一、Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定(英文)（论文文献综述）
徐立铭[1]（2014）在《分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶（MurA）功能研究》文中研究说明结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病的病原体,全球约1/3人口携带此菌。近年来,多重耐药甚至广泛耐药结核分枝杆菌菌株的出现使现有的抗结核药物已经不能满足治疗结核病和控制疾病蔓延的要求。因此,寻找新的抗结核药物作用靶点是当前迫在眉睫的研究任务。结核分枝杆菌具有独特的细胞壁结构,使其能够抵抗环境的不利因素。其细胞壁的核心结构由肽聚糖、聚阿拉伯半乳糖和分枝菌酸组成,其中肽聚糖是维持分枝杆菌细胞形态和菌体渗透压平衡的结构基础。肽聚糖由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替形成骨架结构,并与多肽相连接,形成网状结构。UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）和UDP-N-乙酰胞壁酸（UDP-MurNAc）分别是N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁的糖基供体,而UDP-MurNAc是由UDP-GlcNAc经两步酶促反应生成。UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶（MurA）催化其第一步反应,将磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的烯醇丙酮基团转移到UDP-GlcNAc的3’羟基,生成UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸。MurA已被证明为结核分枝杆菌生长必需基因,并且在哺乳动物细胞中并不存在N-乙酰胞壁酸代谢途径及MurA酶,因此,MurA是理想的抗结核药物作用靶点。多个物种（E.coli,H.influenzae等）MurA酶的催化性质和结构特征已有深入研究,但尚无关于结核分枝杆菌MurA酶促反应动力学特征和3D结构的报道。研究结核分枝杆菌MurA酶的最大难点在于其可溶性极低,在大肠杆菌中诱导表达通常以无活性的包涵体的形式存在。在本课题的研究中,我们引入了一种带有冷休克基因cspA启动子的pColdⅡ表达系统,低温下诱导表达MurA蛋白,大大提高了蛋白的可溶性。我们纯化了 MurA蛋白并获得了其酶促反应动力学参数。结核分枝杆菌具有致病性和传染性,并且菌体代谢缓慢,因此不利于直接研究MurA沉默表达对结核分枝杆菌的影响。我们选取了与结核分枝杆菌有相同细胞壁结构并且生长快速、无致病性的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smemgmatis）作为实验模式菌,应用受四环素诱导的pMind载体,构建了murA反义RNA条件性表达菌株,下调MurA蛋白的表达,并进一步研究MurA的低表达对分枝杆菌的影响。本论文的研究目的:1.获得结核分枝杆菌MurA纯化蛋白,建立UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶活性鉴定方法,分析MurA酶促反应动力学特征,从海洋放线菌此生代谢物组分库中初步筛选MurA酶抑制剂;2.利用反义RNA技术构建耻垢分枝杆菌条件性murA基因敲减菌株,研究MurA表达下调对分枝杆菌生长、形态、结构、药物敏感性和蛋白质组学的影响;3.构建受乙酰胺诱导的pVVAP表达系统,为MurA的功能分析提供新的研究工具。研究结果:1.结核分枝杆菌MurA蛋白的可溶性表达、酶促反应动力学分析和酶抑制剂筛选1.1获得了可溶性MurA蛋白将pCold-Mtb 表达质粒转化至E.coli BL21菌株中,用终浓度0.4 mM IPTG于16℃诱导MurA蛋白的表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化携带C-末端组氨酸标签的MurA蛋白,并通过超滤离心除去小分子物质。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,我们获得了纯度和浓度都非常理想的可溶性MurA蛋白。1.2建立了 MurA酶活性分析方法通过HPLC技术检测MurA酶促反应前后底物UDP-GlcNAc的减少量,以鉴定MurA纯化蛋白的酶活性。结果显示,经MurA酶催化,UDP-GlcNAc的含量降低了 60.1%,证明纯化的MurA蛋白具有UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶活性。为了便于对MurA酶进行酶促反应动力学分析和高通量抑制剂筛选,我们建立了 MurA酶活性简便、快速、准确的检测方法——孔雀石绿显色法,通过检测反应中生成的无机磷酸定量分析MurA酶活性。孔雀石绿显色结果进一步验证了纯化的MurA蛋白的酶活性,经计算,MurA酶的比活性为0.305±0.006 uM min-1μg-1。1.3确定了 MurA酶促反应动力学参数利用建立的孔雀石绿显色法测定MurA酶促反应动力学参数。结果显示,MurA酶促反应初速度范围是酶浓度不大于10 Mg/ml,反应时间不超过15 min;在初速度范围内,我们测定出MurA酶的最适作用温度为37℃,最适pH值为pH 7.5,酶活性不依赖于Ca2+,Mg2+等金属离子;MurA酶对底物UDP-GlcNAc的Km值为2.743±0.231 mM,Vmax 值为 0.430±0.027 μM min-1;MurA 酶对底物 PEP 的 Km值为0.199± 0.013 mM,Vmax 值为 0.767±0.003 μM min-1。1.4 MurA酶抑制剂筛选将海洋放线菌次生代谢物组分库中60种组分分别以50 μg/ml终浓度加入到酶促反应体系中,利用建立的孔雀石绿显色法初步筛选抑制MurA酶活性的组分。结果显示6种组分对MurA酶活性有明显的抑制作用,使MurA酶活性降低60%以上。2.耻垢分枝杆菌murA反义RNA表达系统的构建及MurA蛋白下调表达对耻垢分枝杆菌的影响2.1构建了耻垢分枝杆菌murA反义RNA表达系统获得耻垢分枝杆菌murA基因5’端DNA片段,反向插入受四环素诱导的pMind表达载体,并转化至耻垢分枝杆菌,获得murA反义RNA表达菌株,即MurA蛋白条件性下调表达菌株。2.2制备了耻垢分枝杆菌MurA蛋白多克隆抗体将纯化的耻垢分枝杆菌MurA蛋白免疫BalB/c小鼠,获得抗MurA多克隆抗体。Elisa和Western blot检测结果显示,制备的抗体具有理想的效价和特异性,可用于检测murA基因敲减菌株中MurA蛋白的表达情况。2.3确定了 pMind系统诱导反义RNA,下调MurA蛋白表达的最佳条件用不同浓度四环素诱导murA反义RNA的表达,根据分枝杆菌的生长情况确定了 pMind表达系统的最佳条件。