一、DFMO对吗啡依赖NG108-15细胞内cAMP含量的影响（论文文献综述）
武文鹏[1]（2016）在《电针对吗啡戒断大鼠Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响》文中研究指明目 的:观察电针对吗啡戒断大鼠空间学习记忆能力、VTA和NAc脑组织病理形态学、单胺类神经递质、Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响,探讨电针减轻吗啡戒断症状的作用机制,为吗啡戒断的临床治疗提供实验基础和理论依据。方 法:采用Morris水迷宫筛选出学习记忆能力正常的SD大鼠56只,将其随机分为对照组14只、造模组42只。采用剂量递增法颈背部皮下注射吗啡,连续5日,每日2次;末次吗啡注射3小时后,纳洛酮进行急性催促戒断。造模成功的 42只大鼠再随机分为模型组、针刺组、电针组,每组各 14只。其中对照组和模型组进行与针刺组相同时间、相同程度的捉抓刺激,不予任何治疗干预。针刺组取大鼠“神庭”穴、“百会”穴、双侧“肾俞”穴,常规消毒,以毫针分别刺入上述腧穴,进针2～3mm,快速捻转1min，留针15min,1次/日,连续干预6日。电针组取穴同针刺组,在针刺组操作的基础上将“神庭”穴与“百会”穴连接至导线的正负极;双侧“肾俞”穴连接至导线的正负极,接通电针治疗仪,选用疏密波（频率为2/100Hz）,干预15min,1次/d,连续干预6d。采用Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力;在光镜下观察VTA和NAc脑组织病理学变化;采用ELISA法进行测定血清单胺类神经递质（DA、5-HT、NE）含量;流式细胞术检测VTA和NAc神经细胞内[Ca2+]i和 CaM活性;免疫组化染色检测 CaMK Ⅱ和 CREB 阳性表达,及CaMK Ⅱ和CREB磷酸化;实时定量荧光PCR检测VTA和NAc神经元 CaMKⅡ α亚基 mRNA表达及 CaMK Ⅱ α亚基磷酸化水平;Western Blot 检测 VTA 和 NAc 神经元 CaMK Ⅱ α 蛋白表达及CaMK Ⅱ α亚基磷酸化水平。应用SPSS 1 8.0软件包进行统计分析,计量资料以-x±S表示,组间均数比较采用单因素方差分析,方差齐时用LSD法进行组间两两比较,方差不齐时用Tamhαne’s T2检验,P<0.05差异有统计学意义。结 果:1.体质量变化:针刺干预后,与对照组比较,模型组大鼠体质量下降明显,差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,针刺组和电针组大鼠体质量具体显着性差异（P<0.05）。与针刺组比较,电针组大鼠体质量无显着性差异（P>0.05）。2.Morris水迷宫检测结果:在定向航行实验中,对照组、模型组、针刺组、电针组大鼠随着训练测试次数的增加,各组大鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短。同一时间点与对照组比较,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01）。同一时间点与模型组比较,针刺组和电针组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）。同一时间点与针刺组比较,电针组大鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05）。在空间搜索实验中,与对照组比较,模型组大鼠跨越平台次数明显减少（P<0.05）。与模型组比较,针刺组和电针组大鼠跨越平台次数显着增加（P<0.05,P<0.0 1）。与针刺组比较,电针组大鼠跨越平台次数明显增加（P<0.05）。3.HE染色结果:对照组:脑组织染色清晰,神经细胞形态规整,胞质胞核界限清晰,无组织水肿,散在少量的炎细胞,血管无充血。模型组:脑组织结构疏松,神经细胞形态欠规整,部分神经元细胞核固缩，胶质细胞明显增多,炎细胞数目增多,毛细血管肿胀。针刺组和电针组:脑组织病理状况有明显改变,主要表现为脑组织疏松程度明显减轻,神经元细胞核固缩数目减少,胶质细胞和炎细胞数目也减少,毛细血管肿胀减轻。4.血清单胺神经递质含量:与对照组比较,模型组大鼠血清DA、5-HT、NE含量显着升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。针刺组和电针组吗啡戒断大鼠血清DA、5-HT、NE含量显着减少,与模型组比较,差异具有统计学意义（P<0.01）。与针刺组比较,电针组血清DA、5-HT、NE含量减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.流式细胞术结果:针刺组和电针组大鼠VTA和NAc神经细胞内[Ca2+]i和CaM活性比模型组显着降低（P<0.05,P<0.01）。与针刺组比较,电针干预抑制慢性吗啡依赖纳洛酮急性催促戒断所引起的神经细胞内[Ca2+]i 和 CaM 活性急剧升高更为显着（P<0.05）。6.免疫组化结果:与模型组比较,针刺和电针干预能够显着减少吗啡戒断大鼠 VTA和N Ac神经元 CaMKⅡ 阳性细胞表达（P<0.05,P<0.01）,减少CREB 阳性细胞表达（P<0.05,P<0.01）,抑制CREB磷酸化（P<0.05,P<0.01）,且电针组比针刺组更为显着（P<0.05）。7.实时定量荧光 PCR 结果:针刺和电针干预能够显着下调CaMK Ⅱ α mRNA表达,抑制CaMK Ⅱ α亚基磷酸化,与模型组比较差异具有显着性（P<0.05,P<0.0 1）,且电针组比针刺组更为显着（P<0.05）。8.Western Blot结果:针刺和电针干预能够显着下调CaMKⅡαmRNA蛋白表达,抑制CaMK Ⅱ α亚基磷酸化,与模型组比较差异具有显着性（P<0.05,P<0.01）,且电针组比针刺组更为显着（P<0.05）。结 论:1.电针能够减缓慢性吗啡依赖纳洛酮急性催促戒断大鼠体质量丢失,能够缩短吗啡戒断大鼠平台逃避潜伏期,增加跨越平台次数,改善空间学习记忆能力。2.电针能够改善吗啡戒断大鼠神经元病理形态学改变。3.电针能够降低吗啡戒断大鼠血清单胺类神经递质DA、5-HT、NE含量。4.电针能够抑制慢性吗啡依赖纳洛酮急性催促戒断引起的细胞内[Ca2+]i和CaM活性的急剧升高,下调VTA和NAc神经元CaMKⅡ阳性表达,下调VTA和NAc神经元CaMKⅡα亚基mRNA表达和蛋白表达,抑制CaMKⅡα亚基磷酸化,下调CREB核转录因子蛋白表达,并抑制CREB磷酸化。5.电针抑制吗啡戒断反应、改善吗啡戒断大鼠学习记忆能力可通过Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号途径发挥其生物学效应。
刘海青[2]（2016）在《KOR-NTSR1异源二聚化对KOR信号转导的影响》文中认为Kappa型阿片受体（kappa opioid receptor,KOR）及其内源性配体强啡肽（dynorphin）广泛分布于中枢神经系统,KOR结合配体后,经典的G蛋白通路的活化与KOR镇痛功能的实现密切相关,而非G蛋白依赖性通路的激活,尤其是β-arrestin依赖的信号通路活性的明显增强,往往直接引发KOR相关的负性情绪的出现。多项研究表明,在强迫行为以及习惯行为的养成方面有着重要作用的纹状体,KOR及其配体dynorphin的显着上调已被公认为是药物成瘾的明显标志,并且上调的KOR/dynorphin系统偏向性选择β-arrestin2依赖的信号通路,参与药物滥用以及药物成瘾的形成。因此,探寻纹状体内KOR激活后偏向性选择β-arrestin依赖的通路进行信号转导的根本原因,显然成为阐明药物滥用及成瘾机制研究中亟待解决的关键问题。KOR-DOR二聚体高选择性激动剂,6’-GNTI在脊髓水平具有很强的镇痛作用,但是脑室内给药却没有相似的效应出现,同时考虑到G蛋白偶联受体（GPCR）异源二聚体存在的广泛性以及其结构、功能的特异性,我们推测在脑内极有可能存在与KOR单体或KOR-DOR二聚体的不同另外的KOR表现形式,致使KOR信号通路从G蛋白依赖的经典途径转而选择非G蛋白依赖的通路。虽然大量研究证实了神经降压素（neurotensin,NT）及其受体（neurotensin receptor 1,NTSR1）系统与阿片系统之间的功能重叠性,尤其是KOR/dynorphin系统,但尚未见有关KOR与NTSR1之间相互作用的报道。利用免疫荧光染色结合原位邻位连接技术（PLA）,我们不仅发现KOR及NTSR1共定位于体外培养的纹状体神经元,并且初步鉴定KOR-NTSR1异源二聚体的内源性表达。本实验拟在前期工作的基础上,进一步确认KOR与NTSR1之间的异源二聚化相互作用关系,并对KOR-NTSR1异源二聚体对KOR介导的信号转导的可能影响进行了研究:（1）通过构建多种KOR、NTSR1融合表达载体,瞬时或稳定转染HEK293细胞,建立KOR和/或NTSR1表达的HEK293细胞模型。免疫印迹分析、细胞膜表面蛋白ELISA检测显示,各受体单表达组与共表达组细胞之间,受体表达量无明显差异;同时,免疫荧光染色结合共聚焦扫描观察,发现KOR、NTSR1主要定位于细胞膜上,表达均匀。提示,细胞模型构建正确,KOR、NTSR1融合表达载体表达稳定。（2）通过SOE-PCR技术,对KORTM4区域184以及196位氨基酸进行点突变,将上述位点亮氨酸突变成丙氨酸。成功构建KOR184、KOR196突变体后,瞬时或稳定转染HEK293细胞,建立KOR184/196和/或NTSR1表达的HEK293细胞模型。通过免疫印迹分析、细胞膜表面蛋白ELISA检测显示,各单表达与共表达组细胞内,KOR184/196的受体表达量与野生型KORWT相比较,无明显差异;免疫荧光染色结合共聚焦扫描显示,各单表达与共表达组细胞内,KOR184/196主要定位于细胞膜上,表达均匀稳定,与KORWT类似。（3）经 BRET、FRET、CO-IP 分析,发现 KORWT、KOR184 能与 NTSR1 发生异源二聚化,但KOR196与NTSR1无异源二聚化相互作用,提示:KOR的196位亮氨酸是KOR-NTSR1异源二聚体形成的关键位点;同时,KOR196与NTSR1共表达的细胞,可以作为异源二聚化结合的阴性对照,应用于KOR-NTSR1异源二聚体信号转导机制的实验研究。