一、Cloning and Sequence Analysis of a Steroid 5a Reductase Gene from Cotton (Gossypium hirsuturm L. ) Fiber（论文文献综述）
李雨珈[1]（2021）在《桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析》文中认为桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding associated virus,MVBa V）是桑树病毒病的主要病原病毒,属于番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）的成员,其S RNA编码的核外壳（nucleocapsid,N）蛋白。筛选、鉴定MVBa V N蛋白互作蛋白,进而研究其互作机制对揭示MVBa V的致病机理具有重要作用。前期研究中我们制备了MVBa V N蛋白多克隆抗体,本研究在检测其灵敏度和特异性的基础上,采用免疫共沉淀筛选N蛋白的互作蛋白,并经双分子荧光互补和酵母双杂交系统对10个候选互作蛋白进行验证,对部分编码互作蛋白的基因进行表达分析。主要研究结果如下:1、通过Western blot验证,表明所制备的抗体能够检测出低至0.50 ng的MVBa V N融合蛋白,在稀释倍数1:1000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。2、以具有典型桑脉带病症状的桑叶为材料提取总蛋白,利用免疫共沉淀联合质谱分析（Co IP-MS）的方法,筛选到与MVBa V N存在相互作用的蛋白有106个,其中包括MVBa V编码的运动蛋白（non-structural movement,NSm）、非结构蛋白（non-structural suppressor,NSs）、核外壳蛋白（nucleocapsid protein,N蛋白）。3、选取类乳胶蛋白423（MLP-like protein 423,MLP-LP423）、结瘤素相关蛋白1（Nodulin-related protein 1,NRP1）、果胶酯酶（Pectinesterase,PECT）、烯醇化酶（Enolase,ENO）、14-3-3蛋白B（14-3-3-like protein B,14-3-3LPB）、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose-bisphosphate aldolase,FBA）、核糖体再循环因子（Ribosome-recycling factor,RRF）、丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxymethyltransferase,SHMT）、腺苷高半胱氨酸水解酶（Adenosylhomocysteinase,SAHH）和丙二烯氧化物合酶（Allene oxide synthase,AOS）共10个候选互作蛋白进行双分子荧光互补试验和酵母双杂交系统验证,结果显示,MLP-LP423、NRP1、PECT、14-3-3LPB、FBA、RRF和SAHH共7个蛋白与病毒N蛋白之间存在互作。4、利用实时荧光定量PCR对14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH基因在健康桑树、病毒病桑树以及不同非生物胁迫和激素处理桑幼苗的表达模式进行检测。桑树受MVBa V侵染后,14-3-3LPB的表达量在根部和茎部中呈上调表达;PECT的表达量在叶部和茎部中呈上调表达,在根部中呈下调表达;RRF的表达量在上部叶片和茎部中呈上调表达;SAHH的表达量在根部及叶部中呈上调表达,在茎部中呈下调表达。PECT在不同非生物胁迫和激素处理下的表达量均呈现下调趋势,14-3-3LPB、RRF和SAHH的变化趋势则各不相同。研究结果为进一步阐明MVBa V的致病机制及其与寄主蛋白之间的互作机制打下一定基础。
叶峥秀[2]（2021）在《棉花纤维发育相关基因GhGRAM31和GhTCP15的克隆和功能分析》文中研究表明棉纤维是单细胞研究的良好材料,解析其动态发育过程中的基因调控网络,发掘关键调控节点基因,才能应用于纤维品质改良。植物中含有GRAM结构域的成员参与生长发育和逆境响应过程,但其在棉纤维发育过程中的生物学功能鲜有报道。已有研究表明TCP转录因子参与调控纤维发育,但其作用机制尚不明晰。本研究主要论述了GhGRAM31和GhTCP15调控棉纤维发育的分子机制,以期为棉花纤维品质改良服务,主要研究结果分述如下:一、GhGRAM31参与调控棉纤维伸长本研究以四个棉种GRAM家族成员的全基因组鉴定为切入点,分析了陆地棉GRAM家族成员在纤维发育阶段的表达模式,并对陆地棉GhGRAM31在棉纤维发育阶段中的生物学功能和其作用机制展开了研究,取得的结果如下:1.在亚洲棉、雷蒙德氏棉、陆地棉和海岛棉四个棉种中总共鉴定到164个GRAM成员,根据聚类分析将这些成员分为两个亚家族。陆地棉GRAM成员在纤维发育阶段的表达模式分为四类,ClusterⅣ成员在纤维发育5-10 DPA纤维中优势表达,它们可能参与调控纤维伸长。其中GhGRAM31与拟南芥At GRE5同源,在10DPA纤维中表达优势最强,因此选择该基因进行后续研究。2.为了研究GhGRAM31在棉纤维中的生物学功能,构建了GhGRAM31干涉载体和超量表达载体并转化棉花。连续多年的重复试验检测发现,干涉株系纤维伸长受阻,成熟纤维显着变短,纤维品质变差,衣分降低,种子变小。而超量表达株系成熟纤维变长。3.为了研究GhGRAM31的表达调控网络,对关键基因的转录水平进行分析发现,GhGRAM31干涉材料纤维中CTL2和Ces A7上调表达,而CHIT3、SLR1和部分纤维发育相关转录因子下调表达,导致纤维发育调控网络紊乱,进而影响纤维发育。4.为了进一步发掘GhGRAM31的互作蛋白,从而了解基因的作用模式,通过酵母双杂交实验（Y2H）鉴定到GhGRAM31的互作蛋白为GhGRAM5和GhGRAM35,并通过pull-down、LCI和Bi FC实验对它们之间的互作关系进行了验证。同样的,发现GhGRAM5可以与GhTTG1互作,GhGRAM35可以与GhHD1和GhHOX1互作。通过双荧光素酶报告基因检测系统实验发现,GhGRAM31和GhGRAM35共表达可以增强GhHD1对下游靶标基因的转录激活作用。这些结果显示GhGRAM31可能通过参与GRAM成员和转录因子间复杂互作模块,来调节纤维发育。本研究提供了棉花GRAM家族成员信息,为纤维品质改良提供了大量候选基因资源。对棉花GhGRAM31抑制表达和超量表达株系的表型分析发现该基因正调控纤维伸长。揭示了GhGRAM31通过参与复杂的蛋白互作网络调控纤维发育的过程。二、GhTCP15调控棉纤维伸长和纤维细胞壁加厚植物特异的TCP转录因子参与植物进化和广泛的生物学过程,其可能位于多种信号通路中的中心调控节点,因此解析TCP转录因子的功能和机制能够丰富植物细胞网络。本研究对陆地棉纤维优势表达基因GhTCP15在棉纤维发育过程中的生物学功能和机制展开了深入研究,主要结果如下:1.克隆到陆地棉GhTCP15基因,其编码Class I TCP类转录因子,其蛋白序列与拟南芥At TCP15最同源。GhTCP15在10 DPA纤维中表达优势最强。为了研究GhTCP15在棉纤维中的生物学功能,构建了纤维优势表达的Gb EXPA2启动子驱动GhTCP15超量表达载体并转化棉花。连续多年的重复试验检测发现,超量表达株系纤维伸长受阻,成熟纤维显着变短,整齐度降低,短纤维指数提高。成熟纤维石蜡切片的统计结果显示,与对照材料相比,GhTCP15超量表达株系的成熟纤维细胞壁厚度显着增加。2.为了研究该基因的调控机制,创制了融合GFP标签的GhTCP15超量表达转基因棉花,并进行ChIP-seq实验。经过分析得到GhTCP15潜在的结合顺式元件,为GTGGGNCC,这与拟南芥ClassⅠTCP识别的核心序列一致,表明TCP转录因子结合序列具有很强的保守性。3.为了研究GhTCP15的表达调控网络,对GhTCP15纤维特异超量表达株系与野生型10 DPA同时期的纤维进行比较转录组学分析,鉴定到830个差异表达基因,这些差异表达基因主要富集在细胞壁和次生壁相关过程。其中139个差异表达基因的启动子上具有GhTCP15潜在的结合顺式元件,这些基因也富集在细胞壁和次生壁相关过程。4.通过ChIP-q PCR、酵母单杂交和LUC实验发现,GhTCP15可以结合到细胞壁松弛基因GhEXPA1的启动子上,发挥促进GhEXPA1转录活性的功能。5.为了进一步发掘GhTCP15的互作蛋白,从而了解基因的作用模式,通过Y2H实验对于GhTCP15的互作蛋白进行了鉴定,鉴定到的互作蛋白中包括ClassⅠ类TCP转录因子GhTCP8和ClassⅡ类TCP转录因子GhTCP4,并通过LCI和Bi FC实验验证GhTCP15与GhTCP8、GhTCP15与GhTCP4之间的相互作用关系。GhTCP15可能与其他ClassⅠ类或ClassⅡ类TCP转录因子互作形成二聚体,协调调控细胞壁相关基因的转录,从而影响纤维伸长和纤维细胞壁加厚。总之,通过ChIP-seq和转录组的结合分析,我们发现GhTCP15可能通过直接影响细胞壁相关基因的表达来调控棉纤维的伸长和细胞壁加厚。此外GhTCP15可能与GhTCP4和GhTCP8等因子相互作用来精细协调棉纤维网络。这些结果表明GhTCP15在纤维发育过程中具有重要功能。
张双意[3]（2021）在《毛果杨PtLIM1基因在调控次生壁合成中的功能解析》文中进行了进一步梳理杨树作为重要的经济树种和模式植物,其木材被广泛应用于人类生产和生活的各个方面,具有重要的经济价值。木材从结构上来说主要是茎的次生木质部组成,木质素和纤维素是其主要的组成成分。理解和研究植物次生壁生物合成的机理,不仅对植物次生发育的基础研究具有重要的科学意义,而且选育符合人类生产和生活所需的林木新品种打下坚实的基础。植物LIM蛋白家族一般含有2个被40～50个氨基酸残基分隔的LIM结构域（Lin-Isl-Mec domain）,其分子结构中具有一个或多个锌指结构。LIM蛋白的主要特点是能在不同发育时期以及不同发育类型的细胞中,通过锌指结构影响蛋白质-蛋白质之间的相互作用,造成结构蛋白、激酶、转录因子等多种蛋白的生物学活性发生变化,植物LIM蛋白可作为木质素生物合成和肌动蛋白转录因子的结合蛋白。因此,研究LIM蛋白对细胞的生长与发育具有重要意义。本论文通过对杨树PtLIM1进行系统进化树分析和组织表达分析,并结合前人的研究报道,推测PtLIM1基因可能参与植物次生壁的形成。并利用组织切片、遗传学、分子生物学等研究手段对其功能进行深入研究,探究PtLIM1表达量变化对木材材性的影响,以期为速生树种木材材性的改良提供分子理论技术支撑。主要研究结果如下:（1）PtLIM1基因的克隆及序列分析从毛果杨木质部中克隆出长度为621 bp的CDS序列,其编码206个氨基酸。编码的蛋白中含有2个锌指蛋白结构域。通过对该基因进行系统进化分析,毛果杨PtLIM1基因与拟南芥At PLIM2b基因亲缘关系较近,主要在成熟的花粉中表达,其次在应拉木中高表达,对次生壁木质素和纤维素的合成发挥作用。（2）PtLIM1的表达特异性分析PtLIM1在木质部中表达量最高,韧皮部表达量次之,在叶片中表达水平较低,在根中不表达。推测其可能参与次生壁的生物合成。次生壁的合成过程比较复杂,受到激素、信号分子、转录分子在时间和空间的协同调控。利用一定浓度赤霉素、生长素、乙烯利、脱落酸、油菜素内酯进行处理,PtLIM1基因的表达量发生不同程度的上调,说明激素可能通过影响基因的表达,进而影响木质素和纤维素的合成。（3）PtLIM1在转基因山新杨中的功能分析构建了35S:PtLIM1的过表达载体,通过农杆菌介导的转化方法转化山新杨叶片。将初步Kan抗性筛选得到的转基因苗提取RNA进行定量PCR鉴定基因表达量的变化,获得转基因的阳性植株。PtLIM1过表达转基因山新杨植株的茎顶端变细,生物量降低。茎组织切片显示,过表达PtLIM1基因导致植株木质部区域变窄,髓心部分变大,其次对木质素和纤维素含量的测定,木质素含量降低,纤维素含量增加。由此可以得出PtLIM1负调控杨树次生壁中木质素的形成,正调控纤维素的形成。对温室生长3个月的PtLIM1过表达转基因植株进行定量PCR检测发现PtLIM1木质素通路关键酶基因的表达水平降低,纤维素合成通路关键酶基因的表达量上调。由此我们可以得出PtLIM1通过调控木质素和纤维素通路关键酶的表达调控次生壁物质的合成。PtLIM1基因的功能验证完善次生壁形成的转录调控网络,为实现精准的人工调控和林木育种工作打下了坚实的基础。
