一、猪II型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达（论文文献综述）
于成东[1]（2021）在《内蒙古PCV4分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的初步建立》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒4型（Porcine circovirus type 4,PCV4）作为一种新发现的猪圆环病毒,于2019年在我国湖南省的猪群中首次被检测到,由于发现时间较短,对其流行情况和致病性等相关信息还不明确。对收集的2016年至2018年内蒙古自治区51个猪场的1683份猪血清样本进行了 PCV4回溯性检测,PCR检测结果表明PCV4在猪群中总阳性率为1.6%（27/1683）,PCV4在猪场水平的阳性率为21.6%（11/51）。其中,2016年PCV4在猪群中总阳性率为0.2%（1/485）,2017年为1.7%（12/686）,2018年为2.7%（14/512）;2016年PCV4在猪场水平的阳性率为6.7%（1/15）,2017年为25%（5/20）,2018年为31.3%（5/16）,表明PCV4感染率呈现逐年上升趋势。此外,对PCV2、PCV3、PCV4的共感染情况进行了探究,结果表明PCV4感染与PCV2和PCV3感染并不相关。为明确PCV4的遗传变异和进化规律,本研究共获得了 3条PCV4全基因组序列,同源性分析表明,PCV4具有较高的遗传稳定性。同时,将目前NCBI所能下载到的8条PCV4序列与17种圆环病毒的23条完整基因组序列进行比对,通过核苷酸和推导的氨基酸序列同源性的分析表明,PCV4与水貂圆环病毒同源性最高。PCV4遗传多样性分析结果显示,Cap蛋白序列中存在7个氨基酸突变,Rep蛋白序列中存在6个氨基酸突变;ORF1基因中有19个核苷酸变异位点,ORF2基因中有17个核苷酸变异位点,但没有任何插入和缺失。分别对PCV4全基因组序列、Cap基因序列、Rep基因序列进行系统发育分析,结果显示,PCV4处于一个独立的分支中,与水貂圆环病毒具有最为密切的进化关系。以本实验室扩增的内蒙PCV4毒株的ORF2基因序列为参考,对其密码子进行优化并送往公司进行质粒合成,通过设计特异性引物,扩增出截短后的Cap蛋白基因。将目的基因克隆至pET-28a载体,构建pET28a-PCV4-Cap重组表达质粒。将重组质粒转化至表达宿主菌BL21（DE3）pLysS中进行诱导表达,制备PCV4 Cap重组蛋白。通过优化表达的条件,经SDS-PAGE分析,Cap重组蛋白能够在沉淀中大量表达,且在IPTG终浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导6h条件下表达量最高,其大小约为27 kDa。经Western blot验证,条带单一,与预期结果相同。采用亲和层析的方法,通过镍柱对带有His标签的pET28a-PCV4-Cap重组蛋白进行纯化,纯化后目的蛋白最高纯度可达95.16%。使用纯化、复性后的pET28a-PCV4-Cap重组蛋白与弗氏佐剂按照1:1的比例,乳化后注射于4至6周龄的Balb/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,抗体效价可达1:300000以上。以纯化、复性后重组蛋白作为包被抗原,建立PCV4间接ELISA检测方法,通过对各反应条件进行优化,最终确定:抗原最佳包被浓度为1 μg/mL,4℃包被过夜;使用5%BSA,37℃封闭1 h为最佳封闭条件;待检血清最佳稀释倍数为1:400,37℃孵育1 h;酶标二抗最佳稀释浓度为1:5(000,37℃孵育15 min;底物最佳显色条件为室温显色1 5 min。本研究所建立间接ELISA检测方法批间与批内重复性试验变异系数均小于10%,且与PCV2、PRRSV、PRV、SVV阳性血清不产生血清学交叉反应,证明该方法重复性与特异性良好,为PCV4血清流行病学快速检测提供了新的途径。
曹凤阳[2]（2021）在《猪圆环病毒2型和3型鉴别诊断方法的建立与分子流行病学调查》文中研究指明猪圆环病毒（Porcine Circovirus,PCV）是圆环病毒科圆环病毒属的成员,可引起猪繁殖与呼吸道疾病、断奶仔猪综合征、皮炎及肾炎疾病等症状,给我国养猪业带来巨大经济损失。猪圆环病毒目前分为4个类型:PCV1,PCV2,PCV3和PCV4。其中PCV2和PCV3是在我国猪群流行的主要亚型。而且近年来逐渐出现这两种型混合感染的现象,由于猪感染PCV2和PCV3后在临床表观较难鉴别区分,因此建立针对两种型别PCV的鉴别检测方法,开展分子流行病学调查以进一步了解和揭示病毒的演化和致病机制势在必行。为了解山东省猪群中PCV2和PCV3的感染情况,本研究首先建立了能够区分PCV2和PCV3的Taq Man双重荧光定量PCR检测方法。根据Gen Bank中已经登录的PCV2和PCV3基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。利用棋盘法对引物浓度、探针浓度、退火温度等条件进行了优化,确定最佳反应条件与体系;以标准品质粒为模板绘制标准曲线,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了检验。结果表明,本研究所建立的双重荧光定量PCR方法相关系数R2均大于0.99;该方法对PCV1、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒等病原无扩增;该实验方法对于PCV2和PCV3的检测极限分别为102copies/μL和1copy/μL,相较于普通PCR检测更为敏感;进行的组内和组间重复试验的变异系数均小于3%。上述结果显示,本研究所建立的PCV2和PCV3双重Taq Man荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为后续研究提供了技术支持。随后,应用该方法对77份山东省部分猪场的病料进行检测。结果显示:山东省部分猪场的PCV3阳性率为14.29%（11/77）,PCV2阳性率为32.47%（25/77）,PCV3和PCV2混合感染率为7.79%（6/77）。为进一步了解山东地区PCV2和PCV3的分子生物学特征和遗传变异规律,对所分离到的PCV2和PCV3毒株进行全基因组扩增测序和分析。结果显示,本研究分离的25株PCV2全基因组同源性在96%-99.8%之间,主要亚群是PCV2b和PCV2d;11株PCV3相互之间全基因组序列同源性在98.4%-99.9%之间,在PCV3a亚群、PCV3b亚群、PCV3c亚群均有分布。本研究分离的PCV2和PCV3 Cap蛋白与Rep蛋白位点均发生了突变,相较于PCV3,PCV2的Cap蛋白突变位点较多。上述所获数据为山东地区的PCV2和PCV3的核酸检测、流行病学特征、遗传变异以及防治提供了技术支持和分子生物学依据。鉴于PCV3在世界范围内的广泛流行,建立一种快速、准确的血清学诊断方法对该病的防控具有重大的意义。本研究针对PCV3的Cap蛋白拟建立一个快速检测PCV3抗体的间接ELISA方法。采用PCR方法对PCV3-Cap基因主要抗原区域进行扩增,将扩增产物连接至p ET-28a（+）原核表达载体上,转入大肠杆菌BL21,进行原核表达,成功表达了36.4KDa的蛋白;用包涵体进行纯化,Western blot鉴定表明表达蛋白具有良好的反应活性。对抗原包被浓度、血清稀释比、二抗稀释比等条件进行探索,经反复摸索确定,最适抗原包被浓度为2.5μg/m L,最佳血清稀释比为1:400,最佳羊抗猪酶标记抗体稀释比为1:30000。该方法中PCV3阳性血清的最低检出效价可达1:25600;对PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV等病毒阳性血清测定结果为阴性;批内和批间重复实验变异系数均小于3%;依照优化后的ELISA方法检测了1299份血清,PCV3阳性率为11%。表明建立的ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性。此外,我们同时将纯化后的PCV3 Cap蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,三免后两周内采血分离血清,经检测确认所制备的多抗可以特异性识别PCV3Cap真核表达蛋白。使用PK-15细胞对PCV3毒株进行了分离培养,将PCV3核酸检测结果为阳性的病料研磨液进行小鼠攻毒实验,结果表明:本研究所分离的PCV3病毒无法感染PK-15细胞和BALB/c小鼠。随后,为了进一步了解PCV3的致病机理,本研究预构建PCV3感染性克隆质粒。先以PCV2为模板,设计引物扩增PCV2全基因组,将两个拷贝的PCV2全长基因序列通过酶切位点诱导突变的方式顺次地插入到Blunt质粒,其结果表明转染重组质粒能产生具有感染性的子代病毒,表明PCV2感染性克隆质粒构建成功。参考构建PCV2双拷贝感染性克隆质粒构建方法扩增PCV3的全基因组,将两个拷贝的PCV3全长基因组序列通过Eco R I/Bam H I和Bam H I/Sac I顺次插入到Blunt质粒,构建双拷贝的PCV3感染性克隆质粒Blunt-2PCV3。将构建好的质粒转染PK-15细胞,以鼠抗PCV3 Cap多抗进行IFA鉴定,可见明显的绿色荧光,证明PCV3双拷贝质粒能成功表达病毒蛋白。但在电镜下观察未见病毒粒子,表明本实验所构建的双拷贝PCV3质粒不能拯救出病毒粒子,只是能表达出病毒的部分蛋白。本研究成功构建了双拷贝的PCV3全基因组质粒和具有感染性双拷贝的PCV2的全基因组质粒,为研究PCV2和PCV3分子特性与致病机理提供了参考。
汪孟航[3]（2021）在《PCV3的分子流行病学调查及分离株的致病性研究》文中提出猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3,PCV3）为新发病原体。我国不同地区的研究报道的PCV3阳性率存在差异,其主流基因型还不明确。虽然国内外学者已经进行很多PCV3的研究和报道,但是关于PCV3致病性的信息很少,主要是因为PCV3分离株很难获得,而且实验室感染临床表现差异极大且存在争议。本研究针对现有PCV3研究存在的问题,就PCV3的流行情况、主流基因型、分离鉴定以及致病性方面进行了研究与探讨。本研究对2020～2021年采样自黑龙江、河南、河北、湖北、新疆5省中6个不同养殖集团1201份样本进行PCR检测并测序,结果显示PCV3在所有样本中的感染率为26.3%,PCV3和PCV2混合感染率达18.6%,目前不存在绝对优势PCV3基因型。分子流行病学调查表明我国黑龙江、河南、河北、新疆和湖北的养殖场中猪群PCV2和PCV3的流行情况,PCV2感染率为分别为80.5%、94.6%、86.2%、30.9%和51.9%,总感染率为72.1%;PCV3感染率为分别为21.4%、28.6%、37.9%、21.6%和32.7%,总感染率为26.3%;所有样本中PCV3和PCV2共感染率达18.6%。利用MEGA等生物信息学软件比对PCV2和PCV3的Cap基因,结果表明:PCV2d基因型已经成为主要流行基因型;黑龙江和河北养殖场以PCV3a基因型为主要流行基因型;新疆养殖场以PCV3b基因型为主要流行毒株;河南和湖北养殖场以PCV3c基因型为主要流行毒株。本研究初步掌握我国5省份PCV2和PCV3的流行情况和主流基因型分布,将为PCV2和PCV3的诊断和防控提供一定的理论依据。利用特异性PCR检测呈PCV3阳性病料,接种PK-15细胞有限传代并分离到一株PCV3b型毒株,命名为PCV3-DB-1,并对其生物学特性进行鉴定。PCR全基因组测序明确PCV3-DB-1的基因组大小为2000 bp,并基于ORF2序列的系统发育分析显示PCV3-DB-1毒株属于PCV3b分支。特异性qPCR检测体外原代细胞和传代细胞系中PCV3-DB-1的可传代性,结果显示无法获得连续传代病毒,PK-15细胞系可将PCV3-DB-1分离株最高传至第6代。通过透射电子显微镜和RNAscope原位杂交确认了传代获得的PCV3-DB-1分离株的病毒复制与繁殖。不同时间点q PCR检测并绘制PCV3-DB-1分离株在PK-15细胞中的生长动力学曲线,并采用氯化铯等密度梯度离心法测定PCV3的浮密度为1.37 g/cm3。PCV3-DB-1分离毒株Cap蛋白含有24A和27K分子特征,该类型的PCV3相关生物学特性至今为止首次报道。为探讨PCV3感染在动物体内的致病性,本研究成功建立PCV3-DB-1细胞分离毒和肺脏组织毒动物感染试验,受感染仔猪的临床表现不明显。本研究共进行两批PCV3-DB-1感染3周龄剖宫产无初乳（Cesarean-derived,colostrum-deprived,CDCD）仔猪动物试验,PCV3感染仔猪未出现明显的临床症状和肉眼可见病变。qPCR证实PCV3具有广泛的组织嗜性,且肺脏和淋巴结的病毒含量最高。基于PCV3-rCap-VLPs的间接ELISA检测显示接种PCV3-DB-1细胞毒7 DPI后诱导仔猪产生较弱的IgG抗体应答。然而,流式细胞术检测显示PCV3-DB-1感染没有引起外周血中T淋巴细胞的动态改变。组织学病理学H&E染色显示接种PCV3-DB-1仔猪出现淋巴结淋巴细胞减少和肺泡隔增宽,以及少量炎性细胞浸润的病理学损伤。本研究首次报道Cap蛋白含有24A和27K分子特征的PCV3-DB-1分离株的体内致病性研究,为PCV3的临床相关性提供了一定的理论基础与有益数据。