用20 ng/ml四环素诱导36 h,可有效下调murA反义RNA表达菌株中MurA蛋白的表达,抑制细菌生长。2.4探讨了 MurA下调表达对分枝杆菌细胞形态和结构、药物敏感性和蛋白质组学的影响分别利用扫描电镜和透射电镜观察murA反义RNA表达菌株在20 ng/ml四环素诱导后发生的形态学和细胞结构的变化。结果显示,在MurA表达下调后,耻垢分枝杆菌细胞发生肿胀,细胞壁结构破坏,内容物渗出,细胞间发生融合。利用AlamarBlue法分析MurA下调表达菌株对异烟肼、乙胺丁醇的最小抑制浓度变化。结果显示,MurA的低表达并不改变耻垢分枝杆菌对以上两种药物的敏感性。利用双向电泳技术研究MurA下调表达引起的耻垢分枝杆菌蛋白质组学变化。结果显示,MurA蛋白的低表达引起耻垢分枝杆菌多个蛋白表达水平的变化,经MOLDI-TOF质谱分析,我们最终选取5个差异蛋白,包括2个下调表达的蛋白和3个上调表达的蛋白进行后续研究。3.分枝杆菌乙酰胺诱导表达载体pVVAP的构建及其在条件性反义RNA表达系统中的应用3.1构建了受乙酰胺诱导的pVVAP表达载体以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,获取乙酰胺酶启动子DNA片段,连接到pVV16质粒的XbaI和NdeI位点,替换pVV16的Phsp60启动子,构建成pVVAP表达载体。3.2验证了pVVAP系统诱导表达反义RNA的效果以耻垢分枝杆菌glmM基因作为研究模型,将glmM 5’端DNA片段反向插入pVVAP载体,并转化至耻垢分枝杆菌,通过分枝杆菌的生长及GlmM蛋白的表达水平确定反义RNA表达效果。结果显示,用1.5%（w/v）乙酰胺诱导72 h可有效下调GlmM蛋白的表达,并抑制glmM反义RNA表达菌株的生长,表明构建的pVVAP表达载体可用于下调目标蛋白的表达,是构建分枝杆菌基因敲减菌株的理想载体。结论:1.利用pColdⅡ表达载体在E.coli BL21菌株中稳定表达了可溶性MurA蛋白,纯化后的MurA蛋白具有UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶活性。2.建立了 MurA酶活性的孔雀石绿显色检测方法,确定了 MurA酶促反应动力学参数,并从海洋放线菌次生代谢物组分库中初步筛选了 MurA酶抑制剂。3.MurA的下调表达导致分枝杆菌生长缓慢,细胞形态、结构和蛋白质组发生变化。4.构建了分枝杆菌受乙酰胺诱导的pVVAP表达载体,为MurA及其它蛋白的功能研究提供了新的分子生物学工具。未来研究方向:1.利用建立的MurA酶活性显色方法,继续筛选抑制MurA酶活性的组分和化合物,根据MurA酶促反应动力学参数确定抑制剂的类型,并通过晶体结构分析阐明抑制剂的作用机制。2.研究MurA下调表达后分枝杆菌对其它抗结核药物（利福平、吡嗪酰胺、链霉素等）敏感性的影响,为联合用药治疗结核病提供可能。3.利用Real-time RCR技术对MurA下调表达引起的蛋白差异点进行验证,绘制蛋白质相互作用网络,以期发现与MurA蛋白相关的药物作用的新靶点。4.将pVVAP表达系统应用于MurA功能分析中,研究MurA下调表达对耻垢分枝杆菌生物膜形成的影响。
李华[2]（2010）在《HBV核心区启动子反义真核表达载体的构建》文中指出背景HBV感染是一个严重威胁到人类健康的全球性问题,HBV是引起急慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞肝癌的重要致病因素。抗病毒治疗是目前慢性乙型肝炎的关键性治疗措施,现有的抗病毒药物干扰素-α和核苷类似物的疗效有限,基因治疗日益成为目前的研究热点之一。基因治疗的关键在于选择良好的转基因载体、合适的目的基因和实现目的基因的可控性表达。基因工程中应用最多的载体是真核细胞表达载体,如病毒类载体,它们能将目的基因导入宿主细胞并稳定表达。本实验选择真核表达载体pEGFP-C1,为在细胞水平和体内观察其抑制HBV复制效果打下基础,同时选择HBV core启动子（core promoter, cp）作为目的基因（因为该启动子指导HBV pgRNA和pc mRNA转录的正确启动）,构建HBV cp的反义真核表达载体,该载体可以转录出cp的反义RNA,反义RNA与pgRNA中的cp部分结合有可能使pg RNA逆转录为负链DNA受阻,同时可能导致pg RNA翻译蛋白的水平下降,从而使HBV合成和包装下降,最终有可能使HBV的复制长期受到抑制。目的HBV核心区启动子的克隆及其反义真核表达载体的构建,为乙型肝炎的基因治疗探索新的治疗靶点。方法1.提取HBV DNA:选取外周血HBV DNA载量大于106IU/ml的慢性乙型肝炎患者,用体液病毒提取试剂盒提取HBV DNA。2.PCR扩增HBV核心区启动子序列：选取HBV全长序列中nt1636-nt1860作为扩增片段（该片段包含有HBV核心区启动子）,用Taq DNA聚合酶进行PCR反应扩增HBV核心区启动子,琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物,初步确定引物及提取的HBV DNA模板的可实用性；用Pfu DNA聚合酶PCR扩增HBV核心区启动子序列,以增加扩增基因的保真性,扩增产物进行载体构建。3.重组质粒pEGFP-C1-cp的构建及鉴定：将扩增的HBV核心区启动子和真核表达载体pEGFP-C1经限制性内切酶SacⅡ和HindⅢ分别酶切,用T4DNA Ligase连接后得到重组质粒pEGFP-C1-cp。将重组质粒pEGFP-C1-cp转化感受态大肠杆菌（escherichia coli, E.coli）DH5α,选取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定,鉴定后测序。结果1.HBV核心区启动子的PCR扩增：用Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增后的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,在225bp处有特异性条带出现。2.重组质粒pEGFP-C1-cp的鉴定：重组质粒pEGFP-C1-cp PCR反应后电泳,结果显示在225bp处有特异性条带出现；重组质粒pEGFP-C1-cp经SacⅡ和HindⅢ酶切后电泳,结果显示在约225bp和4700bp处均有特异性条带出现；重组质粒pEGFP-C1-cp中HBV核心区启动子测序结果与GeneBank公布的序列相一致,同源性为97%。结论本实验成功克隆了HBV核心区启动子序列,并构建了HBV核心区启动子的反义真核表达载体pEGFP-C1-cp。