翟云孤[4]（2021）在《甘蓝型油菜BnaTT8基因突变体的创建及功能研究》文中指出油菜是我国重要的油料作物。已有研究表明油菜黄籽较黑籽性状在品质方面具有多方面的优势。但是作为我国主栽的油菜类型,甘蓝型油菜还未发现天然的黄籽突变体。目前生产上的黄籽材料大多通过远缘杂交而来,这种人工合成的方法不仅费时费力,而且获得的黄籽颜色具有较大的变异,不利于黄籽性状的研究。国内外研究者对油菜的黄籽性状开展了大量的遗传和基因定位的相关研究,结果表明黄籽性状遗传十分复杂,至今也没有克隆到相关的基因,这也极大限制了我们对甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子机制的认识。拟南芥和白菜型油菜中的研究表明,TT8是参与黄籽性状形成的重要基因。因此,本研究首次利用CRISPR/Cas9技术对甘蓝型油菜中的Bna TT8基因进行靶向突变,获得黄籽材料;在此基础上,对其参与调控种子中的含油量、蛋白质含量和脂肪酸组分等方面的功能进行了研究,同时利用转录组和代谢组对其参与调控种皮颜色的机理进行了初步解析,研究结果如下:1.根据生物信息学分析和基因克隆,初步确定Bna TT8基因在甘蓝型油菜基因组中存在3个同源拷贝。通过q PCR技术分析Bna TT8基因在甘蓝型油菜J9707不同组织中的表达模式,发现Bna C09.TT8a在这些组织中均未检测到基因的表达,而Bna A09.TT8和Bna C09.TT8b在各组织中均有表达,尤其在种子中特异性高表达;其中Bna A09.TT8拷贝的表达量显着高于Bna C09.TT8b拷贝。对Bna A09.TT8和Bna C09.TT8b在种皮不同发育时期的表达模式进行分析,发现它们的表达从开花7天后开始随着种子的发育呈现出先增加后降低的趋势,且在开花21天后达到峰值。通过进一步分析TT8的蛋白质功能域,确定了Bna TT8基因在甘蓝型油菜J9707基因组中具有2个有功能的拷贝Bna A09.TT8和Bna C09.TT8b。2.设计和构建了BnaTT8基因的CRISPR/Cas9载体。将其转化J9707,获得了420棵T0代植株,对靶点进行测序筛选到48株突变体。对这些突变单株进行两代自交和筛选,获得了9个不含T-DNA插入的纯合突变体单株。其中仅双突表现为黄籽表型,表明这两个拷贝功能冗余。3.利用香草醛和DMACA等化学染色方法对种皮发育过程中的原花色素积累进行了动态分析,发现野生型和单纯合突变体从开花后21天开始出现原花色素积累,并随着种子的发育积累变多;而双纯合突变体中始终未检测到原花色素的积累。4.显微观察发现原花色素只在野生型和单纯合突变体的种皮内皮层中积累。对成熟种子的种皮厚度进行比较分析,发现双突变体和Bna A09.TT8拷贝突变体的种皮厚度比野生型显着降低。5.对T0和T2代的突变体种子中的脂肪酸、油分和蛋白质含量测定分析,发现相对于野生型,双突变体的含油量和蛋白质含量显着增加,脂肪酸组分也发生了显着的变化。田间小区试验结果表明,突变体材料的主要产量相关性状与野生型相比没有发生显着性变化,表明该基因突变体具有较大的应用潜力。对30株T0代突变体进行了26个潜在突变位点的高通量测序检测,均未发现脱靶现象,表明该基因编辑系统具有很好的特异性。6.对纯合双突变体和野生型进行了开花后14天和35天种皮的转录组比较分析,总共筛选到1,298个差异表达基因,其中145个差异表达基因为两个时期所共有。GO功能注释和KEGG富集分析表明,双突变体中的苯丙烷和类黄酮合成代谢过程中的基因较野生型显着下调。对双突变体和野生型的成熟种子进行代谢组比较分析,结果也发现双突变体中类黄酮合成途径的大部分代谢物含量较野生型显着降低。7.对突变体和野生型不同发育时期种子中参与脂肪酸合成和积累的重要转录因子和关键酶进行基因表达检测,发现在14和28 DAF的突变体种子中,Bna FUS3和Bna FAD2的表达量均显着上调,Bna LEC1的表达量在14 DAF的突变体种子中也显着上调。这些结果表明,Bna TT8基因在调控脂肪酸的合成积累方面也具有重要的作用。综上所述,本研究成功创建了甘蓝型油菜Bna TT8基因突变体,证实它在调控籽粒颜色、蛋白质和油分含量以及脂肪酸组分等方面具有重要的功能,并通过转录组和代谢组初步阐明其参与调控种皮中的类黄酮积累、种子脂肪酸的合成等方面的调控机理。本研究为进一步研究该基因的功能及其调控的分子机理奠定了良好的材料基础,也为甘蓝型油菜的黄籽育种提供了优异的种质资源。
范睿深[5]（2021）在《山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析》文中研究说明山桐子是十分重要的木本油料植物,其果实含油率高,亚油酸含量在60%以上具有“树上油库”的美称,在食品、保健品、医药、化工等方面拥有多种用途,具有很高的开发利用价值。选育优良品种,是开发利用山桐子的前提,然而由于缺乏山桐子果实油脂合成相关基因的理论研究及完善的遗传转化体系,严重制约了山桐子这一优良油料树种的良种选育。深入了解山桐子油脂合成相关基因的分子调控机理和功能,对山桐子果实资源的开发具有重要的意义,建立山桐子遗传转化体系有利于利用分子育种技术对山桐子进行遗传改良,还能为其他油料植物基因功能的研究提供借鉴。本研究以山桐子果实为试验材料,分析了不同发育时期山桐子果实的油脂含量及脂肪酸组分的动态变化,对山桐子油脂合成相关基因进行挖掘。在此基础上对油脂合成有关基因成功进行了克隆,从中选出与亚油酸合成有关的基因,通过表达分析验证其基因功能。为了进一步对山桐子进行遗传改良,以叶片为外植体,建立了山桐子遗传转化受体系统,取得以下结果:（1）揭示了山桐子果实不同发育时期油脂含量及脂肪酸组分的动态变化规律。在山桐子果实发育过程中,含油率逐渐增加呈“S”型增长模式,在80～90 DAP（days after pollination）有一个间歇期,在此时期果实颜色发生变化;亚油酸含量在脂肪酸组分中的比例逐渐减小,但其最终值仍在64%以上,在70 DAP和130 DAP时期,果实中的油脂含量,主要脂肪酸组分均差异显着。（2）通过转录组测序发掘油脂合成相关基因。从转录组中发掘出了33个与山桐子油脂合成有关的基因,其中有18个基因在70 DAP和130 DAP的表达量差异显着。其中,Ip ACCase、Ip KAS I、Ip KAS II、Ip SAD、Ip FAD2和Ip FAD3等6个基因是山桐子脂肪酸合成的关键基因;Ip GPAT和Ip DGAT2等2个基因是山桐子TAG合成的关键基因。（3）克隆获得了Ip SAD、Ip FAD2、Ip FAD3、Ip GPAT和Ip DGAT2等5个山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的全长序列。系统进化树结果显示,它们与毛果杨和胡杨的亲缘关系较近。预测蛋白的生物信息学分析推测,这5个功能基因在山桐子油酸、亚油酸及油脂合成过程中发挥着关键作用。（4）对亚油酸合成关键基因Ip FAD2和Ip DGAT2的功能进行了验证。原核表达载体的重组质粒在IPTG的诱导下可以正常表达出与预测蛋白大小基本一致且具有生物活性的蛋白;转化拟南芥表明,转Ip FAD2和转Ip DGAT2分别可以使拟南芥种子的亚油酸和油脂含量增加13.50～29.86%和27.70～39.09%;Ip FAD2和Ip DGAT2的表达量决定了山桐子果实中亚油酸含量及油脂含量。（5）建立了山桐子叶片愈伤组织遗传转化受体系统。愈伤组织诱导最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,诱导率为36.67%;愈伤组织继代最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,愈伤组织增值系数为4.46;不定芽诱导最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,不定芽诱导率为22.22%;不定芽复壮最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+TDZ 0.08 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,增值系数为4.45。抗生素敏感性试验表明,Cef对愈伤组织致死的最大浓度为200 mg/L,Kan对愈伤组织致死的最小浓度为50 mg/L。
姜慧艳[6]（2021）在《MdHOS1响应茉莉酸调控苹果抗冷性的分子机制》文中指出在温带地区,苹果作为经济作物被广泛种植,但其种植仅限于温带地区。低温作为影响植物生长和发育的重要环境因素,并显着限制植物的空间分布和农业生产力。春天,在苹果萌芽期、开花期遭遇寒潮天气可能会影响苹果的产量与品质。与此同时,随着人们生活质量的提高,对苹果果实品质的要求也逐渐变高,果皮的颜色成为决定苹果市场价值的重要性状。花青苷作为影响苹果着色的主要色素且还是一种可以帮助植物抵御外界环境胁迫的次生代谢物,其合成受到多种因素的共同调控。在苯丙氨酸衍生物中,除了花青苷,原花青素也广泛分布于自然界中,对于提高植物抵御外界侵扰的能力具有重要意义。因此,改善苹果的抗冷性和提高花青苷原花青素含量是苹果育种工作中的关键目标性状。植物可以通过应激反应来减弱不利环境条件带来的伤害,其中蛋白酶体起着重要的作用。然而,苹果中蛋白酶体介导的冷信号应激反应的潜在机制仍不完全清楚。为解决此问题,在本研究中,我们分离并克隆出苹果E3-泛素连接酶MdHOS1（High ex pression of osmotically responsive gene1）,通过转基因的方法对其在苹果上的功能进行了鉴定。并通过体内和体外生理生化实验探究了MdHOS1蛋白在苹果抗冷性和次生代谢物合成中发挥作用的分子机理。主要研究结果如下:1.生物信息学分析显示,MdHOS1含有一个保守的RING基序,并与At HOS1具有较高的同源性。通过农杆菌介导的遗传转化获得了MdHOS1过表达（MdHOS1-O X）的‘嘎啦’苹果幼苗。低温处理后,发现过表达MdHOS1的苹果幼苗的耐冷性受到了抑制。q RT-PCR检测表明,冷信号CBF依赖性途径的相关基因的表达水平在转基因株系中呈不同程度的下调趋势。2.高光低温诱导后,发现过表达MdHOS1的苹果幼苗中花青苷和原花青素的合成受到了抑制。此外,将MdHOS1在苹果红肉愈伤组织中过表达,结果发现红肉愈伤组织会变黄,抑制了合成途径中MdLAR、MdANR等结构基因的表达,进而抑制红肉愈伤组织中花青苷和原花青素的积累。3.为了进一步探究MdHOS1抑制苹果中花青苷和原花青素合成的分子机制,利用酵母双杂筛选到一个可以与MdHOS1互作的花青苷正调节因子MdMYB9,并利用pul l-down实验、BIFC实验和Co IP实验进一步证实了MdHOS1蛋白与MdMYB9蛋白之间的相互作用关系。通过体外蛋白降解和泛素化实验揭示了MdHOS1蛋白能够通过泛素/26S蛋白酶体途径促进MdMYB9的蛋白降解。4.用茉莉酸处理野生型苹果幼苗,荧光定量分析和体外蛋白降解实验验证茉莉酸信号抑制MdHOS1在转录水平以及蛋白水平的表达。在MdMYB9转基因王林愈伤组织中过表达MdHOS1,削弱了MdMYB9对花青苷与原花青素合成的促进作用。本研究证明MdHOS1在苹果抗冷性中的功能,并通过酵母筛选发现一个受茉莉酸诱导的MdMYB9转录因子可以与MdHOS1相互作用,通过体外泛素化实验发现MdHOS1可以通过泛素化降解MdMYB9来抑制苹果中花青苷和原花青素的合成。此研究为探索RING finger E3泛素连接酶参与调控植物次生代谢及非生物胁迫响应提供了新的见解。
张明婷[7]（2021）在《铭贤169小麦种子休眠解除的生理变化及分子调控网络研究》文中进行了进一步梳理谷物穗发芽（pre-harvest sprouting,PHS）是指已经生理成熟的谷物种子在田间收获前发芽的现象。穗发芽导致种子活力的下降,降低了产量和品质,不仅造成经济损失,且具有一定的食品安全隐患。穗发芽的影响因素复杂,其中,种质自生的休眠性是关键因素。黄淮麦区是我国小麦的主产区,占全国小麦总面积的40%。铭贤169是黄淮麦区抗条锈病育种中广泛使用的诱发材料,在实践中发现铭贤169具有较强的休眠性。目前,铭贤169小麦的穗发芽抗性未被鉴定,其休眠调控网络未曾研究,非编码RNA和DNA甲基化在植物种子休眠中的作用尚不清楚。本研究以自然条件下生理成熟的铭贤169小麦和小偃22种子为材料,鉴定穗发芽抗性。分析铭贤169小麦种子休眠解除期间种皮和淀粉的结构及胚乳主要成分的变化。利用mRNA、长链非编码RNA（lnc RNA）、小RNA（miRNA）的转录组测序和全基因组DNA甲基化测序手段比较铭贤169发芽种子（GS）和休眠种子（DS）的差异表达谱,分析其调控网络。取得的主要研究结果如下:（1）铭贤169和小偃22的发芽率比较结果表明:小麦种子在脱离母体之后休眠性显着增强。铭贤169种子发育时期的休眠性强于小偃22,且其休眠不是由胚效应导致的,很可能与母体胚乳成分有关。小偃22在收获后40 d解除了休眠,铭贤169直到120 d后才解除了休眠。35℃的储藏高温利于铭贤169种子休眠的解除,4℃的低温不利于种子解除休眠。生理成熟后,脱粒后的种子比整个小穗更易发芽,且70%的相对土壤含水量是破除休眠的最佳湿度环境。（2）休眠解除期间铭贤169淀粉粒和种皮显微结构变化分析表明,A型淀粉粒表面破损加深,淀粉粒与蛋白质之间结合紧密,B型淀粉粒数量增多;休眠解除期间,种子表面细胞排列逐渐松散无规律;种皮横断面的细胞间距增加;栅栏状细胞形态不规则程度加深,表面破损严重。种子主要成分变化分析表明,休眠解除过程中种子吸水率、种子含水量和种胚活力与发芽率成正比,淀粉含量增加,沉降值下降,粗蛋白和面筋含量变化不大;淀粉糊化特性分析表明,解除休眠期间谷值粘度增加,峰值时间增加;淀粉热稳定性增强,淀粉粒径减小;可溶性糖含量下降,淀粉酶活性下降。（3）铭贤169解除休眠的种子和处于休眠种子的mRNA-Seq和lnc RNA-Seq转录组测序共鉴定到1,168,376个mRNA,其中差异表达的mRNA有3,027个,包括上调的114个,下调的2,913个。新筛选条件得到166,138个DE-mRNAs,上调12,658,下调3,480个。通路富集分析显示次生代谢合成,抗坏血酸和醛酸代谢,淀粉和蔗糖代谢是显着富集的途径。鉴定到250,109个lnc RNA,预测到69,335个新的lnc RNA,预测了一个新的nc RNA家族SOX20T＿exon3。差异表达的lnc RNA共有22个,上调表达的2个,下调20个。lnc RNA靶基因的通路富集分析与mRNA的相近。SNP/In Del注释分析发现T—C和A—G是最易发生突变的类型,且休眠种子的突变率高于非休眠的种子。