（4）通过细胞内cAMP水平的分析发现,在KOR、KOR184、KOR196独立表达组,给予dynophinA（1-13）刺激,FSK诱导的cAMP生成均受到明显的抑制:KORWT:最大抑制率=66.5%;KR184:最大抑制率=70%;KOR196:最大抑制率=63.9%。但在KORWT/NTSR1 和 KOR184/NTSR1 共表达细胞内,dynophin A（1-13）仅引起细胞内 cAMP水平轻微下降:KORWT:最大抑制率=14.7%; KOR184:最大抑制率=14.9%,而在KOR196/NTSR1组,cAMP水平与KOR196独立表达组相近。实验表明,异源二聚化结合NTSR1之后,dynorphinA（1-13）激活KOR后,对腺苷酸环化酶的抑制作用明显减弱。（5）为了验证cAMP结果,我们通过eBRET动态监测,对KOR偶联Gi蛋白的能力进行了分析。结果发现,KORWT/NTSR1和KOR184/NTSR1共表达细胞内,给予dynophin A（1-13）刺激时,KORWT/184与Gi蛋白的结合峰值明显低于KORWT/184独立表达组,而KOR196/NTSR1共表达组内,KOR196与Gi蛋白的结合与KOR196独立表达组相似。提示,异源二聚化结合NTSR1后,给予dynorphinA（1-13）时,KORWT/184偶联Gi蛋白的能力明显下降。（6）结合BRET1和eBRET检测发现,异源二聚化结合NTSR1之后,dynorphin A（1-13）刺激下,KORWT/184与β-arrestin1/2的结合峰值明显高于KORWT/184独立表达组,说明KOR WT/184募集β-arrestin1/2的能力明显增强,表现出明显的剂量依赖性以及时程上的延长:KOR WT/184与NTSR1共表达组,KOR WT/184与β-arrestin1/2的结合可延续到给药2h,而KORWT/T84独立表达组,仅维持到30min左右。（7）对ERK1/2磷酸化水平进行免疫印迹分析发现,异源二聚化结合NTSR1之后,dynorphin A（1 -13）刺激下,KOR WT/184介导的ERK1/2磷酸化表现出明显的时程上的改变,出现给药15min之后的持续性ERK1/2活化,且该持续性的ERK1/2磷酸化（30min）表现出明显的剂量依赖性。KOR196与NTSR1共表达组,未观察到与KOR196独立表达组存在ERK1/2磷酸化在时程上的差异。（8）为了探究KOR-NTSR1所介导的持续性的ERK1/2磷酸化的诱因,我们进一步进行了 β-arrestin1/2 shRNA以及PTX干预实验。β-arrestin1/2 shRNA分析发现,虽然β-arrestin 2几乎不参加dynorphin A（1-13）激活KORWT单体后ERK1/2的磷酸化,但是,在KORWT和NTSR1共表达的HEK293细胞,在转染β-arrestin2 shRNA后,本来在30min时间点出现的较强的ERK1/2的磷酸化几乎完全消失,甚至在5min时间点的早期磷酸化也受到明显的影响,与转染control shRNA的同组细胞于相同的时间点相比较,表现出明显的削弱。通过Gi/o蛋白的选择性抑制剂PTX干预实验发现,KORWT独立表达组,PTX预孵育后,dynorphin A（1-13）诱导的早期快速磷酸化（5min时间点）几乎完全消失,而在KORWT/NTSR1共表达的细胞内,PTX对dynorphin A（1-13）诱导的早期ERK1/2磷酸化抑制率仅余40%左右。β-arrestin1/2 shRNA和PTX实验结果提示,与NTSR1发生异源二聚化结合后,KOR所介导的G蛋白依赖的信号转导通路的活性明显削弱,同时β-arrestin2依赖通路的活性明显增强,（9）通过细胞内cAMP水平的检测以及BRET分析,对于KORWT/184和NTSR1共表达的细胞,NT（8-13）单独作用时,对FSK诱导的cAMP水平的升高,没有抑制作用,同时不会引起KORWT/184偶联Gi蛋白、结合β-arrestin1/2;在给予NT（8-13）+dynorhpin A（1-13）共刺激时,KOR WT/184对cAMP生成的抑制作用、偶联Gi蛋白的能力以及募集β-arrestin1/2的能力均恢复到dynorhpinA（1-13）刺激KORWT/184独立表达组细胞的水平。即给予NT（8-13）共刺激,能有效逆转因KORWT/184-NTSR1异源二聚体形成所致的,KOR介导的腺苷酸环化酶活性抑制作用的降低、KOR偶联Gi蛋白能力的降低以及对β-arrestin1/2募集能力的显着增强。（10）通过BRET检测,给予NT（8-13）可导致KOR与NTSR1之间的异源二聚化作用明显减弱,表现为BRET值的浓度依赖性以及时间依赖性的降低。随后的PLA实验验证了 BRET结果,给予NT（8-13）刺激30min,KOR与NTSR1共表达组,代表异源二聚体多寡的PLAP阳性产物明显减少。同时,上述NT（8-13）所介导的BRET值的下降以及PLAP阳性扩增产物的减少与dynorhpinA（1-13）刺激与否无关,提示:只要NTSR1激活,KOR-NTSR1二聚体即有可能出现构象改变或两原聚体发生解聚。通过免疫印迹分析KOR和NTSR1共表达细胞内ERK1/2磷酸化,发现给予NT（8-13）共刺激时,dynorhpin A（1-13）失去诱导持续性ERK1/2磷酸化的能力,即NT（8-13）可以明显抑制dynorhpin A（1-13）刺激 KOR-NTSR1 异源二聚体时引发的 β-arrestin1/2 依赖的 ERK1/2 磷酸化,上述抑制作用表现为明显的剂量依赖性增强。该部分结果提示,NTSR1的激活与否,是决定KOR-NTSR1异源二聚体中KOR选择G蛋白依赖性或β-arrestin2依从性信号通路的关键因素。综上所述,本实验首次原代培养的纹状体神经元,证实了 KOR-NTSR1异源二聚体的内源性表达,并于转染的HEK293细胞内确认了 KOR与NTSR1之间的异源二聚化相互作用关系;通过观察与Gi蛋白、β-arrestin1/2结合能力、对cAMP抑制作用以及对ERK1/2活化等方面的研究发现,与NTSR1发生异源二聚化相互作用后,KOR介导的Gi依赖的通路明显减弱,同时非G蛋白依赖的通路,尤其是β-arrestin1/2依赖的信号转导明显增强。实验结果充分证实了 “NTSR1是纹状体内KOR的工作伙伴”的假设,本研究为纹状体内KOR偏向性选择β-arrestin依赖的通路的现象提供了坚实的实验依据,也为阐明药物滥用及成瘾的机制提供可靠的理论依据。本研究同时还发现NTSR1的激活,可以逆转基于KOR-NTSR1异源二聚化作用而发生的KOR信号通路的转换,促使KOR经由经典的Gi依赖的通路进行信号转导,该结果不仅为NT/NTSR1系统参与痛觉调制以及安定作用的实现提供了理论基础,也为充分发挥病理状态下明显上调的KOR/dynorphin系统的作用提供新的理论支持;本研究同时为药物滥用及成瘾的防治提供了新的思路,并为新型抗成瘾药物的开发提供了有效的作用靶点,具有重要的实际意义和临床应用前景。
盖璐[3]（2016）在《中脑腹侧被盖区硫氧还蛋白-1低表达增强吗啡所致条件性位置偏好》文中进行了进一步梳理药物成瘾（Drug addiction）通常是指某些精神活性药物长期反复使用,作用于大脑奖赏系统,导致依赖和复吸等,是一种慢性、复发性脑病,其发病机制复杂,尚不清楚。吗啡是阿片类的一种,临床上主要用来抑制疼痛,长期使用可导致耐受和成瘾。依赖可分为生理依赖和心理依赖,生理依赖是由于机体对吗啡产生适应性改变,停药后导致生理紊乱,心理依赖是指吗啡戒断后对药物的渴求和强迫性觅药。与吗啡成瘾相关的脑区主要有中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area of the midbrain,VTA）、伏隔核（the nucleus accumbens,NAc）、前额叶皮层（prefrontal cortex,PFC）、杏仁核和海马等。VTA区和其投射的靶区NAc区属于中脑边缘多巴胺奖赏系统,参与药物依赖病理过程。VTA区是多巴胺神经元集中的脑区,成瘾药物作用于VTA引起多巴胺（dopamine,DA）水平升高。VTA的神经纤维投射至NAc,也可导致NAc区DA的水平升高,作用于DA受体,而引起下游分子的改变。cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein, CREB）,酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）和细胞周期依赖蛋白激酶5（Cyclin-depdent kinase5,CDK5）都与药物产生的奖赏效应相关。吗啡给药后会使机体产生氧化应激,氧化还原平衡状态失调。硫氧还蛋白-1 （Thioredoxin-1,Trx-1）是体内重要的抗氧化蛋白。它具有促进细胞增殖、调节转录因子活性及抗凋亡等作用,然而Trx-1在吗啡成瘾过程中的作用及其机制还不清楚。我们选取Trx-1为研究靶点,研究其在吗啡成瘾中的相关信号通路,利用核团定位注射技术,在小鼠VTA区双边注射Trx-1特异性干扰RNA,构建VTA区Trx-1低表达小鼠,并比较对照组和低表达小鼠对吗啡所致条件位置偏好（conditioned place preference,CPP）和运动能力的改变。最后利用蛋白免疫印迹技术（western blot,WB）检测VTA、NAc脑区中与吗啡成瘾相关蛋白Trx-1、p-CREB、 TH、D1以及CDK5的表达。结果：本课题证实了VTA区Trx-1低表达后,吗啡所致小鼠的条件性位置偏好作用和运动能力增强。蛋白质免疫印迹结果显示Trx-1低表达小鼠的VTA区和NAc区Trx-1的表达明显降低,吗啡作用后p-CREB、TH、D1及CDK5的表达显着上调。总结：Trx-1低表达增强吗啡所致的条件性位置偏好,低表达Trx-1增强了吗啡引起的相关信号通路蛋白表达的增加,因此,Trx-1可作为吗啡成瘾治疗的新的靶点,为进一步明确吗啡成瘾机制提供了理论依据。