赵宪琪,姜洪池,朴大勋,梁德森,朱安龙[3]（2009）在《COX-2反义RNA抑制肝癌细胞增殖的实验研究》文中研究说明目的研究COX-2反义RNA对肝癌细胞增殖抑制的作用及其机制,探讨肝癌治疗的新途径。方法人工合成的COX-2反义RNA片段及无关对照空质粒经脂质体包裹后作用CBRH7919细胞,通过MTT法、细胞周期分析、RT-PCR及裸鼠体内接种等方法测定细胞体内外增殖的变化。结果经COX-2反义RNA处理的CBRH7919细胞与对照组CBRH7919细胞相比,体外增殖速度减慢（细胞增殖抑制率达78%）、DNA合成受抑（S期细胞数为34.8%vs59.9%）,细胞周期G0/G1比例明显提高,裸鼠体内成瘤率下降（25%vs100%）。而凋亡相关基因表达并无明显差异（P>0.05）。结论COX-2反义RNA可有效抑制肝癌细胞的体内外生长增殖,可用于实验性肿瘤基因治疗研究。
刘佑斌[4]（2009）在《新疆哈萨克族食管癌survivin基因的克隆及其siRNA干扰研究》文中研究说明目的:survivin主要表达于细胞周期的G2/M期。它不仅具有抑制凋亡、调控细胞周期、而且还与血管形成、肿瘤的浸润、转移、耐药和放疗抗拒等有关。目前研究表明,它与新疆哈萨克族食管癌的发病有着密切的联系,我们从哈萨克族食管癌中克隆出survivin基因,为进一步研究它在新疆哈萨克族食管癌发生发展中的作用奠定基础。并购买survivin特异性siRNA真核表达载体,为以survivin基因为靶点、小片段干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）为手段的食管癌和其它恶性肿瘤的基因治疗打下基础。通过转染食管癌细胞株Eca109,用流式细胞仪检测survivin基因对食管癌细胞凋亡的影响、用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测相关基因表达的情况,以便研究survivin基因在新疆哈萨克族食管癌中的作用机制。方法:①PCR技术自人哈萨克族食管癌cDNA中克隆survivin基因。②将所获片段与真核表达载体pEGFP-N1连接后转入大肠杆菌DH5α中,通过EcoRI与BamH1双酶切鉴定和测序鉴定。③survivin基因siRNA真核表达载体,用Lipofectamine TM2000（脂质体转染试剂）转染入食管癌细胞株Eca109中。④用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,通过流式细胞仪检测食管癌细胞株Eca-109的凋亡参数,用RT-PCR和Western blot检测相关基因表达的情况。结果:①DNA测序证明获得了包含ORF全长的survivin基因,并成功克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,同时有可能发现了新的变异体。②在荧光显微镜下可观察到食管癌细胞株Eca109中有绿色荧光蛋白,证明survivin- pEGFP-N1转染成功。③转染有survivin基因siRNA的食管癌细胞株Eca109的凋亡率明显增高;survivin基因、c-myc基因、PTEN基因、cyclinD1基因在转录水平表达下降;survivin基因在蛋白水平表达下降。结论:①新疆哈萨克族食管癌中survivin基因真核表达载体构建成功。②经荧光显微镜检测到survivin- pEGFP-N1转染入食管癌细胞株Eca-109中。③survivin基因siRNA真核表达载体干扰有效。
李建华[5]（2009）在《受体型酪氨酸激酶TrkB参与前列腺肿瘤发生的机制研究及Sur-D71A显性负突变体诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制》文中研究说明前列腺癌为老年男性常见疾病。全球范围居男性癌症发病率第3位,病死率第6位,在美国则分别居男性癌症发病率第1位,病死率第2位。我国前列腺癌发病率虽远低于欧美国家,但近年随着前列腺癌检出率的提高、人口老龄化及生活习惯的改变,发病率呈明显增加趋势,目前已经成为泌尿系统除膀胱癌和肾癌以外的第3大恶性肿瘤,并有逐渐接近膀胱癌和肾癌的趋势。有关前列腺癌诊断和治疗的研究已经成为泌尿外科的重要研究课题。目前普遍的观点认为从正常前列腺组织发展到前列腺癌经历了前列腺上皮细胞内瘤、局部前列腺癌、侵袭性前列腺癌和转移性前列腺癌等几个阶段。对于晚期的前列腺癌一般采用内分泌治疗,大多数患者起初都对内分泌治疗有效,但经过中位时间1430个月后,几乎所有患者病变都将逐渐发展为雄激素非依赖性前列腺癌。目前,临床上尚无有效的方法来治疗,病死率高。只有从肿瘤的发生发展的分子机制方面来治疗恶性肿瘤,才是彻底根治的唯一途径。因此基因治疗目前成为前列腺癌治疗的选择之一。本论文以针对前列腺癌的基因治疗方法和前列腺癌发生、发展以及预后评价相关新分子的研究为切入点,对两方面的内容进行了较为深入的实验研究。第一部分是关于受体型酪氨酸激酶TrkB参与前列腺癌发生与发展进程分子机制的研究;第二部分是关于我课题组前期发现的一个凋亡诱导分子—Survivin显性负突变分子Sur-D71A诱导前列腺癌细胞凋亡分子机制的研究。TrkB是一种受体型酪氨酸激酶,属于Trk神经营养因子受体家族,其基因表达产物通过与其配体脑衍生营养因子（BDNF）相互作用诱导神经系统细胞的持续性增殖、活化及抵抗外源凋亡刺激因素引起的细胞死亡。近年来发现TrkB及其配体BDNF在多种肿瘤中的表达存在异常,其过量表达高度提示与肿瘤细胞的增殖和转移密切相关,但在前列腺癌方面的研究却为数不多。本部分实验观察了TrkB在前列腺癌中的表达情况,并利用分子生物学方法调节前列腺癌细胞内源TrkB的表达水平,分析TrkB对前列腺癌细胞的生物学行为影响,更进一步的分析了前列腺癌细胞内源TrkB表达水平的改变所导致的胞内信号转导通路变化。目的:①分析TrkB在前列腺癌中的表达是否与疾病进程有关;②观察TrkB对前列腺癌细胞生物学行为的影响;③评价TrkB是否可能成为前列腺癌治疗的分子靶点;④观察TrkB对前列腺癌细胞信号转导通路的影响。方法:①利用免疫组化的方法研究TrkB在前列腺良性增生性病变组织与前列腺癌组织中的表达,分析TrkB的表达与肿瘤的病理分级之间的关系和TrkB的组织定位与前列腺癌进程之间的关系;②构建pSilencer-TrkB干涉表达载体,利用稳定转染pSilener-TrkB干涉表达载体的方法观察TrkB表达水平改变对前列腺癌细胞生物学行为的影响。通过细胞计数实验观察TrkB对前列腺癌细胞增殖能力的影响,通过软琼脂克隆形成实验观察TrkB对前列腺癌细胞恶性表型的影响。③通过观察前列腺癌肿瘤细胞中MAPK信号通路和PI3K/Akt信号通路的变化,分析TrkB分子对前列腺肿瘤细胞增殖活化相关信号转导通路的影响。结果:①TrkB在前列腺癌细胞中高表达,其高表达趋势与前列腺癌的病理分级水平成正相关。TrkB在前列腺癌细胞上主要分布在细胞浆和细胞膜,但是在部分病例中发现TrkB具有非常特异和明确的核定位现象,但由于检测病例标本例数尚不足以进行统计学分析,还无法判定TrkB的核定位与疾病进程之间的关系。②构建的pSilencer-TrkB干涉载体能显着抑制前列腺癌细胞中TrkB的表达。TrkB有促进前列腺癌细胞增殖和恶性转化的能力。③TrkB介导的胞内活化信号通路主要是通过PI3K/Akt通路实现的。结论:①TrkB可能参与了前列腺癌的发生与发展的进程;②TrkB在前列腺癌细胞的增殖和活化中发挥着重要的作用;③TrkB对前列腺癌细胞增殖和活化的影响主要是通过PI3K/Akt信号通路的活化实现的;④以TrkB为靶点的治疗策略有可能成为前列腺癌肿瘤治疗的理想靶点。