Q-PCR验证试验随机选取28个DE-mRNA进行分析,结果有26个基因与转录组的测序结果的表达趋势一致,说明测序结果可靠。（4）miRNA-Seq测序共鉴定到66,570条已存在的miRNA,预测二级结构得到新的miRNA为902个。miRNA碱基编辑情况比例为0.91%。共发掘1,516个miRNA差异表达,其中上调有883个,下调有633个。预测到122,501个靶基因,富集通路结果显示β-葡聚糖代谢和组蛋白泛素化是显着途径。选取9个miRNA进行定量PCR验证,7个miRNA的表达量结果与测序结果一致。（5）平均甲基化水平分析表明,CG类型的位点甲基化率最高,其次是CHG和CHH。染色体的着丝粒区域m CG和m CHG甲基化富集明显。共筛选到差异甲基化位点4,259,934个,其中上调的差异位点占多数,共鉴定到439个C背景差异甲基化区域（439为上调,40为下调）,9,275个CG背景的差异甲基化区域,8,120个CHG差异甲基化区域和77,229个CHH差异甲基化区域。富集分析表明,苯丙醇的生物合成、糖酵解/葡萄糖生成、淀粉和蔗糖的代谢是值得关注的途径。（6）综合mRNA、lncRNA、miRNA和DNA甲基化对特定通路的调控分析表明,lnc RNA,miRNA和DMR在铭贤169休眠调控相关的途径中发挥了重要作用。在植物激素含量测定中,DS中ABA和JA显着增加,GS中GA19和JA-ILE增加。抗坏血酸过氧化物酶（APX）、β-D-葡萄糖苷酶（BGLU）的酶和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性以及谷胱甘肽和蔗糖的物质含量在GS中显着高于DS。综上,本研究结果明确了铭贤169小麦的穗发芽抗性和母体成分相关,并发现胚乳成分对种子休眠具有重要作用,分析了休眠解除期间种子结构和胚乳主要成分的变化。发现植物激素生物合成和信号转导（包括ABA、GA、BR和ETH）抗坏血酸和谷胱甘肽代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径可能是铭贤169休眠的原因,其中非编码RNA和DNA甲基化在转录调控中发挥了关键作用。本研究结果为进一步明晰休眠解除机制及小麦穗发芽调控网络奠定了基础,也对抗穗发芽种质创新和品种培育有参考价值。
韩锐[8]（2020）在《白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究》文中提出植物T-DNA插入突变体是遗传学研究中珍贵的实验材料。白桦（Betula platyphylla Suk.）的全基因组测序已经完成,为开展白桦T-DNA插入突变体的研究及后续的基因鉴定提供了可能。本研究以白桦T-DNA插入突变体br为研究对象,鉴定其突变性状,分离T-DNA插入位点的侧翼序列,确定突变基因,并开展突变基因功能的研究。研究结果如下:（1）以白桦br突变体为试材,以野生型白桦WT为对照,以转BpCCR1过表达白桦OE2为转基因对照,从生长特性、株型特征、光合能力、感病能力和内源激素含量等方面展开研究。生长特性及株型观察结果显示,br株系树高、地径显着低于2个对照株系,但表现出侧枝细,二级侧枝多,节间距小,分枝角小的株型特征。相对叶绿素含量、光合参数及叶绿素荧光参数分析显示,与对照株系相比,br的相对叶绿素含量低,非光化学猝灭系数小,但气孔导度和蒸腾速率大。感病性分析显示,br株系比对照株系更易感链格孢菌（Alternaria alternata）。内源激素含量测定结果显示,br主枝茎尖与侧枝茎尖中IAA和Zeatin激素含量相近,但细胞分裂素与生长素含量的比值较大。同时,br侧枝茎尖中茉莉酸含量低,水杨酸含量高。（2）对WT、OE2和br主枝茎尖和侧枝茎尖进行转录组测序,结果表明,与WT和OE2相比,br主枝茎尖中的差异基因有406条,包括149条上调表达基因和257条下调表达基因;br侧枝茎尖中的差异基因有396条,包括125条上调表达基因和271条下调表达基因。这些差异基因影响了花发育、植物育性、植物生长发育、器官形态建成、顶端分生区活性、激素的生物合成和信号转导等生物学进程。（3）以br突变体为试材,采用TAIL-PCR、基因组二代和三代重测序技术鉴定T-DNA插入位点,结果发现br基因组中存在2个T-DNA插入位点,其中,一个位点位于Chr 5（1729009～1729377 bp）上,引起369 bp不纯合缺失,缺失区域包含了BpCOI1（Bpev01.c0817.g0010.m0001）基因的122 bp 5’UTR和 247 by第一段外显子序列。qRT-PCR结果显示,br中BpCOI1基因表达量显着低于WT和OE2,且br突变体对外源MeJA应答能力降低。（4）通过农杆菌介导法将BpCOI1启动子融合GUS的表达载体转入到白桦合子胚中,共得到4个ProBpCOI1::GUS转基因株系。GUS染色和GUS基因表达量分析显示,在转基因白桦的根、茎、叶和芽中均能检测到BpCOI1转录活性,且GUS基因在茎和芽中表达量较高。跟据BpCOI1启动子序列上顺式作用元件预测结果,对ProBpCOI1::GUS转基因株系进行IAA、ABA、GA、SA、MeJA、ET和光周期处理,GUS活性和GUS基因表达量分析显示,BpCOI1启动子对上述激素均有不同程度的应答,且对MeJA的响应最为明显;不同光周期也会影响BpCOI1启动子活性,其中,长光照促进BpCOI1启动子活性,短光照抑制其活性。（5）BpCOI1定位在细胞核上。与基因组序列相比,白桦中BpCOI1基因第150位碱基发生同义突变。对白桦、拟南芥、水稻和毛果杨中的COI1蛋白进行多序列比对,发现不同物种的COI1序列1～40位氨基酸不保守,这段序列包含了部分F-box结构域;酵母双杂交和双分子荧光互补实验显示这种序列不保守性并未影响BpCOI1蛋白与SKP1家族蛋白的相互作用。（6）采用农杆菌介导法获得8个35S::BpCOI1过表达白桦株系;采用RNAi技术干扰了 2个片段,分别位于BpCOI1的第三段外显子上和第一段外显子上（包含了突变体中部分缺失的序列）,各获得了 5个35S-BpCOI1-RNAi抑制表达株系。生长性状观察结果显示,1年生和2年生转基因株系的树高、地径和侧枝数与野生型白桦相比无明显差别。MeJA诱导实验表明高浓度MeJA抑制了野生型和BpCOI1过表达株系的根生长,但对抑制表达株系的根生长抑制作用不明显。感病性分析显示,链格孢菌侵染7d后,BpCOI1抑制表达株系感病率在83.33%以上,病害指数在10.51%～22.95%之间,而BpCOI1过表达及野生型白桦的叶片均未出现病斑。qRT-PCR结果显示,链格孢菌侵染后,与野生型白桦相比,过表达株系中BpCOI1和BpMYC2表达量均上调,而抑制表达株系中BpCOI1和BpMYC2不上调或上调不明显。（7）对野生型白桦及转BpCOI1基因过表达和抑制表达白桦及进行转录组测序,发现与野生型白桦相比,BpCOI1过表达株系中有1385条基因上调表达,1137条下调表达;抑制表达株系中有1446条基因上调表达,921条下调表达。在抑制表达株系中,多数参与萜类化合物和次生代谢产物合成的基因、4条参与JA信号转导的基因下调表达;6条参与SA信号转导的基因、多数参与调控植物与病原菌相互作用和植物衰老进程的基因、WRKY类的基因均上调表达。此外,参与其他植物激素的生物合成及转导、调控植物防御、激素响应、逆境响应、细菌和真菌响应的基因在BpCOI1转基因株系中也差异表达。综上所述,本研究对易感病、多分枝、矮化等多性状变异的T-DNA插入突变体br进行鉴定,确定了突变体中T-DNA插入位点,分离了突变基因,并对突变基因BpCOI1的启动子和基因功能展开研究。研究结果证明,COI1蛋白在JA信号感知方面至关重要,BpCOI1基因低量表达可以导致白桦对JAs信号不敏感,且易感病,研究结果可为白桦抗病性育种提供参考。
张文婷[9]（2020）在《玉米ZmCYP72A5基因的功能研究》文中研究指明细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）是一类古老的血红素硫蛋白的超家族基因,广泛存在于动植物、细菌、真菌等物种的细胞内,参与了生物生长发育过程中多种物质的合成与代谢。研究表明CYP450氧化酶家族基因在植物的抗虫、抗除草剂等抗性方面具有重要的调控作用,但在玉米（Zea mays L.）发育调控中的作用并不清楚。本研究通过基因编辑技术造成玉米ZmCYP72A5基因的缺失进而研究其在玉米生长发育中的功能。主要结果如下:玉米ZmCYP72A5基因位于3号染色体上,基因全长1853 bp,其中编码区1581 bp,共编码526个氨基酸。结构域分析结果显示,ZmCYP72A5在N端含有一个跨膜结构域和一个高度保守的P450超家族结构域,包含的氧结合活性区、PERF区和亚铁血红素结合区三个区域为P450超家族特有的功能结构域。进化树分析发现,玉米CYP72A5与其它植物的CYP72A同源蛋白有不同程度上的亲缘关系,与单子叶植物的CYP72A同源性较高,且与高粱CYP72A15的亲缘关系最近,与双子叶植物的亲缘关系较远。ZmCYP72A5蛋白在玉米原生质体中的亚细胞定位结果显示,该蛋白定位于内质网膜上。qRT-PCR结果表明,ZmCYP72A5在各个组织和器官中有不同程度的表达,但在幼根和叶中表达水平较高,尤其是授粉后的叶片中表达量高,其他部位的表达量则很低。为了研究ZmCYP72A5基因在玉米中的生物学功能,我们构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体,以玉米自交系Q319为受体材料,进行农杆菌介导的玉米遗传转化实验并获得该基因被编辑的转基因株系（ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9）。结果表明,与对照相比,ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9转基因植株株高变矮,平均株高降低约10 cm,雌穗穗位高度相应随之降低,但植株总的节间数并没有发生变化。解剖学观察结果表明,ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9植株的第9至11节间和节间细胞长度较对照明显缩短。ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9植株的抽穗时间与对照相比延迟2-5天。同时观察并统计从播种至作物完熟时的生育期,该基因敲除的株系的生育期明显比对照株系延长。两种材料前期叶绿素含量差异不明显,授粉20天后差异开始显着。与野生型相比,ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9植株叶片持绿时间较长。转基因株系的光合速率比对照株系低,在同一时期,转基因株系的叶片衰老标志基因ZmSEE1的表达量比对照株系中的低。总之,敲除了ZmCYP72A5基因的转基因株系持绿时间延长,叶片衰老缓慢,生育期增加。为了检测敲除转基因株系的产量是否受影响,我们对各转基因株系授粉后不同时间的种子的百粒鲜重以及收获后的干种子百粒重进行统计比较。结果显示,前期阶段种子中干物质的积累量相对于对照株系积累速度较慢,但由于其生育期的延长,最终弥补了前期干物质的积累缓慢,所以最终的百粒重没有因此而减少,维持住了产量。综上所述,对ZmCYP72A5缺失表达的转基因植株分析表明,该基因参与了玉米发育相关的调控,转基因植株株高变矮、生长缓慢、生育期延长,但产量不变。而且转基因植株所表现出的性状对于利用转基因手段培育玉米高产品系具有较高的应用价值。