钱雯娴[4]（2021）在《藏猪猪圆环病毒2型分离、鉴定与遗传特性研究》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）在引起猪的相关疾病综合征中起到重要作用,是最小的哺乳动物病毒。目前,对西藏地区的猪圆环病毒2型相关报道较少。本研究通过流行病学调查、多重荧光定量PCV2分型方法的建立和感染性克隆构建与遗传特性研究,旨在了解西藏林芝地区PCV2流行情况并建立起快速及定量的PCV2分型方法,深入研究藏猪PCV2分离毒株遗传变异的意义与作用。1.为了解西藏林芝市猪圆环病毒2型的分子流行病学以及毒株的遗传变异情况,采用聚合酶链反应技术,对2018～2019年在西藏林芝不同猪场采集的95份样本进行了PCV2的检测,扩增并克隆阳性样本的全基因组序列进行测序,获得9株PCV2全长基因组序列。藏猪阳性病料经无菌处理后接种PK-15细胞,经PCR检测及测序鉴定成功分离得到1株藏猪来源的PCV2毒株,命名为ZZ2毒株。对阳性样本的全基因组序列进行遗传变异分析,发现9株PCV2阳性毒株中有6株为PCV2b基因型,3株为PCV2d基因型,其中2株藏猪分离株为PCV2b亚型,但全长仅有1756 bp,在复制起始区域有11 bp长度的核苷酸序列缺失。2.为建立一种检测猪圆环病毒2型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种基因型PCV2a、PCV2b、PCV2d检出并分型。基于PCV2的ORF2基因保守序列区设计通用引物,并依据不同的基因型分别设计Taqman探针,3条探针分别标记不同的荧光基团,建立和优化多重荧光定量PCR方法的反应体系,检测其灵敏性、重复性和特异性。结果显示建立的多重荧光定量PCR方法最低检测的拷贝数为PCV2a 100 copies/μL、PCV2b 57 copies/μL和PCV2d 100 copies/μL。通过该方法检测227份PCV2阳性临床样本,结果显示PCV2a、PCV2b、PCV2d三种基因型的混合感染较为严重,检出率为55.95%,PCV2b、PCV2d两种基因型共同感染检出率次之,为17.62%。选取部分样本测序鉴定,结果测序分型与多重荧光定量PCR分型的结果具有较高的一致性,西藏9例检测为阳性的样本均为PCV2单一基因型感染且分型结果一致。3.为进一步研究分离得到的ZZ2毒株缺失的11 bp核苷酸序列是否对PCV2的复制能力和致病性有影响,应用反向遗传技术构建了核苷酸缺失的ZZ2全长感染性克隆质粒和基因型为PCV2b正常序列的5123毒株全长感染性克隆质粒,同时利用基因重组技术构建了核苷酸回补后的ZZ2（1767 bp）全长感染性克隆质粒和核苷酸敲除后的5123（1756 bp）核苷酸缺失感染性克隆质粒,核苷酸回补与核苷酸敲除序列为藏猪分离毒株上相对应的缺失核苷酸片段。在构建的四种感染性克隆质粒转染PK-15细胞后,通过PCR、q PCR、IFA和Western blot等方法检测PCV2 ZZ2毒株、ZZ2核苷酸回补毒株（ZZ2-HB）、5123毒株和5123核苷酸敲除毒株（5123-QC）病毒拯救成功,传代至第10代病毒增殖趋于稳定,但ZZ2拯救毒株拷贝数低于其他三株。通过检测相关免疫因子、自噬标志因子和凋亡因子的转录水平,发现核苷酸缺失株抑制IFN-α1转录,在感染后期促进IL-8表达,在感染早期抑制细胞自噬,并对细胞凋亡有抑制作用。
张文[5]（2020）在《猪Ⅱ型圆环病毒感染调控巨噬细胞极化的机制及其在细菌共感染中的作用》文中研究指明猪Ⅱ型圆环病毒（PCV2）感染引起的以断奶仔猪多系统衰竭综合征为主的猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）是严重危害养猪业的重要传染病之一。PCV2感染宿主后可改变宿主免疫功能,导致免疫抑制和疾病发生。临床中猪单独感染PCV2一般不表现临床症状,当PCV2与其他病原菌如胸膜肺炎放线杆菌（APP）共感染时更容易诱发PCVAD。该病在世界范围内广泛流行,给全球养猪业带来巨大经济损失。因此,深入研究PCV2与细菌协同致病机理为临床上治疗和控制PCVAD疾病具有重要的意义。虽然目前已发现一些影响PCV2继发细菌感染的因素,但PCV2感染促进细菌共感染的详细致病机制尚不清楚。巨噬细胞是PCV2感染的主要靶细胞,受到刺激后功能性极化为经典活化的M1型和替代活化的M2型。最新研究表明巨噬细胞极化在病毒感染及继发细菌感染中发挥重要的作用,然而PCV2感染后如何影响巨噬细胞活化及功能并不清楚,以及PCV2对巨噬细胞的影响是否在继发细菌共感染中发挥作用也未见报道。本研究中我们利用小鼠骨髓巨噬细胞（BMDM）和小鼠为模型,发现PCV2b感染显着地促进了细胞M1相关基因的表达,同时抑制M2相关基因的表达,进一步分析发现PCV2b感染促进了腹腔细胞中M1亚群比例,表明PCV2b感染巨噬细胞促进其向M1型极化。进一步利用猪原代肺泡巨噬细胞为模型,发现PCV2感染也可以显着性上调M1相关基因的表达,同时抑制M2相关基因的表达,从而证实PCV2感染诱导巨噬细胞M1型极化。为深入研究PCV2b感染诱导巨噬细胞M1型极化的调控机制,利用敲除Myd88的BMDM,发现PCV2b诱导的M1相关基因的表达受到显着抑制,提示PCV2b可能通过Myd88介导下游信号通路促进M1相关基因的表达。利用NF-κB和MAPKs信号通路的抑制剂预处理细胞,发现PCV2b通过活化NF-κB和JNK信号通路诱导M1相关基因的表达。深入分析发现PCV2b的Rep,ORF3和ORF4蛋白活化了NF-κB的信号通路。而利用HDACs的广谱抑制剂TSA预处理细胞恢复了PCV2b抑制的M2相关基因的表达,提示组蛋白修饰可能在PCV2b抑制M2相关基因表达中发挥作用。深入研究发现PCV2b通过调控H3K27ac和H3K27me3在M2基因上的修饰,从而抑制M2相关基因的表达。进一步研究表明PCV2b的Rep和Cap蛋白通过抑制H3K27me3的特异性去甲基化酶Jmjd3的表达,从而增加H3K27me3在M2基因上的修饰,进而抑制M2相关基因的表达。为了进一步探究PCV2b诱导M1型巨噬细胞极化在促进细菌共感染中的作用,利用BMDM建立PCV2b与APP或鼠伤寒沙门氏菌（STM）共感染细胞模型,研究发现PCV2b感染BMDM显着地促进了细菌的共感染。利用敲除Myd88的BMDM或NF-κB的抑制剂Bay-11预处理细胞,发现抑制PCV2b感染诱导的巨噬细胞M1型极化降低了细菌的共感染,提示PCV2b诱导的巨噬细胞M1型极化在促进细菌共感染中发挥重要作用。下一步建立PCV2b与APP共感染的小鼠模型,证明PCV2感染在体内也能促进细菌的共感染,深入分析发现PCV2b与APP共感染协同促进机体的炎症反应,加剧了机体的损伤。综上所述,我们发现PCV2b感染通过活化NF-κB和JNK信号通路诱导M1相关基因的表达,同时通过调控H3K27的乙酰化和甲基化修饰抑制M2相关基因的表达,促进巨噬细胞的M1型极化,从而促进细菌的继发感染。我们的研究揭示了PCV2诱导巨噬细胞极化的调控机制,从巨噬细胞活化的角度揭示促进其他病原共感染的协同致病机理。本研究为深入理解PCV2感染的免疫抑制机制及临床上治疗混合感染导致的疾病提供理论指导,并为药物研发提供潜在的靶点。
哈卓[6]（2020）在《PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）分为4种,猪圆环病毒1型（PCV1）,猪圆环病毒2型（PCV2）,猪圆环病毒3型（PCV3）和猪圆环病毒4型（PCV4）。PCV1对猪无致病性;PCV2是威胁世界养猪业重要病原之一,给养猪业造成了巨大经济损失;PCV3作为一种新发病毒,2016年在美国首次报道,被认为与猪的多种临床疾病相关,呈世界范围内流行;2019年PCV4首次在中国发现,其流行情况和致病性目前还不确定。我国是世界养猪业和猪肉消耗量最大的国家,比例占世界一半以上。而我国猪群PCV2和PCV3感染广泛,且已造成危害。本研究旨在对我国猪群中PCV2和PCV3的分子流行病学进行调查,明确目前PCV2和PCV3在猪群中的感染状况,遗传变异和进化规律,对流行毒株进行分离鉴定和致病性研究。同时,针对当前流行毒株开展PCV2和PCV3二联重组腺病毒疫苗研究,通过动物试验对疫苗的免疫效果和对流行毒株的保护效果进行了评估,为防控PCV2和PCV3的感染奠定基础。本研究具体结果如下:（1）为明确PCV2在我国的分子流行病学特征,针对2016-2019年间,我国9省份206个猪场的3201份猪临床样本进行PCV2检测。PCV2在猪群中总阳性率为39.6%（1269/3201）,不同省份阳性率为18.6%-44.7%;在猪场水平阳性率为84.5%（174/206）,表明PCV2在我国猪群中感染率很高。为进一步研究PCV2的遗传变异和进化规律,对部分检测阳性的临床样本进行全基因组和ORF2基因的扩增,共获得了64个PCV2的全基因序列和178个ORF2基因序列。全基因组序列、ORF1和ORF2基因的同源性分别为93.9%-99.9%、96.6%-100%和86.8%-100%;氨基酸比对表明Rep蛋白主要存在12个氨基酸变异位点,Cap蛋白主要存在55个氨基酸变异位点,表明Cap蛋白具有很高的遗传变异特性。重组分析表明,不同的PCV2毒株在猪体内可以发生重组,产生新的毒株。遗传进化分析表明,获得的PCV2毒株序列中,15个为PCV2a基因型,58个为PCV2b基因型,169个为PCV2d基因型,表明目前我国猪群流行的PCV2毒株以PCV2d基因型为主。（2）通过全球毒株序列分析,确定了PCV2毒株进化过程中可视化的基因型漂移规律和氨基酸变异规律,并分析了导致氨基酸变异可能的原因和影响。PCV2毒株进化过程中可视化的基因型漂移规律表明,世界范围内,2001年前,PCV2a为主要基因型,2001-2011年,PCV2b为主要基因型,2011年后,PCV2d为主要基因型;2006年后,PCV2d呈上升趋势,PCV2a和PCV2b呈下降趋势;PCV2进化过程中经历了两次基因型漂移,2001年,PCV2a漂移至PCV2b,2012年,PCV2b漂移至PCV2d。在中国,2002年前,PCV2a为主要基因型,2002-2008年,PCV2b为主要基因型,2008年后,PCV2d为主要基因型;2004年后,PCV2d呈上升趋势,PCV2b呈下降趋势;PCV2进化过程中经历了两次基因型漂移,2002年,PCV2a漂移至PCV2b,2009年,PCV2b漂移至PCV2d。在PCV2毒株的进化过程中,Cap蛋白上14个氨基酸位点发生了明显的变异,发生时间在2007年左右,PCV2商品化疫苗在世界范围内使用时间为2006年,表明疫苗使用和免疫压力可能导致了氨基酸变异。由于2015年前使用的疫苗全部为PCV2a基因型,进一步分析PCV2a、PCV2b和PCV2d基因型的氨基酸组成,发现Cap蛋白氨基酸变异前主要由PCV2a和PCV2b基因型决定,变异后由PCV2d基因型决定,进一步说明疫苗的使用可能导致PCV2在进化过程发生氨基酸变异,而氨基酸变异则导致PCV2d基因型的出现和流行。（3）PCV2的分子流行病学调查结果表明,目前我国猪群流行的PCV2毒株以PCV2d基因型为主。为进一步确定PCV2的流行株,对PCV2d Cap蛋白氨基酸进行比对,发现PCV2/JL/JL19毒株Cap蛋白序列保守,与其它毒株比较没有氨基酸变异,所以将其确定为PCV2优势流行株。为明确PCV2/JL/JL19流行株的致病性,对病毒进行分离,病毒滴度可达106.0 TCID50/m L。猪体攻毒试验中,临床症状主要表现为食欲下降和背毛粗糙,攻毒后28天体重明显下降;临床剖检主要表现为淋巴结肿大和出血,各组织器官中均可检测到高拷贝数PCV2 DNA,产生明显的病毒血症;组织病理学观察腹股沟淋巴结和肺脏产生明显病理变化,这些结果表明目前PCV2流行毒株对猪体有明显的致病性。（4）为了解PCV3在我国的分子流行病学特征,对2016-2019年间,我国10省份278个猪场的4199份猪临床样本进行PCV3检测。PCV3在猪群中总阳性率为29.4%（1235/4199）,不同省份间阳性率为7.3%-37.3%;在猪场水平阳性率为74.8%（208/278）,表明PCV3在我国猪群中普遍存在。统计学分析表明PCV3可能增加PCV2和PRRSV感染率,并与猪的临床疾病相关。为进一步研究PCV3的遗传变异和进化规律,对部分检测阳性的临床样本进行全基因组序列扩增,共获得了70个PCV3全基因序列。同源性分析表明PCV3毒株具有很高的遗传稳定性,与其他圆环病毒有很大区别。通过对NCBI数据库中全部673个PCV3毒株序列分析表明,Cap蛋白主要氨基酸变异位点全部在预测的抗原表位上,并且在PCV3毒株进化过程中发生变异。