一、人肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定（论文文献综述）
徐辰祺[1]（2019）在《活化的肾小球壁层上皮细胞失去向足细胞分化能力的研究》文中研究指明【背景】肾小球壁层上皮细胞（PECs）是肾小球内潜在的干细胞,具有自我更新和可被诱导向其他细胞转分化的特征。PECs在某些疾病中某些特定条件下可向足细胞分化,是补充足细胞数量减少的重要机制之一。但调节PECs向足细胞分化的机制并不清楚。同时PECs在肾小球疾病发生发展中的作用研究并不充分。在新月体肾炎中PECs是组成新月体的主要细胞来源,在新月体形成、向纤维性新月体转化的病理生理过程中起了重要作用。新月体肾小球肾炎中PECs的异常活化常伴随CD44的高表达（活化）。而其他肾小球疾病中特别是糖尿病肾病,有研究观察到PECs高表达TGF-β1,但其是否参与了肾小球病变的发生发展还缺乏研究。这些活化的或高表达TGF-β1的PECs是否还具有向足细胞转分化,补充丢失足细胞的作用也没有研究关注。【目的】原代体外培养PECs并维持其生物学特性;探讨线粒体的数量,氧化磷酸化关键酶和线粒体动力学在PECs体外诱导向足细胞转分化时的变化;通过体外ANCA相关血管炎肾损害（AAVN）患者血清和TGF-β1孵育PECs诱导PECs活化,观察活化的PECs是否失去向足细胞转分化的能力及细胞内信号和相关机制。【方法】我们通过细胞筛联合磁性分离的方式获得小鼠肾小球,对小鼠肾小球进行原代培养获得PECs,使用realtime PCR、Western Blot和免疫荧光染色鉴定PECs特异性标志物claudin-1以及干细胞特性蛋白CD133,和CD24的表达;在体外通过VRADM诱导PECs向足细胞转分化并通过Western Blot和免疫荧光染色鉴定足细胞特异性蛋白表达。我们在体外诱导PECs向足细胞转分化,realtime PCR检测mtDNA拷贝数、WB检测线粒体生物合成关键调控因子和线粒体蛋白、动力学相关蛋白的表达。我们使用免疫组织化学染色对新月体肾炎患者肾活检标本连续切片中claudin-1、CD44和TGF-β1的表达和定位进行检测;体外使用AAVN患者血清、TGF-β1刺激PECs,用U0126抑制ERK1/2信号通路,使用VRADM诱导PECs转分化,实验分组如下:（1）对照组、AAVN血清组;（2）对照组,TGF-β1组;（3）DMSO组,TGF-β1组,TGF-β1+U0126组;（4）对照组,VRADM组,AAVN血清组,AAVN血清+VRADM组;（5）对照组,VRADM组,TGF-β1组,TGF-β1+VRADM组。分别通过realtime PCR检测CD44和fibronectin的基因表达,Western Blot检测PECs活化标志分子、足细胞相关蛋白、细胞内信号蛋白MAPK以及线粒体相关蛋白的表达。【结果】通过细胞筛联合磁性分离的方式可以获得纯度较高的肾小球;原代培养PECs表达特异性标志物claudin-1和干细胞标志CD24、CD133,不表达小管上皮细胞标志aquaporin 1,不表达系膜细胞标志α-SMA;体外传代至6代的PECs仍表达PECs特异性标志物claudin-1和干细胞标志CD24、CD133;PECs可以体外被诱导向PECs分化表达足细胞特异蛋白。体外诱导PECs向足细胞转分化过程中伴随着线粒体数量的增加,包括mtDNA拷贝数增多,线粒体转录关键调节因子PGC-1α上调,线粒体呼吸链COX IV和三羧酸循环关键酶p-PDH表达升高;PECs向足细胞转分化过程中,线粒体动力相关蛋白Mfn-1和p-DRP1（S637）表达升高,线粒体动力学倾向于融合大于分裂。AAVN患者新月体中,claudin-1和CD44高表达,连续切片显示TGF-β1与之表达位置相同,呈弱阳性表达。体外AAVN血清和TGF-β1均可引起PECs活化（表达CD44）并合成细胞外基质蛋白Fibronectin,活化时ERK1/2通路;使用ERK1/2特异性抑制剂可以抑制CD44的表达,和细胞外基质的合成;AAVN血清和TGF-β1引起PECs活化后VRADM无法再诱导PECs表达足细胞特异性蛋白,同时线粒体生成受阻。抑制ERK信号可以部分改善活化的PECs向足细胞转分化【结论】体外培养的原代至6代PECs表达特异性标志物claudin-1和干细胞标志CD24、CD133,可以被诱导向足细胞分化。诱导分化过程中线粒体数量增加,线粒体倾向于融合。ERK1/2信号通路参与AAVN和TGF-β1诱导的PECs异常活化,异常活化的PECs失去向足细胞分化的能力,伴有线粒体数量增加受阻和线粒体动力学改变。
曲玥阳,陈旭,岳喜庆,罗勇,赵伟杰,林炳承[2]（2018）在《原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化》文中进行了进一步梳理为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min和3h的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h时组织消化情况。利用MTT比色法考察了鼠尾I型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT比色法考察不同浓度的血清对细胞增殖速率以及细胞活性维持的影响,细胞免疫荧光法考察不同浓度血清对肾小管上皮细胞的Na+/K+ATPase表达的影响。结果表明:利用Ⅱ型胶原酶,消化15min可以获得较好的肾小管节段;利用基质胶包被培养皿是性价比最高的促进肾小管上皮细胞增殖的条件;观察到在细胞增殖期内,1%,2%,4%的血清浓度较0%和5%有较好的促进细胞增殖作用;在平台期内,2%,4%,5%的血清浓度较0%和1%有较好的细胞活性维持作用;第3天时,2%血清浓度培养的肾小管上皮细胞的Na+/K+ATPase表达最强;第14天时,1%和2%血清浓度培养的细胞的Na+/K+ATPase表达较好,最终确定血清最优浓度为2%。在优化条件下所获得的原代肾小管细胞的角蛋白18和碱性磷酸酶的表达呈阳性。经过上述系统优化,细胞生长周期由传统方法的47d缩短到23d,并且实现了传统方法无法实现的原代肾小管上皮细胞长期培养,时间长达14d,从而为农药中毒性肾病的深入研究奠定了坚实的基础。