张雅静,文迪,杨胜昌,于峰,马春玲,丛斌[4]（2016）在《八肽胆囊收缩素及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠脑内CaMK Ⅱ蛋白表达的影响》文中进行了进一步梳理目的观察八肽胆囊收缩素（CCK-8）、CCK-1受体拮抗剂L-364,718及CCK-2受体拮抗剂LY-288,513对吗啡戒断大鼠额叶皮质、海马、纹状体细胞内钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）表达的影响。方法建立吗啡依赖及纳洛酮催促戒断大鼠模型,观察CCK-8、L-364,718及LY-288,513对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响;采用Western blot方法检测上述脑区CaMKⅡ蛋白表达的变化。结果①CCK-8、L-364,718及LY-288,513能明显改善吗啡依赖大鼠戒断症状的发生;②与盐水对照组相比,吗啡依赖组大鼠额叶皮质、海马、纹状体细胞内CaM KⅡ蛋白表达明显升高;纳洛酮催促戒断后上述脑区CaM KⅡ蛋白表达较吗啡依赖组均明显降低;③CCK-8、L-364,718及LY-288,513均使吗啡戒断大鼠额叶皮质、海马及纹状体内CaMKⅡ蛋白表达升高。结论 CaMKⅡ参与了吗啡依赖及戒断的形成,CCK-8及其受体拮抗剂抑制吗啡依赖大鼠戒断反应的机制可能与其对相关脑区CaMKⅡ蛋白表达的调节有关。
佟艳华[5]（2014）在《PC12细胞—大鼠μ阿片受体稳定表达系的建立与胍丁胺调节阿片功能分子机制研究》文中研究表明药物成瘾已成为严重的全球性公共卫生问题和突出的社会问题。根本原因在于药物成瘾的分子生物学机制尚未阐明，缺乏理想的药物靶标和医学生物学干预手段。本实验室前期研究发现胍丁胺自身不成瘾，通过激活I1咪唑啉受体（I1-imidazoline receptor，I1R）增强阿片镇痛、拮抗阿片耐受，对阿片躯体和精神依赖具有较好的预防与治疗作用，对稽延症状有效，具备理想的防复吸候选药物特点。进一步研究发现，内源性胍丁胺和上述外源性胍丁胺作用类似，对阿片成瘾亦具有显着抑制作用。据此本课题组提出了“胍丁胺——I1R可能构成了又一新的阿片功能调节系统”的科学假说。深入研究I1R调节阿片功能的相关分子生物学机制，对促进I1R成为新型抗阿片成瘾的药物靶标具有重要的理论意义和实际应用价值，将为揭示阿片成瘾的分子机制提供有益的线索。遗憾的是I1R和α2肾上腺素受体（α2adrenergic receptor, α2AR）几乎在所有组织与细胞中同时表达，并且作用于I1R的药物也都能作用于α2AR，无特异性I1R工具药物。这些严重阻碍了I1R调节阿片功能分子机制的研究进展。大量研究工作证实，大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞（pheochromocytoma cell，PC12）经神经生长因子诱导后具有一定神经元生物学特征，表达有I1R，但不表达α2AR和μ阿片受体。本研究采用慢病毒感染技术实现了在PC12细胞中稳定表达了大鼠μ阿片受体（ratmu opioid receptor，rMOR），采用流式细胞分选技术筛选出高表达rMOR的PC12细胞，经单克隆细胞的放大培养后获得了多个表达rMOR的单克隆细胞系，经相关鉴定后建立具有神经元特性、无α2AR干扰、具有rMOR与野生型I1R共表达的稳定细胞系，为研究胍丁胺调节阿片功能的细胞生物学机制提供了一个较为理想的细胞模型。在此模型上，我们观察了胍丁胺对慢性吗啡处理引起的cAMP超射的抑制作用及抗吗啡细胞增殖抑制作用。在此基础上，利用生化药理学技术在此细胞模型上研究了胍丁胺调节阿片功能的可能分子机制。1、PC12细胞-rMOR稳定表达细胞系的建立为了达到建立PC12细胞-μ阿片受体稳定表达细胞系的实验目的，我们首先构建了慢病毒表达载体pBPLV-rMOR-eGFP，包装获得慢病毒，对PC12细胞进行感染，感染72h后细胞生长状态良好。用二脒基苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对此细胞核进行染色后，在荧光显微镜下可观察90%的PC12细胞有增强型绿色荧光蛋白（enhanced fluorescent protein，eGFP）表达，荧光均匀分布于整个细胞中，表明含有rMOR的pBPLV-rMOR-eGFP慢病毒载体在PC12细胞中可以高效表达，提示此实验方法可行。在上述预实验基础上，我们应用此方法对PC12细胞进行感染，在病毒感染3d后，采用流式细胞仪对高表达eGFP的PC12细胞进行分选（eGFP高表达的细胞占全部有荧光的细胞比例约为15.7%）。将分选得到的高表达eGFP细胞利用有限稀释法（0.8个细胞/100μL）接种于96孔板，逐级扩大培养获得在PC12细胞中稳定表达rMOR的单克隆细胞系。用RT-PCR对有荧光表达的PC12单克隆细胞系进行mRNA检测，结果发现感染后有荧光表达的PC12细胞在1.2kd附近有明显条带，这与rMOR基因理论分子量（1198bp）的位置相同，表明rMOR有表达，而未感染病毒的PC12细胞未见此特异性条带出现。从而在mRNA水平证明了rMOR在PC12细胞中的表达。在此基础上，利用阿片受体放射性配体[3H]-二丙诺啡为工具，采用放射配体受体结合实验技术从扩大培养获得的34株表达eGFP的PC12单克隆细胞系中成功筛选出了15株μ阿片受体表达水平较高的细胞系。进一步选定第12号克隆进行进一步研究工作。利用饱和实验对rMOR亲合力和表达水平进行研究。结果发现rMOR与[3H]-二丙诺啡结合的Kd值为0.51±0.07nM，与文献报道相似，Bmax为1.58±0.15pmol/mg （n=3）。那么，在此表达系统中表达的rMOR是否具有细胞信号传递功能呢？为了回答此问题，我们用10μM吗啡分别对PC12细胞和PC12-rMOR细胞进行10min刺激，采用蛋白免疫印迹的方法检测p-ERK与ERK的比值，以确定吗啡对rMOR的激活情况，以此检测PC12细胞中表达的rMOR激活后对细胞信号的传递功能。结果发现，与PC12细胞相比，PC12-rMOR细胞的ERK磷酸化水平显着升高（P<0.001，n=3）。上述结果表明在PC12细胞中表达的rMOR蛋白具有与野生型μ阿片受体相同的生物学特征。2、胍丁胺在PC12-rMOR细胞上抗吗啡依赖和吗啡耐受形成的作用表达有阿片受体的细胞系经吗啡慢性处理后，在纳洛酮催促下会出现cAMP显着升高，称此为cAMP超射。被学界公认为阿片依赖的细胞生物学指标。在本实验中，用吗啡（1100μM）慢性处理PC12-rMOR细胞24小时后，纳洛酮（10μM）催促15min可显着引起胞内cAMP浓度升高。与未经吗啡处理的对照组相比，20μM的吗啡可引起胞内cAMP含量升高255±25.2%（p <0.01，n＝5），而同样的方式处理未表达rMOR的PC12细胞时，对细胞内cAMP含量无影响。胍丁胺（10100μM）伴随吗啡（20μM）慢性慢性处理后，胍丁胺（10μM～100μM）能够浓度依赖性抑制纳洛酮（10μM）催促引起的cAMP超射，胍丁胺浓度为100μM时能够将cAMP超射水平抑制65.2%，与吗啡处理组相比具有显着性差异（p <0.01， n=5）。大量文献报道，吗啡耐受的形成与吗啡长期作用于机体导致中枢神经系统神经元发生凋亡有关。而本课题组前期研究发现胍丁胺对阿片耐受具有拮抗作用，其作用机制尚不十分清楚。因此，我们在PC12-rMOR细胞上采用CCK-8细胞活力检测技术评价吗啡和胍丁胺慢性处理96小时后对活细胞数量的影响以及胍丁胺是否能抑制吗啡对活细胞数量的影响。结果发现，吗啡（160μM～2.5mM）能浓度依赖性减少活细胞的数量，当吗啡浓度达640μM时对减少活细胞数量的减少与盐水对照比较具有统计学差异（p <0.05，n＝3）。当吗啡浓度达到750μM时对PC12-rMOR活细胞数量减少作用具有显着性差异（p <0.01，n＝3），当达到mM水平细胞出现死亡。胍丁胺（2.5μM～160μM）能浓度依赖性促进活细胞数量的增加，当胍丁胺浓度达2.5μM时与盐水对照比较具有统计学差异（p <0.05，n＝3），160μM具有显着性差异（p <0.01，n＝3），浓度达到640μM时其效应消失，但未检测到对细胞的毒性。在此细胞模型上，用不同浓度胍丁胺（2.5μM160μM）与750μM吗啡共同处理PC12-rMOR细胞96小时，胍丁胺2.5μM就能显着地抑制吗啡对细胞增殖的阻碍作用，随着浓度增加，抑制效应也随之加强，当胍丁胺浓度达160μM时能显着地抑制吗啡对活细胞数量减少作用（p <0.01，n＝3）。3、胍丁胺调节阿片功能的可能分子机制在上述细胞模型上利用蛋白免疫印迹方法研究发现：1)分别用20μM吗啡和100μM胍丁胺慢性处理PC12-rMOR细胞72小时均能显着激活p-ERK（p <0.01，n=3），胍丁胺伴随吗啡预处理PC12-rMOR细胞72小时后与单纯吗啡处理组相比，p-ERK不但没进一步加强，反而呈现降低趋势；2)20μM吗啡慢性处理PC12-rMOR细胞72小时后，CREB和p-CREB显着下降（p <0.01，n=3），100μM胍丁胺处理使PC12-rMOR细胞72小时使CREB和p-CREB显着升高，胍丁胺伴随吗啡处理能显着抑制吗啡所致的CREB和p-CREB降低（p <0.05，n=3）；3)20μM吗啡慢性处理72小时后IκB水平显着升高，100μM胍丁胺处理72小时后IκB显着降低（p <0.05，n=3），胍丁胺伴随吗啡给药能显着抑制吗啡慢性作用引起的IκB升高（p <0.01，n=3）；20μM吗啡慢性处理72小时后NF-κB表达水平显着降低（p <0.05，n=3），100μM胍丁胺处理72小时NF-κB水平显着升高（p <0.05，n=3），胍丁胺伴随吗啡处理能显着拮抗吗啡引起的NF-κB降低（p <0.05，n=3）。研究结论：1.成功实现了rMOR在PC12细胞中的稳定表达，并具有与野生型μ阿片受体相同的受体功能特征，为体外研究胍丁胺调节阿片功能的分子机制提供了理想的研究模型；2.胍丁胺（10μM～100μM）在PC12-rMOR细胞模型上能浓度依赖性抑制慢性吗啡处理、纳洛酮催促引起的cAMP超射，即在该细胞模型上胍丁胺能较好地抑制吗啡依赖的形成；3.胍丁胺在PC12-rMOR细胞模型上能浓度依赖性抑制吗啡慢性处理所致细胞凋亡，可能是其拮抗吗啡耐受形成的机制之一；4.胍丁胺调节阿片功能分子机制可能与抑制吗啡所致p-ERK升高和拮抗CREB、p-CREB、NF-κB的降低有关。