遗传进化分析表明,PCV3毒株主要分为两个基因型,PCV3a和PCV3b;在PCV3的进化过程中PCV3a逐渐减少,PCV3b逐渐增多。上述结果为理解PCV3的流行,发病机制,进化规律和将来的防控提供理论基础。（5）流行病学调查结果表明,PCV3在猪群中具有很高的阳性率,除了猪之间的传播外,是否还存在其他潜在的传播途径,比如通过蚊等媒介生物传播。为了解PCV3在蚊子中的感染和基因组特征,对黑龙江,吉林和云南省的7个猪场的269份蚊子和80份猪血清样本进行PCV3检测。蚊子中PCV3的总阳性率为32.0%（86/269）,同一猪场的蚊子中PCV3阳性率和猪中PCV3阳性率呈正相关性,表明蚊子可能作为PCV3的传播载体。为了解蚊子中PCV3的起源和基因组特性,从蚊子中获得了6个PCV3全基因组序列,从猪中获得了2个PCV3全基因序列。序列分析表明,同一猪场的蚊子和猪中PCV3同源性为100%,表明蚊子中PCV3起源于猪。遗传进化分析表明,蚊子中PCV3分别属于PCV3a和PCV3b基因型。上述结果表明蚊子可能作为PCV3传播链中潜在的传播媒介。（6）对PCV2疫苗新兽药注册和临床试验分析表明,PCV2基因工程疫苗和以PCV2为基础的多联疫苗是PCV2疫苗的发展趋势。PCV3作为猪新发传染病,与PCV2同为圆环病毒科圆环病毒属成员,与猪的多种临床症状相关,给养猪业带来危害。以分子流行病学研究中获得的PCV2流行株PCV2/JL/JL19和PCV3流行株PCV3/JL/JL32的Cap氨基酸为参考,针对猪物种进行密码子优化,以腺病毒为载体,获得了单独表达PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白的重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap;和同时表达PCV2 Cap蛋白和PCV3Cap蛋白的重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap。经过测序表明,基因正确,Western Blot和IFA鉴定蛋白获得表达,稳定性实验表明3株重组腺病毒具有很好的稳定性,表明重组腺病毒构建成功。（7）小鼠免疫试验表明,重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap疫苗免疫后35天,PCV2特异性抗体效价可达1:2700和1:2100;中和抗体分别为1:43和1:52;淋巴细胞增殖水平均为对照组PBS的1.37倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。重组腺病毒r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap疫苗免疫猪体后35天,PCV3特异性抗体效价可达1:2100和1:1600;淋巴细胞增殖水平均为对照组PBS的1.3倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。上述结果表明重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap免疫小鼠后能够分别产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答;重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫小鼠后能够同时产生较好的针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答。（8）猪体免疫试验表明,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫后35天,PCV2特异性抗体效价均可达1:1300;中和抗体分别为1:85和1:81;淋巴细胞增殖水平分别为对照组PBS的1.46倍和1.4倍;均能够产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。PCV2流行株PCV2/JL/JL19攻毒后,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫组与对照组相比无明显临床症状,能够减少病毒血症猪数量,肺脏和腹股沟淋巴结无明显病理变化。重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫猪体后35天,PCV3特异性抗体效价可达分别为1:1600和1:1300;淋巴细胞增殖水平均分别为对照组PBS的1.35倍和1.32倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。PCV3组织毒攻毒后,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫组与对照组相比,能够减少PCV3病毒血症,肺脏和腹股沟淋巴结无明显病理变化。这些结果表明重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap免疫猪体后能够分别产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答,分别抵抗PCV2和PCV3的攻击,为猪体提供很好的保护效果;重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫猪体后能够同时产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答,同时抵抗PCV2和PCV3的攻击,为猪体提供很好的保护效果。
刘杏[7]（2016）在《猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及基因进化分析》文中提出猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征等相关疾病的重要病原体之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）能导致怀孕母猪流产、仔猪严重呼吸症状及死亡。因此,PCV2和PRRSV是影响养猪业发展的两大病原体。目前,养猪场内PCV2和PRRSV混合感染的情况越来越普遍,临床上混合感染猪只临床症状包括严重的呼吸症状、流产和极度虚弱等,且常继发严重的病毒性或细菌性疾病,导致严重的经济损失。因此,PCV2和PRRSV的混合感染的流行病学调查及两种病毒的遗传进化分析对于综合防控猪场疾病具有重要意义。为了解PCV2和PRRSV在中国猪场的混合感染及流行情况,本实验自2013-2015年对吉林、辽宁、黑龙江、山西、山东、广东6省进行PCV2和PRRSV分子流行病学调查,采集了192份样品进行检测,PCV2阳性率为64.3%,PRRSV阳性率为23.4%,29份样品为混合感染,阳性率达18.5%。猪群中PCV2和PRRSV的感染比较普遍,混合感染率也较高,加重了疫病防控的难度。采集自不同地区的12个阳性样品进行PCV2全基因组扩增测序及遗传进化分析发现,12个PCV2序列分别属于PCV2b和PCV2d基因型。其中8个测序序列SX-Z1、SX-Z3、YQ、JL、SY-M-X3、SY-L-3、SY-L-X6和SP-2单独形成一个位于PCV2d-1和PCV2d-2之间的单系群,3个测序序列SY-Z-4、ZD-1和ZD-7与只在丹麦流行的PCV2c基因型毒株同源性高,分析发现是PCV2c和PCV2b基因型间毒株的重组毒。PCV2毒株迁移进化分析预测有PCV2毒株从丹麦迁移至中国。采集自不同地区的12个PRRSV阳性样品中PRRSV ORF5、ORF7、部分Nsp2基因测序分析发现,所有毒株均属于美洲型;12个测序序列在GP5和N蛋白的重要基序上均有关键氨基酸的突变;8个序列SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1和SXkl-2014-1与HP-PRRSV一样在Nsp2上的第481位和第533-561位氨基酸有30个氨基酸的不连续缺失;2个序列HLYyq-2015-1和LNsy-2014-2在Nsp2上出现新型缺失即第593-595位氨基酸缺失;1个序列SDly-2014-1与NADC-30毒株ORF7基因相似度高。同时,分离2株PRRSV毒株,命名为LNsy-2014-1和HLJyq-2015-1,接种细胞后细胞出现变圆、聚堆典型病变,RT-PCR和间接免疫荧光鉴定均为阳性,遗传进化分析均为北美洲型且分别与经典毒株JXA1和VR2332相似度最高。
董林[8]（2014）在《猪圆环病毒2型诊断试剂盒的研制与应用》文中提出PCVD是由PCV2感染引起的，以PMWS、PDNS、PRDC、CT和繁殖障碍等为主要特征的系列疾病总称。随着PCV2流行特性不断发生变化，使得PCVD流行与传播愈加复杂，世界范围PCVD的发生，导致养猪业遭受严重损失。由PCV2感染导致猪群免疫力降低，随之而来的其他多种病原的混合或继发感染更是给养猪业带来十分严重的威胁。PCV2感染早期诊断对PCVD综合防控意义重大，本研究针对PCV2流行特点、基因型特征等研制PCV2快速PCR检测试剂，包括PCV2实时荧光定量PCR检测试剂，PCV2间接ELISA抗体检测试剂盒，PCV2抗体胶体金快速检测试纸等PCV2检测试剂，同时针对山东地区PCV2流行毒株基因特征，建立鉴别PCV2基因型的PCR检测方法，对山东地区PCV2分离毒株基因型特征和遗传变异进行研究，以期为PCV2早期诊断、分子流行病学研究和综合防控提供第一手数据支撑。试验1:猪圆环病毒2型PCR检测方法建立及试剂盒研制建立PCV2快速PCR检测方法，优化反应条件，研制PCR检测试剂盒，并对试剂盒敏感性、特异性、重复性和保存期等性能进行评价。对采集山东地区猪场中的208份临床样品用PCR试剂盒进行检测。结果显示，PCR检测扩增500bp特异性PCV2基因片段，最低核酸检出量1×10-6ng/mL；批内、批间变异系数分别为3.2%和5.7%；与PRRSV、PPV、PRV、JEV、CSFV和PCV1等无交叉反应；4℃条件下，试剂盒有效期12个月。临床样品检测结果显示，208份样品中PCV2阳性为140份，阳性率为67.3%。成功建立了特异性检测PCV2快速PCR方法，试剂盒具有良好的特异性、重复性、敏感性和较长保存时间，可用于临床PCV2感染的快速检测及分子流行病学调查。试验2:猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法建立与应用基于SYBR Green Ⅰ建立PCV2q PCR特异性检测方法，优化PCR反应条件，并进行重复性、敏感性和特异性等性能检测。对不同病理程度的临床样品进行检测，研究PCV2核酸载量与PCV2临床致病性关系；对11株PCV2毒株进行细胞培养核酸载量检测，筛选细胞培养滴度高的毒株。结果显示:建立的q PCR检测方法，样品起始浓度与Ct值在3.21×1004.16×108copies/μL范围内呈良好的线性关系，标准曲线R2为0.9988，斜率为-3.286。该方法与PCV1、PRV、PRRSV、PPV、CSFV、大肠杆菌基因组均无交叉反应；敏感性达3.21×100copies/μL；重复检测变异系数小于5.00%。对采集疑似PCV2感染病料荧光定量检测，阳性检出率为68.94%，显着高于普通PCR检测方法。临床样品检测显示，确诊PMWS病理样品PCV2核酸载量均高于106copies/μL，亚临床感染和健康样品核酸载量低于104copies/μL。分离毒株细胞培养定量检测显示，筛选到2株培养滴度较高毒株，核酸载量分别达到3.62×108copies/μL和6.47×107copies/μL。建立了PCV2SYBR Green Ⅰq PCR检测方法，特异性、重复性良好，敏感性高，实现了对PCV2早期诊断和感染程度定量分析检测，为PCV2的防制和疫苗研制奠定了一定基础。试验3:山东地区PCV2流行毒株分子特征分析PCV2分离毒株扩增ORF2基因，进行DNA序列测定，分析山东地区PCV2流行毒株的基因遗传变异情况。建立PCV2基因型鉴定PCR方法，对PCV2检测阳性158份临床样品进行基因型鉴定。结果显示，28株PCV2分离毒株与国内外主要流行毒株核苷酸同源性为90.5%-99.8%，氨基酸同源性为88.0-99.1%，编码Cap蛋白存在：53-91、121-151和190-210位3个氨基酸高区；基因型鉴定表明，4株为PCV2a型，21株为PCV2b型，3株为新的暂定基因型PCV2d。建立基因型鉴定PCR检测方法，扩增片段大小分别为341bp和177bp，最低检测病毒DNA为5ng/μ L，试验显示，特异性和重复性良好。对158份PCV2阳性样品鉴定显示，23份为PCV2a基因型，96份为PCV2b基因型，28份存在PCV2a和PCV2b共感染，确定PCV2b为山东地区流行的PCV2优势基因型。试验4:猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒研制及应用构建去除核定位信号肽（NSL）Cap重组表达载体，诱导蛋白表达，建立ELISA抗体检测方法，确定最优ELSA反应条件。固化和标准化ELISA反应条件，并组装试剂盒。性能检测表明，该ELISA试剂盒与PCV1、PPV、PRV、CSFV、PRRSV、JEV标准阳性血清无交叉反应性，与北京世纪元亨公司同类试剂盒比较，其特异性、敏感性、符合率分别为95.3％、92.6％、93.8％。批内、批间重复性试验变异系数分别小于3.0％和5.0%。保存期检测显示，试剂盒在4℃条件下保存期达8个月。临床血清样品检测显示，抗体阳性率同病理程度和猪群生长阶段存在一定相关性，不同免疫状态猪群中抗体水平差异明显。本课题研制的ELISA抗体试剂盒具有良好的性能特性，可用于猪群PCV2特异性抗体水平检测和血清流行病学调查。试验5:猪圆环病毒2型胶体金快速检测试纸条研制及应用以金标SPA为示踪物，以Cap和猪IgG作为检测线和质控线，研制PCV2抗体胶体金检测试纸条。优化确定标记SPA最适pH值为8.0，最佳结合浓度为26μg/mL，Cap最佳包被浓度为1.5mg/mL，IgG包被浓度为0.8mg/mL。试纸检测结果可于5-10min用肉眼直接观察，操作简便快速。与PCV2间接ELISA抗体检测试剂盒相比，其灵敏度为95.2%,特异性为97.4%,符合率92.6%，与PCV1、CSFV、PRV、 PRRSV和PPV阳性血清无交叉反应。研制的PCV2胶体金免疫层析试纸具有敏感、特异、结果稳定和操作简便快速等优点，适宜于临床大量PCV2样品的现场快速检测工作。
