暴露核心寡糖的鼠伤寒沙门氏菌侵袭人和小鼠抗原提呈细胞的能力更强。3.人的DC-SIGN（h DC-SIGN）和小鼠的SIGN-R1（m SIGN-R1）是巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌的受体用ST-treated和ST侵袭表达h DC-SIGN（h CD209a）的稳转细胞（CHO-h DC-SIGN）和表达m SIGN-R1（m CD209b）的稳转细胞（CHO-m SIGN-R1）以及不表达受体的CHO细胞,沙门氏菌对表达受体的CHO侵袭力更强,而ST-treated比ST对CHO-h DCSIGN和CHO-m SIGN-R1侵袭能力强,说明人的h DC-SIGN和小鼠的m SIGN-R1是巨噬细胞处理后的鼠伤寒沙门氏菌侵袭人和小鼠抗原提呈细胞的受体。4.CD209介导的鼠伤寒沙门氏菌对细胞的侵袭会被甘露寡糖所抑制加入甘露寡糖后,巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌对CHO-h DC-SIGN的侵袭力显着降低,而对CHO-m SIGNR1的侵袭途径影响不显着,说明甘露寡糖可以抑制CHO-h DC-SIGN与巨噬细胞处理过的鼠伤寒沙门氏菌之间的相互结合,且h DCSIGN（h CD209a）和m SIGN-R1（m CD209b）在和鼠伤寒沙门氏菌的相互作用中有所区别。5.稳定表达的O抗原抑制鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的播散用稳定表达O抗原的鼠伤寒沙门氏菌ST-p AY100.1和只携带空载质粒的鼠伤寒沙门氏菌ST-p BR322通过灌胃途径感染小鼠后,对小鼠脏器内的细菌数目进行计数,ST-p AY100.1组小鼠脏器的菌量明显低于ST-p BR322组,表明稳定表达的O抗原会抑制鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的播散。6.稳定表达的O抗原和甘露寡糖均能降低鼠伤寒沙门氏菌的感染能力感染ST-p AY100.1的小鼠存活率明显高于感染ST-p BR322的小鼠,用ST-p BR322感染给予或未给予甘露寡糖的小鼠后,给予甘露寡糖的小鼠存活率显着高于未给予甘露糖的小鼠。说明O抗原的表达和甘露寡糖均能降低鼠伤寒沙门氏菌的感染力。【结论】本研究证明鼠伤寒沙门氏菌侵入宿主后暴露核心寡糖,通过结合CD209来劫持抗原提呈细胞从而促进其在宿主体内的播散。【背景与目的】鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis,简称鼠疫菌）可以引起典型的自然疫源性烈性传染病鼠疫（Plague）,根据传播途径不同,可引起腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。鼠疫菌是由肠道病原菌假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）进化而来,假结核耶尔森氏菌引起的只是温和的肠道自限性腹泻,而在进化过程中获得质粒p PCP1和质粒p MT是假结核耶尔森氏菌进化为致死性鼠疫菌的重要环节。p PCP1可以编码三种蛋白,其中的pla基因编码外膜蛋白纤维蛋白溶酶原激活物（plasminogen activator,Pla）是目前为止鼠疫菌感染中唯一的毒力因子,并且在进化过程中鼠疫菌获得pla后才具有引起肺鼠疫的能力。Pla可以裂解纤溶酶、α2-抗纤溶酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1等,降解补体C3成分。我们前期的实验研究发现Pla可以利用宿主细胞表面的C型凝集素受体m DEC205（CD205）介导细菌的侵袭和播散。研究发现尽管Pla并非为败血症鼠疫所必须,但是在腺鼠疫中Pla可以激活宿主纤维蛋白溶解系统,从而促进鼠疫菌的播散。在肺鼠疫中,Pla对细菌在肺部的大量繁殖起到重要作用。因此,Pla是腺鼠疫和肺鼠疫感染中重要的毒力因子。而pla在鼠疫菌进化过程中的来源仍然不明确。Pla和肠道病原菌鼠伤寒沙门氏菌的毒力因子Pgt E同属于外膜蛋白家族,它们有各自的降解底物,但功能上有非常高的相似性,O抗原的缺失都加强其纤溶酶原激活作用和侵袭力。不仅如此,根据pla和pgtE的基因测序以及Pla和Pgt E的氨基酸序列分析,Pla和Pgt E的编码基因同源性达69%,蛋白质同源性达75%。结合对于pla与pgtE基因序列和编码蛋白氨基酸序列的研究,我们推测肠道致病菌假结核耶尔森氏菌在进化为鼠疫菌的过程中获得的pla可能与同为肠道病原菌鼠伤寒沙门氏菌的pgtE有关。本研究拟通过将鼠伤寒沙门氏菌pgtE转入鼠疫菌后,检测其激酶活性和与CD205结合后促进侵袭的能力,对宿主抗原提呈细胞的侵袭能力,模拟肺鼠疫感染途径观察重组鼠疫菌对小鼠的致病力,从而探讨是否鼠伤寒沙门氏菌的pgtE与鼠疫菌的pla相似,其编码蛋白能通过结合CD205来促进鼠疫菌的感染,为两者的关系提供新的证据。【方法】1.检测表达Pgt E的鼠疫菌纤溶酶原激活物活性将表达Pgt E和Pla的质粒分别转入鼠疫菌和大肠杆菌中,用纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测Pgt E和Pla在鼠疫菌中的活性。2.检测表达Pgt E的大肠杆菌和鼠疫菌对肺泡巨噬细胞的侵袭能力用庆大霉素保护法检测E.coli-pla（表达Pla的大肠杆菌）、E.coli-pgtE（表达Pgt E的大肠杆菌）、1419-pla（表达Pla不表达Pgt E的鼠疫菌）、1419-pgtE（表达Pgt E不表达Pla的鼠疫菌）对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭能力,1419和1418为对照组。3.检测表达Pgt E的大肠杆菌和鼠疫菌对CHO-m DEC205稳转细胞的侵袭用庆大霉素保护法检测E.coli-pla、E.coli-pgtE、1419-pla、1419-pgtE对稳转细胞CHO-m DEC205的侵袭能力。表达O抗原的假结核耶尔森氏菌Y1、大肠杆菌DH5α、DH5α-pla（表达Pla）作为对照组。4.动物感染体内实验1)用转入表达质粒p SE380的野生型鼠疫菌91001p SE380、91001p PCP1--p SE380（敲除质粒p PCP1后转入p SE380的鼠疫菌）、91001p PCP1--pla（转入pla的91001p PCP1-）、91001p PCP1--pgtE（转入pgtE的91001p PCP1-）通过鼻内途径感染小鼠,模拟肺鼠疫途径,48小时后处死取组织器官,HE染色检测小鼠肺部炎症细胞浸润情况。2)用野生型鼠疫菌91001p SE380、91001p PCP1--p SE380、91001p PCP1--pla（转入pla的91001p PCP1-）、91001p PCP1--pgtE（转入pgtE的91001p PCP1-）通过鼻内途径感染小鼠,模拟肺鼠疫途径,观察小鼠的存活率。【结果】1.Pgt E在重组的鼠疫菌中仍具有激活纤维蛋白溶酶原的活性将表达Pgt E和Pla的质粒分别转入鼠疫菌和大肠杆菌后,用纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测,重新转入pla的1419（鼠疫菌1418敲除p PCP1）和E.coli-pla纤维蛋白溶解酶原活化活性与未敲除p PCP1的1418接近,转入pgtE的1419活化作用虽然较慢,但与1419比较活性显着增加,说明Pgt E在鼠疫菌可以表达且其活性并未受到抑制。2.Pgt E介导重组大肠杆菌和鼠疫菌对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭取小鼠肺泡巨噬细胞,将pla和pgtE转入鼠疫菌和大肠杆菌后,用庆大霉素保护法检测发现E.coli-pgtE侵袭小鼠肺泡巨噬细胞的能力比E.coli显着增高,1419-pla、1419-pgtE侵袭肺泡巨噬细胞的能力显着高于1419。表明Pgt E同Pla一样可以介导重组大肠杆菌和鼠疫菌对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭。3.m DEC205是表达Pgt E的细菌侵袭细胞的受体E.coli-pgtE对表达小鼠DEC205的CHO细胞有较强的侵袭力,1419-pla、1419-pgtE对稳转细胞CHO-m DEC205的侵袭能力比1419显着增加。说明在细菌和细胞相互作用的过程中,m DEC205是表达Pgt E的细菌侵袭细胞的受体。4.Pgt E的表达促进鼠疫菌加剧小鼠肺部炎症细胞浸润91001p PCP1--pla、91001p PCP1--pgtE通过鼻内途径感染小鼠后,HE染色结果显示小鼠肺部炎症细胞浸润数量显着多于91001p PCP1--p SE380,说明Pgt E在鼠疫菌中和Pla一样促进鼠疫菌对小鼠肺部的炎症损伤。5.Pgt E的表达降低p PCP1敲除的鼠疫菌感染小鼠的生存率91001p PCP1--pla、91001p PCP1--pgtE通过鼻内途径感染小鼠后,小鼠的存活率显着低于91001p PCP1--p SE380感染的小鼠,说明Pgt E的表达增强了p PCP1质粒缺失鼠疫菌的致死率。【结论】本研究证明了Pgt E和Pla一样可以利用m DEC205侵袭宿主抗原提呈细胞,并促进鼠疫菌在宿主内的感染,引起肺部损伤,为鼠伤寒沙门氏菌的pgtE与鼠疫菌的pla之间的关系提供了新的证据。