张志诚,赵文紧,郑敬民[3]（2017）在《C3aR激动剂对小鼠原代肾小管上皮细胞表型的影响》文中指出目的细胞转分化（EMT）过程中的关键事件包括上皮细胞蛋白（E-钙黏蛋白）的表达下调,细胞活动性增加,细胞基质生成的增多等。文中构建鼠原代肾小管上皮细胞培养及鉴定的方法,探究C3aR活化是否能够引起小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化。方法用鼠肾小管节段进行肾小管上皮细胞原代培养,以免疫细胞化学及免疫荧光染色对上皮细胞进行鉴定。实验分为正常对照组,C3aR激动剂设5个浓度组:0.1、1、100、500及2000 ng/m L组,另设3个时间组:6、12及24 h组。利用Real-time PCR检测肾小管上皮细胞中E-钙黏蛋白、α-SMA及collagen I的表达水平变化;利用Western blot检测E-钙黏蛋白、α-SMA蛋白表达水平;用鬼笔环肽对上皮细胞行骨架染色,观察细胞骨架形态变化。结果与正常对照组比较,C3aR激动剂组（500 ng/m L、刺激48 h）抑制E-钙黏蛋白表达[（0.950±0.901）vs（0.650±0.221）,P<0.05],上调α-SMA[（1.380±0.062）vs（1.600±0.103）,P<0.05]和collagen I表达（P<0.05）,且各自表达趋势与C3aR激动剂呈时间和剂量依赖关系。细胞骨架染色结果显示,随着C3aR激动剂刺激时间的延长,上皮细胞内由激动蛋白构成的应力纤维生成逐渐增多。结论成功构建了小鼠肾小管上皮细胞原代培养及鉴定的方法;C3aR活化能够促进肾小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化,并在肾纤维化的发生发展中起一定作用,预示C3aR可能成为肾疾病治疗的新靶点。
张雪[4]（2016）在《肾小管上皮细胞模型的构建及其应用》文中提出肾小管上皮细胞构成的肾小管是肾脏的重要功能单位,肾系疾病的病灶部位也主要发生在肾小管。因此,利用体外构建的肾小管上皮细胞模型,不仅可在细胞分子水平研究肾系相关疾病的病理机制,还可进行相关药物的筛选及作用机制研究。本研究目的是通过外源物诱导建立体外肾毒性细胞模型,研究中药提取物对外源物致肾小管上皮细胞毒性的保护作用。第一部分建立了兔原代肾小管上皮细胞模型。采用机械研磨过筛联合酶消化法分离培养了兔原代肾小管上皮细胞,经形态学鉴定,细胞呈鹅卵石铺路状的上皮样细胞形态,碱性磷酸酶染色和免疫组化染色的鉴定结果均为阳性,成功在体外构建兔原代肾小管上皮细胞模型。第二部分建立了三种外源物诱导兔原代肾小管上皮细胞的体外肾毒性细胞模型。采用庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ对兔原代肾小管上皮细胞进行诱导,以形态学改变、细胞增殖抑制率及细胞LDH释放量为模型评价指标,判断三种外源物的肾毒性作用。结果表明:庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ均使细胞的形态发生明显改变,对细胞的增殖均有抑制作用,均使细胞LDH释放量增高,并且三种作用结果均呈浓度依赖性。综上所述,庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ均可在体外诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型。第三部分研究了16种中药提取物对三种外源物致肾小管上皮细胞毒性的保护作用。采用中药水煎物和醇提物的低、中、高剂量（3 mg/L、30 mg/L、150 mg/L）对肾小管上皮细胞进行预保护后,分别采用庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ对细胞进行损伤,通过细胞增殖抑制率及细胞LDH释放量的改变判断中药提取物的保护作用,结果如下:本研究中16种中药提取物对兔原代肾小管上皮细胞预保护后庆大霉素的细胞毒性作用的结果表明,能够显着减轻庆大霉素的细胞增殖抑制作用的中药提取物高、中浓度的有1种提取物;高浓度1种提取物。能够显着降低庆大霉素作用后细胞LDH释放量的中药提取物分别有高、中、低浓度4种提取物;高、中浓度4种提取物;中、低浓度1种提取物;高浓度4种提取物。本研究中16种中药提取物对兔原代肾小管上皮细胞预保护后顺铂的细胞毒性作用的结果表明,能够显着减轻顺铂的细胞增殖抑制作用的中药提取物分别有高、中、低浓度2种提取物;高、中浓度6种提取物;高浓度7种提取物。能够显着降低顺铂作用后细胞LDH释放量的中药提取物分别有高、中、低浓度7种提取物;高、中浓度2种提取物;中、低浓度3种提取物;高浓度4种提取物。本研究中16种中药提取物对兔原代肾小管上皮细胞预保护后马兜铃酸Ⅰ的细胞毒性作用的结果表明,能够显着减轻马兜铃酸Ⅰ的细胞增殖抑制作用的中药提取物分别有高、中、低浓度2种提取物;高、中浓度3种提取物;中、低浓度4种提取物;高浓度10种提取物。能够显着降低马兜铃酸Ⅰ作用后细胞LDH释放量的中药提取物分别有高、中、低浓度1种提取物;高、中浓度1种提取物;中、低浓度1种提取物;高浓度6种提取物。综上所述,本研究成功在体外构建了兔原代肾小管上皮细胞模型,并在此基础上分别通过庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ诱导获得体外肾毒性细胞模型。研究了16种中药提取物对庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ致肾小管上皮细胞毒性的保护作用,筛选出对能够减轻外源物的细胞增殖抑制作用和能够降低外源物作用后的细胞LDH释放量的中药。
张志诚[5]（2016）在《肾小管上皮细胞C3aR的表达调控及其活化作用研究》文中研究说明研究背景补体系统是一种生物级联反应体系,具有复杂而精密的调控机制,包含30多种血浆和细胞相关蛋白。补体系统组成成分大致可分为能与细胞结合的固有成分、各种调节因子以及相关的补体受体等。补体系统能被众多因素激活发生级联酶促反应,这些因素包括病原体、自身抗体、细胞凋亡以及组织的缺血缺氧和坏死等。补体系统的激活主要通过三种途径,即经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素（mannose-binding lectin, MBL）途径。三种活化途径生成的C3转化酶促使补体C3活化、裂解,释放C3b调理素、生成C5转化酶,最后形成C5b-9,也称作膜攻击复合物（membrane attack complex, MAC）。C5b-9能够破坏靶细胞的磷脂双分子层,导致细胞损伤以及凋亡,它还能够活化中性粒细胞、内皮细胞及上皮细胞,参与炎性反应。补体系统也是先天免疫的一个重要组成部分,它们可以识别来源于普通病原体的保守抗原,并做出迅速而强烈的回应。而除参与机体的宿主防御外,补体系统正常或异常激活还参与包括肾脏病在内多种疾病的发生及进展。以往人们对肾脏疾病中的补体系统功能的关注更多的是MAC效应,然而近年来,在补体活化过程中,由补体C3通过C3转化酶催化而裂解生成的小片段C3a以及其特异性受体C3aR在肾脏疾病病理过程中的作用逐渐受到学者们的广泛关注。补体系统经过三种途径激活后共同生成C3转化酶,并催化裂解补体C3,使其生成大片段C3b和其代谢物（iC3b,C3dg）以及小片段（C3a）, C3b再经过一系列级联酶促反应,最终生成C5b-9。C3a是一个大约包含77个氨基酸残基的多肽,作为一种强效的促炎因子,除了能够参与机体的先天性免疫反应,C3a还能作用于广泛的免疫及非免疫性细胞发挥众多的生物学效应。例如,调节血管舒张,增加小血管的通透性,引发平滑肌的收缩。对于有吞噬功能的细胞（中性粒细胞、巨噬细胞）,C3a有强烈的化学趋化作用,使吞噬细胞迁移至组织的损伤或炎症区域。C3a还能促进嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放组胺,引发中性粒细胞的氧化猝发现象。C3a还参与组织的再生和纤维化过程,如促进肝脏组织的再生。