梁鹏帅[9]（2012）在《广东省规模化猪场猪圆环病毒感染情况及分子特征研究》文中研究说明猪圆环病毒分为猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）两种类型，近年来的研究发现PCV2与一系列猪的综合征有关。PCV2由于引起PCVAD而受到广泛关注，而PCV1在猪群中的感染情况近年来很少有人研究。为了解广东省猪圆环病毒的最新流行情况和广东省病猪群PCV2的感染情况及其与PRRSV的相关性，本研究采集了广东省11个规模猪场各饲养阶段猪血清807份，用套式PCR（nPCR）检测PCV1和PCV2；采集了若干猪场2010年1月至2012年2月间有咳嗽，喘气，消瘦及疑似PDNS等临床症状的猪血清312份和来自实验室猪病门诊疑似PCVAD的病猪血清样品343份（以下称病猪），以及无临床症状猪血清104份（以下称健康猪），以nPCR检测PCV2，以一步法反转录PCR（RT-PCR）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。结果发现所调查的11个规模猪场中只有5个检出PCV1，所有猪场均检出PCV2。PCV2阳性率为30.61%，而PCV1阳性率仅为4.21%；经产母猪和7周龄以上保育猪PCV阳性率最高；病猪血清PCV2阳性率为59.1%，PRRSV阳性率为43.8%，PCV2阳性猪群中有41.6%的猪同时感染PRRSV；病猪群1012月的PCV2感染率最高，而13月最低；健康猪血清PCV2阳性率为37.5%，PRRSV阳性率为3.29%，PCV2与PRRSV无混合感染。证明PCV尤其是PCV2在华南地区仍广泛传播并流行，而且PCV2与PRRSV混合感染致病情况较多。PCV2的感染率与季节有一定的相关性，种猪带毒情况严重。为了解疫苗免疫与否对猪只抗体水平的影响，初步评估疫苗免疫的效果及保护力，了解免疫后PCV2抗体的消长规律及免疫压力下PCV2的变异情况，本研究按生长阶段不同采集免疫PCV2疫苗猪场（免疫场）和不免疫PCV2疫苗猪场（非免疫场）的猪全血样本798份进行PCV2抗体和抗原检测，对部分阳性样品扩增全基因序列进行序列分析。调查发现免疫场公猪PCV2抗体阳性率达到100%，经产母猪PCV2抗体阳性率达到98.5%，而非免疫场公猪抗体阳性率为75%，经产母猪抗体阳性率达到91.3%，免疫场抗体阳性率高于非免疫场，说明进行PCV2疫苗免疫可以提高猪场PCV2的抗体水平。病毒检测结果发现免疫场经产母猪PCV2阳性率仅为8.46%，而非免疫场经产母猪PCV2阳性率达到24.3%，说明疫苗免疫对降低PCV2的感染率有一定的效果。分别对比经产母猪，公猪和后备母猪的抗体和病毒感染情况发现二者并不相符，三者抗体阳性率均远远高于病毒感染率，证明对经产母猪，公猪和后备母猪的PCV2抗体情况调查并不能说明PCV2的感染情况。仔猪PCV2抗体和病毒感染情况随着周龄的升高呈现出规律性的变化，其中抗体有两个高峰，即13周龄和610周龄，病毒感染率在6周龄之后呈升高趋势。免疫场仔猪PCV2感染率明显低于非免疫场的感染率，说明母猪免疫对仔猪有一定的保护作用。对免疫场和非免疫场PCV2全基因序列分析发现他们与法国（AF055393）和加拿大（DQ220730）的毒株序列相比具有较高的同源性，最高分别达到98.6%和98.5%，本研究分离到的毒株与国内毒株具有较近的亲缘关系，免疫猪场毒株序列有所变化。现有PCR方法只能检测到PCV2的存在而不能区分基因亚型。传统分型方法须经测序和序列比对，过程繁琐，成本较高。本文根据PCV2a和PCV2b的序列特点，设计合成了3条引物，建立起了区分PCV2a和PCV2b基因型的PCR方法。试验结果表明该方法敏感性、特异性较强，适合用于PCV2基因亚型的检测。同时，本研究利用该PCR方法对广东省多家规模化猪场的猪血清样本进行了检测，结果发现PCV2在广东省健康猪群中的感染率为31.5%，在病猪群中的感染率达到42.1%，其中PCV2b成为主要的基因型，PCV2a仅存在少量感染，存在同一头猪同时感染PCV2a和PCV2b的情况。说明PCV2b已经成为广东省的流行毒株。为了解广东地区PCV2的流行毒株及其变异情况，从2010年2012年广东省23份疑似PCVAD病猪血清中分离PCV2病毒，用PCR和间接免疫荧光方法对这些毒株进行检测，并以PCR方法扩增得到其全基因序列进行序列分析。结果发现分离得到了23株PCV2流行毒株，其中有2株1766bp的毒株，其他均为1767bp的毒株。这些毒株与GenBank中其他PCV2全基因序列的同源性在94.2%-99%之间，毒株间同源性在94.5%-99%之间。对其基因组特征以及毒株之间的亲缘关系进行分析发现广东分离株与国内流行毒株之间的亲缘关系密切，但也存在一定的差异。同一猪场的毒株在同一时期或不同时期也存在一定的差异。
陈蓉[10]（2011）在《家养野猪源猪圆环病毒2型安徽株的分离鉴定及其特性研究》文中认为猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）引起的临床症状主要为猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎-肾病综合征（PDNS）、猪增生性坏死性肺炎（PNP）、猪先天性脑震颤（CT）、猪的流产与繁殖障碍等。PCV2及其相关的猪病已在全世界范围内发生和流行，造成的危害相当严重。目前国内许多地方都在进行野猪资源的开发利用。为了了解安徽地区家养野猪是否存在PCV2感染，以及其在分子遗传特性和生物学特性是否存在差异。本研究对家养野猪病料进行PCV2分离与鉴定，全基因组测序以及各阅读框序列分析，与小鼠致病性实验。从而为了解家养野猪源PCV2安徽分离株的分子遗传特性和生物学特性，为猪圆环病毒病的研究提供依据。1.应用PK15细胞进行PCV2的分离与增殖，根据PCR、IFA、电镜技术进行PCV2分离株的鉴定。获得一株来自安徽家养野猪源PCV2分离株，命名为YZ0901。首次证明了安徽省家养野猪中也存在PCV2的感染。2.对YZ0901株与5株PCV2安徽分离株进行全基因组克隆和序列分析。YZ0901株基因全长1767bp组成，属于PCV2-1C基因簇，存在同源重组，与42株国内外参考毒株全基因组序列之间同源性为94.2-99.5%，ORF1和ORF2核苷酸序列同源性为96.7-100%和89.6-89.3%。YZ0901株ORF1相对保守，但ORF2差异较大，主要散在于ORF2两个主要免疫反应区内。YZ0901株基因型与安徽地区PCV2流行毒株相关。3.根据ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针，以重组质粒为标准品做标准曲线，建立了PCV2的TaqMan荧光定量PCR检测方法。TaqMan荧光定量建立的标准曲线循环阈值（Ct值）重复性较好，灵敏度约为6×101拷贝/μL，对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟兔化弱毒无交叉反应。在临床样本检测中，该方法检测快速，灵敏度高。表明本方法快速、敏感、特异性强，具有较高的重复性，为PCV2的临床检测及组织亲嗜性、细胞培养特性等研究提供技术支持。4. YZ0901株与3株家猪源毒株进行小鼠攻毒实验，对其抗体、细胞因子和各组织中病毒粒子数量进行检测，并观察病理变化。YZ0901株的IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-10的浓度处于较低的水平，抗体波动大，引起脾小体增多和肾小球肿大、细胞增多的程度较大，且病毒粒子数的最高值（5.35×104拷贝/μL、5.995×104拷贝/μL）比其它各组大。表明YZ0901株感染小鼠，先产生细胞免疫抑制，后产生体液免疫抑制，并对脾脏、肾脏的亲嗜性较强。同属于PCV2b-1C基因簇的YZ0901株与XC0801株的免疫应答能力比PCV2b-1A（DY0801株）、PCV2b-1B（BH0801株）的低，对组织的亲嗜性则强于PCV2b-1A基因簇而弱于PCV2b-1B基因簇。
二、猪II型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪II型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达（论文提纲范文）
（1）内蒙古PCV4分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 猪圆环病毒概述 |
| 2 病原学 |
| 2.1 病毒的分类及结构 |
| 2.2 PCV的理化性质 |
| 2.3 PCV细胞培养特性 |
| 3 PCV分子生物学特征 |
| 3.1 PCV1基因组结构及编码蛋白 |
| 3.2 PCV2基因组结构及编码蛋白 |
| 3.3 PCV3基因组结构及编码蛋白 |
| 3.4 PCV4基因组结构及编码蛋白 |
| 4 PCV引起的相关疾病研究 |
| 5 PCV实验室诊断方法 |
| 5.1 PCR及实时荧光定量PCR |
| 5.2 酶联免疫吸附试验 |
| 6 PCV流行情况 |
| 6.1 PCV2国内外流行现状 |
| 6.2 PCV3国内外流行现状 |
| 6.3 PCV4国内外流行现状 |
| 7 研究目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样本来源 |
| 1.2 载体与细胞 |
| 1.3 抗体与细胞培养液 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪圆环病毒4型分子流行病学调查 |
| 2.2 PCV4 Cap蛋白表达及纯化 |
| 2.3 PCV4间接ELISA检测方法的初步建立 |
| 结果 |
| 1 内蒙古自治区PCV4分子流行病学调查 |
| 1.1 PCV4的流行情况 |
| 1.2 PCV4与PCV2、PCV3共感染 |
| 1.3 PCV4全基因组序列扩增结果 |
| 1.4 PCV4全基因组序列同源性分析 |
| 1.5 PCV4遗传变异特性 |
| 1.6 PCV4遗传进化分析 |
| 2 PCV4 Cap蛋白表达及纯化 |
| 2.1 PCV4 Cap基因扩增结果 |
| 2.2 pET28a-PCV4-Cap重组质粒鉴定结果 |
| 2.3 pET28a-PCV4-Cap重组蛋白Western blot验证 |
| 2.4 pET28a-PCV4-Cap重组蛋白表达条件优化 |
| 2.5 pET28a-PCV4-Cap重组蛋白表达形式验证结果 |
| 2.6 pET28a-PCV4-Cap重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 PCV4 Cap蛋白真核表达及鼠源多克隆抗体鉴定 |
| 3 PCV4间接ELISA检测方法最佳反应条件建立 |
| 3.1 抗体阳性血清鉴定结果 |
| 3.2 抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数 |
| 3.3 抗原最佳包被条件确定 |
| 3.4 最佳封闭液种类及封闭时间结果 |
| 3.5 最佳血清孵育时间及二抗稀释倍数结果 |
| 3.6 酶标二抗孵育时间与底物显色时间最佳选择结果 |
| 3.7 阴阳性临界值确定 |
| 3.8 批内与批间重复性试验结果 |
| 3.9 特异性试验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简介) |