王晓阳[10]（2020）在《亚洲棉短绒的遗传研究和候选基因鉴定》文中研究说明棉花纤维根据其长度可以分为长绒（Lint）和短绒（Fuzz）。目前对棉花纤维的研究主要集中在长绒的发育方面,而对短绒发育的研究鲜有报道。二倍体亚洲棉是研究纤维发育的理想模式棉种。开展亚洲棉光籽（无短绒,Fuzzless）种质的遗传多样性研究,对理解棉花纤维发育机制具有重要的理论意义和育种价值。本研究以215份亚洲棉自然群体以及其中的一个无短绒突变体（GA0149）及其野生型（GA0146）为材料,利用传统遗传学、全基因组关联分析（genome-wide association studies,GWAS）及分子生物学等方法,鉴定到控制短绒发育性状的候选基因Ga FZ,并详细地研究了Ga FZ的作用机制。具体结果如下:（1）亚洲棉光籽（无短绒）性状的遗传学分析利用55份亚洲棉（Gossypium arboreum）短绒突变体材料作为母本与同一父本材料石系亚1号分别进行杂交,获得55个F1群体,并进行光籽性状显隐性遗传分析,然后选择其中15个F1进行自交,获得相应F2群体并进一步分析光籽性状的分离规律。结果表明,37.5%的光籽材料呈显性遗传,62.5%的光籽材料为隐性遗传;GA0149和横峰铁籽材料光籽性状受显性单基因控制,常紫1号光籽性状受隐性单基因控制,大部分材料的光籽性状均由两对基因控制,并且存在基因互作和显性上位效应,其中8份材料控制光籽性状的基因具有显性抑制作用,4份材料控制光籽性状的基因具有互补效应。数量性状间的相关性分析表明光籽性状与叶茸毛呈显着负相关,部分组合光籽与衣分呈负相关性,在一些杂交组合中光籽性状与叶面积呈正相关,与棉酚数呈负相关。（2）亚洲棉种子短绒和叶茸毛性状的GWAS分析本研究调查了215份亚洲棉自然群体的光籽和叶茸毛性状,利用群体的SNP、插入/缺失标记（Insertions and Deletions,In Dels）和拷贝数变异（Copy Number Variation,CNV）标记进行全基因组关联分析（GWAS）。结果鉴定到19个与叶茸毛显着关联的SNP位点、39个与种子短绒性状显着关联的SNP位点、一个同时与叶茸毛和短绒性状显着关联的大片段的缺失(lar INDELFZ)。其中lar INDELFZ与SNP关联的最高位点(SNPFZ)重合,均位于Chr8号染色体末端约600kb的GWAS区间,说明该区间与光籽性状和叶茸毛性状密切关联。该区间共包含8个基因,与短绒性状相关联的强信号SNPFZ(-log10P=18.95,Chr08:862,509 bp)位于一个编码凯氏带膜蛋白（CASP）基因（Ga08G0117）的内含子中,而lar INDELFZ(-log10P=33.60,Chr08:～885,000 bp)则位于一个未知基因Ga08G0121（命名为:Ga FZ）的上游区域,两者距离～17Kb,群体分型结果表明lar INDELFZ标记更可能显着与叶茸毛和短绒性状相关。（3）lar INDELFZ插入片段的序列特征及其与性状的连锁关系为了明确插入片段的精确位置,在Chr8染色体的～880 kb至～903 kb区间设计了19对连续的重叠引物,以短绒突变体GA0149(包含lar INDELFZ)及其野生型GA0146(不含lar INDELFZ)基因组DNA为模板分别进行扩增,发现仅有SV6号引物扩增片段存在差异。随后分析发现GA0149基因组上存在一段约为6.2 kb片段的插入,并且该序列可能是由附近重复序列扩增引起。为了进一步验证该片段与性状的连锁关系,利用GA0146和GA0149配制F2分离群体,通过PCR鉴定F2子代的插入片段有无,结合相应的光籽和叶茸毛性状,结果显示纯合光籽（无短绒）:杂合光籽（无短绒）:纯合毛籽（有短绒）的比例为1:2:1（卡方检验,P=0.192）,表明GA0149的光籽性状为典型的显性单基因控制。而该插入片段与GA0149光籽性状紧密连锁。同时具有长片段插入的材料叶茸毛数显着少于没有长片段插入材料的叶茸毛数（P<0.0001）,说明lar INDELFZ片段与两个性状均密切连锁。（4）lar INDELFZ调控Ga FZ基因表达分析为了进一步明确控制GA0149短绒发育的候选基因,通过转录组和RT-PCR分析发现,与GA0146相比,Ga08G0121（Ga FZ）在GA0149短绒起始期（+3 DPA至+5 DPA）特异高表达,而候选区间其他7个基因均不存在显着差异。表明Ga FZ可能是调控短绒发育的关键基因。同时发现在GA0146和GA0149之间,除lar INDELFZ以外,Ga FZ基因区间及其侧翼序列上还存在另外4个序列变异。Ga FZ基因上游启动子活性分析和不同长度的lar INDELFZ插入片段荧光素酶活性分析实验证明,lar INDELFZ的插入可能是造成Ga FZ基因在突变体材料GA0149高表达的原因。顺式作用元件分析证明lar INDELFZ可能作为一个远端增强子来调控光籽基因Ga FZ的表达。（5）Ga FZ转基因植株表型调查分析Ga FZ是一个仅含有单个外显子而没有内含子且没有功能注释的基因。亚细胞定位结果显示Ga FZ在细胞核和细胞膜上均有表达,说明该蛋白可能是穿梭蛋白。构建Ga FZ超表达载体并转化拟南芥和棉花,表型调查结果显示转基因拟南芥叶茸毛的发育受到了显着抑制;同时转基因棉花株系的茎毛、叶茸毛和短绒的发育均受到了不同程度的抑制。因此,我们推测Ga FZ负调控叶茸毛和短绒的发育。（6）Ga FZ与MBW-GL2（R2R3-MYB/b HLH/WD40-GL2）系统及下游超长链脂肪酸延伸（very-long-chain fatty acid elongation,VLCFAE）途径相关基因调控关系分析对GA0149和GA0146两个材料4个纤维发育时期（0 DPA、+3 DPA、+5 DPA、+8 DPA）的胚珠和纤维组织进行转录组测序分析发现,MBW-GL2系统的亚洲棉同源基因Ga WER、Ga HOX1、Ga HOX2、Ga HOX3、Ga DEL65和Ga WD40在两个材料中表达差异均不显着。另外,拟南芥同源基因At GL1、At GL3和At TTG1的m RNA转录水平在拟南芥野生型和Ga FZ超量表达株系之间差异也不显着。此外,酵母双杂交实验表明Ga FZ与MBW-GL2系统在蛋白水平上均不存在互作。GUS酶活和荧光素酶实验进一步证明,Ga FZ也不影响Ga GL2的表达。以上结果说明,在亚洲棉中,Ga FZ可能独立于MBW-GL2系统调控叶茸毛和短绒的发育。进一步分析棉花和拟南芥转录组结果发现,参与超长链脂肪酸延伸途径（ko00062）中的关键基因3-酮脂酰-Co A合成酶（3-ketoacyl-Co A synthase,KCS）基因及蜡质、角质和软木质合成途径（ko00500）的基因在短绒突变体GA0149和Ga FZ超量表达株系中表达量显着降低。说明Ga FZ可能直接抑制了下游VLCFAE途径,进而降低角质层、软木质和蜡质的含量,负调控亚洲棉叶茸毛和短绒的发育。
二、Cloning and Sequence Analysis of a Steroid 5a Reductase Gene from Cotton (Gossypium hirsuturm L. ) Fiber（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloning and Sequence Analysis of a Steroid 5a Reductase Gene from Cotton (Gossypium hirsuturm L. ) Fiber（论文提纲范文）
（1）桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 桑脉带相关病毒 |
| 1.2 正番茄斑萎病毒属核外壳蛋白的功能及其互作蛋白 |
| 1.3 植物相关蛋白及其功能 |
| 1.3.1 乳胶蛋白 |
| 1.3.2 结瘤素相关蛋白1 |
| 1.3.3 果胶酯酶 |
| 1.3.4 烯醇化酶 |
| 1.3.5 14-3-3 蛋白 |
| 1.3.6 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 |
| 1.3.7 核糖体再循环因子 |
| 1.3.8 丝氨酸羟甲基转移酶 |
| 1.3.9 腺苷高半胱氨酸水解酶 |
| 1.3.10 丙二烯氧化物合酶 |
| 1.4 植物激素及其在植物病毒与寄主互作中的作用 |
| 1.5 病毒与寄主蛋白互作研究技术 |
| 1.5.1 免疫共沉淀技术 |
| 1.5.2 双分子荧光互补技术 |
| 1.5.3 酵母双杂交系统 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种与质粒来源 |
| 2.1.3 酶及试剂 |
| 2.1.4 所用仪器 |
| 2.1.5 实验相关引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物材料的种植与管理 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 RNA的反转录 |
| 2.2.4 PCR反应体系与条件 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 产物纯化与回收 |
| 2.2.7 目的片段与载体连接 |
| 2.2.8 化学转化 |
| 2.2.9 大肠杆菌质粒小量提取 |
| 2.2.10 限制性内切酶切割DNA片段 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.12.1 提取桑的非变性蛋白 |
| 2.2.12.2 Co-IP |
| 2.2.13 蛋白质的质谱鉴定 |
| 2.2.14 电转化农杆菌感受态制备及转化 |
| 2.2.14.1 制备感受态 |
| 2.2.14.2 转化 |
| 2.2.14.3 农杆菌侵染烟草 |
| 2.2.15 转化酵母NMY51 |
| 2.2.16 相对荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MVBaV N多克隆抗体的灵敏度和特异性检测 |
| 3.2 Co-IP联合质谱分析 |
| 3.3 候选蛋白基因ORF的扩增及序列分析 |
| 3.3.1 候选蛋白基因ORF的扩增 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.4 MVBaV N蛋白候选互作蛋白的验证 |
| 3.4.1 双分子荧光互补实验验证 |
| 3.4.1.1 双分子荧光表达载体的构建 |
| 3.4.1.2 共注射烟草显微观察N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.4.2 酵母双杂验证MVBaV N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.4.2.1 猎物质粒的构建 |
| 3.4.2.2 酵母双杂交实验验证N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.5 互作蛋白基因的表达分析 |
| 3.5.1 生物胁迫下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.1.1 MVBaV对14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.1.2 MVBaV对 PECT的表达影响 |
| 3.5.1.3 MVBaV对 RRF的表达影响 |
| 3.5.1.4 MVBaV对 SAHH的表达影响 |
| 3.5.2 幼苗不同组织14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.3 外源激素处理下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.3.1 外源激素对14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.3.2 外源激素对PECT的表达影响 |
| 3.5.3.3 外源激素对RRF的表达影响 |
| 3.5.3.4 外源激素对SAHH的表达影响 |
| 3.5.4 非生物胁迫下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.4.1 非生物胁迫下14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.4.2 非生物胁迫下PECT的表达影响 |
| 3.5.4.3 非生物胁迫下RRF的表达影响 |
| 3.5.4.4 非生物胁迫下SAHH的表达影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MVBaV N蛋白的互作蛋白 |
| 4.1.1 与MVBaV N蛋白互作的病毒蛋白 |
| 4.1.2 与MVBaV N蛋白互作的寄主蛋白 |
| 4.1.2.1 MLP类蛋白 |
| 4.1.2.2 NRP1 蛋白 |
| 4.1.2.3 果胶酯酶 |
| 4.1.2.4 14-3-3LPB蛋白 |
| 4.1.2.5 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 |
| 4.1.2.6 核糖体再循环因子 |
| 4.1.2.7 腺苷高半胱氨酸水解酶 |
| 4.2 互作基因的表达模式 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 蛋白质的质谱鉴定方法与步骤 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）棉花纤维发育相关基因GhGRAM31和GhTCP15的克隆和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花纤维发育概述 |
| 1.1.1 棉花概述 |
| 1.1.2 棉花纤维发育 |
| 1.2 棉花纤维发育机理研究进展 |
| 1.2.1 激素对纤维发育的影响 |
| 1.2.2 功能基因对纤维发育的影响 |
| 1.2.3 转录因子对纤维发育的影响 |
| 1.2.3.1 MYB类转录因子 |
| 1.2.3.2 HD类转录因子 |
| 1.2.3.3 bHLH类转录因子 |
| 1.2.3.4 其他类型转录因子 |
| 1.3 GRAM家族基因研究进展 |
| 1.4 TCP家族基因研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 棉花GhGRAM31 基因的克隆和功能分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 植物材料 |
| 2.1.1.2 载体和菌株 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 棉花GRAM基因家族鉴定 |
| 2.1.2.2 系统进化树、序列特性及结构、组织表达分析 |
| 2.1.2.3 GhGRAM31 基因的克隆 |
| 2.1.2.4 GhGRAM31 超量表达和干涉载体的构建 |
| 2.1.2.5 DNA提取和Southern blotting |
| 2.1.2.6 RNA提取和表达量检测 |
| 2.1.2.7 棉花总蛋白提取和Western blotting检测 |
| 2.1.2.8 扫描电镜观察纤维突起 |
| 2.1.2.9 纤维长度和品质的测量 |