C3aR是C3a的特异性受体,它属于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCR）超级家族的一员,拥有一个通过胞内胞外环结构链接的7次跨膜结构域。在过去的十年中,已有许多文献报道C3aR表达于众多类型细胞上。众所周知,对于骨髓源性细胞,如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞及肥大细胞等均能检测到C3aR的表达,当然,C3aR也会表达于如活化的星形胶质细胞、内皮细胞、上皮细胞以及平滑肌细胞这类非骨髓源性细胞上。而近几年的研究表明,在肾脏组织中,其小管上皮细胞和足细胞也均能表达C3aR,且多种肾脏疾病模式小鼠的肾组织中,C3aR mRNA及蛋白表达明显上调,这种表达上调在肾脏疾病发病前就己出现,说明C3a/C3aR轴异常激活参与肾脏疾病的发生发展,而不是单纯由疾病导致的伴随现象。肾脏疾病的发病机制与补体系统激活的关系错综复杂,许多研究发现,肾脏疾病如：各类自身抗体介导的肾小球肾炎,C3肾小球沉积病,移植肾后缺血再灌注损伤以及抗体介导的排斥反应均有补体级联反应的参与,且各个补体成分或调控因子所发挥的作用并不相同。作为补体系统中的一个组成部分,C3a/C3aR轴在肾脏疾病中的作用逐渐受到众多学者们的重视,而一些相关文献也表明C3a/C3aR轴正常或异常活化在肾脏疾病中起着更为直接和显着的作用,也预示着C3a/C3aR轴可能是治疗相关肾脏疾病的一个新治疗靶点。糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是一种进展性的肾脏纤维化疾病,是糖尿病常见的并发症,也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。在以往的工作当中,我们观察到,DN患者以及糖尿病小鼠的肾组织中C3aR表达均显着上调,我们推测C3a/C3aR轴活化在DN中也发挥了重要作用,但是具体机制不清,为了更好地了解肾脏组织中C3aR表达调控因素,我们研究了多种炎性细胞因子（IFN-γ、C3a、IL-1β、TNF-α、TGF-β1）对人肾小管上皮细胞（HK2细胞）C3a受体表达调控。另外,肾小管间质纤维化、肾小球硬化是DN肾脏损害的重要表现,一些研究显示,上皮-间质细胞转分化（EMT）在肾脏纤维化中发挥重要作用,我们猜测C3a/C3aR轴的活化可能引发小管上皮细胞发生上皮-间质转分化进而加速肾脏纤维化的进展,因此,我们构建了鼠原代肾小管上皮细胞培养及鉴定的方法,并探究C3aR活化是否能够引起鼠小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化。第一部分炎症细胞因子对人肾小管上皮细胞C3a受体的表达调控目的在以往的工作中,我们发现在糖尿病肾病患者的肾组织中C3aR表达增加,但其具体机制不清,因此,为了更好了解肾脏组织中C3aR表达调控因素,我们研究了多种炎性细胞因子对人肾小管上皮细胞（HK2细胞）C3a受体表达的调控作用。方法HK2细胞以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。将HK2细胞以1×105/孔的密度接种于12孔板中,放入37℃、含5%C02细胞孵育箱进行培养,待孔内细胞密度长至80%融合时换成含0.1%胎牛血清的DMEM/F12培养基同步化12-18h。用多种炎症因子（IFN-γ、C3a、IL-1β、TNF-α、TGF-β）与已同步化的HK2细胞共培育,根据相关文献,每种炎症因子刺激分为浓度梯度及时间梯度组,利用Real-time PCR检测HK2细胞C3aR mRNA的表达水平。选择对HK2细胞C3aR mRNA表达具有显着促进作用的炎性因子IFN-γ作为刺激剂刺激HK2细胞,通过免疫组织化学及免疫印迹的方法探测HK2细胞C3aR蛋白的表达水平。结果我们发现炎症细胞因子IFN-γ能够显着的促进HK2细胞C3aR的表达上调（与正常对照组相比,C3aR mRNA表达水平增长大约5倍,P=0.001,蛋白水平表达上调大约1.6倍,P=0.046）,且HK2细胞C3aR mRNA水平表达上调与IFN-γ成剂量及时间依赖关系；而其他的炎性细胞因子如：TNF-α、TGF-β1、IL-1β甚至生物活性多肽C3a均未观察到对HK2细胞C3aR表达造成影响。结论本实验不仅证明了肾小管上皮细胞表面表达生物活性肽段C3a受体（C3aR）,而且还证明了炎症细胞因子IFN-γ能够明显增强肾小管上皮细胞其C3aR表达,预示着C3a/C3aR轴在肾脏疾病中参与了肾脏局部炎症反应的调节并且与糖尿病肾病的发生、发展有一定的相关。第二部分C3aR激动剂对小鼠原代肾小管上皮细胞表型影响的研究构建小鼠原代肾小管上皮细胞培养及鉴定的方法,探究C3aR活化是否能够引起小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化。方法首先,从小鼠肾组织中分离肾小管节段进行肾小管上皮细胞原代培养,步骤简述如下：小鼠处死消毒后于无菌环境中取出肾组织,肾皮质移入冷PBS中并切成1mm左右的碎片,之后肾皮质碎片移入5m1胶原酶溶液中,并在37℃摇床里震荡消化1h；让消化悬液通过孔径为100umm的尼农筛网,残留于筛网上的组织可以用无菌研钵轻轻碾压。用37℃PBS稍作冲洗后,再用37℃并含I%BSA的PBS液反向冲洗100umm尼农筛网,收集其冲洗液于干净离心管中,并以170g离心5min,得到的组织团块重悬于培养基中并接种于铺好胶原的12孔细胞培养板里,静置于标准的湿化孵育箱中（37℃、5%CO2）48h待肾小管节段贴壁,之后每两天更换一次培养基,约7天后细胞便会长满。将得到的原代肾小管上皮细胞传一代后,制作细胞爬片,并用免疫细胞化学及免疫荧光染色对上皮细胞进行鉴定。用C3aR激动剂与得到肾小管上皮细胞共培育,利用Real-time PCR和免疫印迹技术检测肾小管上皮细胞中E-cadherin、α-SMA及collagen Ⅰ的表达水平变化。用鬼笔环肽对上皮细胞行骨架染色,观察细胞骨架形态变化。结果肾小管节段悬液刚接入细胞培养板48h后,大部分小管节段贴壁,且有少量上皮样细胞从小管节段中向外爬出,随后细胞逐渐增多,呈岛状生长,细胞链接紧密,形态为多边形或短梭形,到第7天时,细胞长满孔底为细胞单层,呈典型鹅卵石铺路样,透明性折光性强。免疫细胞化学及免疫荧光染色结果显示细胞核周围及胞质E-cadherin染色均阳性,阴性对照组无特殊染色。C3aR激动剂能促进α-SMA和collagen Ⅰ表达上调而抑制E-cadherin表达,且三种分子各自的表达趋势与C3aR激动剂呈时间和剂量依赖关系,而细胞骨架染色结果显示,随着C3aR激动剂刺激时间的延长,上皮细胞内由肌动蛋白构成的应力纤维的生成逐渐增多。刺激时间大于12h时,应力纤维生成增加明显。结论我们成功构建了小鼠肾小管上皮细胞原代培养的方法,为以后对小鼠肾小管上皮细胞的研究提供了实验基础；我们也发现C3aR激动剂能够促进鼠肾小管上皮细胞表达α-SMA和collagen Ⅰ,然而抑制其E-cadherin的表达,还能使鼠肾小管上皮细胞应力纤维生成明显增加,表明C3aR活化能够促进肾小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化,表明在肾脏纤维化的发生发展中起着一定程度的作用,也预示着C3aR可能成为肾脏疾病治疗的新靶点。