赵菊平[6]（2019）在《RNA温度感应器调控鼠疫耶尔森氏菌F1抗原表达机制研究》文中提出鼠疫耶尔森氏菌（Yersiniapestis,简称“鼠疫菌”）是烈性传染病鼠疫的病原菌。鼠疫菌以跳蚤作为传播媒介,致病性很强,感染动物宿主后发病很快、死亡率高而且传染性很强。现今世界各地仍然存在许多鼠疫的自然疫源地,而鼠疫菌被用作生化武器以及多药物抗性菌株的产生是人类公共卫生安全的潜伏危机。鼠疫菌带有三个关键的毒性质粒:pCD1以及其由假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotubeculosis,简称“假结核菌”）进化而来时获得的pMT1和pPCP1,其中,pMT1编码鼠疫菌致病重要的鼠毒素Ymt以及F1抗原。F1抗原是鼠疫菌特异性表面荚膜抗原,也是抗鼠疫感染的一种重要的保护性抗原。F1抗原表达基因在鼠疫菌进化初期获得,F1抗原在鼠疫菌感染过程中具有抗巨噬细胞吞噬的的作用,具有免疫调节功能,还可促进以跳蚤作为媒介的鼠疫菌传播。F1抗原表达受到严格调控,其表达水平被控制在特定范围之内,温度是F1抗原表达的一个关键的调控信号,F1抗原在环境温度30℃以下时不表达,而在感染哺乳动物宿主（37℃）时大量表达。细菌RNA温度感应器（RNA thermosenser）是mRNA 5’端折叠而成的感应温度变化的特殊二级结构,掩盖核糖体结合位点,在低温时阻碍翻译起始,而温度升高时,二级结构打开,翻译起始,由此在翻译水平上调控基因表达。我们的研究结果显示温度在转录水平调控F1抗原表达,通过转录激活因子Caf1R实现,我们发现caf1R mRNA 5’UTR及5’端部分编码区序列折叠形成一个特殊的二级结构,通过RNA thermosenser的机制感应温度调控caf1R表达。我们将调控序列与报告基因egfp编码区融合,发现融合序列感应温度调控报告基因表达,当突变与SD（Shine-Da1gamo）序列及起始密码子区域互补配对的碱基,从而稳定RNA二级结构时,报告基因在37℃也不能表达,而当点突变使RNA二级结构更不稳定时,报告基因在26℃表达水平显着上升甚至达到37℃的表达水平,有效破坏了调控序列的温度诱导效应,互补突变则可使温度诱导效应恢复;相应的基因组原位点突变同样破坏了caf1R表达的温度诱导效应;体外翻译实验证明该调控序列感应温度影响蛋白质翻译效率;化学试剂修饰检测RNA二级结构实验证明温度和点突变显着影响caf1R mRNA SD序列及起始密码子区域折叠水平。我们的研究结果表明caf1R RNA thermosenser是一个与以往报道结果不同的新型的调控机制。本文的研究成果不仅丰富了我们对RNA thermosenser的认识,同时也为F1抗原的致病作用研究提供基础依据,为基于F1抗原的疫苗制备提供理论依据。
毋碧聪[7]（2019）在《毒性质粒的丢失促进了宋内氏志贺菌与CD209和CD207之间的相互作用》文中研究说明【背景和目的】21世纪以来,在全球引起痢疾的主要病原体是宋内氏志贺菌,由于志贺菌耐受胃酸,极少量的志贺菌（10-100个）感染机体后,可穿透肠屏障,快速侵入结直肠引起强烈的炎症反应,导致细菌性痢疾。据流行病学研究报道,全世界每年菌痢发生例约有1.6亿,主要集中在5岁以下的儿童,全世界每年因痢疾而死亡的人数约达100万。最新文献表明,宋内氏志贺菌还可通过性传播途径感染,可编码志贺毒素,而且产超广谱β内酰胺酶的多重耐药宋内氏志贺菌与非结石性胆囊炎的发生密切相关。因此迫切需要从志贺菌本身特性以及致病机制方面进行研究。宋内氏志贺菌具有210 kb的毒性质粒,此质粒编码一种亲脂多糖（LPS）的O抗原基因簇。然而,这种毒性质粒在感染过程中却经常丢失。那么对宋内氏志贺菌来说,其感染的优势是否是丢失其毒性质粒?大多数革兰氏阴性的肠道细菌能表达完整的LPS（其结构由内而外包含脂质A、核心多糖core、O抗原三部分组成）,细菌失去O抗原会变成为粗糙型菌落,也就是革兰氏阴性细菌在其表面表达了一个LPS core（LOS）。本实验室前期的研究结果表明,淋病奈瑟菌和鼠疫耶尔森氏菌等本身不表达O抗原的革兰氏阴性菌可通过LOS与CD209相互作用;另外假结核耶尔森氏菌和伤寒沙门氏菌等本身具有O抗原的病原菌在人为条件下不表达O抗原时,能够通过LOS与CD209相互作用侵袭抗原提呈细胞（APCs）。而宋内氏志贺菌在其复制过程中极易自然地丢掉O抗原合成基因进而暴露LPS core,那么宋内氏志贺菌是否也可通过这一方式可与机体免疫细胞相互作用呢?本研究从宿主-病原微生物相互作用的角度,提出了失去210kb的毒质粒的宋内氏志贺菌（rough）以其外膜蛋白核心寡糖的某些成分为配体,与宿主细胞表面一类C型凝集素受体相互结合,促进了宋内氏志贺菌对宿主细胞的黏附和侵袭,而在感染过程中这种相互作用很有可能有助于机体对粗糙型的宋内氏志贺菌进行清除,同时我们推测,可能也有很少一部分的宋内氏志贺菌能够利用和鼠疫耶尔森菌相同的感染机制侵入APCs并逃避免疫系统的监视。【方法】1.刚果红平板筛选宋内氏志贺菌光滑型和粗糙型利用宋内氏志贺菌在生长条件下可自然丢失毒性质粒的特性获得光滑型和粗糙型,运用刚果红可与细菌三型分泌系统（T3SS）编码的毒力蛋白结合进而验证,有毒株呈现红色菌落,而无毒株为无色菌落。2.基因检测宋内氏志贺菌光滑型和粗糙型选择编码宋内氏志贺菌的特有基因、210kb毒性质粒基因及O抗原编码基因设计引物,多聚酶链式反应（PCR）鉴定光滑型和粗糙型菌株。3.宋内氏志贺菌脂多糖LPS表型的分析提取并纯化细菌脂多糖LPS,用SDS-PAGE银染的方法检测细菌O抗原的表达情况。4.细胞侵袭实验3.1用大肠杆菌K12粗糙型CS180及表达O抗原的光滑型CS1861做对照,用宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT及丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough侵袭C57BL/6小鼠的腹腔巨噬细胞,利用庆大霉素保护实验观察细菌感染细胞1.5小时后丢失毒性质粒的粗糙型Ss-rough（无侵袭基因的无毒株）对巨噬细胞的侵袭能力。3.2用大肠杆菌K12粗糙型CS180及表达O抗原的光滑型CS1861做对照,用宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT及丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough侵袭人肠道分离的树突状细胞,利用庆大霉素保护实验观察细菌感染细胞1.5小时后丢失毒性质粒的粗糙型Ss-rough对树突状细胞的侵袭能力。3.3用大肠杆菌K12粗糙型CS180及假结核耶尔森氏菌Y1作为对照,用宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT,丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough及人工构建表达O抗原的宋内氏志贺菌roughO+侵袭表达鼠CD209b,人CD209a和人CD207受体的CHO细胞,利用庆大霉素保护实验观察细菌感染细胞2小时后侵袭进入细胞内的菌量,确定宋内氏志贺菌粗糙型Ss-rough是否是通过与固有免疫细胞表面受体CD209/CD207相互作用进而进入抗原提呈细胞内的。5.细胞侵袭抑制实验用细菌脂多糖类似物及特异性的抗细胞表面分子抗体先与细胞相互作用,然后再进行侵袭实验,观察感染2小时后侵袭进入细胞内的菌量,以此确定宋内氏志贺菌丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough与细胞表面受体是否为特异性相互作用,是否Ss-rough的脂多糖核心LPS core参与同CD209和CD207的相互作用。6.动物感染体内实验腹腔注射途径,用适当剂量的宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT,丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough及人工构建表达O抗原的宋内氏志贺菌roughO+直接注射入腹腔感染C57BL/6小鼠,24小时后观察细菌在体内的播散情况。