一、蛋白酶抑制剂对大鼠肝缺血再灌注和原位肝移植后肝功能的保护作用（论文文献综述）
严启航[1]（2021）在《HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤》文中进行了进一步梳理[目的]缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfusion Injury,IRI）常发生在肝移植、肝切除、休克等情况下,特别对于肝移植来说,手术过程中不得不先阻断血流,完成血管重建后再恢复肝脏供血,从而导致了 IRI。由于肝移植IRI是不可避免且可以预见的,对于如何减轻IRI以提高供肝质量是目前改善肝移植术后患者预后和生活质量的首要策略。本课题组前期的研究已经发现血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1,HO-1）在肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic Ischemia Reperfusion Injury,HIRI）中发挥着重要的抗炎、抗氧化、抗应激功能。本研究拟通过腺相关病毒（Adeno Associated Virus,AAV）作为载体,构建大鼠HO-1的过表达载体,以及通过RNA干扰技术靶向干扰HO-1 mRNA的shRNA AAV载体,转入大鼠体内从而诱导肝脏HO-1过表达或将其沉默,再通过构建大鼠肝移植缺血再灌注损伤模型,在诱导供肝HO-1差异性表达的前提下,观察在肝移植缺血再灌注损伤后移植肝局部炎症以及组织病理学的改变,并初步探究其内在分子机制,以为临床上改善肝移植IRI提供一种新的思路和方法。[方法]1 构建大鼠HO-1 AAV载体、HO-1 shRNA AAV载体,分别转入SD大鼠体内,21 d后获取肝脏,荧光显微镜下观察共表达绿色荧光蛋白,qRT-PCR检测肝组织HO-1表达情况,验证转染效果。2 以热缺血10 min、冷缺血4 hr为基础构建SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型,采用“二袖套法”吻合门静脉和肝下下腔静脉,采用“支架法”重建胆总管。再灌注后6hr、24hr、3d和7d分别观察肝功能、肝脏组织形态学以及HO-1和炎症因子随时间的变化,明确变化最明显的时间点,进行后续研究。3 通过尾静脉给供体SD大鼠注射AAV载体,诱导供肝HO-1高表达和低表达,并在注射后第21 d构建SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型,获取血清检测肝酶ALT和AST变化,获取肝脏组织行HE染色观察组织病理学变化,检测肝组织HO-1、CHOP以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达情况,检测肝组织HO-1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、CHOP以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达情况。[结 果]1 构建HO-1 AAV过表达载体和HO-1 shRNAAAV载体,经测序证明扩增序列正确,表明载体成功构建。2 AAV载体通过尾静脉注射方式能诱导SD大鼠肝脏HO-1转录活性升高和降低,与相应空载AAV病毒组相比有统计学差异（P<0.05）。3 成功构建SD-SD大鼠肝移植缺血再灌注损伤模型。4 肝移植缺血再灌注后ALT、AST活性迅速升高,并在6-24hr达到峰值,7 d左右降至基本正常;肝组织病理学损伤6 hr已经显现,并在24 hr的时候损伤最重,7 d仍可见坏死灶存在。说明肝移植IRI损伤在再灌注后迅速发生,且病理学改变滞后于分子标志物变化。5 通过术前用AAV对供肝HO-1进行诱导处理,在建立肝移植模型6hr后仍能保持高效诱导HO-1高表达或抑制其表达。HO-1的转录活性和蛋白在过表达组的和shRNA干扰组均比相应空载AAV组升高或降低,其差异有统计学意义（P<0.05）。6 在肝移植IRI后6 hr,sh-HO-1组ALT、AST较AAV空载病毒组明显升高（P<0.05）,AAV-HO-1组ALT、AST较AAV空载病毒组明显降低（P<0.05）。行肝组织切片HE染色,光镜下观察sh-HO-1组的坏死区域更大,炎性细胞浸润更明显（P<0.05）。检测肝脏局部炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6转录活性和蛋白表达,sh-HO-1组的升高和AAV-HO-1组的降低与其对应空载AAV组相比有统计学意义（P<0.05）。同时HO-1的升高伴随着p38 MAPK磷酸化的降低以及CHOP表达的下降,提示HO-1可能是通过减少p38MAPK介导的炎症信号通路的激活以及减少CHOP介导的内质网应激来实现。[结 论]1 成功构建HO-1过表达和HO-1 shRNA AAV载体,能转染并在大鼠肝脏诱导或抑制HO-1表达。2 成功建立SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型。3 术前诱导供肝HO-1高表达能减轻肝移植缺血再灌注损伤,而抑制供肝HO-1则会加重损伤。4 HO-1可能通过抑制p38 MAPK介导的炎症信号通路的激活以及减少CHOP介导的内质网应激从而减轻缺血再灌注损伤。
侯宾[2]（2020）在《HO-1基因修饰的BMMSCs联合常温机械灌注保存DCD供肝对大鼠移植肝中胆管上皮细胞的保护作用》文中提出目的:研究血红素加氧酶-1（HO-1）修饰的骨髓间充质干细胞（BMMSCs）联合常温机械灌注（NMP）对大鼠心脏死亡后捐献（DCD）供肝移植后胆管上皮细胞（BEC）及其功能的保护作用。方法:1.采用SPF级的2～3周龄40～60 g健康的雄性SD大鼠,经脊髓离断除死,无菌条件下剥离出股骨和胫骨,采用全骨髓贴壁筛选法在37℃、5%CO2的孵育箱中培养到第三代,并通过对BMMSCs的分化能力、生长形态及表面特异性标记物进行流式表型鉴定。2.将载有HO-1基因的腺病毒转染第三代BMMSCs,构建HO-1转染的骨髓间充质干细胞模型（Ad-HO-1/BMMSCs）。3.建立体外稳定的NMP系统装置。4.采用6～8周龄体重200～220 g雄性SD受体大鼠构建心脏死亡后热缺血30 min DCD肝移植模型并按照随机数表法随机分成假手术组（S组）、冷保存组（SCS组）、单纯NMP组（NMP组）、BMMSCs联合NMP组（BP组）和Ad/HO-1修饰的BMMSCs联合NMP组（HBP组）,其中NMP组、BP组和HBP组均进行4 h体外灌注。各组分别于移植术后0、1、7和14 d取材并检测相关指标。5.观察各组大鼠的生存状态及生存时间,采用生化方法检测各组大鼠肝功能,通过苏木素-伊红染色分析各组大鼠胆管病理学改变,通过蛋白质免疫印迹法以及免疫组化染色检测BEC中细胞角蛋白19（CK19）表达,通过细胞凋亡（TUNEL）染色测定凋亡的BEC,免疫组化法检测凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果:1.经BMMSCs以及Ad-HO-1转染的BMMSCs（Ad-HO-1/BMMSCs）的形态、细胞分化功能和表性鉴定,证实本实验中采用的干细胞为符合标准的BMMSCs和Ad-HO-1/BMMSCs。2.体外成功建立了稳定运行的NMP系统装置。3.体外成功构建雄性SD大鼠在心脏死亡后热缺血30 min大鼠DCD原位肝移植模型。4.HBP组和BP组大鼠术后0、1、7和14 d存活率均较SCS组明显升高,以HBP组升高更为显着,术后1 d存活率达100%。14 d存活率仍明显高于SCS组、NMP组和BP组[90%（18/20）比20%（4/20）、40%（8/20）、45%（9/20）,均P<0.05]。通过对肝移植术后7-14 d各组SD受体大鼠移植肝进行病理学检测,结果表明Ad-HO-1/BMMSCs联合NMP保护DCD供肝的方法能够更加明显的减轻胆管上皮细胞的炎症损伤。随后我们的研究发现HBP和BP组BEC中CK19蛋白表达明显高于SCS和NMP组,而7 d至14 d HBP组CK19蛋白表达高于BP组,各时间点HBP组CK19蛋白表达与S组相比无明显改变。通过对凋亡的BEC进行检测,结果发现SCS组和NMP组移植肝的BEC中的凋亡细胞数较HBP和BP组明显增加,而7 d至14 d BP组的凋亡数较HBP组进一步增加。表明Ad-HO-1/BMMSCs联合NMP对BEC的保护作用明显优于SCS组、NMP组和BP组。结论:1.从雄性SD大鼠骨髓中提取并培养的BMMSCs为符合本实验所需要且符合标准的BMMSCs;将HO-1基因转入BMMSCs构建Ad-HO-1/BMMSCs的方法是可行的,为后续实验提供细胞学基础。2.通过成功构建稳定的体外NMP系统以及大鼠原位肝移植模型,为接下来的实验提供动物模型基础。3.采用Ad-HO-1/BMMSCs联合NMP保护DCD供肝的方法能明显减轻肝移植术后BEC损伤,从而改善大鼠肝移植预后,提高移植术后生存率。