张雅静[6]（2009）在《CCK-8对吗啡戒断大鼠皮质、海马、尾壳核神经元Ca2+-CaM-CaMKⅡ信号通路的影响》文中指出目的:长期应用阿片类物质必将导致躯体依赖和精神依赖的形成。大量摄入外源性阿片样化合物（EOC）如吗啡、海洛因等,可抑制内源性阿片肽（EOP）的形成和释放,一旦撤药,体内EOP和EOC都会缺乏,导致以戒断症状为主要表现的生理机能严重紊乱,同时伴随强烈的心理渴求。躯体依赖和精神依赖是导致阿片类物质滥用的主要原因,对其机制的研究一直是热点问题。迄今为止,阿片成瘾的确切机制还不十分清楚。多年的研究发现内源性阿片肽的变化不足以解释阿片耐受、依赖和戒断的形成,遂即人们将研究的重点集中到了阿片受体后效应。其中,与受体偶联的胞内钙（calcium, Ca2+）、钙调素（calmodulin, CaM）、钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, CaMKⅡ）的改变在吗啡依赖和戒断反应过程中具有重要作用。胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）最早发现于肠道并作为胃肠肽激素调节胆囊收缩和胰腺的分泌功能,后来研究发现CCK广泛存在于中枢和周围神经系统,作为神经递质或调质发挥重要作用。CCK在体内存在多种活性形式,其中八肽胆囊收缩素（Cholecystokinin Octapeptide, CCK-8）是存在于小肠、血液和中枢神经系统最重要的活性形式,通过与受体结合而发挥作用。CCK受体有两种形式,CCK1主要分布于外周组织,而CCK2主要分布在中枢神经系统。研究表明,中枢CCK-8作为一种抗阿片物质,能对抗阿片引起的摄食增加,拮抗吗啡镇痛和阿片肽镇痛。CCK受体拮抗剂不但能针对戒断症状进行对症治疗,而且有一定程度的防止复吸的作用,但具体机制还未完全阐明。皮质、尾壳核、海马等脑区与吗啡成瘾密切相关,因此本实验采用剂量递增法建立吗啡依赖大鼠模型,以纳洛酮催促戒断建立吗啡戒断模型,从Ca2+-CaM-CaMKⅡ信号通路入手研究CCK-8及其受体拮抗剂抑制吗啡戒断反应的分子机制。方法:健康雄性Wistar大鼠66只,体重190g-210g,随机分为11组:盐水对照组（N.S组）、依赖组（Mor组）、戒断组（Mor+Nal组）、CCK-8慢性干预组（CCK-8+Mor+Nal组）、CCK1R拮抗剂L-364,718慢性干预组（L-364,718+Mor+Nal组）、CCK2R拮抗剂LY-288,513慢性干预组（LY-288,513+ Mor+ Nal组）、溶剂对照慢性干预组（Vehicle+Mor+Nal组）、CCK-8急性干预组（Mor+CCK-8+Nal组）、CCK1R拮抗剂L-364,718急性干预组（Mor+L-364,718+ Nal组）、CCK2R拮抗剂LY-288,513急性干预组（Mor +LY-288,513 + Nal组）、溶剂对照急性干预组（Mor+Vehicle+Nal组）。应用剂量递增法皮下注射盐酸吗啡（10-50mg·kg-1,每日2次,连续5天）建立吗啡依赖模型,第6天8时给予吗啡一次50mg·kg-1,2小时后注射纳洛酮5mg·kg-1建立催促戒断模型,以腹腔注射CCK-8及受体拮抗剂进行干预。模型建立后取大鼠皮质、海马和尾壳核,采用流式细胞术测定神经细胞内游离钙离子浓度（[Ca2+]i）和钙调蛋白活性（CaM activity）;Western-blot方法检测大鼠皮质、海马和尾壳核内CaMKⅡ蛋白表达的变化。结果:1 CCK-8及受体拮抗剂对吗啡戒断症状的影响纳洛酮催促戒断后大鼠体重下降,较吗啡依赖组明显下降（P<0.05）,并出现湿狗样抖动、齿颤、流泪、流涎等症状,说明催促戒断模型建立成功。CCK-8及CCK1R拮抗剂L-364,718和CCK2R拮抗剂LY-288,513均可抑制戒断大鼠体重减轻和其他戒断症状的发生。2 CCK-8及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠不同脑区[Ca2+]i的影响吗啡依赖组大鼠皮质、尾壳核和海马内[Ca2+]i显着高于对照组（P<0.01）,戒断后[Ca2+]i均有显着性降低（P<0.01）。慢性CCK-8、L-364,718和LY-288,513干预可使纳洛酮催促戒断后尾壳核、海马的[Ca2+]i明显升高（P<0.01或P<0.05）,而皮质与戒断组相比无显着差异（P>0.05）。急性L-364,718、LY-288,513干预使戒断后海马、尾壳核[Ca2+]i明显升高（P<0.01或P<0.05）,皮质则无明显变化（P>0.05）;溶剂和急性CCK-8干预作用不明显,皮质、海马、尾壳核[Ca2+]i与戒断组相比均无显着差异。3 CCK-8及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠不同脑区CaM活性的影响吗啡依赖组大鼠皮质、海马、尾壳核内CaM活性明显高于对照组（P<0.01）,戒断后CaM活性显着降低（P<0.01）。慢性CCK-8、L-364,718、LY-288,513干预使纳洛酮催促戒断后皮质、海马、尾壳核内CaM活性明显升高（P<0.01或P<0.05）;急性L-364,718、LY-288,513处理,使戒断大鼠海马、尾壳核内CaM活性明显升高（P<0.05）,皮质无明显变化（P>0.05）;溶剂和急性CCK-8干预作用不明显,皮质、海马、尾壳核内CaM活性与戒断组相比均无显着性差异（P>0.05）。4 CCK-8及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠不同脑区CaMKⅡ蛋白表达的影响吗啡依赖组大鼠皮质、海马、尾壳核内CaMKⅡ蛋白表达较对照组明显升高（P<0.01）,戒断后CaMKⅡ蛋白表达显着下降（P<0.01）。慢性CCK-8、L-364,718、LY-288,513干预使纳洛酮催促戒断后皮质、海马、尾壳核内CaMKⅡ蛋白表达较戒断组显着升高（P<0.01）;急性L-364,718、LY-288,513处理,使戒断大鼠海马内CaMKⅡ蛋白表达较戒断组显着性升高（P<0.01）,皮质、尾壳核无明显变化;溶剂和急性CCK-8干预作用不明显,皮质、海马、尾壳核内CaMKⅡ蛋白表达较戒断组无显着性差异（P>0.05）。结论:CCK-8及其受体拮抗剂干预能够抑制吗啡依赖大鼠催促戒断反应,该作用可能是通过调节皮质、海马、尾壳核内Ca2+-CaM-CaMKⅡ信号转导途径来实现。该作用具有明显的脑区特异性。
赵艳梅[7]（2008）在《SNAPs与吗啡依赖关系的初步实验研究》文中认为阿片依赖是一种慢性复发性脑病,以强迫用药、不断增加药物摄入量和停药时出现戒断综合征为主要特征。目前阿片依赖发生的确切机制还不清楚。大量研究表明,突触可塑性的改变在阿片依赖过程中起了重要作用。这些变化包括突触前神经递质的释放和突触后受体的信号转导。以往研究发现,吗啡可以通过调节突触前影响神经递质释放的分子影响递质释放。在神经递质的释放过程中,囊泡膜和质膜的融合是影响递质释放的关键步骤。可溶性NSF附着蛋白（Soluble NSF attachment proteins,SNAPs）是一类在膜融合过程中发挥重要作用的蛋白质分子,介导了囊泡膜和质膜的融合,在哺乳动物中存在α-,β-,和γ- 3种亚型。鉴于SNAPs在膜融合过程中发挥的重要作用,SNAPs参与许多重要的生理进程,包括调节钙依赖的胞吐机制、刺激胰岛β细胞分泌胰岛素、增加肺泡II型细胞表面活性物质的分泌、参与有丝分裂过程中核膜的形成等。虽然大量研究表明SNAPs在神经递质释放的膜融合过程中起重要作用,但是SNAPs是否参与了阿片依赖过程中突触前神经可塑性的发生目前尚未见报道。为了揭示SNAPs与阿片依赖的关系,我们首先在大鼠吗啡依赖及戒断模型上观察了与神经可塑性关系密切的脑区伏隔核（nucleus accumbens,NAc）、尾壳核（caudate putamen,CPu）及海马（hippocampus,Hip）中SNAPs表达的变化,初步探讨SNAPs和吗啡依赖的关系。研究采用成年雄性Wistar大鼠,随机分为对照组、吗啡组和戒断不同时间组。吗啡组大鼠背部皮下注射吗啡8d,每日3次,剂量递增,对照组大鼠注射等体积生理盐水。吗啡组末次注射吗啡4 h后处死,断头取脑。自然戒断组分别在戒断不同时间处死动物。各组均设平行对照。利用RT-PCR和Western blot技术分别检测各脑区SNAPs的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与对照组相比,慢性吗啡依赖大鼠CPu内γ-SNAP的mRNA和蛋白表达水平均上调25%左右（P<0.01） （图1.4,图1.9）,NAc及Hip脑区则无明显变化,自然戒断d2、d3、d7组亦未观察到γ-SNAP明显的表达改变（图1.8,图1.10,表1.1,表1.3）。α-SNAP和β-SNAP在吗啡依赖和自然戒断状态下3个被检脑区（NAc、CPu、Hip）均未检测到明显的表达变化（图1.2,图1.3,图1.5,图1.6,图1.7,表1.1,表1.2）。以上结果说明:慢性吗啡依赖可增加CPu内γ-SNAP的表达,对α-SNAP和β-SNAP的表达没有影响,提示SNAPs 3种亚型在慢性吗啡依赖过程中行使不同的功能,可能与特定神经递质的分泌有关。慢性吗啡依赖及戒断引起的突触前神经递质释放改变可能不是由α-SNAP和β-SNAP表达量变化介导的,其具体机制可能与其内在活性变化或蛋白在细胞内的分布有关。为了进一步研究SNAPs与阿片依赖的关系,我们选择了一种与神经递质释放关系最为明确的亚型—α-SNAP进行研究。已有大量研究报道α-SNAP参与钙依赖的胞吐作用,该作用在神经递质释放过程中的囊泡膜与质膜的融合步骤中是至关重要的。且相关研究报道α-SNAP通过刺激NSF的ATP酶活性来发挥其在递质释放中的作用,α-SNAP对NSF的ATP酶刺激作用明显强于γ-SNAP。