| 附录B |
（2）猪圆环病毒2型和3型鉴别诊断方法的建立与分子流行病学调查（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 病原 |
| 1.1.1 PCV的发现 |
| 1.1.2 PCV的结构及生物学特征 |
| 1.1.3 PCV的基因组结构与编码蛋白 |
| 1.2 猪圆环病毒致病性研究 |
| 1.3 猪圆环病毒的流行病学研究 |
| 1.4 检测方法 |
| 1.4.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR |
| 1.4.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4.4 免疫荧光试验(IF) |
| 1.4.5 免疫组化(IHC) |
| 1.4.6 免疫电镜(IEM) |
| 1.4.7 纳米PCR |
| 1.4.8 原位杂交技术(ISH) |
| 1.4.9 环介导等温扩增技术(LAMP) |
| 1.5 PCV相关疾病的预防与治疗 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料及毒株来源 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.2.1 主要仪器 |
| 2.1.2.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2和PCV3 双重Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 病毒DNA的提取 |
| 2.2.1.3 PCV2 Rep 基因和PCV3 Cap 基因的扩增 |
| 2.2.1.4 胶回收 |
| 2.2.1.5 连接转化 |
| 2.2.1.6 质粒提取 |
| 2.2.1.7 双重TaqMan荧光定量PCR方法的建立和优化 |
| 2.2.1.8 建立标准曲线 |
| 2.2.1.9 特异性试验 |
| 2.2.1.10 敏感性试验 |
| 2.2.1.11 重复性试验 |
| 2.2.1.12 临床样本检测 |
| 2.2.2 PCV2和PCV3 的分子流行病学调查 |
| 2.2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2.2 病毒DNA的提取和全基因组扩增 |
| 2.2.2.3 分子克隆 |
| 2.2.2.4 序列分析和遗传进化树构建分析 |
| 2.2.3 PCV3 Cap多抗的制备和抗体间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.3.1 引物设计 |
| 2.2.3.2 Cap基因的扩增 |
| 2.2.3.3 原核表达质粒pET28-PCV3-Cap的构建 |
| 2.2.3.4 蛋白的诱导表达 |
| 2.2.3.5 蛋白纯化 |
| 2.2.3.6 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.3.7 真核表达质粒pEGFP-PCV3-Cap的构建 |
| 2.2.3.8 多克隆抗体的验证 |
| 2.2.3.9 重组蛋白pET28-PCV3-Cap的 Western blot鉴定 |
| 2.2.3.10 间接ELISA操作方法与最佳反应条件的确定 |
| 2.2.3.11 间接ELISA临界值的确定 |
| 2.2.3.12 间接ELISA敏感性试验 |
| 2.2.3.13 间接ELISA特异性试验 |
| 2.2.3.14 间接ELISA重复性试验 |
| 2.2.3.15 间接ELISA临床样品检测试验 |
| 2.2.4 PCV3 野毒株分离培养的研究 |
| 2.2.4.1 使用PK-15 分离PCV3 野毒株 |
| 2.2.4.2 PCV3 野毒株感染小鼠的研究 |
| 2.2.5 感染性克隆质粒构建的初步研究 |
| 2.2.5.1 引物设计 |
| 2.2.5.2 PCV2 全基因组克隆 |
| 2.2.5.3 PCV2 感染性克隆质粒的构建 |
| 2.2.5.4 重组质粒转染及间接免疫荧光检测 |
| 2.2.5.5 拯救病毒体外感染试验 |
| 2.2.5.6 PCV3 感染性克隆的构建 |
| 2.2.5.7 重组质粒转染及病毒的拯救 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪圆环病毒2 型和3 型双重Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立与应用 |
| 3.1.1 PCV2和PCV3 的标准品质粒的构建 |
| 3.1.2 双重Taq Man荧光定量PCR方法的建立和优化 |
| 3.1.3 标准曲线的建立 |
| 3.1.4 特异性检测 |
| 3.1.5 敏感性检测 |
| 3.1.6 重复性检测 |
| 3.1.7 临床检测 |
| 3.2 PCV2和PCV3 的分子流行病学调查 |
| 3.2.1 PCV2和PCV3 全基因组的扩增和序列测定 |
| 3.2.2 PCV2 全基因组序列分析 |
| 3.2.3 PCV2 Cap遗传进化分析 |
| 3.2.4 PCV2 Rep遗传进化分析 |
| 3.2.5 PCV3 全基因组序列分析 |
| 3.2.6 PCV3 Cap遗传进化分析 |
| 3.2.7 PCV3 Rep遗传进化分析 |
| 3.3 PCV3 Cap多抗的制备和抗体间接ELISA方法的建立 |
| 3.3.1 PCV3Cap基因扩增 |
| 3.3.2 原核表达质粒的构建 |
| 3.3.3 重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.4 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.3.5 鼠PCV3 Cap蛋白多克隆抗体的制备和验证 |
| 3.3.6 间接ELISA最佳反应条件的确定 |
| 3.3.6.1 抗原最佳包被量和血清最佳稀释度和作用时间的确定 |
| 3.3.6.2 二抗最佳稀释度和最佳作用时间的确定 |
| 3.3.7 间接ELISA临界值的确定 |
| 3.3.8 间接ELISA敏感性试验 |
| 3.3.9 间接ELISA特异性试验 |
| 3.3.10 间接ELISA重复性试验 |
| 3.3.10.1 批内重复性试验 |
| 3.3.10.2 批间重复性试验 |
| 3.3.11 间接ELISA临床样品检测试验 |
| 3.4 PCV3 野毒株分离的研究 |
| 3.5 感染性克隆质粒的构建 |
| 3.5.1 PCV2 全基因扩增 |
| 3.5.2 双拷贝PCV2 重组质粒转染检测结果 |
| 3.5.3 PCV2 拯救病毒体外感染试验 |
| 3.5.4 单拷贝PCV3 全基因组的扩增 |
| 3.5.5 Blunt-2PCV3 重组质粒构建 |
| 3.5.6 双拷贝PCV3 重组质粒转染检测结果 |
| 3.5.7 电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）PCV3的分子流行病学调查及分离株的致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 圆环病毒研究进展 |
| 1.1.1 圆环病毒科 |
| 1.1.2 猪圆环病毒 |
| 1.1.3 猪圆环病毒分子生物学特征 |
| 1.1.4 猪圆环病毒流行现状 |
| 1.1.5 猪圆环病毒基因分型 |
| 1.2 PCV3 研究进展 |
| 1.2.1 PCV3 的发现与检测 |
| 1.2.2 PCV3 的起源与进化 |
| 1.2.3 PCV3 的流行现状 |
| 1.2.4 PCV3 的致病性研究 |
| 1.2.4.1 生殖系统疾病相关 |
| 1.2.4.2 呼吸道疾病相关 |
| 1.2.4.3 其他相关疾病 |
| 1.2.4.4 健康动物 |
| 1.2.4.5 混合感染 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 第二章 PCV3 分子流行病学调查以及与PCV2 共感染情况 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 样本处理 |
| 2.1.4 总DNA提取 |
| 2.1.5 特异性PCR检测 |
| 2.1.6 基因序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 黑龙江某一场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.2 黑龙江某二场的PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.3 河南某场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.4 河北某场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.5 新疆某场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.6 湖北某场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.7 PCV2 Cap蛋白差异分析 |
| 2.2.8 PCV3 Cap蛋白差异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PCV3-DB-1 的分离鉴定与生物学特性研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 病料来源 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 全基因组测序 |
| 3.1.5 基因序列分析 |
| 3.1.6 细胞嗜性探索 |
| 3.1.7 病毒分离 |
| 3.1.8 电镜观察 |
| 3.1.9 RNA原位杂交 |
| 3.1.10 生长动力学的测定 |
| 3.1.11 等密度梯度离心 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PCV3 全基因组序列 |
| 3.2.2 PCV3 系统发育分析 |
| 3.2.3 PCV3 细胞系传代 |
| 3.2.4 PCV3 原代细胞传代 |
| 3.2.5 PCV3 病毒颗粒 |
| 3.2.6 PCV3 原位杂交 |
| 3.2.7 PCV3 生长动力学 |
| 3.2.8 PCV3 浮密度 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 PCV3-DB-1 分离株的致病性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 攻毒设计 |
| 4.1.5 临床症状 |
| 4.1.6 血清采集 |
| 4.1.7 体重测量 |
| 4.1.8 解剖观察 |
| 4.1.9 病理学观察 |
| 4.1.10 荧光定量PCR检测 |
| 4.1.11 ELISA抗体检测 |
| 4.1.12 RNA原位杂交 |
| 4.1.13 流式细胞术 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PCV3 细胞分离毒动物感染试验 |
| 4.2.1.1 临床症状 |
| 4.2.1.2 病毒血症 |
| 4.2.1.3 眼观病变观察 |
| 4.2.1.4 病理组织学分析 |
| 4.2.1.5 病毒对不同器官的嗜性 |
| 4.2.1.6 RNA原位杂交 |
| 4.2.1.7 血清抗体分析 |
| 4.2.1.8 外周血T淋巴细胞亚群分析 |
| 4.2.2 PCV3 组织毒动物感染试验 |
| 4.2.2.1 临床症状 |
| 4.2.2.2 病毒血症 |
| 4.2.2.3 组织器官的病毒载量 |
| 4.2.2.4 病理学损伤 |
| 4.2.2.5 血清抗体 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）藏猪猪圆环病毒2型分离、鉴定与遗传特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 猪圆环病毒2 型研究进展 |
| 1.1.1 PCV2 的发现 |
| 1.1.2 PCV2 的理化特性 |
| 1.1.3 PCV2 的基因组特征 |
| 1.1.4 PCV2 的遗传与变异 |
| 1.1.5 PCV2 的病毒复制 |
| 1.2 猪圆环病毒2 型流行病学研究 |
| 1.2.1 猪圆环病毒病 |
| 1.2.2 国内外流行情况 |
| 1.3 猪圆环病毒2 型与宿主的相互作用 |
| 1.3.1 PCV2 引起的免疫抑制 |