| 2.1.2.10 亚细胞定位 |
| 2.1.2.11 酵母双杂交(Y2H) |
| 2.1.2.12 原核表达和pull-down实验 |
| 2.1.2.13 双分子荧光互补实验(BiFC)和荧光素酶互补成像分析实验(LCI) |
| 2.1.2.14 棉花原生质体分离和双荧光素酶报告基因检测系统实验 |
| 2.2 结果和分析 |
| 2.2.1 四个棉种GRAM家族的鉴定 |
| 2.2.2 四个棉种GRAM家族的进化和结构分析 |
| 2.2.3 陆地棉GRAM家族的组织表达模式 |
| 2.2.4 陆地棉GhGRAM31 基因的表达分析和亚细胞定位 |
| 2.2.5 GhGRAM31 干涉棉花株系的获得 |
| 2.2.6 GhGRAM31 干涉棉花株系表型的鉴定 |
| 2.2.7 GhGRAM31 干涉棉花株系纤维中差异表达基因分析 |
| 2.2.8 GhGRAM31 超量表达棉花株系纤维表型的鉴定 |
| 2.2.9 GhGRAM31 互作蛋白的筛选 |
| 2.2.10 GhGRAM5和GhGRAM35 互作蛋白鉴定 |
| 2.2.11 GhGRAM31和GhGRAM35 促进GhHD1 的转录活性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 陆地棉GRAM基因家族的鉴定和分析 |
| 2.3.2 陆地棉GhGRAM31 影响纤维发育 |
| 2.3.3 陆地棉GhGRAM31 参与复杂调控网络 |
| 第三章 棉花GhTCP15 基因的克隆和功能分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 植物材料 |
| 3.1.1.2 载体和菌株 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 GhTCP15 超量表达载体的构建 |
| 3.1.2.2 DNA提取和Southern blotting |
| 3.1.2.3 RNA提取和表达量检测 |
| 3.1.2.4 棉花总蛋白提取和Western blotting检测 |
| 3.1.2.5 纤维长度和品质的测量 |
| 3.1.2.6 石蜡切片 |
| 3.1.2.7 亚细胞定位 |
| 3.1.2.8 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 3.1.2.9 双荧光素酶报告基因检测系统实验 |
| 3.1.2.10 酵母单杂交(Y1H) |
| 3.1.2.11 酵母双杂交(Y2H) |
| 3.1.2.12 双分子荧光互补实验和荧光素酶互补成像分析实验 |
| 3.2 结果和分析 |
| 3.2.1 陆地棉GhTCP15 基因序列和结构分析 |
| 3.2.2 陆地棉GhTCP15 基因的表达分析和亚细胞定位 |
| 3.2.3 GhTCP15 纤维特异超量表达材料的获得 |
| 3.2.4 GhTCP15 超量表达株系表型鉴定 |
| 3.2.5 ChIP-Seq鉴定GhTCP15 结合的基因 |
| 3.2.6 ChIP-qPCR验证ChIP-Seq结果 |
| 3.2.7 RNA-Seq检测GhTCP15 调控的基因 |
| 3.2.8 GhTCP15 靶基因的鉴定 |
| 3.2.9 GhTCP15 通过细胞壁相关基因调控纤维发育 |
| 3.2.10 GhTCP15 互作蛋白的筛选 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 棉花中TCP基因家族的分析 |
| 3.3.2 陆地棉GhTCP15 影响细胞壁合成 |
| 3.3.3 陆地棉GhTCP15 在纤维发育过程中存在复杂的调控机制 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间参与发表和已发表的论文 |
| 致谢 |
（3）毛果杨PtLIM1基因在调控次生壁合成中的功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 木材形成的发育过程 |
| 1.2 细胞壁的组成 |
| 1.2.1 木质素的合成 |
| 1.2.2 纤维素的合成 |
| 1.2.3 木聚糖的合成 |
| 1.3 参与次生壁合成的转录因子的调控模式 |
| 1.3.1 NAC类转录因子 |
| 1.3.2 MYB类转录因子 |
| 1.4 激素对次生壁合成调控的影响 |
| 1.5 LIM类转录因子 |
| 1.6 本课题研究内容与意义 |
| 1.7 技术路线图 |
| 第2章 PtLIM1基因的序列分析 |
| 2.1 生物信息学分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 系统进化树的构建步骤 |
| 2.2.2 氨基酸序列比对 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 杨树PtLIM1基因的克隆分析 |
| 2.3.2 PtLIM1基因的序列分析 |
| 2.3.2.1 PtLIM1基因的系统进化分析 |
| 2.3.2.2 PtLIM1基因的氨基酸序列比对分析 |
| 第3章 PtLIM1基因的表达模式分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料与生长条件 |
| 3.1.2 试剂及试剂盒 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 数据分析方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 模板RNA的提取 |
| 3.2.2 模板cDNA的制备 |
| 3.2.3 引物设计 |
| 3.2.4 荧光定量PCR |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 组织表达模式分析 |
| 3.3.2 响应模式分析 |
| 第4章 毛果杨PtLIM1在调控次生壁合成中的功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌种与质粒 |
| 4.1.3 试剂及试剂盒 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PtLIM1基因表达载体的构建 |
| 4.2.1.1 模板cDNA的制备 |
| 4.2.1.2 引物设计 |
| 4.2.1.3 目的片段PCR扩增 |
| 4.2.1.4 PPZP211 载体酶切 |
| 4.2.1.5 目的片段与载体片段连接 |
| 4.2.1.6 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 4.2.1.7 PCR阳性克隆菌的质粒提取与鉴定 |
| 4.2.2 农杆菌感受态细胞的制备和转化 |
| 4.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 4.2.2.2 冻融法转化农杆菌 |
| 4.2.3 酵母表达载体的构建和转化 |
| 4.2.3.1 酵母感受态细胞的制作 |
| 4.2.3.2 酵母感受态细胞的转化 |
| 4.2.3.3 酵母自激活活性的验证 |
| 4.2.4 农杆菌介导的毛果杨遗传转化 |
| 4.2.5 拟南芥的培育 |
| 4.2.6 农杆菌介导的拟南芥遗传转化 |
| 4.2.7 初步的表型分析 |
| 4.2.8 纤维素、木质素含量的测定 |
| 4.2.8.1 多糖样品的制备 |
| 4.2.8.2 木质素含量的测定 |
| 4.2.8.3 纤维素含量的测定 |
| 4.2.9 石蜡切片观察 |
| 4.2.10 扫描电镜样品的制作与观察 |
| 4.2.11 荧光染色样品的制作与观察 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 杨树PtLIM1基因的转录活性分析 |
| 4.3.2 转基因植株定量鉴定 |
| 4.3.3 转基因植株生长特征分析 |
| 4.3.4 转基因植株切片分析 |
| 4.3.5 转基因山新杨木质素、纤维素含量分析 |
| 4.3.6 转基因拟南芥木质素、纤维素含量分析 |
| 4.3.7 转基因杨树木质素合成通路关键酶基因分析 |
| 4.3.8 转基因杨树纤维素合成通路关键酶基因分析 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）甘蓝型油菜BnaTT8基因突变体的创建及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 黄籽性状的研究进展 |
| 1.1.1 拟南芥中黄籽性状的研究进展 |
| 1.1.1.1 拟南芥中黄籽性状的形成 |
| 1.1.1.2 拟南芥中黄籽突变体的研究 |
| 1.1.1.3 拟南芥中类黄酮合成研究 |
| 1.1.2 油菜中黄籽性状的研究进展 |
| 1.1.2.1 油菜黄籽性状的遗传模式 |
| 1.1.2.2 油菜黄籽性状的定位研究 |
| 1.1.2.3 甘蓝型油菜中的TT同源基因的研究 |
| 1.2 基因编辑技术的研究进展 |
| 1.2.1 基因编辑技术的发展 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas基因编辑技术系统的发展 |
| 1.2.3 基因编辑技术在植物中的应用 |
| 1.2.3.1 基因编辑技术在作物改良中的应用 |
| 1.2.3.2 基因编辑技术在作物育种中的应用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas9载体的构建 |
| 2.2.2 农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化 |
| 2.2.3 转基因植株的阳性检测 |
| 2.2.4 非变性PAGE胶检测转基因植株的编辑 |
| 2.2.5 编辑单株的突变基因型测序 |
| 2.2.5.1 PCR产物测序确定突变基因型 |
| 2.2.5.2 HI-TOM高通量测序确定编辑单株的突变基因型 |
| 2.2.6 种皮厚度的测量 |
| 2.2.7 石蜡切片的制备和细胞学观察 |
| 2.2.8 RNA样的采集与提取 |
| 2.2.9 反转录 |
| 2.2.10 表达分析 |
| 2.2.11 原花色素的香草醛和DMACA检测 |
| 2.2.12 气相色谱法测定甘蓝型油菜种子脂肪酸组成 |
| 2.2.13 NIRS法测定甘蓝型油菜种子含油量 |
| 2.2.14 脱靶检测 |
| 2.2.15 RNA-seq数据处理 |
| 2.2.15.1 原始数据的过滤 |
| 2.2.15.2 Reads的比对及DEGs 的筛选 |
| 2.2.15.3 差异基因GO功能分析和KEGG通路分析 |
| 2.2.15.4 qRT-PCR验证 |
| 2.2.16 代谢产物提取 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 BnaTT8基因克隆及序列分析 |
| 3.2 BnaTT8基因表达分析 |
| 3.3 BnaTT8靶基因的CRISPR/Cas9载体构建 |
| 3.4 编辑载体的遗传转化与再生植株的检测 |
| 3.4.1 编辑载体的遗传转化与再生植株的阳性鉴定 |
| 3.4.2 阳性植株的编辑鉴定与突变体的遗传分析 |
| 3.4.3 突变类型统计 |
| 3.5 BnaTT8突变导致内种皮PA积累缺失 |
| 3.5.1 BnaTT8基因的突变体的籽粒颜色变化 |
| 3.5.2 化学染色观察突变体对种皮发育过程中PA积累的影响 |
| 3.5.3 突变体对PA积累和种皮厚度影响的显微观察 |
| 3.6 BnaTT8突变对种子品质和产量性状的影响 |
| 3.6.1 BnaTT8突变对种子含油量和蛋白质含量的影响 |
| 3.6.2 BnaTT8突变对种子脂肪酸含量的影响 |
| 3.6.3 BnaTT8突变对产量相关性状的影响 |
| 3.7 T_0代编辑单株的脱靶分析检测 |
| 3.8 BnaTT8突变体和野生型种皮的转录组比较分析 |
| 3.8.1 RNA-seq数据分析 |
| 3.8.2 BnaTT8突变体和野生型种皮DEGs的筛选 |
| 3.8.3 BnaTT8突变体和野生型种皮DEGs的富集分析 |
| 3.8.4 BnaTT8突变体和野生型种皮中类黄酮合成相关基因的表达分析 |
| 3.8.5 qRT-PCR验证转录组结果 |
| 3.9 BnaTT8突变体的种子代谢组分析 |
| 3.10 BnaTT8基因突变对种子中脂肪酸合成相关基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CRISPR/Cas9系统在BnaTT8基因编辑中的应用 |
| 4.2 CRISPR/Cas9介导的BnaTT8突变体在育种中的应用前景 |
| 4.3 BnaTT8基因参与内种皮中PA的特异性积累 |
| 4.4 BnaTT8基因改变种子中含油量和脂肪酸组分的分子机理 |
| 4.5 基因编辑技术在作物中的应用前景与挑战 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 本研究所用的部分引物 |
| 附录2 甘蓝型油菜中BnaTT8基因的DNA序列比对信息 |
| 附录3 不同物种中TT8同源基因的进化树分析 |