【结果】1.光滑型和粗糙型宋内氏志贺菌的筛选及鉴定利用刚果红平板法培养野生型宋内氏志贺菌,通过随机挑选若干菌落并用特异性引物鉴定得到了丢失毒性质粒的粗糙型宋内氏志贺菌Ss-rough。2.丢失毒性质粒后的宋内氏志贺菌不表达O抗原银染法结果表明,丢失毒性质粒后的宋内氏志贺菌Ss-rough不表达O抗原。3.丢失毒性质粒促进粗糙型宋内氏志贺菌侵袭小鼠腹腔巨噬细胞和人肠道树突状细胞宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT和丢失毒性质粒的粗糙型Ss-rough均可侵入抗原提呈细胞,且与光滑型相比,丢失毒性质粒的粗糙型Ss-rough侵入抗原提呈细胞更多。4.CD209和CD207是粗糙型宋内氏志贺菌侵入抗原提呈细胞的受体与CHO细胞相比,宋内氏志贺菌粗糙型Ss-rough可侵入表达mCD209（mSIGNR1）,hCD209（hDC-SIGN）,hCD207（hLangerin）分子的CHO转染细胞系。表明粗糙型宋内氏志贺菌Ss-rough可与CD209和hCD207相互作用,而且O抗原可降低他们之间的相互作用。5.粗糙型的宋内氏志贺菌与CD209/hCD207的相互作用是特异性的抗CD209和抗hCD207单克隆抗体可抑制宋内氏志贺菌与CD209和hCD207之间的相互作用,但这种相互作用不能被甘露聚糖（细菌脂多糖类似物）所抑制。表明粗糙型宋内氏志贺菌Ss-rough与受体的相互作用是特异性的,但可能不是利用类似于鼠疫耶尔森的感染机制通过core LPS与受体相互作用的。6.表达O抗原可以降低粗糙型宋内氏志贺菌播散至肠系膜淋巴结和脾脏的能力通过对感染细菌24h后的小鼠内脏中的细菌数目进行比较,观察到宋内氏志贺菌丢失毒性质粒后仍能侵入周围组织,且O抗原可抑制粗糙型宋内氏志贺菌Ss-rough进入肠系膜淋巴结和脾脏。【总结】本研究证明了丢失毒性质粒后的宋内氏志贺菌可与C型凝集素受体CD209和CD207相互作用进入抗原提呈细胞内。
罗罡[8]（2018）在《基于dual RNA-seq识别变形假单胞菌与斜带石斑互作中的关键毒力基因》文中提出变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）是一种海水和淡水中均有分布的革兰氏阴性菌,该菌在一些重要的经济鱼类中已被频繁地发现并导致了非常高的死亡率。然而,就目前而言,关于变形假单胞菌致病机制的研究尚处于起步阶段,基于动态互作转录组探索变形假单胞菌致病机理的研究还未见报道。本研究以变形假单胞菌及其感染的斜带石斑（Epinephelus coioides）病理模型为研究对象,以期识别出变形假单胞菌对斜带石斑致病的关键毒力基因,从而增进对变形假单胞菌致病机理以及病原菌与宿主互作的认识。本研究主要内容如下:提取出野生型变形假单胞菌注射斜带石斑后不同时间点不同器官或组织中基因组DNA后,利用数字PCR技术检测病原菌在鱼体内各器官或组织中的分布情况。结果显示,变形假单胞菌在斜带石斑体内主要通过血液传播,然后在短时间内引发全身性感染;同时,变形假单胞菌在大部分组织中的载量变化存在感染初期短暂下降、之后逐渐上升并在注射后第4d达到最大值、然后又下降的动态分布规律。在感染期的大部分时间点,脾脏中变形假单胞菌的载量均比其它组织要高（注射后第4d达到200多倍）,该结果表明,变形假单胞菌NZBD9菌株感染斜带石斑的主要靶器官是脾脏,这为本研究中dual RNA-seq技术应用的器官取样提供了良好的导向作用。变形假单胞菌感染的斜带石斑脾脏中RNA被提取出后,对构建的cDNA文库进行dual RNA-seq,之后对所有原始测序数据进行过滤,不同样本中均获得Q20大于97%的高质量测序数据（clean reads）。变形假单胞菌和斜带石斑的clean reads分别被进行差异基因分析后,得到病原菌和宿主差异基因的数量:与纯培养变形假单胞菌相比,该病原菌注射斜带石斑后24、48、72和96h的差异基因数分别为258、10,72、808和894;和未感染斜带石斑相比,被病原菌注射后24、48、72和96h斜带石斑差异基因数分别为66,852、77,771、61,369和73,776。注射后48h筛选到的病原菌和宿主差异基因数均是最多的,且不同感染期病原菌和宿主差异基因的表达水平和数量分布均表现出明显的动态变化。分别对病原菌和宿主差异基因进行加权基因共表达网络分析后,获得的共表达模块被进行KEGG功能富集分析,预测出显着富集的主要毒力相关通路为“细菌分泌系统”和“鞭毛组装”通路,主要免疫相关通路为“补体与凝血级联”、“自然杀伤细胞介导的细胞毒性”和“造血细胞系”通路。为了识别变形假单胞菌感染斜带石斑的关键毒力基因,首先对主要毒力和免疫相关通路中差异基因进行基因调控网络构建,预测出变形假单胞菌“sec分泌系统”和“鞭毛组装”通路对宿主的致病性有更重要的作用。之后通过基因共表达网络分析进一步预测到“sec分泌系统”和“鞭毛组装”通路中关键毒力基因分别为secY和fliN。动态分布实验显示:和表达无意义shRNA的变形假单胞菌菌株相比,宿主不同组织中secY和fliN沉默菌株的载量在注射后大部分时间点是显着减少的。secY和fliN沉默菌株感染实验发现,secY沉默菌株感染的斜带石斑存活率显着高于fliN沉默菌株感染的存活率,表明secY对变形假单胞菌毒力的影响大于fliN。综上所述,脾脏为变形假单胞菌感染斜带石斑的主要靶器官,dual RNA-seq同时检测到变形假单胞菌和宿主脾脏的动态互作转录组变化,进一步的生物信息学分析和活体实验识别出secY为变形假单胞菌对斜带石斑致病的关键毒力基因。
曹诗洋[9]（2017）在《鼠疫菌Ⅲ型分泌系统蛋白YscI-YscF相互作用的研究以及蛋白质分泌组新毒力因子的鉴定》文中提出本论文涉及两个部分,即《鼠疫耶尔森氏菌III型分泌系统蛋白YscI-YscF相互作用的研究》和《鼠疫耶尔森氏菌蛋白质组学分析及新毒力因子的鉴定。摘要及正文将分为两个部分撰写。摘要一 鼠疫耶尔森氏菌III型分泌系统蛋白YscI-YscF相互作用的研究III型分泌系统（Type III Secretion System,T3SS）是一种高度保守的毒力机制,广泛分布于革兰氏阴性菌中,能够将效应蛋白直接分泌到宿主细胞的细胞质中。该系统的结构类似于一支注射器,由两部分组成,分别是横跨于细菌内膜、周质及外膜的多环基座以及将毒力蛋白输送到宿主细胞内的中空针头。鼠疫菌的T3SS由pCD1质粒编码而成,是由20余种蛋白质构成的一种超分子复合物,含有许多高度保守结构,通过耗能将分泌性V抗原（LcrV）和耶尔森氏菌外膜蛋白（Yersinia outer proteins,Yops）由宿主细胞表面形成的小孔结构注入到宿主细胞内,从而达到干扰细胞发挥其正常生理功能的目的。鼠疫菌的pCD1质粒共编码90多个基因,除去部分假基因和转座酶相关基因后,共57个基因编码T3SS相关蛋白。在本实验室的前期工作中,已通过酵母双杂交阵列筛选技术筛选到57个蛋白之间的21个相互作用对,其中新发现12对,包括YscF-YscI。YscF的多聚体在细菌表面形成注射小体的针状结构,YscI是连接T3SS装置分泌通道内外环的蛋白。前期实验中已采用GST-pull down验证了YscI-YscF体外存在相互作用,并通过构建Ysc I截短突变体的方法确定介导二者体外相互作用的结构域位于YscI的第83-92位氨基酸。本研究中,将通过免疫共沉淀等方法继续验证YscF-YscI的体内相互作用关系,并探讨其相互作用的生理功能。首先,本研究利用λ-Red重组系统构建鼠疫菌yscI基因突变株。再以阿拉伯糖诱导的pBAD24质粒为载体构建带FLAG标签的yscI互补株及yscI截短突变体,并将成功构建的新载体导入yscI突变株,分别为△yscI-FLAG-YscI、△yscI-C△73-85、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102和△yscI-C△93-102。接下来,运用免疫共沉淀（Co-IP）的方法在FLAG树脂结合下来的样品中检测到了YscF蛋白,验证了YscI-YscF在体内存在相互作用;并使用同样的实验方法对不同突变菌株进行检测,结果,对△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102菌株的Co-IP实验中,FLAG树脂结合下来的样品中未检测到YscF蛋白。以上结果说明,影响YscI-Ysc F体内相互作用的关键结构域位于YscI蛋白C末端的第83-102位氨基酸。本研究分别运用YscF聚合体交联的方法检测上述构建的yscI互补株以及yscI截短突变株在细菌表面组装YscF针状结构的能力;运用WB免疫印迹的方法检测其表达及分泌YscI、YscF以及效应蛋白YopN、YopM、Yop E、YopK和LcrV的能力。