因此,虽然我们在动物模型上未检测到α-SNAP的蛋白表达变化,但由于其在递质释放中的重要作用,我们依然选择这种亚型作为研究对象。为了进一步研究α-SNAP的功能与吗啡依赖的关系,选择一个良好的、调控模式相对简单和直接的细胞模型是十分必要的。该细胞模型必须能够满足以下条件:（1）表达阿片受体;（2）拥有类似成熟神经内分泌细胞的一些特性,能释放与阿片依赖有关的神经递质,如单胺类、谷氨酸（glutamate,Glu）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid ,GABA）等。经过初步筛选,我们选择了分化的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y作为研究对象。据研究报道,SH-SY5Y细胞株经过维甲酸（retinoic acid,RA）分化后可表现出许多类似成熟神经元的特性,如神经突起变长、电刺激的兴奋性增加、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）表达增加、神经分泌颗粒增多等。在研究中我们发现,RA分化6天的SH-SY5Y细胞可形成较长的神经突起（图2.1）,免疫印迹分析检测到分化后的细胞内NSE表达增加（图2.2）。另外,在我们的研究中亦发现了RA分化后的细胞μ阿片受体（μopioid receptor,MOR）表达上调,与以往研究相一致（图2.3）。这些特性都为我们研究阿片依赖的分子机制提供了有力的条件,尤其是与突触前神经递质释放有关的分子机制。为了研究与阿片依赖有关的分子机制,我们首先需要在SH-SY5Y细胞上建立一个阿片依赖的细胞模型。阿片长期暴露后给予纳络酮催促戒断出现cAMP超射常常被作为评定阿片依赖模型建立是否成功的一个重要指标。本研究采用免疫竞争结合法,测定了吗啡处理前后细胞内cAMP含量的变化,发现100μM吗啡作用分化SH-SY5Y细胞24h后给予纳络酮催促戒断可形成明显的cAMP超射,cAMP含量约为催促前的2.36倍（图2.5）,证实了分化SH-SY5Y细胞上吗啡依赖的细胞模型建立是成功的。为了进一步确定吗啡处理过程中神经递质的释放情况,我们采用高效液相-电化学检测法（high performance liquid chromatography- electrochemical detection,HPLC-ECD）测定了急性吗啡作用及慢性吗啡作用纳络酮催促戒断后不同时间SH-SY5Y细胞培养上清液中单胺类神经递质的含量,探讨吗啡处理与神经递质释放的关系。结果显示,在急性吗啡作用下,单胺类神经递质,包括去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、多巴胺（dopamine,DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）的释放均受到普遍抑制（表3.1）。100μM吗啡孵育SH-SY5Y细胞10min1h,细胞培养上清内NE,DA和5-HT及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸（3,4-dihydroxy- phenylacetic acid,DOPAC） （DA代谢产物）和5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindolacetic acid,5-HIAA ）（5-HT代谢产物）均显着下降,其中NE含量从16.97 ng/g蛋白下降至5.34 ng/g蛋白,下降幅度以吗啡作用10min内下降最为明显（P <0.01）,在吗啡继续作用的50min内一直保持在较低水平（图3.4）。DA的变化趋势与NE类似,在吗啡作用的最初10min亦出现明显下降,而且下降幅度在2/3以上（P <0.01） （图3.6）。虽然5-HT在吗啡急性作用的早期出现中等程度的下降,但在吗啡继续作用的50min内,5-HT含量继续降低,至吗啡作用后1h达到基础水平的1/3左右（P<0.01）（图3.8）。与吗啡处理前相比,代谢产物DOPAC和5-HIAA均出现不同程度的降低（P<0.01） （图3.5,图3.7）。这些结果表明,急性吗啡作用可以显着抑制SH-SY5Y细胞单胺类神经递质的释放。在给予100μM吗啡孵育细胞24h后用100μM纳络酮催促戒断测定SH-SY5Y细胞上清单胺类神经递质的含量,结果发现:NE、DA和5-HT及其代谢产物DOPAC和5-HIAA均有不同程度的增加（表3.2）。NE的含量在戒断20 min后由戒断前7.59 ng/g蛋白增加至12.74 ng/g蛋白,增加50%左右,与催促前相比有显着性差异（P <0.01）,在戒断40min时恢复至戒断前水平（图3.9）。与NE相比,DA的变化趋势更加明显,DA在戒断的10min即有增加趋势,但与催促前相比无显着性差异（P> 0.05）,在戒断20min时达最高值,约为催促前基础水平的2倍（P <0.05） （图3.11）。5-HT在戒断后40min出现明显增高,增加幅度约为催促前的2倍（P <0.05） （图3.13）。与吗啡处理前相比,代谢产物DOPAC和5-HIAA均出现不同程度的增加（P<0.05） （图3.10,图3.12）。这些结果说明:慢性吗啡作用后给予纳络酮催促戒断可明显刺激SH-SY5Y细胞内单胺类神经递质的释放,在给予纳络酮2040min时培养上清中单胺类神经递质含量达到高峰,其后迅速下降。为了进一步探讨α-SNAP是否参与了吗啡处理引起的递质释放变化的调节,我们在SH-SY5Y细胞模型上又检测了吗啡作用不同时间α-SNAP的表达情况。结果发现,α-SNAP mRNA在吗啡作用的1h、6h、24h均未检测到明显的表达变化（图4.2）,Western blot检测吗啡作用1h、8h、24hα-SNAP的蛋白表达亦未发现明显改变（图4.3）,上述结果与动物模型上结果相一致。以上结果提示:吗啡作用不引起α-SNAP的表达变化。那么作为一个与神经递质释放关系密切的因子,它是否参与了吗啡处理引起的突触前可塑性的改变呢?研究发现,神经递质的胞吐过程有一系列分子事件的参与,包括囊泡移动、搭靠、融合、内吞等。现在公认的递质释放中膜融合的模式是“SNARE假说”。“SNARE假说”认为,在膜融合过程中,20S复合体的聚合和解聚是其中的关键步骤。复合体的聚合始于v-SNAREs和t-SNAREs的结合。v-SNAREs和t-SNAREs分别定位于囊泡膜和质膜上,t-SNAREs包括SNAP-25和Syntaxin。膜融合发生前,t-SNAREs与v-SNAREs结合形成一个沉降系数为7S的SNARE复合物。一个7S SNARE复合物可以吸引3个α-SNAP分子,然后招募NSF使其连接至膜上。这样,SNARE、NSF和α-SNAP就形成了一个20S复合体。20S复合体一旦形成,随即在NSF的ATP酶作用下水解,同时引起SNARE分子的变构,阻止其继续聚合。SANRE解体后,形成20S复合体的各个组分又被释放到胞浆中,参与下一轮的囊泡循环。由于膜融合过程中形成20S复合体的t-SNARE位于突触前膜,所以我们推测α-SNAP在参与膜融合发生的过程中其细胞内分布有可能发生了变化,如由胞浆分布转移至胞膜。因此,我们在SH-SY5Y细胞模型上采用免疫细胞化学结合激光共聚焦检测技术又继续观察了α-SNAP在吗啡处理后的亚细胞定位。结果发现,在吗啡处理24h后给予纳络酮催促戒断20min可观测到α-SNAP开始由胞浆向胞膜转位,在随后的40min内该现象一直持续存在。在纳络酮处理60min时,转位现象仍较明显（图4.5）。而急性吗啡作用1h内未检测到上述变化（图4.4）。以上结果说明:慢性吗啡处理后给予纳络酮催促戒断可引起α-SNAP由胞浆向胞膜的转位,其转位发生的时间与递质释放变化的时间大致吻合,提示其有可能与吗啡作用引起的神经递质释放变化有关。本研究通过测定吗啡处理及戒断不同状态下SNAPs表达、亚细胞定位及神经递质的释放情况,得出以下结论:（1）慢性吗啡处理及自然戒断对大鼠脑区NAc、CPu和Hip内α-SNAP的表达无明显影响;（2）慢性吗啡处理可上调大鼠CPu内γ-SNAP的表达,但自然戒断无上述改变,慢性吗啡处理及自然戒断对大鼠NAc和Hip内γ-SNAP的表达均无明显影响;（3）SH-SY5Y细胞可用于建立慢性吗啡依赖模型;（4）急性吗啡处理可抑制SH-SY5Y细胞单胺类神经递质的释放,慢性吗啡处理后给予纳络酮催促戒断可刺激SH-SY5Y细胞单胺类神经递质的释放;（5）急慢性吗啡处理不影响SH-SY5Y细胞内α-SNAP的表达;急性吗啡处理不引起α-SNAP亚细胞定位的改变;慢性吗啡处理后给予纳络酮催促戒断可引起α-SNAP由胞浆至胞膜的亚细胞定位发生改变,其转位可能与戒断过程中神经递质释放增加有关。
赵丽[8]（2006）在《CCK-8对慢性吗啡作用的原代大鼠海马神经元的影响》文中研究说明阿片成瘾是对阿片类物质产生的一种身体或心理适应状态,表现为失去控制地、强迫地、不顾后果地滥用阿片类物质,以及对阿片类物质的渴求。阿片类物质依赖包括身体依赖（表现为停药后的戒断症状）和精神依赖（表现为满足感和重新用药的渴求或是为了避免停药后的不适而对药物的渴求）。然而,迄今为止,阿片成瘾的确切机制仍不清楚,在对成瘾的治疗方面也进展缓慢。近来研究表明,多个信号转导通路参与阿片依赖形成,例如:AC-cAMP-PKA-CREB、NO-cGMP、Ca2+-CaM-CaMK-CREB等信号通路。长期使用阿片受体激动剂可引起受体、效应器、相关蛋白的磷酸化,多种蛋白激酶如:蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、G蛋白偶联受体激酶（GRK）和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等参与磷酸化过程。它们在阿片受体的信号传导、阿片类药物的耐受性、依赖性等方面起重要作用。胆囊收缩素（cholecystokinin ,CCK）最早发现于肠道并作为胃肠激素调节胆囊收缩和胰腺的生长分泌功能,后来的研究发现CCK广泛存在于中枢和周围神经系统,作为神经递质或调质发挥重要作用。CCK在体内存在多种活性形式,包括4、8、33、39和58肽等,其中八肽胆囊收缩素（CCK-8）是存在于小肠、血液和中枢神经系统最高的活性形式。药理学实验证实CCK受体有两种亚型:CCK-A受体,主要分布于外周组织;CCK-B受体,主要分布于中枢神经系统（CNS）,这两种受体现已被成功克隆。解剖学研究表明:在CNS CCK-8、CCK-R、内源性阿片物质和阿片受体平行分布,在许多生理反应中,他们的作用相反,例如:疼痛、情绪的调节、情感状态和记忆过程等。CCK-8是目前已知的作用最强的内源性抗阿片肽,连续注射递增剂量的吗啡,可使脑内CCK-8及其mRNA表达升高;行为学研究表明:CCK（0.01和0.1mg/Kg）作用于吗啡依赖戒断大鼠可增加纳洛酮催促戒断后的戒断症状,如跳跃、齿颤、湿狗样抖动、躁动,同时也推迟吗啡引起的CPP（条件位置偏爱）的消退。然而CCK-B受体拮抗剂L365,260（0.1和1mg/Kg）能抑制吗啡依赖大鼠的戒断症状和CPP的形成。说明