陈娴,刘畅,张晴晴,王瑾,毛光玮,李菁菁[6]（2015）在《关于鼠肾小管上皮细胞原代培养的对比探究》文中进行了进一步梳理目的探讨关于鼠肾小管上皮细胞原代培养的有效方法。方法在现有肾小管上皮细胞机械研磨方法的基础上,通过SD大鼠与昆明小鼠的对比实验,Ⅰ型胶原酶消化时间的设定以及第一次换取液的合理利用等方面改进原代培养的方法。对改进后所分离的肾小管上皮细胞进行鉴定。结果与SD大鼠相比,昆明小鼠细胞贴壁生长多且快,胶原蛋消化25分钟后的细胞贴壁多、长满壁底早。将第一次细胞换取液进行再次贴壁,第二天依旧可以有部分细胞贴壁,34天长满壁底,纯度较高。两次细胞均成上皮细胞鹅卵石铺路样生长,经免疫细胞化学法（SABC法）鉴定CK表达阳性。结论实验选择昆明小鼠肾小管上皮细胞经胶原酶消化25分钟左右的细胞数量、质量较好,第一次细胞废弃液可以再次有效利用。
王裕,杨霞,高继萍,皇甫冰,宋国华[7]（2014）在《小鼠肾小管上皮细胞的培养和鉴定》文中认为目的建立小鼠肾小管上皮细胞培养方法,为有关肾损伤体外研究提供实验平台。方法分别采用肾小管节段贴块法、胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ法消化分离肾小管节段,用含10%血清的培养基培养,然后用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,对原代和传一代肾小管上皮细胞进行鉴定。结果三种培养方法培养细胞3 d基本贴壁,胶原酶Ⅰ法3-4 d长满瓶底,肾小管节段贴块法4-5 d长满瓶底,胰蛋白酶7 d左右。细胞均鹅卵石铺路样生长,经细胞免疫组织化学染色鉴定cytokeratin 18呈阳性。结论肾小管节段贴块法和胶原酶Ⅰ消化都可以得到较理想的肾小管上皮细胞,后者细胞生长较快,为研究肾损伤的发生原因和机制提供实验基础。
潘奇,李宏建,潘晓亮,张书信,崔艳霞,王振国,徐亚楠[8]（2012）在《新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定》文中提出【目的】建立一种高效、实用的新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞原代培养方案,为肾脏损伤引起的疾病研究奠定基础。【方法】取5～8个月大的出栏细毛羊肾脏皮质,剪成1～2 mm3大小组块,分别采用传统组织块法和改良组织块法,在含15%～20%新生小牛血清的DMEM的培养基中进行原代培养,无需研磨或使用酶和化学试剂,根据上皮细胞自身的生长特性,首次结合刮除法,相差消化法和差速贴壁法,分离纯化上皮细胞,再选用0.037 mm孔径网筛过滤除去肾小球上皮细胞,分离纯化培养肾小管上皮细胞,细胞免疫组化进行鉴定。【结果】改良方法与传统方法相比,细胞贴壁早,生长快,处理时间短,减少了污染机率,提高了细胞培养效率,分离培养的肾小管上皮细胞,纯度达90%以上,细胞呈多角形,鹅卵石状,折光性强,连接紧密,可传至第9代,免疫细胞化学（CK-18）染色鉴定为阳性。【结论】改良的组织块培养与传统的组织块培养以及常用的酶消化培养相比,经济、简单、不易污染,分离培养的肾小管上皮细胞,活性高,纯度高,是一种高效、实用的细毛羊肾小管上皮细胞培养方法。
臧路平[9]（2011）在《泄浊除痹方总黄酮治疗高尿酸血症机制研究》文中进行了进一步梳理高尿酸血症（hyperuricemia）是指血液中的尿酸浓度超出正常范围的一种机体状态。近年来,随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变,高尿酸血症患病率有非常明显的上升趋势。高尿酸血症作为一种代谢性疾病,与心血管疾病,慢性肾脏病及代谢综合症（糖尿病,胰岛素抵抗和肥胖）密切相关。产生血清尿酸浓度高于正常水平的主要原因为两方面：一为尿酸生成过多,另一方面是尿酸排泄减少。肝脏中的黄嘌呤氧化酶是催化尿酸生成的主要氧化酶,该酶作用受到抑制后,尿酸生产量将会减少；负责尿酸转运的是固定在肾小管上皮细胞上的各种转运蛋白,其中,固定在肾脏近端小管上皮细胞刷状缘侧的尿酸阴离子转运蛋白1（URAT1, urate-anion transporter 1）作为负责尿酸重吸收的主要蛋白,是治疗高尿酸血症的主要靶点之一。小鼠肾脏特异性转运蛋白（Mouse Renal-specific transporter, RST）作为URAT1的鼠源同系物,为以URAT1为靶点的高尿酸血症治疗药物研究,提供了取材方便的体内外实验模型来源。目前,由于西药存在一定的副作用,中药治疗的安全性及长期适用性使其成为治疗高尿酸血症的趋势。泄浊除痹方作为一种中药处方,在临床上已经取得一定成果。本课题组之前对其有效部位总黄酮进行了分离。在此基础上,具体研究内容如下：小鼠肾脏近端小管上皮细胞原代培养条件优化及功能测试：采用机械破碎与酶消化结合法,优化小鼠肾脏近端小管上皮细胞原代培养条件,经鉴定后,对细胞尿酸吸收功能进行验证,结果如下：经机械破碎的肾脏皮质组织在400U胶原酶Ⅰ处理20min时,肾小管节段贴壁率达到最高为54.5%；首次换液最佳时间为72h；细胞在原代培养第5天生长达到对数期,在第10天状态开始有所下降,折光率低,出现部分漂浮死亡细胞。在1500μM尿酸浓度的吸收培养基中,吸收实验进行30mmin时,其对尿酸吸收速率达到最大。指示药物丙磺舒和苯溴马隆在不同的浓度下,对尿酸吸收的抑制率不同,其中苯溴马隆的抑制率要高于丙磺舒。泄浊除痹方总黄酮对小鼠肾小管上皮细胞增殖及尿酸吸收的影响：将原代培养的小鼠肾脏近端小管上皮细胞用不同浓度泄浊除痹方总黄酮孵育48h,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活性。配制尿酸吸收培养基,进行尿酸吸收实验,采用尿酸检测试剂盒测定尿酸吸收值。结果显示：高浓度组总黄酮（10、7.5、5g·L-1）对细胞生长有不同程度的抑制作用,低浓度组药物（2.5、0.5g·L-1）对细胞生长活性无显着影响；在对细胞生长活性无显着影响的低浓度梯度范围内（2.5、2、1.5、1.0、0.5g·L-1）,药物对尿酸吸收表现出不同程度的抑制作用。该研究表明泄浊除痹方总黄酮对小鼠肾小管上皮细胞尿酸吸收功能有一定的抑制作用。泄浊除痹方总黄酮对RST基因表达的影响：利用分子实验手段检测不同药物作用浓度下,细胞中RST蛋白的基因表达。结果显示：泄浊除痹方总黄酮在1g·L-1～2.5g·L-1浓度范围内对尿酸吸收有显着抑制；在1g·L～2.5g·L-1范围内,RST表达明显下调。该研究表明泄浊除痹方能够通过下调RST基因表达降低RTECs尿酸吸收作用。泄浊除痹方总黄酮对肝脏黄嘌呤氧化酶的体外抑制作用：本课题通过以上实验证明了泄浊除痹方总黄酮在体外对尿酸吸收具有抑制作用,并以RST为靶点研究了该抑制作用的分子机制,同时,该成分对黄嘌呤氧化酶的氧化活性有一定的抑制作用。这些都证明泄浊除痹方对高尿酸血症具有一定的治疗效果。