张毅杰[3]（2020）在《琥珀酸盐对移植肝脏缺血再灌注损伤作用的实验研究》文中研究说明目的:肝脏移植是终末期肝病唯一有效的治疗手段。然而供体的短缺严重制约了肝移植手术的开展,大量等待肝脏移植的患者在等待过程中失去了治疗机会。为了解决供体的短缺,欧美移植中心重新关注并开始越来越多的利用心脏死亡供体（Donation after cardiac death,DCD）。然而与脑死亡供体（Donation after brain death,DBD）相比,DCD经历了热缺血损伤,更容易出现原发性移植物无功能（primary non-function,PNF）、早期移植物功能不良（poor early graft function,PEGF）以及缺血性胆道疾病等并发症。在我国,由于没有脑死亡标准的法律规定,DCD成为了我国器官捐献最主要的来源。因此,如何减轻肝脏的缺血再灌注损伤,同时对供肝的质量进行评估以决定是否使用,是目前肝脏移植研究中的重中之重。缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion?injury,IRI）是肝移植术后导致器官丢失的主要原因。IRI的机制包括:氧自由基爆发、细胞内钙超载、酸中毒、炎性细胞反应等,而其中氧自由基爆发被认为是启动因素,在缺血再灌注损伤中占有极其重要的作用。氧自由基过量产生机制包括:黄嘌呤氧化酶,炎性细胞和线粒体等。越来越多的文献报道线粒体呼吸链在缺血再灌注损伤中氧自由基过量产生的关键作用,但是线粒体中氧自由基的产生途径及作用机制尚有待深入研究。最新的一篇文章发现小鼠不同脏器在缺血期都有三羧酸循环中间产物琥珀酸盐的累积,而再灌注时累积的琥珀酸盐通过线粒体呼吸链反电子传递,生成大量线粒体氧自由基,导致缺血再灌注损伤。因此在肝脏的缺血再灌注损伤过程中,如果在缺血期减少琥珀酸盐的累积,是不是可以减轻再灌注损伤,从而起到保护肝脏的作用。同时,在缺血末期检测琥珀酸盐的累积量,是不是可以预测再灌注损伤的严重程度,这样有助于评估脏器功能,减少脏器的丢弃率或增加有效脏器的使用率。在缺血再灌注损伤中,有很多文献报道MAPK通路在心脏、脑、肾脏等脏器中发挥着重要的作用,而在肝脏中的报道虽然很多,但有争议。同时MAPK的三条经典途径JNK,ERK,P38在肝脏的缺血再灌注损伤中的作用也不尽相同。MAPK通路的上游刺激因素中氧自由基占有非常重要的作用。因此氧自由基在MAPK三条经典通路的作用如何,是怎么通过MAPK通路影响肝脏的缺血再灌注损伤,是值得研究和验证的。对于肝脏移植,尤其是DCD时代的中国肝脏移植,如何修复肝脏和评估肝脏的功能,是至关重要的。目前机械灌注是提高供肝保存和评估供肝质量的大势所趋,但机械灌注的保护机制,以及如何提高和评估供肝质量是需要大量的实验去探究和验证的。因此结合琥珀酸盐、氧自由基、MAPK通路、机械灌注,是否可以更好的去保护DCD供肝和评估供肝质量,是本研究的目的所在。研究方法:建立稳定的小动物和大动物肝移植模型:小动物采用SD大鼠磁环双套管肝移植模型;大动物采用巴马小型香猪DCD肝移植模型。通过检测大鼠和猪肝脏在缺血期的琥珀酸盐含量验证缺血期琥珀酸盐累积在大鼠和猪上都适用。采用大鼠肝移植模型,应用药物丙二醛二甲酯（DM）、琥珀酸二甲酯（DS）干预缺血期琥珀酸盐的含量,通过肝移植对照组、DM组、DS组、DM+DS组4个手术组（每组6对）,探究不同干预组琥珀酸盐含量的区别,并进一步通过ROS、MDA、肝功酶学、HE染色等指标比较缺血再灌注损伤的程度,验证琥珀酸盐通过氧自由基产生导致一定程度的缺血再灌注损伤。另外,通过对肝移植组供肝缺血前、热缺血30min、冷保存2h、通血1h、通血24h等各个时间点测定MAPK蛋白的表达情况,发现和缺血再灌注密切相关的JNK通路。采用大鼠肝移植模型,应用药物琥珀酸二甲酯（DS）,SP600125（JNK抑制剂）干预,通过肝移植对照组、DS组、SP600125组、SP600125+DS组4个手术组（每组6对）,检测每组ROS、MDA、肝功酶学、HE染色、JNK通路蛋白表达、MPTP开放程度、TUNEL等指标,验证琥珀酸盐,氧自由基,JNK通路,线粒体通透性转换孔、细胞凋亡的效应路径。另外,通过对肝移植组线粒体Sab和p-JNK的免疫共沉淀,发现JNK通路直接作用于线粒体的证据。采用猪肝移植模型,结合低温机械灌注和SP600125,将前面实验发现的效应路径运用到大动物肝移植模型上。手术组分4组（每组6对）,CS组（热缺血30min+冷保存4h）、CS+SP600125组（热缺血30min+冷保存4h+SP600125）,HMP组（热缺血30min+冷保存2h+低温机械灌注2h）,HMP+SP600125组（热缺血30min+冷保存2h+低温机械灌注2h+SP600125）,通过检测每组ROS、MDA、血清学检查、p-JNK及凋亡蛋白表达、MPTP开放程度、TUNEL、生存率等指标,验证低温机械灌注和SP600125在大动物模型上的保护作用,判断是否可以转化为临床应用。结果:大鼠和猪的肝脏在热缺血期和小鼠一样,有琥珀酸盐的不断累积,而在冷保存期轻度下降后基本维持稳定。通过药物干预缺血期琥珀酸盐的含量,发现各组肝移植后ROS、MDA、肝功酶学、HE染色等指标和琥珀酸盐含量相关,缺血末期琥珀酸盐含量越多,ROS、MDA生成越多,反映缺血再灌注损伤严重程度的肝功酶学和HE染色结果越差。肝移植各个时间点的MAPK通路表达:缺血前、热缺血30min、冷保存2h时p-JNK、p-P38、p-ERK蛋白基本没有表达,仅有p-JNK蛋白在通血1h和24h均明显升高,p-P38仅在通血24h后有所升高,而p-ERK在通血后均基本没有表达。通过DS、SP600125干预的肝移植组间差异比较发现SP600125可抑制p-JNK蛋白的表达,可减轻缺血再灌注损伤,该作用并不受DS的影响。而DS和SP600125共同干预组,JNK通路的上游蛋白表达升高,而p-JNK表达仍受抑制,而移植后的损伤和单纯SP600125组相似。通过免疫共沉淀技术发现p-JNK蛋白和线粒体支架蛋白Sab直接作用,影响线粒体功能。在不同组别的猪肝移植中,低温机械灌注可以减少供肝琥珀酸盐的含量,同时在ROS、MDA、血清学检查、HE染色、TUNEL、生存率等方面结果都优于冷保存组。低温机械灌注合并SP600125组在通血后1h的p-JNK蛋白表达、MPTP的开放程度和细胞凋亡方面较单纯低温机械灌注组有优势,虽然在血清学检查,生存率等方面前者由于后者,但差别没有统计学差异。结论:大鼠和猪热缺血期琥珀酸盐不断累积,在冷保存期轻度下降后维持稳定。缺血末期琥珀酸盐的累积导致再灌注时大量氧自由基产生,造成缺血再灌注损伤,大部分氧自由基通过JNK通路影响线粒体通透性转换孔,进而导致细胞凋亡造成缺血再灌注损伤。低温机械灌注的保护机制之一是可以通过减少缺血末期琥珀酸盐含量,减轻缺血再灌注损伤。低温机械灌注联合应用SP600126可以更好的提高供肝质量,改善肝移植预后。
张黎[4]（2019）在《CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究》文中研究表明第一部分大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒载体的构建及鉴定[目 的]构建大鼠CaMKⅡγ基因的过表达及干扰慢病毒载体并鉴定,为下一步探讨慢病毒介导CaMKⅡγ基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及其在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤的作用提供基础。[方 法]根据大鼠CaMKⅡγ目的基因的mRNA序列,全基因合成CaMKⅡγ目的基因,构建大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,根据本课题组前期实验中已筛出的干扰效率最高的siRNA序列构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγyshRNA慢病毒空载体,转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞并进行测序验证,随后转染293T细胞进行慢病毒包装并用绝对定量qPCR测定慢病毒滴度。应用Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体的蛋白表达情况,确定大鼠CaMKⅡγ过表达的有效性。根据不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A,将其分为生理盐水空白对照组（CON组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体组（CON-mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒载体组（mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒空载体组（CON-shCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒载体组（shCaMKⅡγ组）,应用Western Blot检测各组CaMKⅡγ蛋白表达情况。[结 果]成功构建了大鼠CaMKIIⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体蛋白的表达。根据已知干扰效率最高的siRNA序列成功构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγshRNA慢病毒空载体。绝对定量qPCR测定大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体、大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体滴度均为2E+9TU/mL。不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A 48h后,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ蛋白表达最高,shCaMKⅡγ的CaMKⅡγ表达最低,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ表达高于CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01）,shCaMKⅡγ组的 CaMKⅡγ表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。[结 论]大鼠CaMKⅡγ基因的过表达慢病毒在293T细胞中构建成功并表达,大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体在293T细胞中构建成功。大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中蛋白表达显着增加,而大鼠CaMKⅡγ干扰慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中的蛋白表达量显着下降,为后续研究CaMKⅡγ作为靶基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及在大鼠DCD肝移植术缺血-再灌注损伤的作用提供基础。第二部分建立SD大鼠DCD原位肝移植模型[目 的]建立稳定的SD大鼠DCD原位肝移植模型并确定在本课题后续实验中SD大鼠DCD原位肝移植模型的最佳热缺血时间。