闫玉仙[9]（2006）在《CCK受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠海马神经元的抑制作用及信号转导机制研究》文中研究说明毒品在世界范围的蔓延泛滥,不仅危害着人类的健康,造成肝炎、性病、爱滋病等疾病的感染和传播,而且还带来一系列的社会问题。据WHO统计,现今全球至少有5000万人染上药物依赖,连同其它医疗用药依赖者估计超过1亿人口,全球每年死于药物依赖的人口达10万人以上,据最新统计,目前我国登记在册的吸毒人数已经超过了100万,每年增加十几万到几十万人,并且呈逐年上升的趋势,对国民经济、人口素质和社会安定的危害是无法估量的。在我国主要以阿片类物质的滥用为主。长期应用阿片类物质必将导致身体依赖和心理依赖。身体依赖的形成是因长期大量应用外源性阿片制剂遏制了体内正常内源性阿片肽的形成和释放;同时阿片受体对大量外源性阿片制剂很快产生耐受,致使用药量越来越大,造成机体的一种病理性的稳态,一旦撤药,这种稳态难以维持,将导致以戒断症状为主要表现的生理机能严重紊乱。极强的身体依赖性是限制阿片物质临床应用以及导致阿片成瘾的重要原因,因此对其机制的研究始终是阿片类药物研究中的一个热点。吗啡依赖机制非常复杂,目前尚不清楚。在发现脑内阿片受体后的十余年中,许多学者通过对阿片受体密度、数目和亲和力改变的研究均不能解释吗啡依赖成因。近年人们发现药物依赖是一种中枢神经系统的长时程生物学效应,药物依赖的形成需要新的肽或蛋白质的合成,涉及到受体后信号转导,基因转录和翻译,效应子表达及其生物学效应的产生,所以将研究重点转移到受体后效应。其中与受体偶联的胞内Ca2+、钙调素（CaM）、Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶（CaMK）、核转录因子CREB磷酸化过程的改变在吗啡依赖和戒断反应过程中具有重要的作用。目前治疗阿片类药物成瘾的方法主要有替代治疗和对症治疗。替代治疗是以阿片受体激动剂进行剂量递减的治疗,其实质是以另一种阿片类似物进行替代以缓解成瘾者的戒断症状,不能解决替代药物潜在的成瘾性,
何萍[10]（2005）在《吗啡对大鼠交感神经节突触传递、胞内信号转导及形态学的影响》文中提出阿片类药物（以下简称阿片类）依赖已成当今世界严重的社会问题和医学问题。研究阿片类依赖的机制及其治疗对策,不仅是社会的当务之急,也是神经生物学研究的重要课题。对阿片类依赖性机理的研究,在行为、神经生化、细胞、分子水平都有了一定的进展。目前普遍认为,cAMP 信号系统的适应性上调可能参与了阿片类依赖的产生和发展。阿片类依赖的细胞适应性反应,除了包括细胞机能适应外,还包括形态适应,二者导致细胞的生理生化过程及组织结构的代偿性改变,最终达到病理状态的平衡。自主神经系统尤其是交感神经系统与阿片类依赖密切相关。有关交感神经系统与阿片类依赖的研究已在众多脑内的交感神经有关的核团中展开。某些资料提示,外周交感神经系统有可能参与了阿片类依赖的形成,但缺乏直接的证据。本研究在建立吗啡依赖大鼠模型的基础上,用多种研究方法——细胞内电生理记录技术、放射性免疫测定、免疫组织化学、RT-PCR 及电镜等方法,研究了吗啡对大鼠交感神经节突触传递、胞内信号转导和形态学特别是超微结构的影响。（一） 吗啡对大鼠交感神经节突触传递的影响制备来自正常大鼠和吗啡依赖大鼠的离体交感神经节——SCG 标本。运用细胞内电生理技术研究吗啡急性与慢性给药对SCG 突触传递的影响及其机制。1、来自正常大鼠离体SCG 标本的结果:（1）10-410-3mol/L 吗啡能可逆地完全或部分抑制绝大部分（39/42）SCG 神经元的f-EPSP或顺行AP。（2） 1×10-3 mol/L 吗啡不影响绝大部分（9/10）细胞的静息电位（RMP）、膜电阻（Rm）和直接AP 的幅度和时程。但在个别的细胞（1/10）引起膜去极化（平均幅度10.83±1.61mV,平均时程11.67±1.26min,给药3 次）,期间Rm 无显着性改变。（3） 1×10-3mol/L 吗啡可逆性地抑制锋电位后AHP 的幅度。（4） 1×10-3mol/L 吗啡抑制大部分（7/10）SCG 细胞的ACh 和Carb 除极反应均受到抑制,对少数细胞（3/10）的ACh 和Carb 除极反应无影响。（5）1×10-4mol/L 纳洛酮对f-EPSP、直接AP和RMP、Rm均无明显影响,可降低5×10-4mol/L
二、DFMO对吗啡依赖NG108-15细胞内cAMP含量的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DFMO对吗啡依赖NG108-15细胞内cAMP含量的影响（论文提纲范文）
（1）电针对吗啡戒断大鼠Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1. 成瘾的共同特征 |
| 1.1 正强化 |
| 1.2 负强化 |
| 1.3 药物耐受性 |
| 1.4 嗜欲 |
| 1.5 应激性刺激 |
| 2. 药物成瘾的形成机制 |
| 2.1 中枢奖赏系统 |
| 2.2 巴多胺系统 |
| 2.3 5-羟色胺系统 |
| 2.4 组胺 |
| 2.5 去甲肾上腺素 |
| 2.6 氨基酸类 |
| 2.7 阿片肽 |
| 2.8 非编码RNA( ncRNA)miRNA |
| 3. 药物成瘾相关脑区 |
| 3.1 中脑-边缘系统脑区 |
| 3.2 中脑导水管周围灰质 |
| 4. 戒断效应的神经基础 |
| 5. 药物依赖的治疗 |
| 5.1 药物治疗 |
| 5.2 外科治疗 |
| 5.3 心理行为疗法 |
| 5.4 运动促进疗法 |
| 6. 中医药在吗啡戒断中的研究进展 |
| 6.1 中药 |
| 6.1.1 单味药提取物/有效成分 |
| 6.1.2 复方 |
| 6.2 针灸 |
| 6.2.1 针刺 |
| 6.2.2 电针 |
| 6.2.3 温针灸 |
| 7. Ca~(2+)-CaM-CaMKⅡ -CREB信号通路与药物成瘾 |
| 7.1 信号转导与药物成瘾 |
| 7.2 Ca~(2+)-CaM-CaMK Ⅱ-CREB信号通路 |
| 7.3 Ca~(2+)-CaM-CaMK Ⅱ -CREB信号通路与吗啡依赖 |
| 实验研究 |
| 实验一 电针对吗啡戒断大鼠行为学及学习记忆能力影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 吗啡戒断动物模型制备 |
| 2.3 各组处理 |
| 2.4 体质量观察 |
| 2.5 戒断症状观察 |
| 2.6 Morris水迷宫行为学检测 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 慢性吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮急性催促戒断症状观察 |
| 3.2 各组大鼠不同时间点体质量变化比较 |
| 3.3 Morris水迷宫定向航行实验结果 |
| 3.4 Morris水迷宫空间搜索实验结果 |
| 3.5 所有干预方法未影响大鼠的运动能力 |
| 实验二 电针对吗啡戒断模型大鼠VTA和NAc脑区病理形态学的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 吗啡戒断动物模型制备 |
| 2.3 各组处理 |
| 2.4 标本制备 |
| 2.5 石蜡包埋 |
| 2.6 苏木素-伊红(HE染色) |
| 3. 实验结果 |
| VTA、NAc的HE染色结果 |
| 实验三 电针对吗啡戒断模型大鼠血清单胺类神经递质( DA、5 -HT、NE)的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 吗啡戒断动物模型制备 |
| 2.3 各组处理 |
| 2.4 血清标本制备 |
| 2.5 观察指标及方法 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 各组大鼠血清DA含量比较 |
| 3.2 各组大鼠血清5-HT含量比较 |
| 3.3 各组大鼠血清NE含量比较 |
| 实验四 电针对吗啡戒断模型大鼠Ca~(2+)-CaM-CaMK Ⅱ -CREB信号通路影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 吗啡戒断动物模型制备 |
| 2.3 各组处理 |
| 2.4 主要试剂配制 |
| 2.5 标本制备 |
| 3. 观察指标及方法 |
| 3.1 流式细胞术检测VTA和NAc胞内[Ca~(2+)]i |
| 3.2 流式细胞术检测VTA和NAc胞内CaM活性 |
| 3.3 VTA和NAc神经元CaMKI阳性细胞表达情况(免疫组织化学染色法) |
| 3.4 VTA和NAc神经元CaMK ⅡαmRNA表达情况(实时定量荧光PCR) |
| 3.5 VTA和NAc神经元CaMK Ⅱ α蛋白表达及其磷酸化水平(Western B 1ot法) |
| 3.6 VTA和NAc神经元CREB蛋白表达及其磷酸化水平(免疫组织化学染色法) |
| 4. 统计学处理 |
| 5. 实验结果 |
| 5.1 VTA和NAc神经细胞内[Ca~(2+)]i含量 |