结果表明:鼠疫菌yscI互补株和yscI截短突变株均可以在菌体内表达Ysc I和YscF,但不能分泌到上清中;在△yscI、△yscF和△yscI-C△83-92的菌体表面未检测到YscF多聚体,在其分泌上清中也未检测到效应蛋白;在△yscI-C△93-102细菌表面能检测到YscF多聚体,但该菌株不能够正常分泌效应蛋白。以上结果阐明,当YscI的第83-92位氨基酸缺失时,该突变株不能形成针状结构且无法分泌效应蛋白;当第93-102位氨基酸缺失时,该菌株组装YscF针状结构的能力受到一定影响,但其分泌效应蛋白的功能并未完全丧失。针对YscI的83-92位氨基酸区域进行序列比对结果发现Ysc I的第85、86、88和92位氨基酸与YscF同源性高。因此,本研究构建了C末端带有FLAG标签的yscI点突变体,并导入yscI突变株,分别为△yscI-CW85A、△yscI-CS86A、△yscI-CI88A以及△ysc I-CI92A。利用免疫共沉淀方法检测与YscF体内相互作用,结果在对△yscI-CW85A、△yscI-CS86A菌株的Co-IP实验中,FLAG树脂结合下来的样品中未检测到YscF蛋白。利用GST-pull down方法检测与YscF体外相互作用,结果发现YscI-W85A或YscI-S86A与YscF未发生结合。以上结果表明,YscI第85或86位氨基酸的缺失,同时影响了YscI与YscF之间体内外的相互作用。本研究进一步发现无法在△yscI-CW85A和△yscI-CS86A的细菌表面检测到YscF多聚体,也无法在其上清中检测到效应蛋白。这一结果阐明,YscI的第85或86位氨基酸缺失导致YscI-YscF失去相互作用,并且该突变株也不能形成针状结构和分泌效应蛋白。本研究还通过观察细菌感染Hela细胞后形态的变化,以及用无标记细胞实时定量分析法研究鼠疫菌yscI截短及点突变株的细胞毒性。在显微镜下,我们看到野生株鼠疫菌感染3h后的Hela细胞明显变圆,表明效应蛋白破坏细胞骨架;而△yscI、△yscF、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102、△yscI-CW85A以及△yscI-CS86A感染的Hela细胞形态更接近于正常细胞,这说明以上菌株对Hela细胞的毒力作用已大幅度减弱。本研究还利用免疫印迹的方法检测了yscI截短及点突变株感染Hela细胞后向胞内转运效应蛋白的能力,结果表明对HeLa细胞毒力明显减弱的几株突变株同样不能将效应蛋白Lcr V、Yop M和Yop E转运到细胞胞浆中。摘要二 鼠疫耶尔森氏菌蛋白质组学分析及新毒力因子的鉴定鼠疫（plague）是由鼠疫耶尔森氏菌引起的烈性传染病,主要由节肢动物跳蚤通过叮咬传染给宿主啮齿类动物,并有可能传播给人导致腺鼠疫、肺炎鼠疫和败血症等的发生,给人们造成了巨大的生命和财产损失。本研究利用蛋白质组技术,在鼠疫菌全基因组测序已完成的基础上,对鼠疫菌201株在两种不同的生理条件下,即26°C含钙（模拟跳蚤体内环境）和37°C低钙（模拟哺乳动物体内环境）的蛋白质组展开研究,并进一步发现鼠疫菌致病的新的关键毒力因子,为防治鼠疫菌和新疫苗研究提供更多方法和靶标。首先,本研究制备出鼠疫菌在26°C含钙和37°C低钙培养条件下的分泌蛋白质组和菌体蛋白质组。该过程主要使用TMH人工合成培养基培养鼠疫菌,在两种条件下培养8h,然后使用超滤法进行上清蛋白的浓缩,菌体用含尿素裂解液裂解,并用BCA试剂盒测量菌体蛋白和上清蛋白的浓度。此外,为了实现对鼠疫菌T3SS不同蛋白质组分的动态监控,在8h分泌时间内选择了一系列时间点作为分泌时间,分别为,80min、160min、240min、320min、400min和480min,制备出不同时间序列的分泌蛋白质组及菌体蛋白质组样品。在本研究中,我们通过同量异序化学标签（Tandem Mass Tags,TMT）法对样品进行定量分析。TMT是通过串联质谱同时定量鉴定不同样品中蛋白质的有效工具。这些小化学分子标签的结构类似,以共价结合赖氨酸的氨基末端的方式标记蛋白样品中的多肽。在质谱分析中,每种分子量的TMT标签都能生成一个特殊的离子图谱,通过比较不同标签标记的离子的相对丰度实现了对蛋白的相对定量。我们共检测到2141个鼠疫菌蛋白质,占基因组预测CDS的52.2%。其中1081个蛋白质同时出现在分泌和菌体蛋白质组中。将Score≥5和Unique Peptide≥2作为定义潜在分泌蛋白的标准,共在培养上清中检测到767个分泌蛋白,其中Yp-2058、Yp-3657和Yp3415-Yp3418几种未知功能的蛋白在37°C表达上调,可能与鼠疫菌在宿主动物中的毒力密切相关。在研究T3SS的分泌蛋白动态变化实验中,根据不同时间序列的蛋白质组样品的质谱结果分析,未观察到鼠疫菌T3SS蛋白组分随时间的蛋白特异性变化规律,推测可能是由于最短分泌时间80min时,分泌蛋白质种类已基本趋于稳定。本研究建立了一种新方法分辨哪些蛋白是T3SS的分泌蛋白,即将上清/菌体的PSM值大于1作为分泌蛋白的评判标准。发现根据上清/菌体的PSM值大于1为标准判断鉴定出的T3SS分泌底物的蛋白,均是文献中已经报道的分泌蛋白;而那些比值小于1的蛋白为T3SS结构蛋白、ATP酶以及转运蛋白等。在分子实验部分中,针对筛选出的高表达分泌蛋白质Yp3416、Yp3417、Yp3418、Yp2058和Yp3657进行毒力及功能的验证。本研究采用基于p DS132自杀载体的方法构建yp3416、yp3418和yp3416-3418的无痕突变株。分别以尾静脉感染途径和滴鼻感染途径对小鼠进行攻毒实验,绘制出生存曲线。结果表明,经尾静脉感染后,鼠疫菌野生株与yp3416突变株,yp3416-3418突变株的生存曲线差异有统计学意义,与yp3418突变株无差异;滴鼻感染结果中,野生株与以上3株突变株的差异均有统计学意义。本研究还构建出yp3416、yp3417、yp3418、yp2058和yp3657的β-内酰胺酶（TEM）报告质粒,导入鼠疫菌野生株后,分别感染Hela细胞。当靶蛋白进入宿主细胞时,与靶蛋白融合表达的β-内酰胺酶可降解细胞内CCF2-AM染料分子,在409nm光的照射下发出447nm的蓝光;而靶蛋白未进入细胞时,完整的CCF2-AM具有荧光能量共振转移现象,在409nm光的照射下发出520nm的绿光。利用该原理,研究Yp3416、Yp3417、Yp3418、Yp2058和Yp3657五种靶蛋白能否被转运到真核细胞内。结果表明,以上五种蛋白均能转运到真核细胞内,且转运效率较高。这一结果为新鉴定分泌蛋白质因子功能的后续研究奠定了基础。
陈珂琪[10]（2017）在《假结核耶尔森氏菌中HpaR的调控及其功能研究》文中研究说明假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis,Yptb）属于耶尔森氏菌属,为人畜共患病原菌,其与小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）、鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）同为该菌属的三大致病菌,且在生理生化特征及进化上与他们有着极高的相似性。MarR（multiple antibiotic resistance regulator）家族转录调控因子被发现广泛存在于细菌和古细菌中,其家族成员调控了菌体的一系列生物学功能,包括多种抗生素抗性和化学毒素抗性,同时,也调控一些动植物病原菌致病因子的表达以及对于不同环境的适应性。MarR家族转录调控因子功能的解析及丰富是细菌生理生化研究的热点内容。在假结核耶尔森氏菌中含有多个MarR家族转录调控因子,HpaR（homoprotocatechuate degradation operon regulator）为其中之一,其能调控4-羟基苯乙酸（4-HPA）的降解。本研究将以假结核耶尔森氏菌为模式菌,以调控蛋白HpaR（YPK2462）为主要研究对象,以揭示HpaR的调控多样性及其功能。主要研究结果如下:1.转录组测序分析假结核耶尔森氏菌野生型与hpaR突变体基因表达水平的差异,有59个基因发生了转录水平的改变,其中有28个基因在突变体中表达上调,31个基因表达下调。通过KEGG代谢通路分析,有17条不同功能的代谢通路受到了HpaR的调控。在hpaR突变体中,4-HPA降解基因簇hpa各结构基因在转录水平上有不同程度的上调,与环境适应性相关的T6SS4基因簇结构基因在转录水平上均有明显的下调。另一方面,一些编码超氧化物歧化酶、ABC转运蛋白、核苷酸转运蛋白、糖类转运蛋白等基因在突变体中的表达水平都发生了不同程度的改变,这似乎预示着HpaR参与了细菌的环境适应性功能,并具有多种生物学功能。2.分析比对假结核耶尔森氏菌与大肠杆菌中的4-羟基苯乙酸降解基因簇hpa,发现两者在基因簇结构与蛋白序列上具有很高的相似性。实验验证假结核耶尔森氏菌hpa基因簇也具有降解芳香族化合物4-羟基苯乙酸的功能,而且其降解功能受到了HpaR的调控。进一步探究HpaR对于基因簇的调控机制,发现HpaR直接结合在hpa基因簇启动子上,抑制启动子活性,从而通过抑制hpa基因簇蛋白的表达来影响对4-羟基苯乙酸的降解。3.发现了HpaR作为MarR家族调控蛋白,能够在氧化胁迫下通过清除胞内自由基来提高菌体的存活率,并且,这种抗胁迫能力依赖于第56位半胱氨酸。当菌体受到氧化胁迫时,第56位半胱氨酸的巯基将形成分子间二硫键,使HpaR以二聚体的形式来行使抗氧化胁迫功能。4.实验发现hpaR突变体形成生物膜的能力明显低于野生型及互补株,并且其对小鼠的致病性明显低于野生型,说明假结核耶尔森氏菌HpaR对于菌体生物膜形成及小鼠致病性具有重要意义。