[方 法]本实验通过Kamada“二袖套”法,控制不同热缺血时间（热缺血Omin、热缺血15min及热缺血30min）建立SD大鼠DCD原位肝移植模型,并通过移植术后存活时间及肝脏变化确定本实验最佳动物模型热缺血时间。[结 果]供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型术后7d的生存率分别为90%、80%及60%,随着热缺血时间延长,肝脏损伤加重,肝功能ALT、AST及TBIL逐渐升高,肝脏病理切片结果显示肝细胞从轻度水肿到点状坏死,再从桥接样坏死到大片状坏死。[结 论]在SD大鼠DCD原位肝移植模型中,热缺血时间的长短是直接影响供肝质量的关键因素,随着热缺血时间延长,供肝肝功能损伤逐渐加重,与病理结果一致,术后受体存活率随热缺血时间延长而显着下降。经过对比,热缺血15min是建立SD大鼠DCD原位肝移植模型并为后续进一步试验的理想造模时间,既可保证移植术后受体有一定的存活率,又可观察后续慢病毒干预对肝损伤是否有效。第三部分CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]用第二部分建立的供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型,三组分别于肝移植术后1d、3d及7d处死20只大鼠,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、CytC的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ蛋白表达,探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[结 果]三组移植术后1dCa2+水平达到高峰,术后3d Ca2+下降,到术后7d Ca2+又逐渐升高,同一时点,热缺血15min组及30min组Ca2+浓度水平高于热缺血Omin组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例随时间延长逐渐升高,提示线粒体膜势能下降比例逐渐升高,术后1d,三组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.01）。Tunel检测肝细胞凋亡比例随时间延长逐渐升高,术后1d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,热缺血15min组与热缺血Omin组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）且热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血15min组（P<0.05）。Western Blot测CaaM、CaMKⅡγ、AIF及Cyt C蛋白表达随热缺血时间延长而逐渐增加（P<0.05,P<0.01）,同一时点,热缺血15min组及30min组的蛋白表达高于热缺血Omin组,QRT-PCR及免疫组化测CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA及 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与 Western Blot 结果趋势大致相同。[结 论]热缺血时间是影响供肝质量的关键因素,SD大鼠DCD原位肝移植术后,供肝热缺血时间越长,供肝功能损伤越重,移植术后Ca2+浓度逐渐升高,从分子、蛋白及组织水平验证了随热缺血时间的延长,CaM及CaMKⅡγ表达增加,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,线粒体膜势能下降细胞比例增加,AIF及CytC从线粒体内释放,线粒体凋亡增加,由线粒体凋亡引起的肝细胞凋亡随之增加。第四部分慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]建立热缺血15min SD大鼠DCD原位肝移植模型,每只大鼠术中通过门静脉按1.0×108TU/mL注射CaMKⅡγ过表达及其对照慢病毒。（mCaMKⅡγ组、CON-mCaMKⅡγ组）、CaMKⅡγ干扰及其对照慢病毒（shCaMKⅡγ组及CON-shCaMKⅡγ组）、生理盐水（CON组）转染移植肝脏,于术后1d、3d、7d分别处死20只大鼠。取血清行肝功能检测,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、Cyt C的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ的蛋白表达,电镜检测肝组织中肝细胞、线粒体的超微结构变化。[结 果]CaMKⅡγ过表达慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为83.3%、78.3%及70.0%,而CaMKⅡγ干扰慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为98.3%、93.3%及88.3%,提示干扰CaMKⅡγ的表达对大鼠DCD肝移植术后肝损伤是保护因素,可提高大鼠DCD肝移植术后生存率。肝功能结果示:血清 ALT、AST 术后各时点 mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,血清TBIL于术后1d各组无显着差异,术后3d及7d结果同血清ALT、AST。移植术后Ca2+浓度于术后1d达到高峰,各组间无显着差异,术后3d逐渐下降,术后7d再次升高,术后3d及7d,mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例在术后1d及3d,shCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）,术后 7d,mCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。Tunel法测肝细胞凋亡结果示:术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例低于CON-shCaMKⅡγ组（p<0.01）。Western Blot 测 CaM、CaMKⅡγ、AIF 蛋白表达于术后 1d,mCaMKⅡγ组表达高于 CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01,P<0.05）,术后 3d 及 7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,CytC蛋白表达于术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）。QRT-PCR 测 CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA 的表达及免疫组化测 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与Western Blot结果趋势相同。电镜结果可见mCaMKⅡγ组出现超微结构损伤,肝细胞肿胀及坏死、线粒体肿胀、嵴消失,而shCaMKⅡγ组受损形态明显改善,肝细胞大致正常,线粒体或肝细胞轻微肿胀,CON组、CON-mCaMKⅡγ组、CON-shCaMKⅡγ组可见肝组织轻微的超微结构损伤,随时间推移,mCaMKⅡγ组损伤逐渐加重,shCaMKⅡγ组损伤逐渐减轻。[结 论]DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致CaMKⅡγ异常表达,可通过激活Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路诱导线粒体损伤,上调CaMKⅡγ可使Ca2+水平升高,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,使线粒体膜势能下降,线粒体通透性增加进而导致线粒体肿胀、破裂及凋亡,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质可启动线粒体凋亡,进一步促进肝细胞凋亡;而下调CaMKⅡγ则可使Ca2+水平降低,减少线粒体膜势能下降,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质减少,进而减少线粒体凋亡及其诱导的肝细胞凋亡,对SD大鼠DCD原位肝移植术后的肝功能损伤有保护作用。CaMKⅡγ过表达在DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致的线粒体凋亡中起主导作用,特异性干扰CaMKⅡγ表达可特异性调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路,有效改善SD大鼠DCD原位肝移植术后肝损伤及提高术后移植大鼠存活率。