向华[10]（2011）在《新生山羊肾小管上皮细胞分离培养及永生化的研究》文中指出近年来,研究者们通过使用原代分离培养的肾小管上皮细胞进行生理学、细胞损伤及修复的研究,以避免整个动物或者器官试验的复杂性。但体外分离培养的肾小管上皮细胞随着传代次数的增加,细胞逐渐失去分化、增殖能力,给研究工作带来了很大的困难。本研究采集新生山羊肾,利用胶原酶Ⅳ消化法分离培养肾小管上皮细胞,纯化后转染人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因,激活肾小管上皮细胞端粒酶活性,以期获得具有无限增殖能力的山羊肾小管上皮细胞系,为肾小管上皮细胞研究提供充足的细胞材料。研究获得了如下结果:（1）经1.3 mg/mL浓度的胶原酶Ⅳ消化分离获得的肾小管上皮细胞在倒置显微镜下观察细胞团块多,纯度高,且细胞生长快。第3天细胞汇合成片,呈典型的多边鹅卵形铺路石样,第4天基本铺满皿底,进行传代培养后,细胞生长迅速,每3天可传1代,可成功培养至第12代,13代时细胞出现衰老、死亡。（2）纯化后的肾小管上皮细胞经角蛋白18与碱性磷酸酶鉴定为阳性,表明分离培养的细胞为山羊肾小管上皮细胞。透射电镜下观察,细胞表面有微绒毛结构,细胞间存在桥粒连接复合体,符合新生山羊肾小管上皮细胞的特征。（3）转染hTERT基因的肾小管上皮细胞,经G418抗性筛选14～15 d后,对照组的细胞全部死亡,维持筛选,得到阳性克隆细胞,滤纸片法消化,转移,继续扩大培养。细胞呈典型的上皮样,绘制生长曲线显示曲线呈倒置的“S”型,比对照细胞的增殖活力强。（4）RT-PCR在转染细胞中检测到了外源性hTERT mRNA,Western blot检测到转染细胞中存在外源性hTERT蛋白的表达。通过对肾小管上皮细胞重要的标志物角蛋白18和碱性磷酸酶检测,表明转染后的细胞仍为肾小管上皮细胞。流式细胞仪检测细胞周期,结果显示转染hTERT基因的细胞增殖活力强于原代细胞,细胞凋亡率低于原代培养的第10代细胞。综上所述,本试验成功的将人端粒酶逆转录酶基因转染入新生山羊肾小管上皮细胞,延长了肾小管上皮细胞的寿命,转染后的肾小管上皮细胞保留了原代细胞的生长特性。由于时间有限,现传至20代,为肾小管上皮细胞的永生化奠定了基础。
二、人肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定（论文提纲范文）
（1）活化的肾小球壁层上皮细胞失去向足细胞分化能力的研究（论文提纲范文）
| 全文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 绪论 |
| 第一部分 小鼠肾小球壁层上皮细胞原代培养和鉴定 |
| 前言 |
| 1.1 实验动物和材料仪器 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验材料 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验中所需缓冲液的配制 |
| 1.2.2 肾小球壁层上皮细胞生长培养液配制 |
| 1.2.3 诱导壁层上皮细胞向足细胞分化的诱导分化培养液的配制 |
| 1.2.4 小鼠肾小球壁层上皮细胞原代培养 |
| 1.2.5 实时荧光定量多聚合酶链式反应(real-time qPCR) |
| 1.2.6蛋白印迹(western blot)实验 |
| 1.2.7 细胞爬片免疫荧光染色 |
| 1.2.8 数据处理、统计和分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 分离、培养小鼠原代肾小球壁层上皮细胞 |
| 1.3.2 体外培养的原代肾小球壁层上皮细胞表达claudin-1、CD24和CD |
| 1.3.3 第6 代小鼠肾小球壁层上皮细胞仍表达Claudin-1、CD24和CD133 |
| 1.3.4 小鼠肾小球壁层上皮细胞可在体外被诱导分化表达足细胞特异性标志蛋白 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 线粒体在肾小球壁层上皮细胞分化为足细胞中的作用 |
| 前言 |
| 2.1 实验对象和材料仪器 |
| 2.1.1 实验对象和分组 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠肾小球壁层上皮细胞原代培养 |
| 2.2.2 贴壁培养的细胞总DNA提取 |
| 2.2.3 实时荧光定量多聚合酶链式反应(real-time qPCR) |
| 2.2.4 透射电子显微镜(TEM)和线粒体计数 |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.6 数据分析和统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 诱导PECs向足细胞分化时,伴随线粒体数量增加和线粒体基因拷贝数增加 |
| 2.3.2 诱导PECs向足细胞分化时线粒体生成转录因子PGC-1α和线粒体氧化磷酸化蛋白COX IV的表达升高 |
| 2.3.3 诱导PECs向足细胞分化时线粒体三羧酸循环关键酶的表达升高 |
| 2.3.4 诱导PECs向足细胞分化时线粒体动力学相关蛋白的表达改变 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 ANCA相关肾小球肾炎患者血清和TGF-β1 对肾小球壁层上皮细胞分化能力的影响 |
| 前言 |
| 3.1 实验对象和材料仪器 |
| 3.1.1 实验对象和分组 |
| 3.1.2 人肾穿刺活检标本 |
| 3.1.3 AAVN患者血清收集 |
| 3.1.4 实验材料 |
| 3.1.5 主要仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验中所需缓冲液的配制、培养液配制 |
| 3.2.2 小鼠肾小球壁层上皮细胞原代培养 |
| 3.2.3 实时荧光定量多聚酶链式反应(real-time qPCR) |
| 3.2.4 蛋白免疫印迹(western blot)实验 |
| 3.2.5 石蜡切片制备 |
| 3.2.6 免疫组织化学染色 |
| 3.2.7 数据处理、统计和分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 新月体肾炎患者肾活检中观察到PECs活化和TGF-β1 的表达 |
| 3.3.2 ANCA相关性肾小球肾炎(AAVN)患者血清可在体外引起PECs活化 |
| 3.3.3 TGF-β1 在体外诱导PECs活化 |
| 3.3.4 抑制ERK1/2 通路的激活可以抑制TGF-β1 诱导的PECs活化 |
| 3.3.5 AAVN血清和TGF-β1 引起的PECs活化阻碍VRADM诱导PECs向足细胞分化 |
| 3.3.6 AAVN血清和TGF-β1 抑制PECs向足细胞分化时线粒体生成 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
（2）原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 原代肾小管上皮细胞提取方法 |