肿瘤组织中Survivin的高表达可促进肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的增殖以及抗凋亡能力。以Survivin为靶点的治疗策略通过抑制其表达或破坏其功能而诱发肿瘤细胞凋亡已经成为共识。我实验室张剑博士在前期研究中通过对以往关于Survivin晶体结构相关文献的分析提出Survivin分子第71位天冬氨酸的突变体可能是一个尚未被实验证实的Survivin显性负突变分子,他通过复制缺陷性腺病毒介导的基因导入方式证明Sur-D71A氨基酸点突变分子具有诱导前列腺癌细胞凋亡的生物学效应。在其基础上,我们通过观察凋亡相关分子Bcl-2家族成员Bcl-2、Bax和Bcl-xl的表达变化,以及Sur-D71A与野生型Survivin分子形成同源或异源二聚体能力的差异分析Sur-D71A对前列腺癌细胞诱导凋亡作用的可能机制。目的:分析Sur-D71A显性负突变分子诱导肿瘤细胞凋亡的可能分子机制。①检测Sur-D71A导入前列腺癌肿瘤细胞对线粒体相关凋亡分子Bcl-2家族成员表达的影响;②观察野生型Survivin分子与Sur-D71A显性负突变分子形成同源二聚体或异源二聚体结合力的差别。方法:①包装、扩增并纯化表达Sur-D71A的复制缺陷性腺病毒,感染前列腺癌细胞后检测Sur-D71A的表达;②利用免疫印迹实验观察Sur-D71A对肿瘤细胞内Bcl-2家族抗凋亡和抑凋亡分子表达的影响;③利用分子生物学方法构建融合标签（flag,HA）的野生型Survivin和Sur-D71A真核表达载体和融合GST的野生型Survivin和Sur-D71A原核表达载体,并在此基础上进行蛋白诱导表达、蛋白纯化和免疫印迹实验检测构建分子的表达状况;④利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）和GST-pulldown实验检测野生型Survivin分子和Sur-D71A形成同源或异源二聚体结合能力的差别。结果:①成功获得了高滴度表达Sur-D71A的复制缺陷型腺病毒,免疫印迹实验证明Sur-D71A分子可在前列腺癌细胞中正确表达;②免疫印迹实验结果显示Sur-D71A可导致前列腺癌细胞中Bcl-2家族抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xl表达水平的下降和促凋亡分析Bax表达水平的上升;③成功构建融合标签（flag,HA）的野生型Survivin和Sur-D71A真核表达载体和融合GST的野生型Survivin和Sur-D71A原核表达载体,蛋白表达检测方法证明各种分子的表达正确;④利用Co-IP和GST-pulldown实验证明野生型Survivin和Sur-D71A分子在体内和体外均具有类似的二聚体结合能力。结论:①Sur-D71A显性负突变分子通过影响线粒体相关凋亡分子实现诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性;②外源表达的Sur-D71A通过竞争结合的方式抑制了野生型Survivin分子形成同源二聚体从而破坏了野生型Survivin分子抵抗细胞凋亡的生物学活性。
新燕,张荣繁,王晓娟,于慧玲,杨丽敏,康毅敏,郝兴霞[6]（2008）在《Survivin反义RNA/HSP70双基因转染对HepG2细胞的影响》文中研究说明目的:探讨survivin反义RNA/HSP70双基因转染对肝癌细胞系HepG2的影响。方法:将已成功获得的双基因载体（pIRES2-EGFP-survivin反义RNA/HSP70）用脂质体介导转染肝癌细胞系HepG2,转染72小时,收集各组细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过RT-PCR、western-blot检测转染后细胞中survivinmRNA、survivin蛋白及HSP70蛋白表达的变化。结果:转染双基因载体与转染空载体的肝癌细胞系HepG2于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光;转染双基因载体的HepG2细胞与转染空载体的HepG2细胞和未转染的HepG2细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高。结论:Sur-vivin反义RNA与HSP70双基因转染成功;survivin反义RNA能干扰HepG2内源survivin的表达,HSP70能上调HepG2细胞HSP70蛋白的表达。
刘中宏[7]（2008）在《Survivin shRNA载体的构建及其对大肠癌细胞体内外作用的研究》文中研究指明背景和目的大肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,且发病率有逐年增加的趋势,在美国是导致恶性肿瘤死亡的第二大原因,且每年的发病人数达到135,000人。随着我国人民生活水平的提高,膳食结构的改变,大肠癌的发病率也逐年提高,发病率已占恶性肿瘤的第三位,严重威胁人类的健康。目前绝大多数的大肠癌仍采取手术为主的综合治疗,随着治疗水平的提高,大肠癌的术后复发、转移逐步下降,但综合治疗的费用较高,副作用多,局部复发和肝转移仍然是治疗失败的主要原因,因此预防和早期发现局部复发和肝转移,筛选高危患者,预测复发和转移,以便及时治疗,对提高患者的生存质量和生存率具有重要的意义。随着分子生物学和基因工程的发展,基因治疗正成为肿瘤防治研究的重点。目前,肿瘤的基因治疗方法主要有基因替代,反义核酸技术,细胞因子基因治疗以及近年来最为关注的RNA干扰技术,肿瘤基因治疗的关键是找到合适的靶基因以及应用最先进的基因治疗手段。Survivin是新近发现的具有独特结构的凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成员,在许多恶性肿瘤中高表达,近年研究发现Survivin在正常大肠上皮细胞中不表达而在大肠癌中高表达,Survivin的表达上调与大肠癌的凋亡指数下降、总体存活率缩短、预后不良和复发率增加有关。鉴于它的独特的生物学特点,Survivin有望成为肿瘤基因治疗的理想靶点,许多研究显示降低它的表达影响肿瘤细胞的生物学活性,对肿瘤的治疗有利。RNA干扰是目前最有效的基因沉默技术,具有简单、高效、特异的优点,它主要通过核酸酶将双链RNA（dsRNA）切割成21-25nt的小干扰RNA,即siRNA,由siRNA按碱基配对的原则特异性的识别并切割同源性靶mRNA分子而实现。短发夹样RNA（short hairpin RNA,shRNA）在细胞内会自动被加工成siRNA,使基因沉默,且比siRNA作用更稳定,高效。本研究构建针对Survivin基因的特异性shRNA表达载体,探索针对Survivin基因的RNA干扰技术对大肠癌细胞系生物学功能的影响,构建裸鼠人大肠癌动物模型,观察其在体内对肿瘤的作用。