唐波[5]（2018）在《树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究》文中认为第一部分树鼩原位肝移植模型的建立[目的]首次尝试用树鼩建立同种异体原位肝移植动物模型,为肝移植的临床及科学研究提供一种新型的,与人类基因型及免疫系统同源性更高,且更为经济实用的肝移植动物模型。[方法]在Kamada报道的“二袖套”法肝移植模型基础上加以改进,通过对总共60只树鼩进行随机分组为供体组和受体组进行同种异体原位肝移植实验,观察手术成功率,术后树鼩存活率,并行肝脏组织病理学检查,建立稳定的树鼩原位肝移植模型。[结果]定型手术成功率为90.00%（27/30）,树鼩24h存活率为76.67%（23/30）,3 天存活率为 60.00%（18/30）,1 周存活率为 30.00%（9/30）,最长存活时间为11天。3例手术失败原因为:肝上下腔静脉吻合口出血,麻醉过深,气胸死亡各1例。24h内死亡4例,其中1例因吻合口出血,1例吻合口血栓形成,2例死亡原因不明。术后存活超24h死亡23例,原因分别为急性排斥反应15例,占65.22%,其它为:胆道梗阻1例,腹腔感染2例,肝叶坏死1例,不明原因4例。[结论]1树鼩原位肝移植模型建立的难度及操作复杂性比大鼠肝移植更大,综合影响因素更多。合理的围手术期处理及娴熟的显微镜操作是影响肝原位移植模型手术成功的关键。2树鼩肝移植模型成功建立为本研究的创新点,目前未见报道,首次成功用树鼩建立了同种异体原位肝移植模型,作为一种新型动物肝移植模型的建立——改良“二袖套”法在树鼩原位肝移植模型的建立,模型稳定可靠,为今后将树鼩原位肝移植模型运用于肝移植的临床及基础研究奠定了基础。第二部分树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因表达和迁移的体外实验研究[目的]研究雷帕霉素对树鼩外周血淋巴细胞趋化因子CXCL12（SDF-1）趋化功能及其受体CXCR4表达的影响,为移植排斥体内研究提供实验依据。[方法]实验分组:Rapacymin药物组、DMSO对照组和空白组。采用MTS细胞增殖实验,观察雷帕霉素对树鼩淋巴细胞存活及状态的影响;用细胞迁移运动实验检测雷帕霉素对人源性重组CXCL12所诱导树鼩淋巴细胞迁移能力的影响:使用Real-time PCR法检测雷帕霉素对树鼩淋巴细胞CXCR4基因的表达情况。[结果]雷帕霉素对树鼩淋巴细胞活力无显着影响,但对树鼩的淋巴细胞的迁移有抑制作用。同时雷帕霉素可下调树鼩淋巴细胞的CXCR4基因表达。[结论]趋化因子CXCL12及其受体CXCR4表达水平可影响淋巴细胞迁移,为树鼩肝移植急性排斥反应体内实验研究提供依据。第三部分树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究[目的]在肝移植模型建立的基础上加用免疫抑制剂及趋化因子受体阻止剂对趋化因子及其受体的作用进行实验研究。通过表达的差异性,阐明肝移植急性排斥中趋化因子/趋化因子受体（CXCL12/CXCR4）轴调控淋巴细胞迁移发挥的作用和机理等系列问题。为肝移植急性排斥反应发生机制提供重要依据,同时为临床有效的治疗和控制急性排斥反应,促进移植物存活提供实验数据和理论支持。[方法]1树鼩肝移植急性排斥反应模型建立,方法同第一部分。2实验分组;（1）对照组,A组（n=25）:正常树鼩作为对照;（2）排斥组,B组（n=25）:树鼩同种异基因肝移植组;（3）AMD3100组,C组（n=25）:树鼩同种异基因肝移植静脉注射AMD3100,1mg/kg/day;（4）雷帕霉素（Rapacymin,RAPA）抑制组,D组（n=25）。术后1、3、5、7d随机处死5只,收集血液、肝脏、脾脏标本。留下5只观察生存期,绘制生存曲线。3 实验室常规指标测定:收集各组肝移植术后1d,3d,5d,7d的血清,使用血液全自动生化分析仪测定TP,ALT,AST,TB水平。4流式细胞仪检测淋巴细胞CXCR4:分别在肝移植术后1d,3d,5d,7d,收集脾脏淋巴细胞,进行分离、培养,流式细胞检测。5移植物组织形态及病理学检测:免疫组织化学染色（IHC）检测并分析CXCL12的表达情况。肝组织HE染色病理学检查,根据Banff评分系统判断排斥反应程度。6酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中CXCL12（SDF-1）蛋白量。7组织蛋白印迹（Western blot）分析与检测各组移植肝的CXCR4蛋白表达情况。[结果]1 C、D组树鼩移植后中位生存时间明显长于B组,差异有显着意义（P<0.05）,各组与 A 组比较,（P<0.05）。2树鼩肝移植术后实验室常规检查指标:对比各组树鼩肝移植术后1d,3d,5d,7d的相关指标。血清TP同时间点各组之间相比较,B、C、D组明显低于A组,差异有显着性（P<0.05）。而1d时,B、C、D,TP开始下降,但三组间比较,无显着性差异（P>0.05）。B组呈持续性下降,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,开始恢复,呈上升趋势,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性（P<0.05）。D组3d后,TP上升略高于C组,但两组统计无差异（P>0.05）。B组,C组,D组术后血清TB,ALT,AST,急剧上升,与A组在1d,3d,5d,7d同期比较,明显高于A组,差异有显着性（P<0.05）。B组持续性升高,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,肝功能开始恢复,略有上升趋势,但较平缓,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性（P<0.05）。而1d时,B、C、D三组间比较,无显着性差异（P>0.05）。3外周脾淋巴细胞流式细胞检测:术后1d、3d,B、C、D组间脾脏淋巴CXCR4表达无明显差异（p>0.05）,与A组有显着性差异（P<0.05）。术后5d、7d各时间点,C、D组明显低于B组,差异有显着性（P<0.05）。4移植肝脏形态学检测:采用Banff分级对移植肝脏AR的程度进行分级,A组术后各时间点,移植肝脏组织结构正常;B、C、D组1d肝小叶结构基本完好,肝细胞基本无变性、坏死,汇管区仅有少许炎性细胞浸润,未发生排斥;B组移植术后Id排斥不明确,在术后第3、5、7 d分别发生了轻度（Ⅰ级）、中度（Ⅱ级）、重度（Ⅲ级）排斥;C、D组术后3天到10天内,有少数发生了轻度AR。B组与C,D组同期比较排斥反应更为严重（P<0.05）。B组,术后3d可有明确的急性排斥反应发生。5免疫组化检测肝脏CXCL12表达:术后第7d B组CXCL12在肝脏细胞表达最高,C组、D组肝细胞CXCL12表达少,C组、D组与B组比较有显着性差异（P<0.05）。A组正常组织也有较少量的CXCL12表达,但与B组、C组、D组比较有显着性差异（P<0.05）。6酶联免疫吸附法检测树鼩外周血浆中CXCL12蛋白的表达:肝移植后`d,B组,C组,D组血清CXCL12表达相互比较均无明显差异（P>0.05）,与A组相比有显着差异（P<0.01）。移植术后3d,B组血清中CXCL12快速上升,与术前`d的表达水平相比较,有显着差别（P<0.05）,并随时间上调。C组、D组表达水平在术后5d,7d天上升缓慢,与B组同时间点比较表达水平低（P<0.05）。CXCL12蛋白的表达变化与RAI呈正相关,相关系数（r）为0.880。7 Western蛋白印迹分析检测:术后第1d各组树鼩移植肝内CXCR4蛋白表达无明显差异（P>0.05）。而术后第3d、5d、7d各时段A组、C组、D组树鼩淋巴细胞表达CXCR4蛋白明显低于B组（P<0.05）。C组、D组术后CXCR4蛋白表达高于A组（P<0.05）,而C组、D组两组之间第3d、5d、7d 比较CXCR4蛋白表达差异不明显（P>0.05）。[结论]1树鼩与人同源性较好,可用人的相关试剂应用在树鼩实验研究上,本实验研究结果的可靠性,进一步证实树鼩肝移植模型可应用于肝移植的系列实验研究中,并具有物种的优越性和价值。2树鼩肝移植模型急性排斥反应研究证实,正常肝组织有CXCL12表达,急性排斥时,可与CXCR4协同发生淋巴细胞、炎性细胞迁移至移植物,引起移植肝功能不全或受损。3趋化因子受体抑制剂AMD3100可阻断CXCL12/CXCR4轴在肝移植排斥中的作用,抑制T淋巴细胞向移植物浸润,减轻急性排斥反应。4雷帕霉素可抑制CXCL12人重组蛋白诱导的树鼩淋巴细胞迁移。其相关可能的机制为:雷帕霉素可下调CXCL12的激活与表达,并影响CXCR4受体的表达,以调控CXCL12/CXCR4信号通路所介导的淋巴细胞的运动能力,发挥其免疫抑制作用。5肝移植后CXCL12/CXCR4的表达水平与急性排斥反应的程度密切相关,表达水平与排斥反应强度有关,可评估免疫排斥反应状态。6 CXCL12血清中持续高表达可较敏感地预示肝移植急性排斥发生。检测血清CXCL12表达可作为一种无创的、敏感的早期诊断肝移植急性排斥反应的方法,为临床监测和诊断提供参考依据。并且可通过CXCL12的表达水平在一定程度上预测排斥反应的严重程度和判断抗排斥反应的治疗效果。
胡昭明[6]（2018）在《常温下奥拉帕尼对大鼠体外供肝灌注保存的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:探究在不同温度下奥拉帕尼对大鼠离体供肝灌注保存的保护作用。方法:选取Wistar系雄性大鼠80只,SPF级。将50只大鼠随机分为5组:G0:对照组（肝脏离体后不灌注保存）10只;G1:低温组（单纯UW液4℃灌注肝脏）10只;G2:低温联合奥拉帕尼组（奥拉帕尼加入UW液4℃灌注肝脏）10只;G3:常温组（单纯UW液37℃灌注肝脏）10只;G4:常温联合奥拉帕尼组（奥拉帕尼加入UW液37℃灌注肝脏）10只;另30只为肝移植受体。术前禁食12h,不禁水,术前用10%水合氯醛以0.3ml/100g经腹腔麻醉,麻醉后取腹部“十”字形切口进入腹腔,分离门静脉,留置针插入门静脉后取出针芯并用4号丝线固定,连接灌注机械泵,以（6.0±1.0）ml/min的流速在室温下泵入PBS液,并剪开下腔静脉放血,持续原位灌洗肝脏,待20min后肝脏变为均匀土黄色,灌注流出液变清澈后完整分离肝脏。G0组离体肝脏直接取肝送检。G1组离体肝脏放入装有200mlUW液的烧杯中,并将烧杯置于碎冰中维持灌注液0-4℃,将机械泵入口置于烧杯中,同理G2组离体肝脏放入装有200ml含奥拉帕尼（浓度50nM）UW液中,烧杯置于碎冰中维持灌注液0-4℃。G3组离体肝脏放入装有200mlUW液的烧杯中,烧杯置于恒温水浴箱中维持灌注液37℃。G4组离体肝脏放入装有200ml含奥拉帕尼（浓度50nM）UW液中,烧杯置于恒温水浴箱中维持灌注液约37℃。以上G1-G4组保持持续回流循环灌注4h后撤走机械泵后烧杯置于碎冰中在0-4℃下继续保存2h。所有组随机选4只大鼠选肝脏固定位置取肝左叶组织行HE和TUNEL染色,并用免疫组化观察caspase-3表达情况。提取肝组织中Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、IL-1β、IL-6、TNF-α反应肝脏凋亡和炎症水平各项细胞因子,并比较各项指标。各组另6只大鼠供肝行原位肝移植,观察受体术后1、3、7日肝功能以评价各组灌注保存效果。结果:1.单纯常温灌注保存较单纯低温灌注保存供肝组织细胞凋亡及炎症水平降低;2.UW液中加入奥拉帕尼灌注后能减轻供肝组织中细胞凋亡和炎症反应;3.常温联合奥拉帕尼灌注保存供肝可以更好的降低细胞凋亡和炎症反应;4.常温联合奥拉帕尼灌注保存供肝行肝移植后肝功能指标更佳。结论:1.常温下灌注保存效果优于低温灌注保存;2.奥拉帕尼有利于供肝灌注保存;3.常温联合奥拉帕尼的灌注保存效果优势更明显;4.常温联合奥拉帕尼灌注保存供肝改善行肝移植术后肝功能效果更佳。