| 1.3 细胞特异性蛋白标志物鉴定 |
| 1.4 包被条件测定 |
| 1.5 培养液血清浓度优化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 胶原酶的选择优化 |
| 2.2 胶原酶消化时间优化 |
| 2.3 特异性蛋白标志物鉴定 |
| 2.4 培养皿包被条件优化 |
| 2.5 培养液血清浓度优化 |
| 3 讨论与结论 |
（3）C3aR激动剂对小鼠原代肾小管上皮细胞表型的影响（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 小鼠肾小管上皮细胞原代培养 |
| 1.2.2 小鼠原代肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 1.2.3 RT-PCR检测各组小鼠肾小管上皮细胞E-钙黏蛋白、α-SMA、TGF-β1表达水平 |
| 1.2.4 细胞骨架观察 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 肾小管上皮细胞形态学观察 |
| 2.2 肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 2.3 原代肾小管上皮细胞E-钙黏蛋白、α-SMA、collagen I表达调控 |
| 2.4 小管上皮细胞骨架观察 |
| 3 讨论 |
（4）肾小管上皮细胞模型的构建及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 肾小管上皮细胞模型构建方法的研究进展 |
| 1.2.1 原代分离肾小管上皮细胞的研究进展 |
| 1.2.2 肾小管上皮细胞株的研究进展 |
| 1.3 肾小管上皮细胞模型应用的研究进展 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 肾小管上皮细胞模型的构建 |
| 2.1 实验材料及主要仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.1.5 玻片的处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 兔原代肾小管上皮细胞的分离培养 |
| 2.2.2 兔原代肾小管上皮细胞的传代培养及细胞爬片的制备 |
| 2.2.3 兔原代肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 2.2.4 兔原代肾小管上皮细胞分离培养方法的优化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 肾小管节段贴壁状况及肾小管上皮细胞的生长状况 |
| 2.3.2 兔原代肾小管上皮细胞的鉴定结果 |
| 2.3.3 兔原代肾小管上皮细胞分离培养方法的优化结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 三种外源物诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型 |
| 3.1 实验材料及主要仪器 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试剂的配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 兔原代肾小管上皮细胞传代培养生长曲线的绘制 |
| 3.2.2 庆大霉素诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型 |
| 3.2.3 顺铂诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型 |
| 3.2.4 马兜铃酸Ⅰ诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 兔原代肾小管上皮细胞传代培养生长曲线 |
| 3.3.2 庆大霉素诱导结果 |
| 3.3.3 顺铂诱导结果 |
| 3.3.4 马兜铃酸Ⅰ诱导结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 中药提取物对外源物致肾小管上皮细胞毒性的保护作用 |
| 4.1 实验材料及主要仪器 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验中药 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 中药的选择 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 中药提取物的制备 |
| 4.3.2 中药提取物对庆大霉素致肾小管上皮细胞毒性的保护作用 |
| 4.3.3 中药提取物对顺铂致肾小管上皮细胞毒性的保护作用 |
| 4.3.4 中药提取物对马兜铃酸Ⅰ致肾小管上皮细胞毒性的保护作用 |
| 4.3.5 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 中药提取物的制备结果 |
| 4.4.2 中药提取物对庆大霉素致肾小管上皮细胞毒性的保护作用结果 |
| 4.4.3 中药提取物对顺铂致肾小管上皮细胞毒性的保护作用结果 |
| 4.4.4 中药提取物对马兜铃酸Ⅰ致肾小管上皮细胞毒性的保护作用结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）肾小管上皮细胞C3aR的表达调控及其活化作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 炎症细胞因子对人肾小管上皮细胞C3a受体的表达调控 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 C3aR激动剂对小鼠原代肾小管上皮细胞表型影响研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 全文总结 |
| 英文缩略词 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）关于鼠肾小管上皮细胞原代培养的对比探究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 肾小管节段分离 |
| 1.3.2 肾小管上皮细胞的原代培养及传代 |
| 1.3.3 首次换液后废液的有效利用 |
| 1.3.4 肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 1.3.4.1 倒置显微镜下对细胞的形态及生长进行观察 |
| 1.3.4.2 免疫细胞化学法 (SABC 法) |
| 2 结果 |
| 2.1 SD 大鼠和昆明小鼠肾小管上皮细胞分离生长和传代的比较 |
| 2.4 肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 3 讨论 |