研究方法1、针对Survivin基因的一段靶序列:GGCTGGCTTCATCCACTGC（86-104）采用GeneChemTMsiRNA的设计工具,参照siRNA的设计原则,利用含绿色荧光蛋白的真核表达载体pGCsi-H1/Neo/GFP,构建真核表达质粒。两条寡核苷酸经退火、限制性内切酶Hind和BamH1双酶切、连接、转化、PCR鉴定阳性克隆、构建pGCH1/Survivin shRNA表达质粒,测序验证。2、培养大肠癌细胞系SW480（Survivin高表达）,用非脂质体法将真核表达质粒转染入SW480,并应用硫酸盐G418进行筛选阳性克隆,转染后以流式细胞仪、荧光显微镜、透射电镜、Western-blot方法检测肿瘤细胞的凋亡、转染和细胞周期及Survivin蛋白的表达情况。3、MTT法测定质粒转染后SW480细胞的增殖情况。4、Transwell小室法测定对细胞迁移能力的影响。5、将SW480细胞和转染pGCH1/Survivin shRNA的SW480细胞分别接种裸鼠皮下,建立裸鼠人大肠癌荷瘤模型,观察shRNA-Survivin对成瘤性的影响6、采用双盲法定期测量皮下肿瘤结节的二维值,计算每个肿瘤的体积和各组平均体积变化的差值,计算肿瘤抑制率。7、免疫组织化学法测定Survivin蛋白的表达情况。8、TUNEL法和透射电镜检测肿瘤细胞凋亡情况。9、显微镜下观察肝,肾,肺等组织变化并测定血常规,了解siRNA对裸鼠血液系统,肝,肾,肺等器官的影响。结果1、成功构建了重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin,经测序显示重组质粒shRNA编码序列与我们设计的靶向Survivin的核苷酸序列完全一致。2、绿色荧光蛋白载体构建的真核表达质粒瞬时转染SW480细胞,G418筛选获得了稳定转染的细胞株。荧光显微镜观察转染效率达90%以上,流式细胞仪分析和透射电镜显示转染后的细胞出现了细胞周期的变化（G2/M期增高）和凋亡的出现（细胞核内的染色质聚集,核内呈团块状,可见凋亡小体）。Western-blot分析转染后的细胞Survivin蛋白的表达受到抑制,转染后48小时和稳定转染后Survivin蛋白的表达分别被下调了52.1%、73.6%、45.8%、41.7%,抑制的时间较长。3、MTT测定显示转染重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin后细胞的增殖受到抑制。4、Transwell小室法分析细胞的迁移能力显示转染重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin后的SW480细胞迁移能力较未转染和转染阴性质粒的SW480细胞明显下降,抑制率为44.08%。5、接种转染细胞的裸鼠成瘤能力较未转染的裸鼠成瘤能力降低,成瘤时间延长,瘤结节的体积小,抑瘤率为67.86%。6、免疫组化测定转染质粒的裸鼠移植瘤Survivin的表达降低,TUNEL法和透射电镜显示凋亡增加,凋亡指数（17.25±3.30）%vs（5.48±1.38）%,（P＜0.05）。7、转染质粒的安全性分析显示,转染后的裸鼠与未转染组重要脏器的结构和功能以及血液系统都未受到影响。结论1、成功构建了重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin。2、靶向Survivin的shRNA表达载体可以较长时间抑制Survivin蛋白的表达;抑制大肠癌细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,改变了细胞周期。3、转染重组质粒后的SW480细胞迁移能力明显下降,说明Survivin除了抗凋亡和调节细胞周期的作用外,还可能参与和影响了肿瘤的转移过程,降低Survivin的表达还可能抑制肿瘤的转移。4、SW480细胞可成功在裸鼠身上建立大肠癌模型。5、事先转染特异的shRNA-Survivin的大肠癌SW480细胞成瘤性差,重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin。能抑制大肠癌裸鼠移植瘤的发生和生长,诱导其凋亡。6、重组质粒没有明显毒副作用。
郭婷婷,刘晓伟,王晓娟,新燕,康毅敏,郝兴霞[8]（2007）在《Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体的构建及鉴定》文中研究指明目的:构建Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体,为后期转染肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及激发机体有效的特异性抗肿瘤免疫应答提供重要的实验材料。方法:应用RT-PCR从Jurkat细胞中获得Survivin cDNA片段,反向插入pIRES2-DsRed2质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的Survivin反义RNA表达载体是否成功;应用RT-PCR从HepG2细胞中获得的HSP70 cDNA片段,定向插入到pIRES2-DsRed2质粒载体中;经菌落PCR、酶切和测序鉴定所构建的HSP70表达载体是否正确。结果:经酶切和测序鉴定证明Survivin反义RNA表达载体已成功构建;经菌落PCR、限制性酶切和测序鉴定证明HSP70表达载体已成功构建。结论:本实验已成功构建了Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体,为进一步研究提供了实验基础。
王琰[9]（2007）在《Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞的抑制作用》文中研究表明目的：白血病是血液系统的恶性肿瘤，细胞增殖与细胞凋亡失衡是其发生的主要原因之一。Survivin是细胞凋亡抑制蛋白家族（lnhibtor of Apoptosis Family of Proteins，IAPs）新成员之一，其表达具有高度特异性，在正常成年组织不表达而在多种肿瘤中高表达，而且survivin的表达与肿瘤的恶性程度及患者的预后密切相关。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平封闭相应序列基因的表达使其沉默的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默（PTGS）。RNAi是生物体抵抗病毒入侵、调控基因表达的监控机制。RNAi介导的基因沉默已经成为一种快速有效地研究基因功能和基因治疗的手段。本实验利用转录载体pSINsi-Hu6构建靶向survivin基因的短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）的真核表达载体，研究其在白血病细胞株HL-60中对细胞增殖和凋亡的影响，为进一步研究沉寂survivin基因用于白血病细胞的基因治疗提供实验室依据。方法：1．构建针对survivin基因的shRNA真核表达载体，即pSIN／shRNA。2．