张威[7]（2013）在《超短无肝期对肝移植受体及供肝保护机制的实验研究》文中指出目的本文应用自主研发的血管快速吻合磁环进行大鼠SHVC的重建,显着缩短了无肝期,在国际上率先建立了超短无肝期的大鼠肝移植模型,并由此提出超短无肝期（extremely short anhepatic phase,ESAP）的概念;遵循外科未来发展趋势,立足临床需求来研究超短无肝期对受体及供肝的双重保护作用、受体与供肝之间的相互影响,探讨超短无肝期的意义与价值,并揭示其内在机制。方法1、首先进行磁环结构的设计及优化、并进行钛涂层磁环生物相容性的研究。将自主研发钛涂层钕铁硼磁环埋入大鼠腹腔内,分别于术后14d、1m、3m及6m取材,肉眼及病理检查,从炎症、纤维囊壁形成、周边组织反应及材料降解四个方面进行组织学观察评价其生物相容性,并观察其磁暴露风险。2、其次成功建立超短无肝期的大鼠肝移植模型,使用磁环进行大鼠肝上下腔静脉吻合,比较磁环吻合与手工缝合的差异,借助血管造影、超声多普勒、吻合口组织病理及扫描电镜等检查对血管快速吻合磁环进行验证,同时评估无肝期的差异及模型的稳定性及实用性。3、最后借助超短无肝期的大鼠肝移植模型平台深入探讨超短无肝期的意义,分别从新肝开放后不同时间点的肝脏酶学指标、肌酐水平、内毒素水平、蛋白质芯片技术监测细胞因子变化、组织病理、透射电镜观察以及术后生存率等不同角度深入评估超短无肝期对肝移植受体及供肝的影响,并探讨其内在机制。结果1、利用数控线切割技术成功加工出一系列规格不同的微型钕铁硼磁环,等离子溅射技术覆盖的钛涂层均匀致密。术后14天磁环周围有轻度炎症反应,到术后6月炎症反应基本消失;术后1月磁环周围形成完整纤维组织包裹,术后囊壁逐渐变薄;由于钛涂层的保护,植入大鼠腹腔14天至6月均未发现磁环降解腐蚀,周围组织反应也较轻;由于术后磁环周围囊壁逐渐变薄,因此对周围组织压迫明显减轻,所以周围组织再未出现萎缩。显示出良好的生物相容性,体内局部磁场强度及范围安全可靠。2、使用磁环快速吻合技术,大鼠肝移植模型中SHVC重建变得简单,快速,SHVC重建时间从10.40±2.11min下降至0.91±0.24min,无肝期从17.76±2.51min下降至5.63±0.65min。血管造影及彩色多普勒超声检查证实吻合口通畅,吻合口病理及扫描电镜证实愈合良好。术后1周生存率90%,术后1个月生存率85%。3、肝脏酶学指标、肌酐水平、内毒素水平、蛋白质芯片技术监测细胞因子变化、组织病理、透射电镜观察以及术后生存率的结果均显示超短无肝期组相比正常无肝期组,缺血再灌注损伤程度明显减轻,无论对受体还是供肝均显示出明显的保护作用。结论1、钛涂层微型血管吻合磁环结构设计合理,生物相容性良好,磁暴露强度远低于国际安全标准。2、使用钛涂层微型血管吻合磁环成功进行大鼠肝移植SHVC快速重建,可以顺利实现5min左右的超短无肝期,模型简便、稳定、可靠。3、超短无肝期对大鼠肝移植受体及供肝存在双重保护作用,其机制与减少内毒素释放并缩短温缺血时间,从而减少炎性细胞因子TNF-a、IL-1?、IL-6和IFN-γ的产生、并减少趋化因子MCP-1及粘附因子L-selectin、ICAM-1的生成,从而抑制炎症瀑布样级联反应、减轻缺血再灌注损伤有关。
于建健[8]（2012）在《丙酮酸乙酯对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用》文中指出第一部分大鼠原位肝移植（ROLT）模型的建立目的：探讨大鼠原位肝移植（Rat Orthotopic Liver Transplantation, ROLT）模型的建立,为肝移植的相关实验研究提供理想的动物模型。方法：采用Kamada’s二袖套法,并在此模型基础上做相应改良,施行了80例大鼠原位肝脏移植手术,观察手术成功率和并发症。结果：经过50例的训练,成功建立大鼠肝移植模型。在定型的30例肝移植术中,供肝热缺血时间（0-1）min,受体平均无肝期时间为（16-21）min,受体平均手术时间38-46min,手术成功率90%（27/30）,术后两周存活率83%（25/30）。结论：改良二袖套法肝移植术成功率高,重复性强,为成熟稳定的大鼠肝移植理想术式,可为肝移植相关的基础与临床研究提供理想的动物模型。第二部分丙酮酸乙酯对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用目的：探讨丙酮酸乙酯（Ethyl Pyruvate, EP）对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用及相关机制。方法：采用“二袖套”法大鼠原位肝移植模型,选取SPF级成年雄性SD大鼠104只,采用随机数字表法,将大鼠随机分为假手术组8只、原位肝移植组和丙酮酸乙酯（EP）治疗组各48只。假手术组（S组）仅行单纯开关腹手术,原位肝移植组（O组）及丙酮酸乙酯治疗组（EP组）分别行“二袖套”法原位肝移植术,EP组受体于切皮前1h给予EP40mg/kg, O组受体于切皮前1h给予与EP组等体积的林格氏液。分别于再灌注后2h、6h和24h检测大鼠血清ALT和AST活性,黄嘌呤氧化酶法测定肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活性,硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量,ELISA法检测血清中TNF-α和IL-6浓度。数据应用SPSS17.0进行统计分析处理。结果：与S组比较,O组各时点和EP组再灌注后2h,6h MDA含量升高,SOD活性降低（P<0.05或P<0.01）,两组各时点ALT、AST活性和TNF-α、IL-6浓度明显升高（P<0.05或P<0.01）；与O组比较,EP组各时点ALT和AST活性降低（P<0.01）,MDA含量、TNF-α、IL-6浓度下降（P<0.05或P<0.01）,SOD活性升高（P<0.05）。结论：1、大鼠供肝在冷保存90min后原位植入受体,术后肝脏缺血再灌注损伤明显。血清ALT、AST活性明显升高；炎性细胞因子TNF-α、IL-6水平升高；肝组织SOD活性降低,MDA含量升高。2、术前给予丙酮酸乙酯预处理后,血清的ALT和AST水平明显下降,减轻了移植肝的缺血再灌注损伤。主要通过减少氧自由基的生成,降低了抗氧化物质SOD的消耗,脂质过氧化终产物MDA生成减少,有效抑制脂质过氧化反应；显着降低血清中炎性细胞因子TNF-α和IL-6水平,从而对大鼠肝移植缺血再灌注损伤起保护作用。
林艺雄[9]（2010）在《灯盏花素对原位肝移植大鼠供肝冷保存再灌注损伤的保护作用》文中指出背景肝脏缺血再灌注损伤是肝移植的常见问题之一,缺血后的再灌注不仅不能使肝功能恢复,反而引起移植肝功能受损,严重时导致原发性移植物无功能,直接影响肝移植的效果。随着手术技术的成熟和免疫排斥研究的深入,肝移植发展迅速,供体需求量激增,边缘供体渐为各大器官移植中心所接受。边缘供体耐受缺血缺氧能力较正常供体差,导致移植肝无功能的机会也相对增加。近年来针对缺血再灌注损伤的一些研究发现,TLR4启动了宿主天然免疫系统,从而引起心、肺、肝、肾的缺血再灌注损伤。TLR4是Toll样受体家族（TLRs）重要成员,机体可通过宿主TLRs识别病原体,从而启动先天性免疫系统。灯盏花素（Breviscapine）又名灯盏细辛,是从菊科飞蓬属植物短亭飞蓬中提取出来的黄酮类有效成分,主要成分是灯盏乙素（含量占95%以上）。研究发现灯盏花素有改善心脑血管血流量、抗血小板凝聚、抗氧自由基等作用。临床主要治疗闭塞性脑血管病及其后遗症。因其还能降低血浆纤维蛋白原含量和促进纤溶酶活性、改善微循环、清除氧自由基,因此也有保肝作用。但尚未发现其在肝移植冷保存缺血再灌注损伤中作用的研究报道。鉴于此,本课题采用SD大鼠建立原位肝移植模型,研究灯盏花素对肝脏冷保存缺血再灌注损伤是否具有保护作用；并进一步研究TLR4介导的信息通路是否参与其中。第一部分大鼠原位肝移植模型的建立目的建立大鼠原位肝移植模型,以便进行肝移植冷保存缺血再灌注损伤的研究。方法健康、成年、SPF级纯系雄性SD大鼠（Sprague-Dawley）168只,体重260-320g。实验分为两个阶段进行,其中预实验108只,系手术技巧及方法的练习；正式实验60只。手术操作步骤如下：①游离供体肝脏周围韧带、肝上、肝下下腔静脉,门静脉、肝动脉、肝外胆道及右肾静脉。②穿刺门静脉并肝素化。③使用4℃含肝素12.5U／ml的乳酸钠林格氏液行腹主动脉冷灌注,灌注满意后切取供肝。④在修肝容器中进行供肝修整和袖套安装,必须保证全程浸泡在装4℃乳酸林格氏液的修肝容器中。供肝修整完毕后,置4℃冰箱中保存待用。⑤游离受体肝脏周围韧带、肝上、肝下下腔静脉,门静脉、肝动脉、肝外胆道及右肾静脉。⑥阻断受体肝下下腔静脉、门静脉主干、肝上下腔静脉,切除受体肝脏。⑦将供肝从4℃的保存液中取出,原位置入受体腹腔,重建腔静脉、门静脉和胆管,恢复血流。检查腹腔内无出血后关腹。结果1、共进行SD-SD大鼠原位肝移植84次,其中前期预实验54次,后期定型手术30次。2、在正式实验中,供体手术时间为28.42±1.83min,供肝修整时间为36.58±3.31min,受体手术时间47.25±1.59min,无肝期为21.45±1.57min。3、受体门静脉恢复灌注后未见血栓形成,血液复流和肝脏灌注情况良好。4、54次预实验死亡23例,死亡率为42.59%（23／54）。30次定型手术3例死亡,死亡率为10%（3／30）。死亡原因包括无肝期过长、麻醉过深、空气栓塞、腹腔内出血,等。第二部分灯盏花素保护大鼠肝移植冷缺血再灌注损伤的实验研究目的探讨灯盏花素是否对大鼠肝脏冷保存缺血再灌注损伤具有保护作用。方法1.实验动物分组设计健康、成年、SPF级纯系雄性SD大鼠42只,体重260-320g,随机分为假手术组、生理盐水对照组、低剂量灯盏花素治疗组和高剂量灯盏花素治疗组。将供肝在4℃保存液保存4小时后原位植入受体。按照“二袖套”法进行大鼠原位肝移植术。于供肝恢复灌注6小时后取材。2.观察指标及方法（1）测定各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶及天冬氨酸氨基转移酶。