| 附录4 T_2代中BnaTT8纯合突变体单株的预测氨基酸序列 |
| 附录5 作者简介及研究生阶段发表成果 |
| 致谢 |
（5）山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 山桐子的研究进展 |
| 1.2.1 山桐子概述 |
| 1.2.2 国内外山桐子研究现状 |
| 1.3 植物油脂的生物合成 |
| 1.3.1 植物油脂的合成步骤 |
| 1.3.2 植物油脂合成相关基因的研究进展 |
| 1.4 植物功能基因的研究方法 |
| 1.4.1 基因测序技术 |
| 1.4.2 基因克隆技术 |
| 1.4.3 植物基因的功能验证 |
| 1.5 植物的遗传转化方法 |
| 1.6 本研究的目的意义与研究内容 |
| 1.6.1 目的意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 山桐子果实发育过程中油脂含量及脂肪酸组分的动态变化 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 山桐子果实油脂的提取 |
| 2.1.4 山桐子果实脂肪酸组分的测量 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 山桐子果实的含油率 |
| 2.2.2 山桐子果实的脂肪酸组分 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 山桐子果实发育过程中油脂含量的动态变化 |
| 2.3.2 山桐子果实发育过程中酸组分的动态变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 山桐子果实转录组分析及油脂合成相关基因的挖掘 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 山桐子果实RNA的提取及检测 |
| 3.1.4 cDNA文库构建及转录组测序 |
| 3.1.5 转录组数据的过滤及从头组装 |
| 3.1.6 Unigene的功能注释 |
| 3.1.7 Unigene的差异表达检测 |
| 3.1.8 差异表达Unigene的Pathway功能分析 |
| 3.1.9 q-PCR分析验证转录组测序准确性 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA质量检测 |
| 3.2.2 转录组数据分析及组装 |
| 3.2.3 山桐子Unigene的功能注释 |
| 3.2.4 山桐子差异表达基因分析 |
| 3.2.5 山桐子差异表达基因的功能注释 |
| 3.2.6 参与山桐子油脂合成基因的鉴定 |
| 3.2.7 转录组测序的q-PCR验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 山桐子油脂的生物合成模型 |
| 3.3.2 参与山桐子脂肪酸合成的关键基因 |
| 3.3.3 参与山桐子TAG合成的关键基因 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的克隆及表达分析 |
| 4.1 试验材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 山桐子果实RNA的提取及检测 |
| 4.1.5 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因核心序列的克隆 |
| 4.1.6 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因全长序列的克隆 |
| 4.1.7 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的生物信息学分析 |
| 4.1.8 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的全长序列 |
| 4.2.2 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的生物信息学分析 |
| 4.2.3 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的基本信息 |
| 4.3.2 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达模式 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 山桐子亚油酸合成关键基因Ip FAD2 和Ip DGAT2 的功能分析 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要仪器和试剂 |
| 5.1.3 引物设计 |
| 5.1.4 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因表达载体的构建 |
| 5.1.5 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的原核表达 |
| 5.1.6 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的真核表达 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的的原核表达 |
| 5.2.2 山桐子Ip FAD2 基因的的真核表达 |
| 5.2.3 山桐子Ip DGAT2基因的的真核表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 山桐子Ip FAD2 基因的功能验证 |
| 5.3.2 山桐子Ip DGAT2基因的功能验证 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 山桐子遗传转化受体系统的建立 |
| 6.1 试验材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 主要仪器和试剂 |
| 6.1.3 叶片愈伤组织再生体系的建立 |
| 6.1.4 愈伤组织的抗生素敏感性试验 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 叶片的消毒与灭菌 |
| 6.2.2 愈伤组织的诱导 |
| 6.2.3 愈伤组织的继代 |
| 6.2.4 不定芽的诱导 |
| 6.2.5 不定芽的复壮 |
| 6.2.6 抗生素敏感性 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 山桐子叶片愈伤组织再生体系 |
| 6.3.2 山桐子叶片愈伤组织的抗生素敏感性 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）MdHOS1响应茉莉酸调控苹果抗冷性的分子机制（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 低温胁迫 |
| 1.1.1 低温胁迫影响植物生长发育 |
| 1.1.2 植物响应低温胁迫的分子机制 |
| 1.1.3 翻译后修饰参与调控植株抗冷性 |
| 1.2 植物花青苷及原花青素的结构与功能 |
| 1.2.1 花青苷及原花青素的结构 |
| 1.2.2 花青苷及原花青素的功能 |
| 1.3 花青苷及原花青素的生物合成与调控途径 |
| 1.3.1 花青苷及原花青素的生物合成 |
| 1.3.2 花青苷及原花青素合成的结构基因 |
| 1.3.3 调控花青苷及原花青素合成的转录因子 |
| 1.4 非生物因素对花青苷和原花青素合成的影响 |
| 1.4.1 温度 |
| 1.4.2 植物激素 |
| 1.4.3 花青苷和原花青素对低温胁迫的影响 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料与条件 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 载体 |
| 2.1.4 抗生素 |
| 2.1.5 酶 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.1.7 培养基 |
| 2.1.8 生化试剂及药品 |
| 2.1.9 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 花青苷的提取及含量测定 |
| 2.2.2 原花青素染色 |
| 2.2.3 原花青素提取及含量测定 |
| 2.2.4 RNA反转录实验 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.2.6 基因的扩增 |
| 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳与PCR产物回收 |
| 2.2.8 连接零背景载体 |
| 2.2.9 转化大肠杆菌感受态(DH5α) |
| 2.2.10 菌落PCR与测序 |
| 2.2.11 质粒提取 |
| 2.2.12 质粒与载体的双酶切反应 |
| 2.2.13 连接与构建表达载体 |
| 2.2.14 农杆菌感受态(LBA4404)的转化 |
| 2.2.15 大肠杆菌感受态BL21(DE3)的转化 |
| 2.2.16 苹果组培苗转化实验 |
| 2.2.17 王林及红肉苹果愈伤组织转化实验 |
| 2.2.18 酵母双杂交实验 |
| 2.2.18.1 活化酵母 |
| 2.2.18.2 制备Y2H gold感受态 |
| 2.2.18.3 酵母转化 |
| 2.2.19 酵母单杂交实验 |
| 2.2.20 原核诱导蛋白 |
| 2.2.21 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.22 蛋白纯化 |
| 2.2.23 pull-down |
| 2.2.24 蛋白体外降解 |
| 2.2.25 western检测 |
| 2.2.25.1 电泳 |
| 2.2.25.2 转膜 |
| 2.2.25.3 封闭 |
| 2.2.26 蛋白泛素化 |
| 2.2.27 NBT染色 |
| 2.2.28 染色质免疫共沉淀实验 |
| 2.2.29 蛋白凝胶迁移实验(EMSA) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MdHOS1系统进化树和序列分析 |
| 3.2 过表达MdHOS1抑制苹果幼苗的抗冷性 |
| 3.3 过表达MdHOS1抑制苹果幼苗花青苷和原花青素的合成 |
| 3.4 过表达MdHOS1抑制红肉苹果愈伤组织花青苷和原花青素的合成 |
| 3.5 MdHOS1蛋白与MdMYB9蛋白相互作用 |
| 3.6 MdHOS1通过泛素/26S蛋白酶体降解MdMYB9蛋白 |
| 3.6.1 MdHOS1促进MdMYB9蛋白降解 |
| 3.6.2 MdHOS1泛素MdMYB9蛋白 |
| 3.7 过表达MdHOS1抑制MdMYB9正调控花青苷和原花青素的合成 |
| 3.8 MdHOS1响应茉莉酸甲酯 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MdHOS1负调控苹果的抗冷性 |
| 4.2 MdHOS1通过泛素降解MdMYB9抑制苹果花青苷和原花青素的积累 |
| 4.3 茉莉酸甲酯抑制MdHOS1基因的表达 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）铭贤169小麦种子休眠解除的生理变化及分子调控网络研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小麦穗发芽的危害 |
| 1.2 种子萌发和休眠的过程 |
| 1.2.1 种子萌发的过程 |
| 1.2.2 种子休眠的过程 |
| 1.3 种子休眠的研究进展 |
| 1.4 转录组测序技术在植物休眠研究中的运用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 铭贤169 小麦种子休眠解除期间成分变化分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 供试材料及种植条件 |
| 2.1.2 种子和种胚的发芽处理 |
| 2.1.3 不同储藏温度和湿度的发芽试验 |
| 2.1.4 休眠解除期间种子吸水率和生活力测定 |
| 2.1.5 休眠解除期间淀粉粒和种皮显微结构观察 |
| 2.1.6 休眠解除期间铭贤169 种子品质测定 |
| 2.1.7 休眠解除期间种子生理指标的测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 铭贤169 种子和胚发芽率比较分析 |
| 2.2.2 不同储藏温度铭贤169 种子的发芽特性 |
| 2.2.3 不同土壤湿度中铭贤169 种子发芽特性 |
| 2.2.4 休眠解除期间铭贤169 种皮吸水率和种子活力变化 |
| 2.2.5 休眠解除期间铭贤169 淀粉粒和种皮的显微结构变化 |
| 2.2.6 休眠解除期间小麦铭贤169 种子品质的变化 |
| 2.2.7 铭贤169 种子休眠解除期间淀粉糊化特性的变化 |
| 2.2.8 休眠解除时期铭贤169 种子淀粉热特性的变化 |