实验分组：实验分为转染组，阴性对照组，空白对照组；3．采用RT-PCR法检测pSIN／shRNA对HL-60细胞对survivin mRNA表达的影响；免疫组化法检测pSIN／shRNA对HL-60细胞survivin蛋白表达的影响。4．采用四甲基偶氮唑盐光吸收法（MTT法）检测pSIN／shRNA转染HL-60增殖情况。5．应用流式细胞仪Annexin v-FITC／PI法检测细胞凋亡。6．统计学处理所有结果以均数±标准差（（?）±s）表示，应用SPSS 10.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析（ANOVA），以α=0.05作为检验水准。结果：1．重组质粒的酶切及测序鉴定：用限制性内切酶BamH I、Cla I双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示：重组载体可产生5606bp和63bp的片断，而空载体产生6522bp的DNA片断。重组质粒经自动基因测序仪测序（上海申能博彩生物公司），结果与设计序列完全相符，所含目的基因序列准确无误，重组质粒构建成功。2．pSIN／shRNA对HL-60细胞survivin mRNA及Survivin蛋白表达的影响：RT-PCR结果显示：4.0μg pSIN／shRNA转染HL-60细胞24、48、72、96h后，转染各时间组与空白对照组和阴性对照组相比，对目的基因mRNA表达水平下调有显着性差异（P＜0.01），阴性对照组与空白对照组间无显着性差异（P＞0.05）。转染各时间组组间比较，转染24h组对目的基因mRNA表达下调水平明显低于48、72、96h组，有显着性差异（P＞0.05）。48h、72h、96h间无显着性差异（P＞0.05）。免疫组化结果显示：4.0μg pSIN／shRNA作用HL-60细胞48h后，空白对照组与阴性对照组Survivin蛋白HL-60细胞中表达阳性积分为（147.32±13.71）和（142.33±14.43），转染组Survivin蛋白表达明显降低，积分为（50.33±7.33）。两对照组间积分均显着高于转染组，与转染组相比有显着性差异（P＜0.01），两对照组间积分无明显差异（P＞0.05）。3．pSIN／shRNA对HL-60细胞的增殖抑制作用MTT法检测结果显示：4.0μg pSIN／shRNA转染细胞后，每24小时检测各组细胞，连续检测72小时，观察pSIN／shRNA对HL-60细胞的增殖抑制作用，24h开始出现抑制作用，48h抑制作用最强，转染各时间组与空白对照组及阴性对照组比较，对HL-60细胞的增殖抑制作用均有统计学意义（P＜0.01），阴性对照组与空白对照组间无差异（P＞0.05）。转染各时间组组间比较，24h组与48、72h组间比较对HL-60细胞的增殖抑制作用差异有统计学意义（P＜0.05），48、72h组间差异无统计学意义（P＞0.05）。本实验表明，pSIN／shRNA对HL-60细胞的增殖抑制作用有时间依赖性和序列特异性，其作用最佳时间为48h。4．pSIN／shRNA诱导HL-60细胞凋亡的作用：转染4.0μg pSIN／shRNA 48h后，pSIN／shRNA组胞凋率可达（20.21±0.75）％，明显高于阴性对照组的（2.58±0.48）％和空白对照组的（1.26±0.30）％，有统计学意义，（P＜0.01）。阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1．成功的构建了针对survivin基因的shRNA真核表达载体，即pSIN／shRNA。2．pSIN／shRNA能明显持续抑制HL-60细胞survivin mRNA及Survivin蛋白的表达。3．pSIN／shRNA能明显持续抑制HL-60细胞的增殖，其抑制作用具有时间依赖性及序列特异性，其作用最佳时间为48h。4．pSIN／shRNA具有诱导HL-60细胞凋亡的作用。
王业生[10]（2007）在《Survivin特异性小发夹RNA真核表达载体的构建及其对HL-60细胞的影响》文中指出RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由siRNA（small interfering RNA，siRNA）介导的转录后基因沉默。作用机制包括起始阶段和效应阶段，在起始阶段，双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在Dicer酶的作用下，被降解为21～23碱基的siRAN。在效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导活化沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，从而导致mRNA降解，出现转录后的基因沉默。RNAi自1998年被发现以来，国内外学者对其进行了大量的研究工作，证实了RNAi技术不仅基因抑制效果确切，而且有严格的序列特异性，治疗针对性强，副作用小。到目前为止，该技术已在多种恶性肿瘤和白血病细胞的研究中应用，均显示出良好的基因沉默效果。因此，RNAi是目前基因治疗的良好手段。Survivn基因是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptotic protein，IAP）成员之一，位于17q25染色体，基因长度为14.7kb，能编码142个氨基酸组成的分子量约为16.5kD的胞质蛋白。它的BIR结构域可以通过抑制caspase-3和caspase-7而导致细胞凋亡。国内外研究证实，survivin在正常成人组织中不表达，而在恶性肿瘤细胞及白血病细胞中高表达，并且与肿瘤的发生、发展及预后有关。文献报导，应用反义寡核苷酸技术和RNAi技术沉默survivin基因可以导致其他恶性肿瘤细胞凋亡。因此，survivin可能成为白血病基因治疗的一个新靶点。白血病是血液系统的恶性肿瘤，发病率高，恶性度强，严重影响人们的生活质量。20世纪80年代以来，白血病的治疗取得了较大的进展，大剂量化疗、造血干细胞移植及免疫治疗的联合应用，大大提高了白血病患者的生存率。但大剂量化疗具有严重的毒副作用，造血干细胞移植费用昂贵，且具有移植物抗宿主病等并发症，限制了其临床广泛应用。有研究显示以RNA干扰沉默BCR／ABL基因可以促进CML细胞株K562细胞凋亡、抑制其增殖。但以RNA干扰沉默survivin基因对白血病基因治疗的研究报导较少，本研究通过构建Survivin特异性小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）真核表达载体、利用Lipofectamine 2000TM脂质体转染到HL-60细胞。研究survivin基因对白血病细胞的增殖、蛋白表达及凋亡的影响。旨在为以Survivin基因为靶点，RNA干扰为手段的白血病和其他恶性肿瘤的基因治疗的研究提供技术手段和理论基础。方法：（1）构建survivin特异性shRNA真核表达载体，同时构建survivin非特异性真核表达载体。