| 5.2 VTA和NAc神经细胞内CaM活性 |
| 5.3 VTA和NAc神经元CaMKⅡ蛋白表达 |
| 5.4 VTA和NAc神经元CaMKⅡα mRNA表达 |
| 5.5 VTA和NAc神经元CaMKⅡα蛋白表达及pCaMKⅡα蛋白表达 |
| 5.6 VTA和NAc神经元CREB表达及CREB磷酸化 |
| 讨论 |
| 1. 动物模型制备 |
| 2. 中医学理论基础及干预方法选择依据 |
| 2.1 医学对本病证的认识 |
| 2.2 电针方法选择依据 |
| 2.3 腧穴选择依据 |
| 3. 脑区的选择 |
| 4. 电针对吗啡戒断大鼠学习记忆能力的影响 |
| 5. 电针对吗啡戒断大鼠VTA和NAc病理形态学的影响 |
| 6. 电针对吗啡戒断大鼠单胺类神经递质的影响 |
| 7. 电针对吗啡戒断大鼠Ca~(2+)-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路影响 |
| 8. 问题与展望 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 个人简历 |
（2）KOR-NTSR1异源二聚化对KOR信号转导的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 GPCR二聚化——“革命性”的新概念 |
| 1.2 GPCR最小的功能单位——单体还是二聚体? |
| 1.3 异源二聚体的鉴定标准 |
| 1.4 内源性受体之间相互作用的研究方法及策略 |
| 1.5 阿片系统与异源聚化系统的交集 |
| 1.6 阿片受体参与构成的异源二聚体的功能转归 |
| 1.7 阿片受体异源二聚化作用与新药的研发 |
| 1.8 KOR与NTSR1的功能相关性以及发生二聚化的可能性 |
| 1.9 本课题主要研究目的和研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞、质粒及菌株 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 主要液体配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SD大鼠纹状体神经元原代培养 |
| 2.2.2 HEK293细胞培养 |
| 2.2.3 原代培养的纹状体神经元内KOR与NTSR1表达的鉴定 |
| 2.2.4 PLA检测纹状体神经元内KOR与NTSR1之间的相互作用 |
| 2.2.5 真核表达载体的构建 |
| 2.2.6 HEK293细胞转染 |
| 2.2.7 转染HEK293细胞内受体表达的鉴定 |
| 2.2.8 免疫共沉淀检测 |
| 2.2.9 HEK293细胞内cAMP含量的检测 |
| 2.2.10 BRET检测 |
| 2.2.11 FRET检测KORs与NTSR1之间的相互作用 |
| 2.2.12 PLA检测HEK293细胞内KORs与NTSR1之间的相互作用 |
| 2.2.13 Western blot检测ERK1/2磷酸化 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 纹状体神经元中KOR及NTSR1的内源性表达及共定位 |
| 3.2 纹状体神经元内源性KOR-NTSR1异源二聚体的验证 |
| 3.3 重组真核表达载体的构建 |
| 3.4 KORs(野生型或突变体)和NTSR1在HEK293细胞中的表达 |
| 3.5 KOR及其突变体与NTSR1之间相互作用的检测 |
| 3.6 NTSR1与KOR异源二聚化作用对KOR介导的G蛋白信号转导的影响 |
| 3.7 KOR-NTSR1异源二聚化作用对KOR募集β-arrestin影响 |
| 3.8 KOR-NTSR1异源二聚化作用对KOR介导的ERK1/2磷酸化的影响 |
| 3.9 β-arrestin2参与KOR-NTSR1异源二聚体介导的持续性ERK1/2磷酸化 |
| 3.10 NTSR1的激活可削弱KOR-NTSR1异源二聚化相互作用 |
| 3.11 NT(8-13)对KOR-NTSR1异源二聚体介导的ERK1/2磷酸化的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 196位氨基酸是KOR与NTSR1发生异源二聚化结合的关键位点 |
| 4.2 异源二聚化结合NTSR1后KOR信号通路的转归 |
| 4.3 NTSR1在KOR信号转导通路选择中的独特导向作用 |
| 4.4 KOR-NTSR1异源二聚体是否参与疼痛与成瘾的调节? |
| 4.5 KOR-NTSR1异源二聚化研究的新方向 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 |
（3）中脑腹侧被盖区硫氧还蛋白-1低表达增强吗啡所致条件性位置偏好（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 吗啡成瘾 |
| 1.1.1 吗啡成瘾简介 |
| 1.1.2 吗啡成瘾机制 |
| 1.2 硫氧还蛋白-1的生物学功能 |
| 1.2.1 硫氧还蛋白-1简介 |
| 1.2.2 硫氧还蛋白-1的生物学功能 |
| 1.3 吗啡成瘾相关的主要分子 |
| 1.3.1 TH |
| 1.3.2 D1 |
| 1.3.3 CREB |
| 1.3.4 CDK5 |
| 1.4 蛋白免疫印迹 |
| 1.4.1 蛋白免疫印迹原理 |
| 1.4.2 蛋白质免疫印记的操作流程 |
| 1.5 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验方案 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物和药品 |
| 2.2.2 主要试剂和来源 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 C57BL/6小鼠饲养 |
| 2.3.2 脑立体定位注射 |
| 2.3.3 条件性位置偏爱实验 |
| 2.3.4 自主运动实验 |
| 2.3.5 组织取材及保存 |
| 2.3.6 小鼠脑组织蛋白质的提取 |
| 2.3.7 蛋白免疫印迹 |
| 2.3.8 统计学处理 |
| 第三章 Trx-1在吗啡引起的CPP中的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 行为学实验结果 |
| 3.2.1 低表达Trx-1小鼠引起吗啡导致的条件性位置偏爱 |
| 3.2.2 低表达Trx-1小鼠引起吗啡导致的自主运动能力增强 |
| 3.3 吗啡给药对VTA和NAc区Trx-1表达的影响 |
| 3.3.1 引言 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.3.3 小结 |
| 3.4 吗啡给药对VTA和NAc区p-CREB表达的影响 |
| 3.4.1 引言 |
| 3.4.2 结果 |
| 3.4.3 小结 |
| 3.5 吗啡给药对VTA和NAc区TH表达的影响 |
| 3.5.1 引言 |
| 3.5.2 结果 |
| 3.5.3 小结 |
| 3.6 吗啡给药对VTA和NAc区D1表达的影响 |
| 3.6.1 引言 |
| 3.6.2 结果 |
| 3.6.3 小结 |
| 3.7 吗啡给药对VTA和NAc区CDK5表达的影响 |
| 3.7.1 引言 |
| 3.7.2 结果 |
| 3.7.3 小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
（4）八肽胆囊收缩素及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠脑内CaMK Ⅱ蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1药品和试剂 |
| 1.2动物分组及给药方式 |
| 1.3大鼠脑组织的急性分离 |
| 1. 4Western blot法检测Ca MKⅡ蛋白的表达 |
| 1.5统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1吗啡催促戒断模型的成功建立 |
| 2.2 CCK-8及其受体拮抗剂对额叶皮质细胞内Ca MKⅡ蛋白表达的影响 |
| 2.3 CCK-8及其受体拮抗剂对海马细胞内Ca MKⅡ蛋白表达的影响 |
| 2.4 CCK-8及其受体拮抗剂对纹状体细胞内Ca MKⅡ蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
（5）PC12细胞—大鼠μ阿片受体稳定表达系的建立与胍丁胺调节阿片功能分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1、以阿片受体为靶标的戒毒药临床作用效果均不理想 |
| 2、阿片成瘾的形成涉及多个神经环路及多个信号转导途径 |
| 3、基于非阿片受体靶标的戒毒药可能有理想的临床疗效 |
| 4、非阿片肽类内源性生物活性——胍丁胺具备理想防复吸候选药物特点 |
| 5、科学问题 |
| 6、本课题研究内容 |
| 7、本课题研究主要结果 |
| 8、参考文献 |
| 第一章 PC12 细胞—大鼠μ阿片受体稳定表达细胞系的建立 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 载体和质粒 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 实验设计 |
| 2.6 实验方法 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组慢病毒表达载体 pBPLV-rMOR-eGFP 的构建 |
| 3.2 表达 rMOR 的 PC12-rMOR 细胞模型建立 |
| 3.3 PC12-rMOR 细胞中 rMOR 蛋白功能鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 参考文献 |