（2）检测各组大鼠肝组织匀浆超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶。（3）制作石蜡切片,HE染色,于光镜下观察肝组织病理形态学表现,并进行Suzuki病理学评分。（4）制作电镜切片,在透射电镜下观察细胞的超微结构。（5）TUNEL法检测肝细胞的凋亡情况。计算凋亡指数（AI）。3..统计学分析计量资料采用均数±标准差（i±s）表示,数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,四组均数比较采用单向方差分析（One-Way ANOVA）,组间两两比较采用最小差异t检验（LSD-t）或Tamhane’s T2检验,相关性分析采用双变量相关分析。Suzuki病理评分采用Kruskal-Wallis H-test.P<0.05为差异有统计学意义。结果1、血清肝功能检测结果生理盐水对照组、灯盏花素低剂量治疗组、灯盏花素高剂量治疗组的ALT、AST水平显着高于假手术组（P<0.05）；灯盏花素治疗后ALT、AST水平较生理盐水对照组降低,其中高剂量治疗组较生理盐水对照组显着下降（P<0.05）；高剂量治疗组ALT、AST水平较低剂量治疗组降低,其中门冬氨酸氨基转移酶的降低为显着性（P<0.05）。2.肝组织匀浆SOD、MDA、GSH-Px检测结果假手术组MDA、GSH-Px的表达水平与其它三组差别显着（P<0.05）；灯盏花素治疗后MDA、GSH-Px的表达水平较生理盐水对照组差别显着（P<0.05）；高剂量治疗组MDA较低剂量治疗组有显着降低（P<0.05）。生理盐水对照组SOD表达较假手术组显着下降（P<0.05）；灯盏花素治疗组SOD较生理盐水对照组高但低于假手术组,其中高剂量治疗组相对于生理盐水对照组和低剂量治疗组均有显着升高（P<0.05）。3.肝组织病理学观察和评分假手术组：肝小叶结构大体正常,镜下肝细胞排列规则,可见双核肝细胞。生理盐水对照组：肝细胞索紊乱,并呈现多灶性的肝细胞水泡样变性、凋亡和坏死,肝窦内可见散在脱落的肝细胞核,病变分布没有特异性。低剂量组：肝细胞轻度水样变性,组织改变较生理盐水对照组轻。高剂量组：肝细胞索清晰可辨,肝细胞结构完整,排列尚规则。通过病理学评分分析,各组肝脏淤血、空泡样变、坏死差异不具有统计学意义（P>0.05）,总分比较有统计学意义（P<0.05）。4.透射电镜观察假手术组：肝细胞结构正常。细胞核近圆形,核膜完整,核仁居中；细胞浆内可见线粒体、糖原颗粒、内质网、脂滴结构,其中线粒体由不同切面切成柱形、椭圆形、圆形外观,具有双层界膜,内膜内可见线粒体嵴,基质密度较高。生理盐水对照组：显示肝细胞早期凋亡的结构特点。细胞核皱缩,核内染色质固缩并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或环状小体；内质网变疏松,线粒体数量明显减少,体积明显增大,线粒体内基质密度明显降低,但保持完整而清晰的双层单位膜。灯盏花素低剂量组：细胞核近圆形,核膜完整,核内染色质有向核膜边集趋势；线粒体数量减少,体积增大,基质密度降低,总体结构改变较B组轻。灯盏花素高剂量组：细胞核近圆形,核膜完整,已出现染色质颗粒状聚集；细胞质中线粒体数量没有明显变化,但分布不均,三五聚集,嵴减少,内质网扩张。结构改变程度介于C组和A组之间。5.凋亡指数（AI）大鼠肝移植后6小时各组肝细胞凋亡指数比较差异显着（P<0.001）,假手术组凋亡最轻,生理盐水对照组凋亡最严重；灯盏花素治疗组凋亡较生理盐水对照组轻但比假手术组严重,且高剂量组显着低于低剂量组（P<0.05）。说明灯盏花素能减轻大鼠肝移植术后肝实质细胞的凋亡,且具有剂量依赖关系。结论1、大鼠供肝在冷保存4小时后原位植入受体,术后肝脏恢复灌注后6小时,缺血再灌注损伤明显。血清ALT、AST明显升高；肝组织SOD、GSH-Px降低、脂质过氧化物MDA升高；肝细胞出现凋亡表现。2、受体术前给予灯盏花素预处理后,可以明显减轻移植肝的缺血再灌注损伤。通过抑制氧自由基生成,降低了SOD、GSH-Px的消耗,抑制了脂质过氧化反应,脂质过氧化终产物MDA生成减少,对肝细胞损伤减轻,肝功能好转,肝细胞凋亡减少。第三部分灯盏花素对肝移植冷缺血再灌注损伤TLR4、NF-κB和细胞因子表达的影响目的研究灯盏花素是否通过抑制TLR4启动的天然免疫系统,从而减轻肝移植缺血再灌注损伤。方法1.实验动物分组设计健康、成年、SPF级纯系雄性SD大鼠42只,体重260-320g,随机分为假手术组、生理盐水对照组、低剂量灯盏花素治疗组和高剂量灯盏花素治疗组。将供肝在4℃保存液保存4小时后原位植入受体。按照“二袖套”法进行大鼠原位肝移植术。于供肝恢复灌注6小时后取材。2.观察指标及方法Western Blotting检测TLR4和NF-κB蛋白,免疫组织化学染色观测肝脏TNF-α、IL-1β在组织中的表达情况。3.统计方法计量资料用均数±标准差（x±s）表示,数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,多组均数间比较采用方差分析,组间两两比较采用最小差异t检验（LSD-t）,P<0.05为差异有统计学意义。结果1. Western Blotting检测结果假手术组肝脏TLR4蛋白的表达量极低,而经缺血再灌注损伤6小时后,生理盐水对照组肝脏TLR4蛋白表达量显着升高（P<0.05）。经灯盏花素处理后TLR4蛋白表达受到抑制（P<0.05）,且高剂量组对TLR4的抑制程度较C组显着（P<0.05）。2.免疫组化观测结果假手术组肝细胞内未见TNF-α、IL-1β着色的阳性表达（-）；经冷缺血再灌注损伤6小时后,生理盐水对照组大鼠的肝细胞的细胞浆、细胞核内均出现深棕黄色染色（++～+++）,尤以细胞浆内表达明显；经灯盏花素处理后,低剂量组TNF-α的阳性表达强度下降（+～++）,阳性表达主要在细胞浆；而高剂量组只表现为细胞浆内轻微黄染（+）。结论1、TLR4介导的天然免疫反应参与了大鼠原位肝移植冷保存再灌注损伤的过程,其信息通路为“LPS→TLR4→核因子κB→细胞因子”。2、采用灯盏花素预处理能够保护大鼠肝移植的冷缺血再灌注损伤,通过抑制TLR4和核因子κB,减少下游TNF-α、IL-1β等炎症性细胞因子的分泌,从而减轻移植肝的缺血再灌注损伤。
林峰[10]（2008）在《青藤碱保护大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的实验研究》文中指出肝脏缺血再灌注损伤是肝脏移植中常见的问题之一,缺血再灌注引起的肝脏损伤是一个连续不断的过程,并最终导致肝细胞损伤。这个过程是在肝脏短暂缺氧并再氧合时触发,临床上许多情况下可发生肝脏缺血再灌注,例如肝脏低灌流状态,各种各样的外科手术操作,以及移植中的供体器官切取。实际上肝脏缺血再灌注损伤是抗原成分获取的结果,是影响肝脏移植结果的重要因素,引起10%左右的早期移植后器官功能衰竭,并且急性和慢性排异的发生率较高。此外,由于边缘性供体对于缺血再灌注损伤非常敏感,这加剧了供体器官的短缺。因此减少缺血再灌注损伤能明显增加获得手术成功的病人数量。然而,到目前为止仍没有可以预防缺血再灌注损伤的有效方法。所以,为了保护细胞和器官的功能,需要通过广泛的研究更好的了解肝脏缺血再灌注损伤的机制以及寻找合适的干预方法必要的。青藤碱是从防己科防己属植物青风藤Sinomenium acutum Rehd.et Wils.根茎中分离出的主要活性成分,其结构类似于吗啡,分子式为C19H23NO4,分子量为329.38,具有镇痛,抗炎等作用,临床主要用于类风湿病的治疗,疗效确切。国内外的研究表明,青藤碱具有良好的抗炎、免疫抑制作用。但是在缺血再灌注损伤中的作用却未见报道。本课题应用“二袖套”法建立大鼠原位肝移植模型,研究青藤碱在肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用,并对其作用机制进行探讨。第一部分:青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用目的:探讨青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。方法:应用SD大鼠为模型动物;采用Kamada’s“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只随机分为假手术组、生理盐水对照组、低剂量（40mg/kg）和高剂量青藤碱治疗组（80mg/kg）,将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,分别观察移植术后1周存活率,检测移植术后2,6,12,24h血清ALT、AST,TUNEL法检测肝细胞凋亡指数（AI）,RT-PCR检测肝脏组织中的TNF-α、IL-β、ICAM-1mRNA的含量,ELISA检测血清IL-2含量,并观察移植肝脏病理形态学的改变。结果:与对照组比较,青藤碱低剂量、高剂量治疗组术后1周存活率显着提高（75%,75%vs12.5%,P＜0.01）,在各个时间点,青藤碱治疗组的ALT、AST水平明显低于生理盐水对照组（P＜0.01）,肝组织中的TNF-α、IL-1β、ICAM-1mRNA表达与对照组相比均显着减少（P＜0.01）,肝细胞凋亡指数下降,在肝移植术后24小时,生理盐水对照组的AI为37.0±4.30,而在青藤碱两治疗组分别为23.8±3.27、18.6±3.03,与对照组相比有显着差异（P＜0.01）。血清IL-2含量降低,肝细胞和肝窦内皮细胞形态也明显改善。结论:青藤碱可以通过抑制Kupffer细胞激活及释放TNF-α、IL-1β等炎症性细胞因子及ICAM-1等粘附分子,抑制肝细胞凋亡,减少细胞免疫相关IL-2的分泌,减轻肝细胞及肝窦内皮细胞的损伤,达到保护肝移植缺血再灌注损伤的效果。第二部分青藤碱对大鼠肝移植缺血再灌注后TLR4、MAPKs和NF-κB表达的影响目的:通过观察不同剂量的青藤碱对大鼠肝移植术后TLR4、MAPKs和NF-κB的影响,探讨青藤碱保护大鼠肝移植缺血再灌注损伤的机制。方法:应用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只随机分为假手术组、对照组、低剂量（40mg/kg）和高剂量青藤碱治疗组（80mg/kg）,将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,选择缺血再灌注后大鼠肝功能损伤最严重的术后6小时为观察点。