二、鼠疫耶尔森氏菌质粒上重要毒力相关基因的克隆与表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼠疫耶尔森氏菌质粒上重要毒力相关基因的克隆与表达（论文提纲范文）
（1）食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 小肠结肠炎耶尔森菌概述 |
| 1.1.1 病原学研究 |
| 1.1.2 流行病学与药物敏感性 |
| 1.1.3 两种小肠结肠炎耶尔森菌外膜蛋白的概述 |
| 1.2 小肠结肠炎耶尔森菌检测技术进展 |
| 1.2.1 培养检测 |
| 1.2.2 分子生物学检测 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.3 免疫磁珠分离技术 |
| 1.3.1 免疫磁珠的原理与结构特点 |
| 1.3.2 免疫磁珠分离技术的优势 |
| 1.3.3 免疫磁珠分离技术的实际应用 |
| 1.4 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.4.1 实时荧光定量PCR技术原理与特点 |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR技术的应用 |
| 1.5 Red重组技术 |
| 1.5.1 Red重组技术原理以及优势 |
| 1.5.2 Red重组技术应用实例 |
| 1.6 研究目的与内容 |
| 第2章 小肠结肠炎耶尔森菌外膜蛋白的表达纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验用菌株与载体 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 细菌的培养以及基因组提取 |
| 2.2.4 ail,ompF基因生物信息学分析及序列扩增 |
| 2.2.5 原核表达载体的构建与验证 |
| 2.2.6 重组外膜蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 ail,ompF基因生物信息学分析结果 |
| 2.3.2 外膜蛋白基因的扩增与16SrDNA验证 |
| 2.3.3 原核表达载体的构建 |
| 2.3.4 三种外膜蛋白的表达纯化结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 扩增基因的选择标准 |
| 2.4.2 表达载体选择与包涵体蛋白纯化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 小肠结肠炎耶尔森菌免疫磁珠的制备与参数优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验菌株与动物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 重组外膜蛋白抗血清的制备 |
| 3.2.4 多克隆抗体的纯化以及效价的测定 |
| 3.2.5 多克隆抗体的免疫印迹分析(Western-blot) |
| 3.2.6 免疫磁珠的制备 |
| 3.2.7 免疫磁珠制备参数优化 |
| 3.2.8 免疫磁珠捕获小肠结肠炎耶尔森菌的特异性评价 |
| 3.2.9 扫描电镜(SEM)观察免疫磁珠-小肠结肠炎耶尔森菌复合物 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组外膜蛋白多克隆抗体的纯化以及效价的测定 |
| 3.3.2 多克隆抗体的免疫印迹分析(Western-blot)结果 |
| 3.3.3 免疫磁珠制备参数的优化 |
| 3.3.4 免疫磁珠捕获小肠结肠炎耶尔森菌特异性评价 |
| 3.3.5 扫描电镜(SEM)观察免疫磁珠-小肠结肠炎耶尔森菌复合物 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 免疫磁珠制备参数的优化 |
| 3.4.2 免疫磁珠捕获能力与特异性分析 |
| 3.4.3 两种抗体制备磁珠捕获效率差异分析 |
| 3.4.4 多抗交叉性原因分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验菌株以及载体 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 pKD46质粒抗性改造与验证 |
| 4.2.4 感受态细胞的制备与电转化 |
| 4.2.5 重叠PCR扩增抗性片段 |
| 4.2.6 抗性片段的电转化 |
| 4.2.7 PCR鉴定ompF基因敲除突变株 |
| 4.2.8 基因敲除菌株吸附纯化兔抗血清 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 pKD46质粒抗性改造与验证 |
| 4.3.2 重叠PCR扩增抗性片段结果 |
| 4.3.3 PCR鉴定小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 供体同源臂的长度对同源重组效率的影响 |
| 4.4.2 提高同源同组效率需注意的其他因素 |
| 4.4.3 构建ompF基因敲除突变株的意义 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 IMBs-qPCR检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌方法建立 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 基于在线软件设计foxA荧光定量PCR引物 |
| 5.2.3 建立荧光定量PCR标准曲线 |
| 5.2.4 荧光定量PCR检测foxA基因的重复性检测 |
| 5.2.5 荧光定量PCR检测foxA基因的特异性评价 |
| 5.2.6 IMBs-qPCR检测食品(肉、奶)中小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.2.7 IMBs-qPCR检测野生型与基因缺失菌株捕获效率差异 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 基于在线软件设计foxA荧光定量PCR引物 |
| 5.3.2 建立荧光定量PCR标准曲线 |
| 5.3.3 荧光定量PCR的重复性检测 |
| 5.3.4 荧光定量PCR检测foxA基因的特异性评价 |
| 5.3.5 IMBs-qPCR检测食品(肉、奶)中小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.3.6 免疫磁珠对野生型与OmpF基因缺失型菌株捕获效率对比 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 荧光定量PCR检测基因的选择 |
| 5.4.2 IMBs-qPCR检测食品中的小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.4.3 IMBs-qPCR检测体系的优化 |
| 5.4.4 IMBs-qPCR检测方法展望 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（2）两株鼠疫菌pMT1质粒整合入染色体位置的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1.引言 |
| 1.1 鼠疫流行概述 |
| 1.2 鼠疫耶尔森氏菌概述 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 参考鼠疫菌株基因组信息 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基础培养基制备 |
| 2.2.2 菌株培养 |
| 2.2.3 质粒DNA提取 |
| 2.2.4 基因组DNA提取 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 全基因组测序 |