| 2.2.9 休眠解除时期铭贤169 种子淀粉粒径变化 |
| 2.2.10 铭贤169 种子在休眠解除期间生理指标的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 铭贤169 穗发芽抗性与胚乳成分有关 |
| 2.3.2 铭贤169 穗发芽抗性受环境影响 |
| 2.3.3 后熟改变铭贤169 小麦的种皮结构 |
| 2.3.4 后熟改变淀粉粒结构和性质 |
| 2.3.5 后熟对蛋白质变化的影响 |
| 2.3.6 后熟改变铭贤169 小麦种子其他成分 |
| 第三章 铭贤169 休眠与萌发种子mRNA-Seq和 lncRNA-Seq转录组测序分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料及种植条件 |
| 3.1.2 取样方法 |
| 3.1.3 RNA提取和质量检测方法 |
| 3.1.4 lncRNA的特异性文库构建和测序方法 |
| 3.1.5 生物信息学分析方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 测序数据质量分析 |
| 3.2.2 mRNA分析 |
| 3.2.3 lncRNA分析 |
| 3.2.4 SNP/InDel注释和可变剪切分析 |
| 3.2.5 mRNA转录组差异表达基因的验证 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 铭贤169 休眠与萌发种子miRNA-Seq测序分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 Small RNA文库构建和测序方法 |
| 4.1.3 生物信息学分析方法 |
| 4.1.4 标准数据处理方法 |
| 4.1.5 定量PCR验证方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 数据质量分析 |
| 4.2.2 small RNA tag长度分布 |
| 4.2.3 标准数据比对鉴定分析 |
| 4.2.4 miRNA表达分析 |
| 4.2.5 miRNA定量PCR验证 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 铭贤169 休眠与萌发种子的表观遗传学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 文库构建和测序方法 |
| 5.1.3 生物信息学分析方法 |
| 5.1.4 甲基化水平统计方法 |
| 5.1.5 差异甲基化区域分析方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 测序数据质量分析 |
| 5.2.2 位点甲基化水平统计分析 |
| 5.2.3 各类特定区域的平均甲基化水平统计 |
| 5.2.4 差异性甲基化分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 CHH背景下的端粒甲基化可能与种子发芽后的DEGs有关 |
| 5.3.2 转录起始位点(TSS)的低甲基化导致基因的表达 |
| 5.3.3 转座子区域的低甲基化抑制转座子的活性 |
| 第六章 铭贤169 穗发芽抗性的分子调控网络 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料同上 |
| 6.1.2 植物激素的测定方法 |
| 6.1.3 酶的活性和相关物质含量的测定 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 与铭贤169 穗发芽有关的植物激素的生物合成和信号转导途径 |
| 6.2.2 AsA-GSH的代谢 |
| 6.2.3 淀粉和蔗糖代谢 |
| 6.2.4 穗发芽期间的生理反应 |
| 6.2.5 PHS过程中不同甲基化区域的调控 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 涉及植物激素转导、AsA-GAH代谢、淀粉和蔗糖代谢途径的DEGs与铭贤169 的PHS有关 |
| 6.3.2 非编码RNA参与铭贤169的PHS的目标差异基因 |
| 6.3.3 DNA甲基化修饰参与铭贤169 的休眠调控 |
| 6.3.4 生理指标与分子网络共同揭示铭贤169 小麦种子的休眠机制 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 插入突变 |
| 1.2.1 转座子插入突变 |
| 1.2.2 T-DNA插入突变 |
| 1.3 植物T-DNA插入突变体的研究方法 |
| 1.3.1 T-DNA插入拷贝数的确定 |
| 1.3.2 T-DNA侧翼序列的分离 |
| 1.3.3 突变基因的验证 |
| 1.4 COI1基因与茉莉素信号转导 |
| 1.4.1 COI1基因的研究概况 |
| 1.4.2 茉莉素的发现 |
| 1.4.3 茉莉素的化学结构及生物合成 |
| 1.4.4 茉莉素的信号转导 |
| 1.4.5 茉莉素的生物学功能 |
| 1.5 目的意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 白桦突变体的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 感病分析所用菌株 |
| 2.1.3 主要试剂和培养基 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苗期生长量的测定 |
| 2.2.2 生长特性的测定 |
| 2.2.3 叶片和芽的解剖结构的观察 |
| 2.2.4 相对叶绿素含量、光合特性参数及叶绿素荧光参数的测定 |
| 2.2.5 木材特性的测定 |
| 2.2.6 感病性分析 |
| 2.2.7 内源激素含量的测定 |
| 2.2.8 生长素和细胞分裂素的免疫组织化学定位 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 突变体苗期生长量的变异 |
| 2.3.2 突变体生长参数的变异 |
| 2.3.3 突变体株型的变异 |
| 2.3.4 突变体芽形态及解剖结构特征 |
| 2.3.5 突变体叶片形态、解剖结构及光合特性变异 |
| 2.3.6 突变体材质特性的变异 |
| 2.3.7 突变体感病性分析 |
| 2.3.8 突变体内源激素含量变化 |
| 2.3.9 突变体生长素和细胞分裂素的分布 |
| 2.3.10 突变体展叶时间和结实情况的调查 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 基于转录组测序的白桦突变体差异基因分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备和实验耗材 |
| 3.1.4 主要数据库和软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 转录组的取材及测序 |
| 3.2.2 转录组数据分析 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转录组数据的评估及qRT-PCR验证 |
| 3.3.2 突变体主枝茎尖的转录组分析 |
| 3.3.3 突变体侧枝茎尖的转录组分析 |
| 3.3.4 突变体茎尖的转录组分析 |
| 3.3.5 突变体中差异基因的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 白桦突变体T-DNA插入位点的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 载体和菌株 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 4.1.5 主要软件和网站 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转基因株系的分子检测 |
| 4.2.2 Southern杂交 |
| 4.2.3 TAIL-PCR确定T-DNA的插入位点 |
| 4.2.4 基因组重测序确定T-DNA的插入位点 |
| 4.2.5 突变体中突变基因BpCOI1的时空表达特异性分析 |
| 4.2.6 突变体对MeJA应答分析 |
| 4.2.7 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 突变体的分子检测 |
| 4.3.2 br株系中T-DNA插入位点数目鉴定 |
| 4.3.3 br株系中T-DNA插入位点侧翼序列的分离及验证 |
| 4.3.4 突变体中BpCOI1的时空表达特异性及MeJA应答 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 白桦BpCOI1启动子功能研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 载体和菌株 |
| 5.1.3 主要试剂及培养基 |
| 5.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 5.1.5 主要网站和软件 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 突变基因BpCOI1启动子的克隆及序列分析 |
| 5.2.2 BpCOI1启动子融合GUS的载体构建 |
| 5.2.3 工程菌的制备 |
| 5.2.4 白桦遗传转化 |
| 5.2.5 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的分子检测 |
| 5.2.6 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的GUS染色 |
| 5.2.7 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的组织表达特异性分析 |
| 5.2.8 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同激素的响应分析 |
| 5.2.9 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同光周期的响应分析 |
| 5.2.10 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 BpCOI1启动子顺式作用元件预测 |
| 5.3.2 ProBpCOI1::GUS载体构建及工程菌的获得 |
| 5.3.3 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的获得 |
| 5.3.4 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的组织定位及表达特性 |
| 5.3.5 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同激素和光周期的响应特性 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 BpCOI1与SKP1家族互作关系验证 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体和菌株 |
| 6.1.3 主要试剂和培养基 |
| 6.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 6.1.5 主要网站和软件 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 BpCOI1基因的克隆及亚细胞定位 |
| 6.2.2 BpCOI1基因的生物信息学分析 |
| 6.2.3 酵母双杂交 |
| 6.2.4 双分子荧光互补 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 BpCOI1基因的克隆及定位 |
| 6.3.2 BpCOI1基因的生物信息学分析及系统发育进化分析 |
| 6.3.3 BpCOI1互作蛋白的验证 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 白桦BpCOI1基因功能研究 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 载体和菌株 |
| 7.1.3 主要试剂和培养基 |
| 7.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 7.1.5 主要网站和软件 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 超表达和抑制表达载体的构建 |
| 7.2.2 工程菌的制备及白桦的遗传转化 |
| 7.2.3 BpCOI1转基因白桦的分子检测 |
| 7.2.4 BpCOI1转基因白桦的生长性状测定 |
| 7.2.5 BpCOI1转基因白桦的MeJA应答 |
| 7.2.6 BpCOI1转基因白桦的感病性分析 |
| 7.2.7 BpCOI1转基因白桦的转录组测序及qRT-PCR验证 |