| 1.3.2 PCV2 诱导的细胞自噬 |
| 1.3.3 PCV2 诱导的细胞凋亡 |
| 1.4 猪圆环病毒2 型检测技术 |
| 1.4.1 环介导等温扩增技术检测PCV2 的研究进展 |
| 1.4.2 聚合酶链式反应技术检测PCV2 的研究进展 |
| 1.4.3 酶联免疫吸附试验检测PCV2 的研究进展 |
| 1.4.4 免疫荧光技术检测PCV2 的研究进展 |
| 第二章 西藏林芝猪圆环病毒2 型流行病学调查及病毒分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验试剂 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 检测样本来源 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 PCR和荧光定量PCR检测PCV2 相关引物设计 |
| 2.2.2 样本处理和核酸提取 |
| 2.2.3 特异性PCR扩增 |
| 2.2.4 病毒基因组的克隆与序列分析 |
| 2.2.5 分析比较PCV2 全长基因序列 |
| 2.2.6 病毒的分离 |
| 2.2.7 藏猪PCV2 分离毒株的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 特异性PCR扩增结果 |
| 2.3.2 样本中PCV2 全长序列的基因分析 |
| 2.3.3 PCV2 分离毒株PCR检测及全长基因序列鉴定结果 |
| 2.3.4 PCV2 分离株不同代次增殖情况的测定 |
| 2.3.5 间接免疫荧光(IFA)检测 |
| 2.3.6 PCV2 分离株TCID_(50)测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 多重荧光定量PCR检测猪圆环病毒2a、2b和 2d基因型方法的建立与应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒与病料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物的设计及合成 |
| 3.2.2 PCV2a、PCV2b、PCV2d重组质粒标准品的制备 |
| 3.2.3 PCV2 多重荧光定量PCR分型检测方法的建立 |
| 3.2.4 临床样本的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 多重荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.3.2 标准曲线的绘制结果 |
| 3.3.3 特异性试验结果 |
| 3.3.4 灵敏性试验结果 |
| 3.3.5 重复性试验结果 |
| 3.3.6 临床样本的检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 PCV2 藏猪分离株感染性克隆的构建及相关特性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞及抗体 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 构建感染性克隆质粒引物的设计与合成 |
| 4.2.2 ZZ2、5123 毒株PCR全长基因重组质粒的构建 |
| 4.2.3 ZZ2 毒株基因回补重组质粒的构建 |
| 4.2.4 5123 毒株基因敲除重组质粒的构建 |
| 4.2.5 感染性克隆的构建 |
| 4.2.6 感染性克隆质粒的转染及测序鉴定 |
| 4.2.7 感染性克隆毒株的TCID_(50)测定 |
| 4.2.8 病毒拯救Cap蛋白表达的Western blot检测 |
| 4.2.9 拯救病毒的复制增殖检测 |
| 4.2.10 检测PCV2 体外感染细胞因子m RNA水平 |
| 4.2.11 检测PCV2 体外感染对细胞自噬的影响 |
| 4.2.12 检测PCV2 体外感染对细胞凋亡的影响 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 毒株全长基因组的扩增 |
| 4.3.2 感染性克隆重组质粒的构建 |
| 4.3.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.3.4 PCV2 毒株感染性克隆的拯救及测序鉴定 |
| 4.3.5 拯救病毒Cap蛋白的Western blot检测结果 |
| 4.3.6 感染性克隆构建毒株的病毒增殖水平检测 |
| 4.3.7 感染性克隆构建毒株的TCID_(50)测定 |
| 4.3.8 检测PCV2 体外感染细胞因子m RNA水平 |
| 4.3.9 检测PCV2 体外感染对细胞自噬的影响 |
| 4.3.10 检测PCV2 体外感染对细胞凋亡的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（5）猪Ⅱ型圆环病毒感染调控巨噬细胞极化的机制及其在细菌共感染中的作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 猪Ⅱ型圆环病毒研究进展 |
| 1.1.1 猪圆环病毒相关疾病 |
| 1.1.2 圆环病毒概述及分型 |
| 1.1.3 PCV2 的基因组及编码蛋白功能 |
| 1.1.4 PCV2 的流行现状与传播途径 |
| 1.2 PCV2 的致病机理 |
| 1.2.1 PCV2 感染对细胞的致病作用 |
| 1.2.2 PCV2 感染与细胞因子表达 |
| 1.2.3 PCV2 感染与免疫抑制 |
| 1.2.4 PCV2 与其他病原共感染 |
| 1.2.5 免疫刺激对PCV2 感染的促进作用 |
| 1.3 PCV2 感染与细胞信号通路调控 |
| 1.4 PCV2 感染的动物模型 |
| 1.5 巨噬细胞活化研究进展 |
| 1.5.1 巨噬细胞极化的定义 |
| 1.5.2 巨噬细胞M1 和M2 表型、功能及信号分子 |
| 1.5.3 调控巨噬细胞极化的分子机制 |
| 1.5.4 巨噬细胞极化与病毒感染 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器设备 |
| 2.2 实验动物、材料和试剂 |
| 2.3 主要试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞及细菌的培养 |
| 2.4.2 小鼠原代骨髓巨噬细胞的分离培养 |
| 2.4.3 小鼠腹腔细胞的分离 |
| 2.4.4 细胞感染实验 |
| 2.4.5 RNA提取及反转录 |
| 2.4.6 实时荧光定量PCR |
| 2.4.7 RNA-seq分析 |
| 2.4.8 流式细胞术分析 |
| 2.4.9 免疫印迹 |
| 2.4.10 染色体免疫共沉淀(Ch IP) |
| 2.4.11 细菌的荧光标记 |
| 2.4.12 载体的构建 |
| 2.4.13 质粒提取 |
| 2.4.14 双荧光素报告基因检测 |
| 2.4.15 逆转录病毒介导的蛋白在原代BMDMs细胞中的表达 |
| 2.4.16 PCV2 感染小鼠模型 |
| 2.4.17 石蜡组织切片 |
| 2.4.18 病理组织学分析及免疫组化 |
| 2.4.19 免疫组织化学分析 |
| 2.4.20 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PCV2b感染对巨噬细胞活化的影响 |
| 3.1.1 PCV2b体外感染巨噬细胞诱导其M1 极化 |
| 3.1.2 PCV2b感染诱导体内巨噬细胞M1 极化 |
| 3.2 PCV2b通过激活NF-κB和 MAPK信号诱导M1 相关基因的表达 |
| 3.2.1 PCV2b感染巨噬细胞诱导M1 相关基因表达依赖于My D88 |
| 3.2.2 PCV2b通过活化NF-κB和 JNK信号诱导M1 相关基因的表达 |
| 3.2.3 PCV2b的 ORF1、ORF3和ORF4 编码的蛋白活化NF-κB信号通路 |
| 3.3 PCV2b调节组蛋白修饰抑制巨噬细胞M2 相关基因表达 |
| 3.4 PCV2b感染巨噬细胞体外促进细菌的共感染 |
| 3.5 PCV2b感染通过诱导巨噬细胞极化促进细菌的共感染 |
| 3.6 PCV2b体内感染促进了细菌的共感染 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCV2 感染与巨噬细胞极化调控和免疫抑制 |
| 4.2 PCV2 诱导M1 型巨噬细胞极化的调控机制 |
| 4.3 PCV2 继发细菌共感染的致病机制 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
（6）PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪圆环病毒特性 |
| 1.1.1 猪圆环病毒2型 |
| 1.1.2 猪圆环病毒3型 |
| 1.2 猪圆环病毒的流行病学 |
| 1.2.1 猪圆环病毒2型的流行病学 |
| 1.2.2 猪圆环病毒3型的流行病学 |
| 1.3 猪圆环病毒的致病机制 |
| 1.3.1 猪圆环病毒2型的致病机制 |
| 1.3.2 猪圆环病毒3型的致病机制 |
| 1.4 猪圆环病毒疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 PCV2疫苗的种类 |
| 1.4.2 PCV2疫苗临床试验 |
| 1.4.3 PCV2疫苗的展望 |
| 1.4.4 PCV3疫苗的研究进展 |
| 1.5 腺病毒载体疫苗 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 细胞和毒株 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪圆环病毒2型的分子流行病学调查 |
| 2.2.2 PCV2全球毒株的进化规律分析 |
| 2.2.3 PCV2流行株的分离及致病性研究 |
| 2.2.4 猪圆环病毒3型的分子流行病学调查 |
| 2.2.5 PCV3潜在的传播途径监测 |
| 2.2.6 PCV3 Cap蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.7 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗构建及鉴定 |
| 2.2.8 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗免疫小鼠试验 |
| 2.2.9 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗猪体免疫试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪圆环病毒2型的分子流行病学调查 |
| 3.1.1 PCV2在中国9省份的流行状况 |
| 3.1.2 PCV2 全基因组序列和ORF2 基因的扩增 |
| 3.1.3 同源性分析 |
| 3.1.4 氨基酸比对 |
| 3.1.5 重组分析 |
| 3.1.6 遗传进化分析 |
| 3.1.7 PCV2流行毒株的选择 |
| 3.2 全球PCV2毒株的进化规律分析 |
| 3.2.1 PCV2毒株进化过程中世界范围内的基因型漂移 |
| 3.2.2 PCV2毒株进化过程中在中国的基因型漂移 |
| 3.2.3 全球PCV2毒株进化过程中氨基酸变异 |
| 3.2.4 中国的PCV2毒株进化过程中氨基酸变异 |
| 3.2.5 PCV2毒株进化过程中氨基酸变异产生的可能原因 |
| 3.3 PCV2流行株的分离及致病性研究 |
| 3.3.1 PCV2的分离与鉴定 |
| 3.3.2 PCV2分离株的纯净性检测和全基因组测序 |
| 3.3.3 PCV2分离株的滴度测定 |
| 3.3.4 PCV2流行株攻毒试验 |
| 3.4 猪圆环病毒3型的分子流行病学调查 |
| 3.4.1 PCV3在中国10个省份的流行状况 |
| 3.4.2 PCV3与猪临床疾病潜在的相关性 |
| 3.4.3 PCV3全基因组序列扩增 |
| 3.4.4 同源性分析 |
| 3.4.5 PCV3的遗传变异 |
| 3.4.6 全基因组序列的比对 |
| 3.4.7 遗传进化分析 |
| 3.4.8 PCV3基因型的进化规律 |
| 3.4.9 PCV3流行毒株的选择 |
| 3.5 PCV3潜在的传播途径 |
| 3.5.1 PCV3在蚊子和猪场中的检测 |
| 3.5.2 PCV3可能的传播圈 |
| 3.5.3 蚊子中PCV3全基因组序列扩增 |
| 3.5.4 氨基酸比对 |
| 3.5.5 蚊子中PCV3的起源 |