采用Western Blot方法检测大鼠肝脏组织的TLR4、磷酸化JNK、ERK、p38 MAPK和NF-κB蛋白表达的变化情况。结果:在假手术组TLR4呈低表达,生理盐水对照组TLR4呈高表达,青藤碱显着降低了肝组织TLR4的表达（P＜0.01）。磷酸化JNK、ERK在各组的表达比较无明显差异。磷酸化p38 MAPK和NF-κB在假手术组呈低表达,在生理盐水对照组高表达,而青藤碱明显抑制了磷酸化p38 MAPK和NF-κB的表达（P＜0.01）。结论:青藤碱保护大鼠肝移植缺血再灌注损伤的机制与抑制TLR4介导的天然免疫反应有关,通过抑制p38MAPK信号通路和NF-κB通路,减少下游TNF-α、IL-1β和ICAM-1等炎症细胞因子的分泌。第三部分青藤碱对肝脏缺血再灌注后抗原提呈细胞的影响目的:通过观察不同剂量的青藤碱对大鼠肝移植缺血再灌注后肝脏来源的DC成熟和功能的影响,深入了解青藤碱保护缺血再灌注损伤作用的机制。方法:应用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠48只随机分为生理盐水对照组、低剂量（40mg/kg）和高剂量青藤碱治疗组（80mg/kg）,将供肝在4℃林格液中保存2h后植入受体,术后第三天切取肝脏,分离纯化肝脏DC,观察青藤碱对其成熟和功能的影响。以荧光抗体标记和流式细胞仪对DC进行表型分析OX62和MHC-Ⅱ、CD86等分子。FACS检测移植后肝脏DC对荧光标记的卵清蛋白（OVA-FITC）能力,分析青藤碱对肝脏DC内吞功能的影响。收集获取的DC,用RT-PCR方法测定其中具有免疫调节作用的细胞因子IL-12,IL-1,TNF-αmRNA的表达水平,Western Blot方法检测各组肝脏DC表达的TLR4。收集各处理组肝脏DC以3H-TdR掺入法进行DC刺激同种异基因T细胞增殖功能（MLR）的检测。结果:FACS分析显示,青藤碱处理组DC呈现不成熟DC的表型,DC表面MHC-Ⅱ类分子和CD86等分子表达均显着下降,而对照组则表现为成熟DC表型,高表达MHC-Ⅱ类分子和CD86分子。内吞功能试验发现青藤碱处理组平均荧光强度较对照组的明显增强,表明了青藤碱对肝脏DC向成熟DC转化具有抑制作用。提示青藤碱可显着降低缺血再灌注后肝脏DC的抗原提呈功能。对照组肝脏DC表达IL-12,IL-1,TNF-αmRNA等水平明显增高,TLR4蛋白的表达明显升高,而青藤碱处理组可不同程度抑制这种效应（P＜0.01）。DC刺激同种T细胞增殖功能（MLR）的检测发现青藤碱处理后肝脏DC的混合淋巴细胞反应明显减弱,提示青藤碱能明显抑制DC向T细胞提呈抗原的能力。结论:青藤碱对大鼠缺血再灌注后肝脏DC的成熟和功能具有抑制作用,青藤碱对肝移植缺血再灌注损伤的保护作用可能通过期其抑制DC成熟和功能,抑制缺血再灌注后T细胞的免疫应答有关。
二、蛋白酶抑制剂对大鼠肝缺血再灌注和原位肝移植后肝功能的保护作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白酶抑制剂对大鼠肝缺血再灌注和原位肝移植后肝功能的保护作用（论文提纲范文）
（1）HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 大鼠HO-1和HO-1 shRNA腺相关病毒载体的构建及转染效果验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 大鼠心脏死亡供体原位肝移植缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 微小RNA在肝脏缺血再灌注损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）HO-1基因修饰的BMMSCs联合常温机械灌注保存DCD供肝对大鼠移植肝中胆管上皮细胞的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、BMMSCs的提取及Ad-HO-1 基因转染的BMMSCs的制备 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物及材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 BMMSCs的提取、培养和鉴定 |
| 1.2.2 Ad-HO-1/BMMSCs的制备和鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、建立稳定的体外NMP系统装置和大鼠原位肝移植模型 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物及材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 体外NMP系统装置的鉴定 |
| 2.2.2 成功建立DCD供肝的原位肝移植模型 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、Ad-HO-1/BMMSCs联合NMP 对大鼠胆管上皮细胞保护作用的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物及材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 移植术后各组大鼠胆管形态学检测 |
| 3.2.2 移植术后各组大鼠胆管中CK19蛋白检测 |
| 3.2.3 移植术后各组大鼠移植肝中BEC凋亡相关检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 机械灌注减轻DCD肝移植术后胆道并发症的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）琥珀酸盐对移植肝脏缺血再灌注损伤作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :肝脏缺血期琥珀酸盐累积量与肝移植后缺血再灌注损伤的关系 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 大鼠肝脏缺血各时期琥珀酸盐的测定 |
| 2.2.2 大鼠肝移植中供体肝脏经历缺血和通血后琥珀酸盐量的变化 |
| 2.2.3 药物干预琥珀酸盐量对大鼠肝移植的影响 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠肝移植模型的建立 |
| 2.3.2 研究指标及方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠肝脏缺血各时期琥珀酸盐量的变化 |
| 3.2 大鼠肝移植过程中供体肝脏经历缺血和通血后琥珀酸盐量的变化 |
| 3.3 药物干预琥珀酸盐量对大鼠肝移植的影响 |
| 3.3.1 手术基本情况 |
| 3.3.2 琥珀酸盐含量测定 |
| 3.3.3 ROS测定 |
| 3.3.4 MDA测定 |
| 3.3.5 肝功能ALT,AST测定 |
| 3.3.6 肝组织HE染色 |
| 3.3.7 Western blot测定蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 肝脏缺血期琥珀酸盐累积与肝移植后缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 观察指标及方法 |
| 2.3.1 手术基本情况 |
| 2.3.2 琥珀酸盐含量测定 |
| 2.3.3 ROS测定 |
| 2.3.4 MDA测定 |
| 2.3.5 肝功能ALT,AST测定 |
| 2.3.6 TNF-α,IL-1β测定 |
| 2.3.7 肝组织HE染色 |
| 2.3.8 Western blot测定蛋白表达 |
| 2.3.9 MPTP开放程度检测 |
| 2.3.10 TUNEL法 |
| 2.3.11 免疫共沉淀 |
| 2.3.12 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 手术基本情况 |
| 3.2 琥珀酸盐含量测定 |
| 3.3 ROS测定 |
| 3.4 MDA测定 |
| 3.5 肝功能ALT,AST测定 |
| 3.6 TNF-α,IL-1β测定 |
| 3.7 肝组织HE染色 |
| 3.8 Western blot测定蛋白表达 |
| 3.9 MPTP开放程度测定结果 |
| 3.10 TUNEL结果 |
| 3.11 免疫共沉淀结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 琥珀酸盐结合低温机械灌注和SP600125在肝移植供肝修复和评估中的作用 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 猪肝脏缺血各时期琥珀酸盐的测定 |
| 2.2.2 低温机械灌注联合SP600125对猪DCD肝移植的影响 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 猪DCD肝移植模型的建立 |
| 2.3.2 观察指标及方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪肝脏缺血各时期琥珀酸盐的测定 |
| 3.2 观察指标 |
| 3.2.1 手术基本情况 |
| 3.2.2 琥珀酸盐含量 |
| 3.2.3 ROS测定 |
| 3.2.4 MDA测定 |
| 3.2.5 血清学检查 |
| 3.2.6 肝组织HE染色 |
| 3.2.7 Western blot测定蛋白表达 |
| 3.2.8 MPTP开放程度测定结果 |
| 3.2.9 TUNEL法 |