| 7.2.8 数据分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 BpCOI1基因植物表达载体的构建及工程菌的获得 |
| 7.3.2 BpCOI1转基因白桦的获得 |
| 7.3.3 BpCOI1转基因白桦生长性状分析 |
| 7.3.4 BpCOI1转基因白桦MeJA应答分析 |
| 7.3.5 BpCOI1转基因白桦感病性分析 |
| 7.3.6 BpCOI1转基因白桦转录组分析 |
| 7.4 本章小结 |
| 8 讨论 |
| 8.1 T-DNA插入突变体是研究基因功能的珍贵材料 |
| 8.2 基因表达差异影响br突变体的突变表型 |
| 8.3 激素调控植物分枝发育 |
| 8.4 F-box在植物激素信号转导中发挥重要作用 |
| 8.5 BpCOI1基因对外界环境因子有不同的应答模式 |
| 8.6 br突变体和BpCOI1抑制表达株系含有相同的差异基因 |
| 8.7 COI1参与调控植物的生长发育及逆境应答 |
| 结论 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（9）玉米ZmCYP72A5基因的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物抽穗开花的调控机理 |
| 1.1.1 玉米抽穗开花的调控 |
| 1.1.1.1 光信号通路 |
| 1.1.1.2 生物钟通路 |
| 1.1.1.3 光周期通路 |
| 1.1.1.4 自主通路 |
| 1.1.1.5 年龄通路 |
| 1.1.1.6 赤霉素通路 |
| 1.2 细胞色素CYP450家族的研究进展 |
| 1.2.1 CYP450分类和结构特点 |
| 1.2.1.1 细胞色素P450家族分类 |
| 1.2.1.2 细胞色素P450在植物中的分类 |
| 1.2.1.3 细胞色素P450家族结构特点 |
| 1.2.2 细胞色素P450功能研究进展 |
| 1.3 CYP72A的研究进展 |
| 1.3.1 CYP72A的结构 |
| 1.3.2 CYP72A家族基因功能的研究进展 |
| 1.4 与植物发育相关的CYP家族的研究 |
| 1.5 CRISPR基因编辑技术 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9 的工作原理及功能 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9 的应用 |
| 1.6 玉米遗传转化 |
| 1.6.1 玉米遗传转化的方法 |
| 1.6.2 影响转化效率的因素 |
| 1.7 本文的研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料和生长条件 |
| 2.1.2 菌株和载体质粒 |
| 2.1.3 酶、生化试剂 |
| 2.1.4 实验涉及的仪器 |
| 2.1.5 数据分析软件及数据库 |
| 2.1.6 实验引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA提取方法 |
| 2.2.2 反转录cDNA第一链合成 |
| 2.2.3 亚细胞定位载体构建 |
| 2.2.3.1 目的基因的克隆 |
| 2.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 |
| 2.2.3.3 目的基因片段回收 |
| 2.2.3.4 克隆载体连接体系 |
| 2.2.3.5 热激法转化大肠杆菌 |
| 2.2.3.6 大肠杆菌活化 |
| 2.2.3.7 阳性菌落筛选 |
| 2.2.3.8 克隆载体质粒大量提取 |
| 2.2.3.9 酶切、连接表达载体pROCKⅡ |
| 2.2.3.10 热激法转化农杆菌 |
| 2.3 农杆菌介导的玉米幼胚转化实验及抗性植株的获得 |
| 2.3.1 ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9 载体的构建 |
| 2.3.2 玉米幼胚收集及农杆菌侵染 |
| 2.3.3 愈伤的诱导和筛选 |
| 2.3.4 生芽、生根培养 |
| 2.3.5 阳性苗鉴定 |
| 2.4 玉米原生质体的提取与转化方法 |
| 2.5 生理指标测定 |
| 2.5.1 叶绿素含量测定方法 |
| 2.5.2 光合速率测定方法 |
| 2.6 转基因植株表型分析 |
| 2.7 技术路线 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 玉米ZmCYP72A5 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1.1 ZmCYP72A5 基因的克隆 |
| 3.1.2 ZmCYP72A5 基因的序列分析 |
| 3.1.2.1 ZmCYP72A5 蛋白结构域分析 |
| 3.1.2.2 ZmCYP72A5 进化树分析 |
| 3.2 ZmCYP72A5 蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 ZmCYP72A5 基因的表达模式分析 |
| 3.4 构建ZmCYP72A5 基因敲除转基因株系 |
| 3.4.1 ZmCYP72A5 基因CRISPR/Cas9 载体的构建 |
| 3.5 玉米遗传转化及再生植株的获得 |
| 3.6 阳性苗鉴定 |
| 3.7 转基因植株的表型分析 |
| 3.7.1 植株抽穗时间比较 |
| 3.7.2 株型分析 |
| 3.7.3 生长期的分析 |
| 3.7.4 产量分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ZmCYP72A5 定位于内质网膜 |
| 4.2 ZmCYP72A5 基因对玉米植株抽穗时间的影响 |
| 4.3 ZmCYP72A5 基因对玉米植株株高的影响 |
| 4.4 ZmCYP72A5 功能缺失对植物生长周期的影响 |
| 4.5 展望 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（10）亚洲棉短绒的遗传研究和候选基因鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 棉纤维类型及其不同类型突变体 |
| 1.3 不同棉种纤维进化研究进展 |
| 1.4 棉花纤维发育不同时期形态与生理特征 |
| 1.5 棉花纤维调控机制研究进展 |
| 1.5.1 植物激素调控棉纤维发育机制的研究进展 |
| 1.5.2 小的信号肽及其对纤维调控机制研究进展 |
| 1.5.3 转录因子调控棉纤维发育 |
| 1.5.4 超长链脂肪酸合成相关基因与纤维发育的研究进展 |
| 1.5.5 影响棉纤维发育的其它因子 |
| 1.6 挖掘棉花纤维相关基因方法研究进展 |
| 1.6.1 QTL定位 |
| 1.6.2 全基因组关联分析(GWAS) |
| 1.6.3 基因组结构变异与复杂性状解析 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 第二章 亚洲棉光籽性状的孟德尔遗传研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料及群体构建 |
| 2.1.2 田间试验及其性状调查 |
| 2.1.3 数据统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同亚洲棉亲本及F1光籽性状分级 |
| 2.2.2 亚洲棉光籽性状显隐性遗传学分析 |
| 2.2.3 亚洲棉杂交组合F2代光籽性状遗传分析 |
| 2.2.4 亚洲棉光籽性状与其他农艺性状相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 亚洲棉光籽基因功能和调控机制分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 载体和菌种 |
| 3.1.3 试验所用试剂和试剂盒 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 引物合成及测序 |
| 3.1.6 实验常用试剂配制及保存 |
| 3.1.7 叶茸毛数目调查 |
| 3.1.8 扫描电镜 |
| 3.1.9 石蜡切片 |
| 3.1.10 棉花和拟南芥叶片总DNA提取 |
| 3.1.11 亚洲棉GWAS分析 |
| 3.1.12 基因组结构变异分析 |
| 3.1.13 棉花总RNA的提取、反转录和q RT-PCR |
| 3.1.14 文库构建、转录组测序、质量评估与结果分析 |
| 3.1.15 Ga FZ和 Ga08G0117 基因的亚细胞定位分析 |
| 3.1.16 Ga08G0117基因组织定位分析 |
| 3.1.17 VIGS诱导的Ga08G0117 基因沉默 |
| 3.1.18 不同亚洲棉品种GaFZ基因序列和启动子序列分析 |
| 3.1.19 原生质体瞬时表达分析 |
| 3.1.20 蛋白序列比对与系统进化分析 |
| 3.1.21 GaFZ超表达载体的构建及遗传转化 |
| 3.1.22 甲苯胺蓝染色(TB staining) |
| 3.1.23 酵母双杂交分析 |
| 3.1.24 转录激活分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 短绒突变体GA0149和其野生型GA0146表型鉴定 |
| 3.2.2 基于SNP和 SVs的短绒性状全基因组关联分析 |
| 3.2.3 候选基因区间及关键变异的确定 |
| 3.2.4 大片段(lar INDELFZ)插入序列的确定 |
| 3.2.5 lar INDELFZ与群体(GWAS和 F2)短绒和叶茸毛性状的连锁关系 |
| 3.2.6 lar INDELFZ序列特征 |
| 3.2.7 候选基因在GA0146和GA0149材料中的表达模式分析 |
| 3.2.8 Ga08G0117基因组织和亚细胞定位分析 |
| 3.2.9 VIGS诱导的亚洲棉Ga08G0117 基因沉默 |
| 3.2.10 亚洲棉FZ位点区域序列分析 |
| 3.2.11 lar INDELFZ大片段促进Ga FZ的表达 |
| 3.2.12 GaFZ基因特征性分析 |
| 3.2.13 GaFZ的转基因拟南芥功能验证 |
| 3.2.14 GaFZ转基因陆地棉阳性植株的获得 |
| 3.2.15 GaFZ转基因陆地棉插入拷贝数检测 |
| 3.2.16 GaFZ转基因陆地棉阳性植株表型鉴定 |
| 3.2.17 陆地棉同源基因在转基因材料中的鉴定 |
| 3.2.18 短绒突变体GA0149和其野生型GA0146转录组分析 |
| 3.2.19 拟南芥野生型和转基因株系转录组分析 |
| 3.2.20 R2R3-MYB/b HLH/WD40(MBW)系统与短绒发育的关系 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 非编码区间结构变异可能在调控棉花重要性状方面发挥着重要作用 |
| 3.3.2 lar INDELFZ可能作为增强子激活了Ga FZ基因的表达 |
| 3.3.3 GaFZ可能是直接作用于脂肪酸代谢途径的新的纤维调控因子 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 全文结论及展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 附图和附表 |
| 附录Ⅱ 在读期间研究成果 |
| 致谢 |
四、Cloning and Sequence Analysis of a Steroid 5a Reductase Gene from Cotton (Gossypium hirsuturm L. ) Fiber（论文参考文献）
- [1]桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析[D]. 李雨珈. 广西大学, 2021(12)
- [2]棉花纤维发育相关基因GhGRAM31和GhTCP15的克隆和功能分析[D]. 叶峥秀. 华中农业大学, 2021
- [3]毛果杨PtLIM1基因在调控次生壁合成中的功能解析[D]. 张双意. 鲁东大学, 2021(12)
- [4]甘蓝型油菜BnaTT8基因突变体的创建及功能研究[D]. 翟云孤. 华中农业大学, 2021
- [5]山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析[D]. 范睿深. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [6]MdHOS1响应茉莉酸调控苹果抗冷性的分子机制[D]. 姜慧艳. 山东农业大学, 2021(01)
- [7]铭贤169小麦种子休眠解除的生理变化及分子调控网络研究[D]. 张明婷. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [8]白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究[D]. 韩锐. 东北林业大学, 2020
- [9]玉米ZmCYP72A5基因的功能研究[D]. 张文婷. 山东农业大学, 2020
- [10]亚洲棉短绒的遗传研究和候选基因鉴定[D]. 王晓阳. 华中农业大学, 2020(01)