| 2.2.7 pMT1 质粒整合至染色体的位点确定及验证 |
| 2.2.8 生化试验 |
| 2.2.9 鼠疫菌毒力因子试验 |
| 2.2.10 鼠疫菌营养需求检查 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 质粒DNA提取 |
| 3.2 基因组DNA提取 |
| 3.3 基因组分析 |
| 3.3.1 染色体 |
| 3.3.2 质粒 |
| 3.4 pMT1 序列整合位点的确定及验证 |
| 3.4.1 整合位点的初探 |
| 3.4.2 O-1 菌株 |
| 3.4.3 ST菌株 |
| 3.5 生化试验 |
| 3.5.1 糖醇发酵结果 |
| 3.5.2 其他生化试验结果 |
| 3.6 鼠疫菌毒力因子试验结果 |
| 3.6.1 F1 抗原检测结果 |
| 3.6.2 色素沉着因子检查结果(P因子) |
| 3.6.3 VW抗原检查结果 |
| 3.7 营养需求试验 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（3）云南省2017年新分离鼠疫菌表型与基因型研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1.鼠疫概况 |
| 2.鼠疫流行现状 |
| 3.鼠疫菌概况 |
| 4.鼠疫菌基因型研究 |
| 第一章 云南省新分离鼠疫菌株表型研究 |
| 1.实验材料和实验方法 |
| 2.实验试剂和仪器 |
| 3.试剂配置 |
| 4.实验方法 |
| 5.实验结果 |
| 6.讨论 |
| 第二章 云南省鹤庆县新分离鼠疫菌基因分型 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验试剂和仪器 |
| 3.试剂配置 |
| 4.实验方法 |
| 5.结果 |
| 6.讨论 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（4）斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 斑点叉尾鮰养殖概况 |
| 2 鮰爱德华氏菌研究进展 |
| 2.1 生物学特性 |
| 2.2 宿主种类和范围 |
| 2.3 相关毒力因子研究 |
| 2.5 鮰爱德华氏菌外膜蛋白的研究 |
| 2.6 鮰爱德华氏菌的疫苗研究 |
| 3 鲁氏耶尔森氏菌研究进展 |
| 3.1 生物学特性 |
| 3.2 宿主种类和范围 |
| 3.3 相关毒力因子研究 |
| 3.4 鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白研究 |
| 3.5 鲁氏耶尔森氏菌疫苗研究 |
| 4 渔用疫苗研究进展 |
| 4.1 渔用疫苗的发展历程 |
| 4.2 渔用疫苗的种类 |
| 4.3 渔用疫苗的免疫方式 |
| 5 渔用口服疫苗载体研究 |
| 5.1 微囊和微球载体 |
| 5.2 减毒细菌载体 |
| 5.3 生物被膜载体 |
| 5.4 生物载体疫苗 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鮰爱德华氏菌OmpN2 与鲁氏耶尔森氏菌OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增 |
| 2.3 重组克隆质粒的构建 |
| 2.4 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 核苷酸序列特征分析 |
| 2.6 氨基酸序列特征分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增和T克隆鉴定 |
| 3.2 核苷酸序列特征分析 |
| 3.3 氨基酸序列特征分析 |
| 3.4 OmpN2和OmpF核苷酸和氨基酸序列相似性比对 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增 |
| 2.3 重组克隆质粒的构建 |
| 2.4 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 重组表达质粒的构建 |
| 2.6 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.7 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.8 重组蛋白的大量制备及纯化 |
| 2.9 兔抗重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.10 Western blotting分析 |
| 2.11 目的蛋白在细菌表面分布验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF的表达及纯化 |
| 3.3 重组蛋白的免疫原性分析 |
| 3.4 目的蛋白在细菌表面的分布 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 二联融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 Linker序列选择与引物设计 |
| 2.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linker-F的构建与鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒P-N2-linker-F的构建与鉴定 |
| 2.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化 |
| 2.6 兔抗融合蛋白N2-F多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.7 融合蛋白N2-F免疫原性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 N2-linker与 linker-F的 PCR扩增 |
| 3.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linlker-F的构建与鉴定 |
| 3.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定 |
| 3.4 重组表达质粒P-N2-Linker-F的构建与鉴定 |
| 3.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化 |
| 3.6 融合蛋白N2-F的免疫原性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰免疫效果分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 疫苗、菌株与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细菌复壮 |
| 2.2 亚单位疫苗制备 |
| 2.3 免疫程序 |
| 2.4 收集血清 |
| 2.5 血清免疫相关指标检测 |
| 2.6 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 2.7 免疫相关基因表达分析 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清抗体水平检测 |
| 3.2 血清溶菌酶活性检测 |
| 3.3 血清补体C3 活性检测 |
| 3.4 血清总蛋白含量检测 |
| 3.5 血清SOD活性检测 |
| 3.6 免疫相关基因表达分析 |
| 3.7 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 蛋白与主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 海藻酸钠-壳聚糖复合微球制备流程 |
| 2.2 包封率和载药率测定 |
| 2.3 单因素试验 |
| 2.4 响应面试验 |
| 2.5 口服微球疫苗的理化特性分析 |
| 2.6 口服微球疫苗的抗原性检测 |
| 2.7 口服微球疫苗的安全性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 单因素试验 |
| 3.2 响应面试验结果 |
| 3.3 响应面分析及结果验证 |
| 3.4 口服微球疫苗的理化特性分析 |
| 3.5 口服微球疫苗的抗原性检测 |