（2）实验分三组：survivin特异性shRNA真核表达载体作用组（转染组）、survivin非特异性真核表达载体作用组（阴性对照组）、未做处理的HL-60细胞组（空白对照组）。（3）用无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，采用脂质体转染法将其转染急性粒细胞白血病细胞株HL-60。（4）用台盼蓝拒染法计数细胞，分别计算转染后24h，48h和72h细胞生长抑制率，观察survivin siRNA对细胞生长增殖的影响。（5）分别在转染后24h、48h、72h收集各组细胞，TRIZOL法提取蛋白，Western-blot方法测定细胞转染后survivin蛋白变化。（6）利用原位酶标记检测法（TUNEL）检测细胞转染后HL-60细胞的凋亡状况。（7）所得数据用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，计数资料采用X2检验。计量资料统计学数据用均数±标准差（（?）±s）表示，多样本均数比较采用方差分析。方差不齐时进行变量转换。检验标准以P＜0.05为有统计学意义。结果：（1）经酶切鉴定和基因测序证实：survivin特异性及非特异性shRNA真核表达载体与设计完全一致，所含目的基因序列准确无误。（2）台盼蓝细胞增殖计数的结果显示：转染survivin特异性小发夹RNA真核表达载体后，转染组细胞生长受到明显抑制，且随作用时间的延长而增强，其转染后24h、48h、72h的生长抑制率分别为17.6±8.5％、38.3±4.2％、44.0±1.2％。转染组与阴性对照组和空白对照组生长抑制率相比，作用24h，48h及72h组均有显着性差异（p＜0.01）。转染组24小时与48小时和72小时相比均有显着性差异（p＜0.01），转染组48h和72h以及空白对照组和阴性对照组各时间段抑制率差异无统计学意义（p＞0.05）。（3） Western-blot结果显示：转染组24h、48h、72h survivin蛋白相对空白对照组表达量分别为0.74±0.01、0.35±0.02、0.34±0.01，阴性对照组分别为0.99±0.02、1.00±0.02、0.99±01，转染组与阴性或空白对照组相比明显降低（P＜0.01）。转染组24h与48h或72h结果相比存在显着性差异（P＜0.01），48h与72h结果相比无显着性差异（P＞0.05）。（4） TUNEL结果：转染48h后，转染组、阴性对照组和空白对照组细胞凋亡率分别为31.0％、3.33％、3.67％，转染组明显高于阴性或空白对照组（P＜0.01）。结论：（1） survivin特异性shRNA真核表达载体构建成功。（2）转染survivin特异性shRNA真核表达载体后，可以使HL-60细胞生长和增殖受到抑制。（3）利用RNA干扰沉默Survivin基因后，可以使HL-60细胞的Survivin蛋白表达量下降，并促进细胞凋亡。（4）转染survivin特异性shRNA真核表达载体后，细胞生长和增殖抑制可能与Survivin蛋白表达量下降及细胞的凋亡增加有关。（5）利用RNA干扰沉默Survivin基因可能是白血病基因治疗的一种有效途径。
二、Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定(英文)（论文提纲范文）
（1）分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶（MurA）功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 结核分枝杆菌MurA蛋白的可溶性表达、酶促反应动力学分析及酶抑制剂筛选 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 MurA蛋白的纯化和检测 |
| 2.2 MurA蛋白的酶活性鉴定 |
| 2.3 MurA酶促反应动力学分析 |
| 2.4 MurA酶抑制剂筛选 |
| (三) 结果 |
| 1. MurA蛋白的可溶性表达、纯化和检测 |
| 2. MurA酶活性的HPLC检测 |
| 3. MurA酶活性的孔雀石绿法检测 |
| 4. MurA酶促反应动力学特征的确定 |
| 5. MurA酶抑制剂筛选 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 第二部分 耻垢分枝杆菌murA反义RNA表达系统的构建及MurA蛋白下调表达对分枝杆菌的影响 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 pMind-As murA反义RNA表达载体的构建 |
| 2.2 耻垢分枝杆菌murA条件性下调表达菌株的构建 |
| 2.3 耻垢分枝杆菌MurA蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.4 四环素诱导耻垢分枝杆菌murA反义RNA表达效果检测及条件优化 |
| 2.5 MurA下调表达对耻垢分枝杆菌形态学的影响 |
| 2.6 MurA下调表达对耻垢分枝杆菌细胞结构的影响 |
| 2.7 MurA下调表达对耻垢分枝杆菌药物敏感性的影响 |
| 2.8 MurA下调表达对耻垢分枝杆菌蛋白质组学的影响 |
| (三) 结果 |
| 1. pMind-As murA反义RNA表达载体的构建 |
| 1.1 murA317基因片段的获得 |
| 1.2 pJET-murA317重组质粒的构建和鉴定 |
| 1.3 pMind-As murA重组表达质粒的构建和鉴定 |
| 2. 耻垢分枝杆菌MurA蛋白多克隆抗体的制备和检测 |
| 3. pMind系统诱导murA反义RNA表达效果的检测及条件优化 |
| 4. MurA蛋白在M. smegmatis MD和M. smegmatis ASM菌株中的表达情况检测 |
| 5. MurA下调表达对耻垢分枝杆菌形态和细胞结构的影响 |
| 6. MurA下调表达对耻垢分枝杆菌药物敏感性的影响 |
| 7. MurA下调表达对耻垢分枝杆菌蛋白质组学的影响 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 第三部分 分枝杆菌乙酰胺诱导表达载体pVVAP的构建及其在条件性反义RNA表达系统中的应用 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 pVVAP表达载体的构建 |
| 2.2 pVVAP-As glmM反义表达载体的构建 |
| 2.3 乙酰胺对耻垢分枝杆菌glmM反义RNA诱导效果的检测 |
| (三) 结果 |
| 1. pVVAP表达载体的构建 |
| 2. pVVAP-As glmM质粒的构建 |
| 3. 乙酰胺诱导glmM反义RNA效果检测 |
| 3.1 glmM反义RNA的诱导表达对耻垢分枝杆菌生长的影响 |