| 3.2.10 生存率分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒的构建及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 建立SD大鼠DCD原位肝移植模型 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 树鼩原位肝移植模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因迁移和表达的体外实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）常温下奥拉帕尼对大鼠体外供肝灌注保存的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 :大鼠离体肝脏持续灌注模型的建立 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 :常温下奥拉帕尼对大鼠体外供肝灌注保存的保护作用 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）超短无肝期对肝移植受体及供肝保护机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法、意义 |
| 第一部分 快速吻合磁环的研制及其生物相容性评价 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 试剂与仪器 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 磁环 |
| 1.2.2 磁环局部磁场参数 |
| 1.2.3 生物相容性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 磁环制作材料的选择 |
| 1.3.2 磁环钛涂层生物相容性 |
| 1.3.3 磁环产生恒定磁场的磁暴露安全性 |
| 1.3.4 小结 |
| 第二部分 超短无肝期大鼠肝移植模型的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.2 实验动物与分组 |
| 2.1.3 实验动物与分组 |
| 2.1.4 术后处理 |
| 2.1.5 观察指标 |
| 2.1.6 统计学处理 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 一般情况及主要血管吻合时间及手术时间 |
| 2.2.2 术后生存率及死亡原因分析 |
| 2.2.3 术后生存率 |
| 2.2.4 吻合口肉眼及病理HE染色 |
| 2.2.5 吻合口扫描电镜 |
| 2.2.6 吻合口VEGF免疫组化 |
| 2.2.7 腔静脉造影检查 |
| 2.2.8 彩色超声观察 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 磁环吻合与手工缝合的比较 |
| 2.3.2 磁环产生的恒定磁场在血管修复中的作用 |
| 2.3.3 超短无肝期大鼠肝移植模型的建立及意义 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 超短无肝期对肝移植受体及供肝的保护机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 标本采集及检测方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 磁性材料在血管外科中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）丙酮酸乙酯对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、大鼠原位肝移植模型的建立 |
| 1 对象和方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验地点 |
| 1.1.3 主要手术器械与耗材 |
| 1.1.4 药品与试剂 |
| 1.1.5 袖套管制作 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 供体手术 |
| 1.2.2 供肝修剪与套管 |
| 1.2.3 受体手术 |
| 1.2.4 术后管理 |
| 2 结果 |
| 2.1 实验手术和定型手术模型制备结果比较 |
| 2.2 实验手术和定型手术并发症比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠肝脏解剖要点 |
| 3.2 手术要点和技术改良 |
| 3.2.1 麻醉 |
| 3.2.2 供肝获取 |
| 3.2.3 修肝与套管 |
| 3.2.4 供肝移植 |
| 3.2.5 受体术后管理 |
| 3.3 手术失败原因与预防措施 |
| 3.3.1 麻醉意外 |
| 3.3.2 术中出血 |
| 3.3.3 血管栓塞 |
| 3.3.4 无肝期时间过长 |
| 3.3.5 术后出血 |
| 3.3.6 胆道并发症 |
| 3.3.7 术后感染 |
| 4 小结 |
| 二、丙酮酸乙酯对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1 对象和方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂与药品 |
| 1.2 动物模型制备与分组 |
| 1.2.1 大鼠原位肝移植模型的建立 |
| 1.2.2 动物分组 |
| 1.2.3 尾静脉注射方法 |
| 1.3 标本采集 |
| 1.3.1 血标本的采集 |
| 1.3.2 肝组织匀浆制备 |
| 1.4 检测指标与方法 |
| 1.4.1 ALT、AST的测定 |
| 1.4.2 MDA的测定 |
| 1.4.3 SOD的测定 |
| 1.4.4 TNF-α(IL-6)的测定 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 模型制备结果 |
| 2.2 血清ALT、AST水平 |
| 2.3 肝脏MDA、SOD水平 |
| 2.4 血清TNF-α、IL-6水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 动物模型的建立 |
| 3.1.1 造模对象的选择 |
| 3.1.2 术式选择 |
| 3.1.3 模型制备方法与改良(略) |
| 3.2 移植肝缺血再灌注损伤的机制 |
| 3.3 丙酮酸乙酯与肝移植缺血再灌注损伤 |
| 3.3.1 丙酮酸乙酯对肝移植IR损伤氧化应激的影响 |
| 3.3.2 丙酮酸乙酯对肝移植IR损伤炎性因子的影响 |
| 3.3.3 丙酮酸乙酯的其它作用 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 肝移植相关的缺血再灌注损伤的预防与治疗 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）灯盏花素对原位肝移植大鼠供肝冷保存再灌注损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠原位肝移植模型的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 灯盏花素保护大鼠肝移植冷缺血再灌注损伤的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 灯盏花素对肝移植冷缺血再灌注损伤TLR4、NF-κB和细胞因子表达的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 肝移植缺血再灌注损伤机制的研究进展 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学合格证明 |
（10）青藤碱保护大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 缩写对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分：青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分：青藤碱对大鼠肝移植缺血再灌注后TLR4、MAPKs和NF-κB表达的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分：青藤碱对肝脏缺血再灌注后抗原提呈细胞的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、蛋白酶抑制剂对大鼠肝缺血再灌注和原位肝移植后肝功能的保护作用（论文参考文献）
- [1]HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤[D]. 严启航. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]HO-1基因修饰的BMMSCs联合常温机械灌注保存DCD供肝对大鼠移植肝中胆管上皮细胞的保护作用[D]. 侯宾. 天津医科大学, 2020(06)
- [3]琥珀酸盐对移植肝脏缺血再灌注损伤作用的实验研究[D]. 张毅杰. 中国医科大学, 2020(01)
- [4]CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究[D]. 张黎. 昆明医科大学, 2019(05)
- [5]树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究[D]. 唐波. 昆明医科大学, 2018(05)
- [6]常温下奥拉帕尼对大鼠体外供肝灌注保存的实验研究[D]. 胡昭明. 南京医科大学, 2018(01)
- [7]超短无肝期对肝移植受体及供肝保护机制的实验研究[D]. 张威. 天津医科大学, 2013(05)
- [8]丙酮酸乙酯对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用[D]. 于建健. 天津医科大学, 2012(02)
- [9]灯盏花素对原位肝移植大鼠供肝冷保存再灌注损伤的保护作用[D]. 林艺雄. 南方医科大学, 2010(12)
- [10]青藤碱保护大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的实验研究[D]. 林峰. 第二军医大学, 2008(01)