| 第二章 胍丁胺在 PC12-rMOR 细胞上抗吗啡依赖和吗啡耐受形成的作用 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验设计 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 吗啡对细胞内 cAMP 水平的影响 |
| 3.2 胍丁胺对吗啡引起的 PC12-rMOR 细胞依赖形成的影响 |
| 3.3 胍丁胺对吗啡引起的 PC12-rMOR 活细胞数减少的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 参考文献 |
| 第三章 胍丁胺调节阿片功能分子机制的研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验设计 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 胍丁胺对吗啡所致的 ERK 表达及 ERK 激活（p-ERK）的影响 |
| 3.2 胍丁胺拮抗吗啡引起 CREB 表达及 p-CREB 的影响 |
| 3.3 胍丁胺对慢性吗啡处理的 PC12-rMOR 中 NF-κB 及 IκB 表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）CCK-8对吗啡戒断大鼠皮质、海马、尾壳核神经元Ca2+-CaM-CaMKⅡ信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 CCK-8 对吗啡戒断大鼠皮质、海马、尾壳核神经元Ca~(2+)-CaM-CaMKⅡ信号通路的影响 |
| 引言 |
| 第一部分 CCK-8 对吗啡戒断大鼠皮质、海马、尾壳核神经元[Ca~(2+)]_i和CaM 活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CCK-8 对吗啡戒断大鼠皮质、海马、尾壳核神经元CaMKⅡ蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）SNAPs与吗啡依赖关系的初步实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究论文 SNAPs 与吗啡依赖关系的初步实验研究 |
| 引言 |
| 第一部分 慢性吗啡依赖及戒断对大鼠不同脑区SNAPs 表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SH-SY5Y 细胞慢性吗啡依赖模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 急、慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断对SH-SY5Y 细胞单胺类神经递质释放的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 急、慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断对SH-SY5Y细胞α-SNAP表达及亚细胞定位的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 SNAPs在神经胞吐机制中的作用 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）CCK-8对慢性吗啡作用的原代大鼠海马神经元的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 CCK-8 对慢性吗啡作用的原代大鼠海马神经元的影响 |
| 引言 |
| 第一部分 吗啡对原代培养大鼠海马神经元CCK受体mRNA表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CCK受体拮抗剂对吗啡作用原代大鼠海马神经元内PKA活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CCK受体拮抗剂对原代培养大鼠海马神经元PKC内活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CCK 受体拮抗剂对吗啡作用原代大鼠海马神经元内?FosB 蛋白表达量的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 CCK 受体拮抗剂对大鼠吗啡依赖戒断症状及脑内?FosB 蛋白表达量的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 药物成瘾的分子神经学机制 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）CCK受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠海马神经元的抑制作用及信号转导机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 CCK 受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠海马神经元的抑制作用及信号转导机制研究 |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠海马神经元中μ阿片受体、CCK 受体的表达及慢性吗啡作用对其表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CCK 受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠海马神经元内游离钙和钙调蛋白的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CCK 受体拮抗剂对吗啡依赖及纳洛酮催促戒断大鼠海马神经元CaMKⅡαmRNA、蛋白表达及蛋白活性表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CCK 受体拮抗剂对纳洛酮催促戒断大鼠海马神经元CRE磷酸化水平及CREB |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 胆囊收缩素对中枢阿片肽系统的调节作用 |
| 综述二 RGS 蛋白在阿片信号转导及耐受机制中的研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）吗啡对大鼠交感神经节突触传递、胞内信号转导及形态学的影响（论文提纲范文）
| 主要缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 吗啡对大鼠交感神经节突触传递的影响 |
| 实验一 吗啡依赖大鼠模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 吗啡对大鼠交感神经节突触传递的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 吗啡对大鼠交感神经节信号转导通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 吗啡依赖大鼠交感神经节的光镜、电镜形态学观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新、意义及展望 |
| 附录:目的基因mRNA 序列及 PCR 产物测序结果 |
| 论文参考文献 |
| 综述:阿片类药物依赖性的胞内信号转导机制 |
| 1 细胞内信号转导系统概述 |
| 2 阿片类依赖的胞内信号转导机制 |
| 2.1 AC-cAMP-PKA 通路 |
| 2.2 NO/NOS-cGMP 信号通路 |
| 2.3 Ca~2+-CaM-CaMK 信号通路 |
| 2.4 MAPK 信号转导通路 |
| 3 结语 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、DFMO对吗啡依赖NG108-15细胞内cAMP含量的影响（论文参考文献）
- [1]电针对吗啡戒断大鼠Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响[D]. 武文鹏. 黑龙江中医药大学, 2016(05)
- [2]KOR-NTSR1异源二聚化对KOR信号转导的影响[D]. 刘海青. 山东农业大学, 2016(02)
- [3]中脑腹侧被盖区硫氧还蛋白-1低表达增强吗啡所致条件性位置偏好[D]. 盖璐. 昆明理工大学, 2016(02)
- [4]八肽胆囊收缩素及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠脑内CaMK Ⅱ蛋白表达的影响[J]. 张雅静,文迪,杨胜昌,于峰,马春玲,丛斌. 中国药理学通报, 2016(03)
- [5]PC12细胞—大鼠μ阿片受体稳定表达系的建立与胍丁胺调节阿片功能分子机制研究[D]. 佟艳华. 中国人民解放军军事医学科学院, 2014(02)
- [6]CCK-8对吗啡戒断大鼠皮质、海马、尾壳核神经元Ca2+-CaM-CaMKⅡ信号通路的影响[D]. 张雅静. 河北医科大学, 2009(10)
- [7]SNAPs与吗啡依赖关系的初步实验研究[D]. 赵艳梅. 河北医科大学, 2008(01)
- [8]CCK-8对慢性吗啡作用的原代大鼠海马神经元的影响[D]. 赵丽. 河北医科大学, 2006(11)
- [9]CCK受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠海马神经元的抑制作用及信号转导机制研究[D]. 闫玉仙. 河北医科大学, 2006(11)
- [10]吗啡对大鼠交感神经节突触传递、胞内信号转导及形态学的影响[D]. 何萍. 广西医科大学, 2005(05)