| 3.6 口服微球疫苗的安全性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第七章 二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 疫苗、菌株与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 口服微球疫苗制备 |
| 2.2 口服疫苗饲料制备 |
| 2.3 免疫程序 |
| 2.4 血清和肠粘液采集 |
| 2.5 肠黏液免疫相关指标检测 |
| 2.6 血清免疫相关指标检测 |
| 2.7 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 2.8 免疫相关基因表达分析 |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肠黏液免疫指标 |
| 3.2 血清免疫相关指标 |
| 3.3 免疫相关基因表达分析 |
| 3.4 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）鼠伤寒沙门氏菌致病机制的研究（论文提纲范文）
| 第一部分 巨噬细胞释放的鼠伤寒沙门氏菌通过与CD209相互作用促进其在宿主体内的感染和播散 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鼠伤寒沙门氏菌的PgtE利用CD205促进鼠疫菌感染的研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 沙门氏菌外膜蛋白PgtE的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录1攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（6）RNA温度感应器调控鼠疫耶尔森氏菌F1抗原表达机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 鼠疫耶尔森氏菌概况及其危害 |
| 2. F1抗原 |
| 3. 细菌RNA温度感应器(RNA thermosenser)及其调控机制 |
| 4. 研究目的、研究意义及技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 菌株质粒 |
| 3. 引物列表 |
| 4. 实验方法 |
| 结果和讨论 |
| 1. F1抗原表达受温度调控 |
| 2. caf操纵子表达在转录后水平不受温度调控 |
| 3. caf1R mRNA稳定性及蛋白质稳定性与温度调控无关 |
| 4. caf1R翻译起始密码子验证 |
| 5. caf1R mRNA 5'端二级结构感应温度调控基因表达 |
| 6. 原位突变验证caf1R RNA thermosenser调控作用 |
| 7. 体外实验验证点突变影响翻译效率 |
| 8. DMS-seq验证温度变化及点突变改变caf1 R mRNA 5'端二级结构 |
| 9. 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）毒性质粒的丢失促进了宋内氏志贺菌与CD209和CD207之间的相互作用（论文提纲范文）
| 绪言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）基于dual RNA-seq识别变形假单胞菌与斜带石斑互作中的关键毒力基因（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 变形假单胞菌研究概况 |
| 1.1.1 变形假单胞菌的生物学特性 |
| 1.1.2 变形假单胞菌流行病学 |
| 1.1.3 变形假单胞菌致病机理的研究现状 |
| 1.2 鱼类免疫系统与免疫应答 |
| 1.2.1 免疫系统 |
| 1.2.2 免疫应答 |
| 1.3 转录组学研究 |
| 1.3.1 转录组和转录组学 |
| 1.3.2 转录组学主要研究技术 |
| 1.3.3 病原菌与宿主相互作用的转录组学研究 |
| 1.4 本研究的目的、内容和创新性 |
| 1.4.1 研究目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究的创新性 |
| 第2章 变形假单胞菌在斜带石斑体内的分布 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株和动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌悬液的制备 |
| 2.2.2 人工感染试验 |
| 2.2.3 基因组DNA的提取 |
| 2.2.4 引物探针的设计 |
| 2.2.5 数字PCR反应 |
| 2.2.6 不同组织中变形假单胞菌的检测 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 斜带石斑存活实验 |
| 2.3.2 病原菌在斜带石斑体内的迁移路径 |
| 2.3.3 病原菌在斜带石斑体内的动态分布 |
| 2.3.4 病原菌感染斜带石斑的主要靶器官 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 变形假单胞菌感染斜带石斑的动态互作转录组分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株和动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌悬液的制备和人工感染 |
| 3.2.2 RNA提取和纯化 |
| 3.2.3 cDNA文库的制备和测序 |
| 3.2.4 测序数据的过滤 |
| 3.2.5 序列与病原菌参考基因组比对 |
| 3.2.6 宿主参考转录组的组装和功能注释 |
| 3.2.7 序列与宿主参考转录组比对 |
| 3.2.8 差异基因的识别和Venn分析 |
| 3.2.9 加权基因共表达网络分析 |
| 3.2.10 基因模块的KEGG功能富集分析 |
| 3.2.11 差异基因的q RT-PCR验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 测序数据的过滤 |
| 3.3.2 序列与病原菌参考基因组比对结果 |
| 3.3.3 病原菌差异基因的检测结果和Venn分析 |
| 3.3.4 病原菌差异基因加权基因共表达网络分析的结果 |
| 3.3.5 病原菌差异基因的q RT-PCR验证 |
| 3.3.6 参考转录组的组装结果统计和功能注释 |
| 3.3.7 序列与宿主参考转录组比对结果 |
| 3.3.8 宿主差异基因的检测结果和Venn分析 |
| 3.3.9 宿主差异基因加权基因共表达网络分析的结果 |
| 3.3.10 宿主差异基因表达的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 变形假单胞菌感染斜带石斑关键毒力基因的识别 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌株和动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 变形假单胞菌感染斜带石斑关键毒力基因的预测 |
| 4.2.2 变形假单胞菌沉默菌株的构建 |
| 4.2.3 变形假单胞菌生长曲线的测定 |
| 4.2.4 变形假单胞菌毒力测定 |
| 4.2.5 斜带石斑体内变形假单胞菌载量的测定 |
| 4.2.6 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 变形假单胞菌感染斜带石斑关键毒力基因的预测结果 |
| 4.3.2 变形假单胞菌沉默菌株的构建结果 |
| 4.3.3 变形假单胞菌的生长曲线 |
| 4.3.4 变形假单胞菌对斜带石斑的毒性 |
| 4.3.5 变形假单胞菌在斜带石斑体内的动态分布 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 小结与展望 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的学术论文 |
（9）鼠疫菌Ⅲ型分泌系统蛋白YscI-YscF相互作用的研究以及蛋白质分泌组新毒力因子的鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 鼠疫耶尔森氏菌Ⅲ型分泌系统蛋白YscI-YscF相互作用的研究 |
| 第一章 前言 |
| 1.鼠疫的传播与流行 |
| 2.鼠疫菌的生理特性 |
| 3.鼠疫菌的III型分泌系统 |
| 4.鼠疫菌III型分泌系统蛋白的相互作用 |
| 5.本研究意义 |