| 3.2 glmM反义RNA的诱导表达对M smegmatis AP和M.smegmatis ASG菌株GlmM蛋白表达的影响 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）HBV核心区启动子反义真核表达载体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 正文部分 HBV核心区启动子反义真核表达载体的构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 慢性乙型肝炎的治疗现状及基因治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录部分 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（4）新疆哈萨克族食管癌survivin基因的克隆及其siRNA干扰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1.新疆哈萨克族食管癌中 survivin 基因真核表达载体的构建 |
| 2.survivin 基因的转染以及干扰后的研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（5）受体型酪氨酸激酶TrkB参与前列腺肿瘤发生的机制研究及Sur-D71A显性负突变体诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 受体型酪氨酸激酶TRKB 参与在前列腺肿瘤发生与发展的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 SUR-D71A 显性负突变体诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）Survivin反义RNA/HSP70双基因转染对HepG2细胞的影响（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 实验分组 |
| 1.2.3 细胞转染 |
| 1.2.4 转染细胞survivin mRNA表达的检测 |
| 1.2.5 转染细胞survivin蛋白、HSP70蛋白表达的检测 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 瞬时转染成功的鉴定 |
| 2.2 瞬时转染对HepG2细胞survivin mRNA表达水平的影响 |
| 2.3 瞬时转染对肝癌HepG2细胞survivin蛋白、HSP70蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
（7）Survivin shRNA载体的构建及其对大肠癌细胞体内外作用的研究（论文提纲范文）
| 一、摘要 |
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 二、英文缩略语 |
| 三、论文 |
| 论文一、Survivin shRNA表达载体的构建 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文二、RNA表达载体抑制大肠癌Survivin基因的体外试验研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文三、RNA干扰表达载体抑制大肠癌Survivin基因的体内试验研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 四、本研究创新性自我评价 |
| 五、参考文献 |
| 六、附录 |
| 综述 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞的抑制作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文部分 Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞的抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 RNA干扰及其在恶性血液病治疗的研究现状 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 读硕期间发表文章 |
| 致谢 |
（10）Survivin特异性小发夹RNA真核表达载体的构建及其对HL-60细胞的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| Survivin特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及其对HL-60细胞的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 RNA干扰研究现状及其在白血病研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 致谢 |
四、Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定(英文)（论文参考文献）
- [1]分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶（MurA）功能研究[D]. 徐立铭. 大连医科大学, 2014(05)
- [2]HBV核心区启动子反义真核表达载体的构建[D]. 李华. 郑州大学, 2010(06)
- [3]COX-2反义RNA抑制肝癌细胞增殖的实验研究[J]. 赵宪琪,姜洪池,朴大勋,梁德森,朱安龙. 中华肝胆外科杂志, 2009(12)
- [4]新疆哈萨克族食管癌survivin基因的克隆及其siRNA干扰研究[D]. 刘佑斌. 新疆医科大学, 2009(S2)
- [5]受体型酪氨酸激酶TrkB参与前列腺肿瘤发生的机制研究及Sur-D71A显性负突变体诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制[D]. 李建华. 第四军医大学, 2009(12)
- [6]Survivin反义RNA/HSP70双基因转染对HepG2细胞的影响[J]. 新燕,张荣繁,王晓娟,于慧玲,杨丽敏,康毅敏,郝兴霞. 现代肿瘤医学, 2008(05)
- [7]Survivin shRNA载体的构建及其对大肠癌细胞体内外作用的研究[D]. 刘中宏. 中国医科大学, 2008(01)
- [8]Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体的构建及鉴定[J]. 郭婷婷,刘晓伟,王晓娟,新燕,康毅敏,郝兴霞. 中国误诊学杂志, 2007(13)
- [9]Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞的抑制作用[D]. 王琰. 郑州大学, 2007(05)
- [10]Survivin特异性小发夹RNA真核表达载体的构建及其对HL-60细胞的影响[D]. 王业生. 郑州大学, 2007(05)