| 3.5.6 蚊PCV3遗传进化分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.6.1 PCV3 Cap原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.6.2 PCV3 Cap蛋白原核表达与鉴定 |
| 3.6.3 PCV3 Cap蛋白的纯化与鉴定 |
| 3.6.4 PCV3 Cap蛋白多克隆抗体制备与鉴定 |
| 3.7 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗构建及鉴定 |
| 3.7.1 PCV2 ORF2和PCV3 ORF2 基因的优化 |
| 3.7.2 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒穿梭质粒的构建 |
| 3.7.3 包装重组腺病毒 |
| 3.7.4 重组腺病毒IFA鉴定 |
| 3.7.5 重组腺病毒Western Blot鉴定目的蛋白 |
| 3.7.6 稳定性鉴定 |
| 3.8 PCV2 Cap和 PCV3 Cap单独及二联重组腺病毒疫苗免疫小鼠试验结果 |
| 3.8.1 特异性抗体检测 |
| 3.8.2 PCV2中和抗体检测 |
| 3.8.3 淋巴细胞增殖反应 |
| 3.8.4 细胞因子检测 |
| 3.8.5 PCV2攻毒保护试验 |
| 3.9 PCV2 Cap和 PCV3 Cap单独及二联重组腺病毒疫苗免疫猪体试验 |
| 3.9.1 特异性抗体检测 |
| 3.9.2 PCV2中和抗体检测 |
| 3.9.3 淋巴细胞增殖反应 |
| 3.9.4 细胞因子检测 |
| 3.9.5 PCV2攻毒保护试验 |
| 3.9.6 PCV3攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCV2的分子流行病学特征 |
| 4.2 通过全球毒株序列分析PCV2的进化规律 |
| 4.3 PCV3在中国的分子流行病学特征 |
| 4.4 PCV3潜在的传播途径 |
| 4.5 重组腺病毒疫苗的设计和构建 |
| 4.6 重组腺病毒疫苗的免疫效果的评价 |
| 4.7 重组腺病毒疫苗免疫后攻毒保护试验 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及基因进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 引言 |
| 1.1 PCV2研究进展 |
| 1.1.1 PCV2基因组及其复制转录 |
| 1.1.2 PCV2感染和相关疾病 |
| 1.1.3 PCV2编码蛋白及其功能 |
| 1.1.4 PCV2研究展望 |
| 1.2 PRRSV研究进展 |
| 1.2.1 PRRSV基因组及其复制转录 |
| 1.2.2 PRRSV感染及致病力 |
| 1.2.3 PRRSV编码蛋白及其功能 |
| 1.2.4 PRRSV研究展望 |
| 1.3 PCV2和PRRSV混合感染研究进展 第二章 PCV2和PRRSV流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 样品采集结果 |
| 2.2.2 临床观察结果 |
| 2.2.3 病料阳性率和基因PCR扩增测序 |
| 2.2.4 PRRSV分离株鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 PCV2和PRRSV在猪场中的流行及混合感染 |
| 2.3.2 PRRSV分离株 第三章 PCV2遗传进化分析 |
| 3.1 PCV2遗传进化分析方法 |
| 3.2 PCV2遗传进化分析结果 |
| 3.2.1 PCV2测序序列相似度 |
| 3.2.2 PCV2遗传进化树 |
| 3.2.3 PCV2测序序列核苷酸突变分析 |
| 3.2.4 PCV2测序序列重组分析 |
| 3.2.5 PCV2迁移进化分析 |
| 3.3 讨论 第四章 PRRSV遗传进化分析 |
| 4.1 PRRSV遗传进化分析方法 |
| 4.2 PRRSV遗传进化分析结果 |
| 4.2.1 12个测序序列及PRRSV不同亚群之间相似度 |
| 4.2.2 ORF5遗传进化树 |
| 4.2.3 ORF7遗传进化树 |
| 4.2.4 Nsp2遗传进化树 |
| 4.2.5 GP5、N蛋白、Nsp2推导氨基酸序列分析 |
| 4.3 讨论 第五章 全文结论 参考文献 附录 致谢 作者简历 |
（8）猪圆环病毒2型诊断试剂盒的研制与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 英文摘要 第1部分 绪论 |
| 1 PCV 的病原学特征研究 |
| 1.1 PCV 的发现与分类地位 |
| 1.2 PCV 形态和理化特征 |
| 1.3 培养 |
| 2 PCV 分子生物学特性 |
| 2.1 基因组成特征 |
| 2.2 PCV2 基因型与基因重组 |
| 2.3 毒力与基因型相关性 |
| 2.4 PCV 主要编码蛋白 |
| 2.4.1 Rep 蛋白 |
| 2.4.2 Cap 蛋白 |
| 2.4.3 ORF3 编码蛋白 |
| 3 PCV2 流行病学研究 |
| 3.1 PCV2 流行地区 |
| 3.2 PCV2 流行病学特征 |
| 4 PCV2 感染与 PCVD 发生 |
| 4.1 PCV2 感染与免疫 |
| 4.2 断奶仔猪多系统衰歇综合征（PMWS） |
| 4.3 猪皮炎肾病综合征（PDNS） |
| 4.4 繁殖性障碍 |
| 4.5 呼吸道综合征（PRDC） |
| 4.6 PCV2 致病机理 |
| 5 PCV2 感染相关诊断技术 |
| 5.1 PCV2 病原学诊断技术 |
| 5.1.1 病毒细胞培养与鉴定 |
| 5.1.2 PCV2 基因诊断技术 |
| 5.1.3 间接免疫荧光试验（IFA） |
| 5.1.4 免疫组织化学（IHC） |
| 5.1.5 抗原捕获 ELISA |
| 5.2 血清抗体检测技术 |
| 5.2.1 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA） |
| 5.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 5.2.3 胶体金检测技术 |
| 5.2.4 间接免疫荧光检测试剂（IFA） |
| 6 PCVD 综合防控研究 |
| 7 PCV2 疫苗研究进展 |
| 7.1 全病毒灭活疫苗 |
| 7.2 弱毒疫苗 |
| 7.3 亚单位疫苗 |
| 7.4 载体类活疫苗 |
| 7.5 DNA 重组弱毒疫苗 |
| 7.6 核酸疫苗 |
| 7.7 PCV2 新型标记疫苗 |
| 7.8 RNA 治疗性疫苗 |
| 8 本项目研究目的和意义 第2部分 试验研究部分 |
| 第1章 猪圆环病毒 2 型 PCR 检测方法建立及试剂盒研制 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第2章 猪圆环病毒 2 型实时荧光定量 PCR 检测方法建立及应用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 山东地区 PCV2 流行毒株分子特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病料采集 |
| 3.1.2 标准毒株与细胞系 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 主要实验仪器 |
| 3.1.5 引物设计与合成 |
| 3.1.6 样品处理与 DNA 提取 |
| 3.1.7 PCV2 ORF2 基因扩增反应 |
| 3.1.8 PCR 产物回收、连接及序列测定 |
| 3.1.9 遗传变异分析 |
| 3.1.10 PCV2 基因型鉴别 PCR 检测方法建立 |
| 3.1.11 PCR 性能检测 |
| 3.1.12 临床样品 PCV2a 和 PCV2b 基因型鉴别检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 ORF2 基因克隆和序列测定 |
| 3.2.2 分离毒株基因遗传变异与基因型鉴定 |
| 3.2.3 PCV2 基因型鉴别 PCR 检测方法建立 |
| 3.2.4 敏感性、特异性及重复性试验 |
| 3.2.5 基因型鉴别 PCR 检测方法应用 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 猪圆环病毒 2 型间接 ELISA 抗体检测试剂盒研制及应用 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 质粒和表达菌株 |
| 4.1.2 标准血清和血清样品 |
| 4.1.3 试验所需试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 引物设计 |
| 4.1.6 PCV2 DNA 提取 |
| 4.1.7 PCV2 Cap 基因克隆及鉴定 |
| 4.1.8 重组表达载体构建与鉴定 |
| 4.1.9 Cap 重组蛋白表达 |
| 4.1.10 表达特性分析与 Cap 重组蛋白活性检测 |
| 4.1.11 包涵体提取与纯化 |
| 4.1.12 ELISA 方法建立 |
| 4.1.13 PCV2 间接 ELISA 检测试剂盒临床应用 |
| 4.1.14 PCV2 疫苗免疫后抗体水平监测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PCR 扩增基因片段 |
| 4.2.2 重组表达载体构建与鉴定 |
| 4.2.3 Cap 重组蛋白表达情况 |
| 4.2.4 诱导表达蛋白可溶性鉴定及 Western-blot 分析 |
| 4.2.5 Cap 重组蛋白纯化 |
| 4.2.6 ELISA 方法的建立 |
| 4.2.7 ELISA 试剂盒的应用 |
| 4.2.8 PCV2 疫苗免疫后血清抗体测定 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 猪圆环病毒 2 型胶体金快速检测试纸条研制及应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 血清、菌株和载体 |
| 5.1.2 主要试验材料 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 PCV2 Cap 蛋白表达与纯化 |
| 5.1.5 器皿预处理 |
| 5.1.6 胶体金的制备 |
| 5.1.7 标记 SPA 预处理 |
| 5.1.8 标记最适 pH 值确定 |
| 5.1.9 标记最适蛋白浓度确定 |
| 5.1.10 胶体金标记 SPA 及其纯化 |
| 5.1.11 样品垫和金标垫处理 |
| 5.1.12 硝酸纤维素膜（NC 膜）制备 |
| 5.1.13 试纸条的组装 |
| 5.1.14 样品检测及判定标准 |
| 5.1.15 胶体金检测试纸性能检测 |
| 5.1.16 PCV2 胶体金检测试纸临床应用 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Cap 蛋白表达与纯化 |
| 5.2.2 胶体金的制备 |
| 5.2.3 标记最适 pH 值确定 |
| 5.2.4 标记最适 SPA 蛋白浓度确定 |
| 5.2.5 胶体金标记 SPA 的制备 |
| 5.2.6 PCV2 Cap 蛋白包被浓度确定 |
| 5.2.7 IgG 包被浓度确定 |
| 5.2.8 胶体金检测试纸组装及检测结果 |
| 5.2.9 敏感性、特异性和符合率 |
| 5.2.10 交叉反应试验 |
| 5.2.11 稳定性试验 |
| 5.2.12 保存期试验 |
| 5.2.13 胶体金检测试纸的应用 |
| 5.3 讨论 结论 参考文献 导师简介 作者简介 致谢 |
（9）广东省规模化猪场猪圆环病毒感染情况及分子特征研究（论文提纲范文）
| 致谢 常用缩写词 摘要 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学及毒株变异情况研究进展 |
| 3. PCV2 的传播途径及致病性研究进展 |
| 4. 猪圆环病毒的发病机制研究 |
| 5 PCV2 引起的主要疾病 |
| 5.1 仔猪断奶后全身多系统衰竭综合症（PMWS） |
| 5.2 猪皮炎与肾病综合征（PDNS） |
| 5.3 PCV2 相关性繁殖障碍 |
| 5.4 仔猪先天性震颤 |
| 5.5 PCV2 相关性肺炎 |
| 5.6 PCV2 相关性小肠炎 |
| 6 猪圆环病毒单克隆抗体的研究进展 |
| 6.1 猪圆环病毒单克隆抗体的相关研究 |
| 6.2 猪圆环单克隆抗体的应用 |
| 6.2.1 猪圆环单克隆抗体在病原诊断上的应用 |
| 6.2.2 猪圆环单克隆抗体在 PMWS 致病机理研究上的应用 |