| 第二章 yscI突变株的构建 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果及讨论 |
| 3.1 yscI突变株的构建 |
| 3.2 YscI目的蛋白的纯化 |
| 3.3 yscI基因突变株免疫印迹验证 |
| 4.小结 |
| 第三章 鼠疫菌T3SS蛋白YscI与YscF体内相互作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 yscI互补株及yscI截短突变株的构建 |
| 3.2 pBAD24载体阿拉伯糖诱导浓度的验证 |
| 3.3 yscI截短体突变株的免疫印迹验证 |
| 3.4 免疫共沉淀验证YscI及其截短蛋白与YscF体内相互作用 |
| 4.小结 |
| 第四章 鼠疫菌YscF-YscI相互作用的生理功能研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果及讨论 |
| 3.1 鼠疫菌及其突变株组装YscF针状结构的能力 |
| 3.2 鼠疫菌yscI截短突变株YscI和YscF的表达及分泌 |
| 3.3 鼠疫菌yscI互截短突变株Yops蛋白分泌情况 |
| 4.小结 |
| 第五章 鼠疫菌YscI点突变蛋白与YscF间的相互作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 pBAD24-YscI-FLAG点突变体的构建 |
| 3.2 yscI点突变株的免疫印迹验证 |
| 3.3 pBAD24-YscI点突变蛋白与YscF体内相互作用 |
| 3.4 pGEX-4T2YscI点突变体蛋白的纯化 |
| 3.5 His-YscF蛋白的表达与纯化 |
| 3.6 GST-pull down验证YscI点突变蛋白与YscF体外相互作用 |
| 4.小结 |
| 第六章 鼠疫菌yscI点突变株生理功能的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果及讨论 |
| 3.1 鼠疫菌yscI点突变株组装YscF针状结构的能力 |
| 3.2 鼠疫菌yscI点突变株Yops蛋白分泌情况 |
| 4.小结 |
| 第七章 鼠疫菌yscI截短及点突变株细胞毒力及转运效应蛋白的能力 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果及讨论 |
| 3.1 鼠疫菌yscI截短及点突变株对Hela细胞的毒力 |
| 3.2 鼠疫菌yscI点突变株感染Hela细胞的RTCA |
| 3.3 鼠疫菌yscI截短及点突变株效应蛋白的转运 |
| 4.小结 |
| 第八章 总结 |
| 第二部分 鼠疫耶尔森氏菌蛋白质组学分析及新毒力因子的鉴定 |
| 第一章 前言 |
| 1.蛋白质组概述 |
| 2.细菌的分泌途径 |
| 2.1 两步分泌途径 |
| 2.2 一步分泌途径 |
| 3.细菌分泌蛋白质组的研究 |
| 3.1 细菌分泌蛋白质组研究的技术和方法 |
| 3.2 细菌不同生理条件下分泌蛋白质组的研究 |
| 3.3 细菌不同菌株蛋白质组的研究 |
| 3.4 新抗生素的发现及耐药机制的研究 |
| 3.5 细菌分泌蛋白中药物靶标的研究 |
| 4.鼠疫耶尔森氏菌蛋白质组的研究 |
| 5.本研究意义 |
| 第二章 鼠疫耶尔森氏菌蛋白质组样品的制备 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果及讨论 |
| 3.1 鼠疫菌蛋白质组样品 |
| 3.2 鼠疫菌不同时序蛋白质组样品 |
| 4.小结 |
| 第三章 蛋白质组的质谱分析 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果及讨论 |
| 第四章 鼠疫菌蛋白质组质谱结果分析 |
| 1.比较蛋白质组学分析 |
| 2.鼠疫菌分泌蛋白质组的定义 |
| 3.鼠疫菌T3SS相关蛋白质组动态变化 |
| 第五章 鼠疫菌五个新的毒力相关基因功能的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.结果及讨论 |
| 3.1 鼠疫菌yp_3416、yp_3418、yp_3416-3418基因敲除 |
| 3.2 鼠疫菌基因突变株感染小鼠的生存曲线 |
| 3.3 β-内酰胺酶（TEM）报告质粒的构建 |
| 3.4 鼠疫菌向细胞内转运靶蛋白的 β-内酰胺酶（TEM）报告实验 |
| 4.小结 |
| 第六章 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）假结核耶尔森氏菌中HpaR的调控及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 假结核耶尔森氏菌概述 |
| 1.2 假结核耶尔森氏菌的致病性研究进展 |
| 1.2.1 毒力因子及其调控 |
| 1.2.2 宿主免疫系统抗性 |
| 1.3 MarR家族调控因子 |
| 1.3.1 MarR家族调控病原微生物致病性 |
| 1.3.2 MarR家族调控病原微生物抗氧化胁迫功能 |
| 1.4 HpaR调控4-HPA降解的研究 |
| 1.4.1 芳香族化合物的危害及降解途径 |
| 1.4.2 HpaR调控4-HPA的降解 |
| 1.5 论文选题依据 |
| 1.6 本研究的技术路线 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 菌株、质粒和引物 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 克隆构建 |
| 2.3.2 突变体及回复株构建 |
| 2.3.3 蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.4 细菌存活率检测 |
| 2.3.5 活性氧(ROS)自由基检测 |
| 2.3.6 β-Galactosidase报告基因检测 |
| 2.3.7 实时定量PCR实验 |
| 2.3.8 蛋白二聚化检测 |
| 2.3.9 凝胶迁移实验(EMSA) |
| 2.3.10 生物膜形成实验 |
| 2.3.11 小鼠致病性检测 |
| 2.3.12 数据统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 在全基因组中分析受HpaR调控的基因 |
| 3.1.1 转录组数据分析及验证 |
| 3.1.2 受调控代谢通路分析 |
| 3.2 假结核耶尔森氏菌HpaR对4-HPA代谢途径的调控作用 |
| 3.2.1 鉴定假结核耶尔森氏菌hpa基因簇 |
| 3.2.2 分析hpa基因簇的功能与调控 |
| 3.3 HpaR通过二聚化维持胞内ROS水平,抵抗多种氧化胁迫 |
| 3.3.1 HpaR参与抵抗多种氧化胁迫 |
| 3.3.2 HpaR通过二聚化行使抗氧化胁迫功能 |
| 3.4 HpaR多种生物学功能分析 |
| 3.4.1 HpaR影响生物膜的形成 |
| 3.4.2 HpaR影响假结核耶尔森氏菌对小鼠的致病性 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、鼠疫耶尔森氏菌质粒上重要毒力相关基因的克隆与表达（论文参考文献）
- [1]食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究[D]. 迟恒. 天津大学, 2020(01)
- [2]两株鼠疫菌pMT1质粒整合入染色体位置的研究[D]. 安森玲. 大理大学, 2019(02)
- [3]云南省2017年新分离鼠疫菌表型与基因型研究[D]. 张海鹏. 大理大学, 2019(01)
- [4]斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究[D]. 王二龙. 四川农业大学, 2019(07)
- [5]鼠伤寒沙门氏菌致病机制的研究[D]. 叶成林. 华中科技大学, 2019(01)
- [6]RNA温度感应器调控鼠疫耶尔森氏菌F1抗原表达机制研究[D]. 赵菊平. 北京协和医学院, 2019(02)
- [7]毒性质粒的丢失促进了宋内氏志贺菌与CD209和CD207之间的相互作用[D]. 毋碧聪. 华中科技大学, 2019(03)
- [8]基于dual RNA-seq识别变形假单胞菌与斜带石斑互作中的关键毒力基因[D]. 罗罡. 集美大学, 2018(01)
- [9]鼠疫菌Ⅲ型分泌系统蛋白YscI-YscF相互作用的研究以及蛋白质分泌组新毒力因子的鉴定[D]. 曹诗洋. 中国人民解放军军事医学科学院, 2017(01)
- [10]假结核耶尔森氏菌中HpaR的调控及其功能研究[D]. 陈珂琪. 西北农林科技大学, 2017(01)