（7）小鼠肾小管上皮细胞的培养和鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肾小管的分离提取 |
| 1.2.2 肾小管上皮细胞的原代培养 |
| 1.2.3 肾小管上皮细胞的传代 |
| 1.2.4 肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 原代细胞的生长 |
| 2.2 传代细胞的生长 |
| 2.3 细胞的鉴定 |
| 3 讨论 |
（8）新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定（论文提纲范文）
| 0 引 言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.2 含肾小管节段组织块的分离及培养 |
| 1.2.1 传统组织块培养 |
| 1.2.2 改良组织块培养 |
| 1.3 非肾小管节段细胞的刮擦和肾小管上皮细胞的分离培养 |
| 1.4 肾小管上皮细胞的传代培养 |
| 1.5 肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 1.5.1 形态学鉴定 |
| 1.5.2 免疫细胞化学鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（9）泄浊除痹方总黄酮治疗高尿酸血症机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 高尿酸血症与相关疾病 |
| 1.1.1 高尿酸血症与心血管疾病 |
| 1.1.2 高尿酸血症与慢性肾脏病 |
| 1.1.3 高尿酸血症与代谢综合征 |
| 1.2 高尿酸血症发病机制 |
| 1.2.1 原发性高尿酸血症发病机制 |
| 1.2.2 继发性高尿酸血症发病机制 |
| 1.3 高尿酸血症治疗药物及其作用靶点 |
| 1.3.1 黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO) |
| 1.3.2 尿酸盐阴离子转运体1(URAT1) |
| 1.3.3 果糖转运子9(GLUT 9) |
| 1.3.4 三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(ABCG2) |
| 1.3.5 其他靶点 |
| 1.4 高尿酸血症治疗药物研究现状 |
| 1.5 基于治疗高尿酸血症药物作用靶点的机制研究方法 |
| 1.5.1 以XOD为靶点的治疗机制研究方法 |
| 1.5.2 以尿酸转运蛋白为靶点的机制研究方法 |
| 1.5.3 爪蟾卵母细胞表达体系(Xenopus oocyte expression system) |
| 1.5.4 体外细胞模型 |
| 1.5.5 整体动物模型 |
| 1.6 本课题的研究内容及意义 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 研究意义 |
| 第二章 小鼠肾脏近端小管上皮细胞原代培养条件优化及功能测试 |
| 2.1 实验仪器、材料及试剂 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 实验动物及材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溶液配制 |
| 2.2.2 肾组织处理 |
| 2.2.3 肾小管节段分离 |
| 2.2.4 首次换液时间对肾小管节段贴壁率的影响 |
| 2.2.5 Ⅰ型胶原酶消化条件对肾小管贴壁率的影响 |
| 2.2.6 细胞生长曲线绘制 |
| 2.2.7 细胞鉴定 |
| 2.2.8 尿酸吸收功能测试 |
| 2.2.9 阳性药物对尿酸吸收的抑制作用 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 首次换液时间对肾小管节段贴壁率的影响 |
| 2.3.2 Ⅰ型胶原酶消化条件对肾小管贴壁率的影响 |
| 2.3.3 细胞生长曲线的绘制 |
| 2.3.4 细胞鉴定 |
| 2.3.5 细胞尿酸吸收功能测试 |
| 2.3.6 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 泄浊除痹方总黄酮对小鼠RTECs增殖及尿酸吸收的影响 |
| 3.1 主要实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RTECs细胞的培养 |
| 3.2.2 泄浊除痹方总黄酮溶液配制 |
| 3.2.3 泄浊除痹方总黄酮对RETCs增殖活性的影响 |
| 3.2.4 不同浓度泄浊除痹方总黄酮对尿酸吸收的体外抑制作用 |
| 3.2.5 实验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 泄浊除痹方总黄酮体外抑制尿酸吸收分子机制研究 |
| 4.1 主要实验材料和仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞预处理 |
| 4.2.2 RNA的提取 |
| 4.2.3 RST蛋白基因扩增引物设计 |
| 4.2.4 反转录与cDNA扩增 |
| 4.3 实验结果和讨论 |
| 4.3.1 泄浊除痹方总黄酮对RST基因表达的影响 |
| 4.3.2 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 泄浊除痹方总黄酮体外抑制黄嘌呤氧化酶活性研究 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂与仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 试剂的配制 |
| 5.2.2 酶活测定原理 |
| 5.2.3 酶促反应米氏方程的绘制 |
| 5.2.4 黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制实验 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 实验结果 |
| 5.3.2 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 总结与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）新生山羊肾小管上皮细胞分离培养及永生化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 肾小管上皮细胞的体外分离培养及其应用 |
| 1.1 肾小管和肾小球的发育 |
| 1.2 肾小管上皮细胞的成熟过程 |
| 1.2.1 未分化期 |
| 1.2.2 分化期 |
| 1.2.3 成熟期 |
| 1.3 肾小管上皮细胞的功能 |
| 1.3.1 物质重吸收作用 |
| 1.3.2 药物肾毒性研究的靶作用位点 |