| 6.2.3 猪圆环单克隆抗体在检测抗原差异上的应用 |
| 6.2.4 其它 |
| 7 PCV2 疫苗研究进展 |
| 7.1 灭活疫苗 |
| 7.2 弱毒疫苗 |
| 7.3 基因工程疫苗 |
| 7.4 PCV2 疫苗应用现状 实验研究 |
| 前言 试验一 广东省猪圆环病毒流行病学调查 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV1 检测结果 |
| 3.2 PCV2 检测结果 |
| 4 讨论 试验二 广东省病猪 PCV2 和 PRRSV 检测分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 一步法 RT-PCR 检测 PRRSV 结果 |
| 3.2 猪场样品 PCV2 检测结果 |
| 3.3 PRRSV 与 PCV2 混合感染情况 |
| 4 讨论 试验三 猪圆环病毒 2 型疫苗免疫与非免疫猪场 PCV2 的抗体变化规律及感染情况研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清 ELISA 检测检测结果 |
| 3.2 血清 PCR 检测结果 |
| 4 讨论 试验四 PCR 区分 PCV2a 与 PCV2b 基因型方法的建立及应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 PCV2a 及 PCV2b 阳性样品 |
| 2.1.2 血清样品 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCR 扩增方法的建立 |
| 2.2.2 PCR 敏感性试验 |
| 2.2.3 PCR 的特异性试验 |
| 2.2.4 PCR 方法的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 区分 PCV2a 与 PCV2b 基因型方法的建立 |
| 3.2 PCR 敏感性试验 |
| 3.3 PCR 的特异性实验 |
| 3.4 区分 PCV2a 与 PCV2b 基因型 PCR 方法的应用 |
| 4 讨论 试验五 广东省猪圆环病毒 2 型的分离与序列分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品 DNA 提取及套式 PCR 扩增 |
| 2.2.2 病毒分离 |
| 2.2.3 间接免疫荧光试验检测 |
| 2.2.4 PCV2 全基因序列的 PCR 扩增 |
| 2.2.5 PCV2 全基因序列 PCR 产物的处理 |
| 2.2.6 测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 样品检测结果 |
| 3.2 接毒细胞 PCR 检测结果 |
| 3.3 间接免疫荧光检测结果 |
| 3.4 PCV2 全基因序列的扩增 |
| 3.5 PCV2 全基因序列的鉴定 |
| 3.6 PCV2 分离株测序结果 |
| 3.7 PCV2 分离株 ORF2 与广东流行株的氨基酸序列比较 |
| 3.8 PCV2 分离株全基因序列比较分析 |
| 4 讨论 全文总结 参考文献 ABSTRACT |
（10）家养野猪源猪圆环病毒2型安徽株的分离鉴定及其特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 主要缩略语列表 目录 插图和附表清单 文献综述 |
| 1 PCV2基本结构与特性 |
| 1.1 PCV2的发现与分类地位 |
| 1.2 PCV2的形态特征及理化特性 |
| 1.3 PCV2培养特性 |
| 2 PCV2分子遗传特征 |
| 2.1 PCV2基因组结构 |
| 2.2 PCV2遗传与变异 |
| 2.3 ORF1 基因与编码蛋白 |
| 2.4 ORF2 基因与编码蛋白 |
| 2.5 ORF3 基因与编码蛋白 |
| 3 PCV2感染和致病机制 |
| 3.1 PCV2的组织亲嗜性及靶细胞 |
| 3.2 PCV2的致病机理 |
| 3.2.1 PCV2对淋巴组织和淋巴细胞的影响 |
| 3.2.2 PCV2在细胞因子对免疫调节中的影响 |
| 4 流行病学特点 |
| 4.1 PCV2感染的流行病学调查 |
| 4.2 PCV2流行毒株序列分析 |
| 4.3 传染源及传播途径 |
| 4.4 宿主及易感动物 |
| 5 PCV2感染的相关临床症状及病理变化 |
| 6 PCVAD 检测与防治 |
| 6.1 PCV2检测技术 |
| 6.2 PCVAD 的防治 |
| 7 结语 1 引言 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 家养野猪病例分析 |
| 2.1.2 病料 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 PCV2标准毒株、PCV2安徽分离株 |
| 2.1.5 PCV2阳性血清、阴性血清 |
| 2.1.6 试验动物 |
| 2.1.7 载体、菌种及分子生物学试剂 |
| 2.1.8 溶液和培养基的配制 |
| 2.1.8.1 细胞培养相关溶液配制 |
| 2.1.8.2 DNA 提取相关溶液配制 |
| 2.1.8.3 PCR 相关溶液配制 |
| 2.1.8.4 间接免疫荧光试验相关溶液配制 |
| 2.1.9 主要仪器 |
| 2.1.10 引物和探针序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料检测 |
| 2.2.1.1 病料的处理 |
| 2.2.1.2 病料总 DNA 的提取 |
| 2.2.1.3 病料中 PCV2特异性基因片段的扩增 |
| 2.2.2 病料中 PCV2的分离鉴定 |
| 2.2.2.1 PCV2的分离 |
| 2.2.2.2 PCR 检测 |
| 2.2.2.3 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.2.4 电镜观察 |
| 2.2.3 PCV2全基因组序列克隆与测定 |
| 2.2.3.1 PCV2全基因组序列 PCR 扩增 |
| 2.2.3.2 PCV2全基因组序列 PCR 扩增产物纯化与回收 |
| 2.2.3.3 外源 DNA 片段与质粒载体的连接反应 |
| 2.2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） |
| 2.2.3.5 重组质粒转化 |
| 2.2.3.6 质粒 DNA 小量制备 |
| 2.2.3.7 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 2.2.3.8 PCV2全基因组序列测定 |
| 2.2.4 YZ0901 株分子遗传特征分析 |
| 2.2.4.1 YZ0901 株全基因组序列分析 |
| 2.2.4.2 PCV2安徽分离株同源重组分析 |
| 2.2.4.3 YZ0901 株与国内外参考毒株的 ORF1、ORF2 序列分析 |
| 2.2.5 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 PCV2方法的建立及应用 |
| 2.2.5.1 标准品的制备 |
| 2.2.5.2 TaqMan 荧光定量 PCR 方法反应体系和反应条件优化 |
| 2.2.5.3 TaqMan 荧光定量 PCR 方法标准品的建立 |
| 2.2.5.4 TaqMan 荧光定量 PCR 方法敏感性试验 |
| 2.2.5.5 TaqMan 荧光定量 PCR 方法特异性试验 |
| 2.2.5.6 TaqMan 荧光定量 PCR 方法重复性试验 |
| 2.2.5.7 TaqMan 荧光定量 PCR 方法的临床应用 |
| 2.2.6 YZ0901 株对小鼠致病力试验 |
| 2.2.6.1 半数细胞感染量（TCID50）测定 |
| 2.2.6.2 昆明小鼠分组及攻毒方法 |
| 2.2.6.3 血清中 PCV2的抗体检测 |
| 2.2.6.4 血清中细胞因子检测 |
| 2.2.6.5 TaqMan 荧光定量 PCR 对 PCV2组织亲嗜性检测 |
| 2.2.6.6 组织病理切片制作与观察 3 结果与分析 |
| 3.1 病料检测 |
| 3.2 病料中 PCV2的分离鉴定 |
| 3.2.1 PCR 检测 |
| 3.2.2 间接免疫荧光试验结果 |
| 3.2.3 电镜观察结果 |
| 3.3 PCV2全基因组序列克隆 |
| 3.3.1 全基因组序列 PCR 扩增结果 |
| 3.3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.4 PCV2全基因组序列测定： |
| 3.5 YZ0901 株分子遗传特征分析 |
| 3.5.1 YZ0901 株全基因组序列同源性分析 |
| 3.5.2 YZ0901 株全基因组序列进化树分析 |
| 3.5.3 同源重组分析 |
| 3.5.4 YZ0901 株的 ORF1 核苷酸序列同源性分析 |
| 3.5.5 YZ0901 株的 ORF2 核苷酸序列同源性分析 |
| 3.5.6 YZ0901 株的 ORF2 氨基酸序列同源性分析 |
| 3.6 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 PCV2方法的建立及应用 |
| 3.6.1 标准品的制备 |
| 3.6.1.1 PCR 扩增与克隆结果 |
| 3.6.1.2 PCR 产物的测序结果 |
| 3.6.1.3 TaqMan 荧光定量 PCR 方法反应体系和反应条件优化 |
| 3.6.1.4 TaqMan 荧光定量 PCR 方法标准品的建立 |
| 3.6.1.5 TaqMan 荧光定量 PCR 方法敏感性试验 |
| 3.6.1.6 TaqMan 荧光定量 PCR 特异性试验 |
| 3.6.1.7 TaqMan 荧光定量 PCR 重复性试验 |
| 3.6.1.8 TaqMan 荧光定量 PCR 方法的初步应用 |
| 3.7 YZ0901 株对小鼠致病力试验 |
| 3.7.1 TCID50 测定 |
| 3.7.2 血清中 PCV2的抗体检测 |
| 3.7.3 血清中细胞因子检测 |
| 3.7.4 TaqMan 荧光定量 PCR 对 PCV2组织亲嗜性检测 |
| 3.7.5 组织病理切片的制作与观察 4. 讨论 |
| 4.1 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 PCV2方法的建立及应用 |
| 4.2 家养野猪源安徽分离株的分离与鉴定 |
| 4.3 YZ0901 株全基因组序列分析 |
| 4.4 同源重组分析 |
| 4.5 YZ0901 株的 ORF1、ORF2 核苷酸序列分析 |
| 4.6 YZ0901 株的 ORF2 氨基酸序列分析 |
| 4.7 YZ09101 株对小鼠致病力试验 |
| 4.7.1 YZ0901 株与家猪源 PCV2毒株感染小鼠的抗体及细胞因子水平分析 |
| 4.7.2 YZ0901 株与家猪源 PCV2毒株感染小鼠的组织亲嗜性分析 结论 参考文献 附录 致谢 个人简介 |
四、猪II型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达（论文参考文献）
- [1]内蒙古PCV4分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的初步建立[D]. 于成东. 延边大学, 2021(02)
- [2]猪圆环病毒2型和3型鉴别诊断方法的建立与分子流行病学调查[D]. 曹凤阳. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]PCV3的分子流行病学调查及分离株的致病性研究[D]. 汪孟航. 中国农业科学院, 2021(01)
- [4]藏猪猪圆环病毒2型分离、鉴定与遗传特性研究[D]. 钱雯娴. 西藏大学, 2021(12)
- [5]猪Ⅱ型圆环病毒感染调控巨噬细胞极化的机制及其在细菌共感染中的作用[D]. 张文. 山东农业大学, 2020(01)
- [6]PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究[D]. 哈卓. 东北农业大学, 2020(04)
- [7]猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及基因进化分析[D]. 刘杏. 中国农业科学院, 2016(02)
- [8]猪圆环病毒2型诊断试剂盒的研制与应用[D]. 董林. 吉林大学, 2014(03)
- [9]广东省规模化猪场猪圆环病毒感染情况及分子特征研究[D]. 梁鹏帅. 河南农业大学, 2012(04)
- [10]家养野猪源猪圆环病毒2型安徽株的分离鉴定及其特性研究[D]. 陈蓉. 安徽农业大学, 2011(07)