| 1.3.3 参与疾病的发生 |
| 1.4 肾小管上皮细胞培养的研究近况 |
| 1.4.1 人肾小管上皮细胞培养的进展 |
| 1.4.2 其他动物肾小管上皮细胞的培养 |
| 1.5 肾小管上皮细胞的分离及纯化 |
| 1.5.1 组织块培养法 |
| 1.5.2 胶原酶消化分离肾小管上皮细胞 |
| 1.5.3 其他酶学消化分离肾小管上皮细胞 |
| 1.6 肾小管上皮细胞的纯化 |
| 1.7 体外培养肾小管上皮细胞的培养条件 |
| 1.7.1 血清 |
| 1.7.2 其他营养因子 |
| 第二章 端粒、端粒酶与细胞永生化 |
| 2.1 端粒与细胞衰老 |
| 2.1.1 衰老 |
| 2.1.2 端粒 |
| 2.1.3 端粒与细胞衰老 |
| 2.2 细胞的永生化 |
| 2.2.1 转染病毒 |
| 2.2.2 原癌基因转染 |
| 2.2.3 放射性因素 |
| 2.2 4 端粒酶 |
| 试验研究 |
| 第三章 新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物和组织来源 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 血清 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 培养液的配制 |
| 3.2.2 新生山羊肾小管上皮细胞的分离 |
| 3.2.3 新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养 |
| 3.2.4 新生山羊肾小管上皮细胞的传代培养 |
| 3.2.5 新生山羊肾小管上皮细胞的纯化与培养 |
| 3.2.6 新生山羊肾小管上皮细胞的观察与鉴定 |
| 3.2.7 新生山羊肾小管上皮细胞生长曲线的绘制 |
| 3.2.8 新生山羊肾小管上皮细胞增殖周期和细胞凋亡的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 胶原酶Ⅰ和Ⅳ对新生山羊肾小管上皮细胞分离培养效果的比较 |
| 3.3.2 新生山羊肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 3.3.3 新生山羊肾小管上皮细胞生长曲线的测定 |
| 3.3.4 新生山羊肾小管上皮细胞的增殖周期和细胞凋亡率分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养及纯化 |
| 3.4.2 新生山羊肾小管上皮细胞的周期与凋亡 |
| 3.4.3 新生肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 hTERT 基因转染新生山羊肾小管上皮细胞 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.2 方法与步骤 |
| 4.2.1 溶液配制 |
| 4.2.2 pCI-neo-hTERT 质粒转化、扩增与鉴定 |
| 4.2.3 pCI-neo-hTERT 质粒转染山羊肾小管上皮细胞 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 pCI-neo-hTERT 质粒提取与酶切鉴定 |
| 4.3.2 pCI-neo-hTERT 质粒浓度与纯度的确定 |
| 4.3.3 新霉素（G418）对新生山羊肾小管上皮细胞最佳筛选浓度的确定 |
| 4.3.4 pCI-neo-hTERT 转染后阳性克隆细胞的获得 |
| 4.3.5 pCI-neo-hTERT 转染后细胞形态和特征 |
| 4.3.6 阳性克隆细胞的纯化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因介导的细胞永生化 |
| 4.4.2 脂质体转染应用的优越性 |
| 4.4.3 pCI-neo-hTERT 的转染及抗性克隆的筛选 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 转染hTERT 基因的新生山羊肾小管上皮细胞生长特性的鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 工具酶与试剂 |
| 5.1.2 主要仪器与设备 |
| 5.2 方法与步骤 |
| 5.2.1 溶液配制 |
| 5.2.2 RT-PCR 检测转染细胞中外源性hTERT 的表达 |
| 5.2.3 Western blot 检测转染细胞中外源性hTERT 蛋白的表达 |
| 5.2.4 转染山羊肾小管上皮细胞的角蛋白与碱性磷酸酶染色鉴定 |
| 5.2.5 转染山羊肾小管上皮细胞生长曲线的测定 |
| 5.2.6 转染山羊肾小管上皮细胞增殖周期与凋亡的测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 转染外源性hTERT 基因细胞的RT-PCR 检测 |
| 5.3.2 Western blot 检测转染细胞中外源性hTERT 蛋白的表达 |
| 5.3.3 角蛋白18 间接免疫荧光检测 |
| 5.3.4 转染hTERT 基因的肾小管上皮细胞生长曲线 |
| 5.3.5 细胞周期与凋亡检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、人肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定（论文参考文献）
- [1]活化的肾小球壁层上皮细胞失去向足细胞分化能力的研究[D]. 徐辰祺. 上海交通大学, 2019(06)
- [2]原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化[J]. 曲玥阳,陈旭,岳喜庆,罗勇,赵伟杰,林炳承. 沈阳农业大学学报, 2018(01)
- [3]C3aR激动剂对小鼠原代肾小管上皮细胞表型的影响[J]. 张志诚,赵文紧,郑敬民. 医学研究生学报, 2017(01)
- [4]肾小管上皮细胞模型的构建及其应用[D]. 张雪. 贵州大学, 2016(05)
- [5]肾小管上皮细胞C3aR的表达调控及其活化作用研究[D]. 张志诚. 南方医科大学, 2016(02)
- [6]关于鼠肾小管上皮细胞原代培养的对比探究[J]. 陈娴,刘畅,张晴晴,王瑾,毛光玮,李菁菁. 世界最新医学信息文摘, 2015(19)
- [7]小鼠肾小管上皮细胞的培养和鉴定[J]. 王裕,杨霞,高继萍,皇甫冰,宋国华. 山西医科大学学报, 2014(11)
- [8]新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定[J]. 潘奇,李宏建,潘晓亮,张书信,崔艳霞,王振国,徐亚楠. 新疆农业科学, 2012(02)
- [9]泄浊除痹方总黄酮治疗高尿酸血症机制研究[D]. 臧路平. 华南理工大学, 2011(04)
- [10]新生山羊肾小管上皮细胞分离培养及永生化的研究[D]. 向华. 西北农林科技大学, 2011(04)