一、根癌农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展（论文文献综述）
李玉帅[1]（2021）在《玉米PEPC基因在烟草和紫花苜蓿中的表达分析》文中研究指明磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是C4途径光合关键酶,利用现代分子生物技术将C4植物光合关键酶PEPC基因转入C3植物中改良C3植物光合效率,进而提高C3植物产量是国内外研究热点之一。为探究PEPC基因对C3植物烟草光合效率的影响,本研究利用根癌农杆菌介导法将玉米PEPC基因转入到烟草中,并继续进行种植筛选获得T3代转玉米PEPC基因烟草植株,利用PCR、RT-PCR等分子生物学技术对T3代转玉米PEPC基因烟草植株进行鉴定;对分子生物学鉴定呈阳性的T3代转玉米PEPC基因烟草植株在烟草团棵期和现蕾期分别测定其PEPC酶活性、Rubisco酶活性、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、净光合速率、蒸腾系数、气孔导度、胞间CO2浓度和农艺性状等生理生化指标,研究了玉米PEPC基因对烟草光合效率的影响;在干旱胁迫条件下检测了转玉米PEPC基因烟草和非转基因烟草的叶绿素含量、净光合速率、SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA和可溶性糖含量,研究了玉米PEPC基因对烟草抗旱性的影响。主要研究结果如下:1.将玉米PEPC基因通过农杆菌介导法导入到烟草中,获得转玉米PEPC基因烟草植株,并连续种植筛选,获得T3代转玉米PEPC基因烟草植株。2.对T3代转玉米PEPC基因烟草PCR鉴定,结果转基因烟草DNA作为模板的PCR产物片段大小与阳性对照（含有玉米PEPC基因的大肠杆菌质粒DNA为模板）一致;提取转基因烟草RNA,进行反转录,以反转录出的c DNA为模板进行RT-PCR,获得与阳性对照（含有玉米PEPC基因的大肠杆菌质粒DNA为模板）大小一致的片段。3.在烟草团棵期和现蕾期分别对T3代转玉米PEPC基因烟草和非转基因烟草的生理生化指标进行检测。T3代转玉米PEPC基因烟草的平均PEPC酶活性在团棵期是非转基因烟草的3.5倍,在现蕾期是非转基因烟草的3.6倍;平均Rubisco酶活性在团棵期较非转基因烟草高53.33%,在现蕾期较非转基因烟草高50.77%;转玉米PEPC基因烟草叶片的平均叶绿素含量在团棵期较非转基烟草高32.86%,在现蕾期较非转基因烟草高28.95%;平均叶绿素荧光参数在团棵期较非转基因烟草高4.94%,在现蕾期较非转基因烟草高4.88%;平均净光合速率在团棵期较非转基因烟草高38.46%,在现蕾期较非转基因烟草高46.67%;平均蒸腾系数在团棵期较非转基因烟草高27.28%,在现蕾期较非转基因烟草高31.58%;气孔导度在团棵期较非转基因烟草高55.56%,在现蕾期较非转基因烟草高63.16%;在团棵期转基因烟草的平均株高、茎围、叶片数、最大叶长、最大叶宽分别比非转基因烟草高15.19%、3.13%、16.17%、8.01%、23.87%,在现蕾期分别比非转基因烟草高3.95%、2.63%、13.04%、3.05%、4.93%。4.干旱胁迫条件下转玉米PEPC基因烟草的净光合速率较非转基因烟草高67.50%,叶绿素含量较非转基因烟草高37.50%,SOD、POD和CAT的活性较非转基因烟草分别高58.62%、30.44%、64.71%,MDA的含量较非转基因烟草低35.71%,可溶性糖含量转基因烟草和非转基因烟草无明显变化。5.利用根癌农杆菌介导法将玉米PEPC基因成功转入紫花苜蓿中,获得转玉米PEPC基因紫花苜蓿植株,PCR、RT-PCR等分子生物学技术鉴定均扩增出与阳性对照（含有玉米PEPC基因的大肠杆菌质粒DNA为模板）大小一致的片段。
赵晓登[2]（2021）在《苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1对烟草和小麦的遗传转化及抗旱性研究》文中进行了进一步梳理苜蓿Mfhb-1基因是在苜蓿体细胞胚胎发生初期通过扣除杂交而获得的,属于同源异域型-亮氨酸拉链蛋白（Homeodomain-leuzine zipper protein,HD-Zip）Ⅰ类转录因子基因。目前常见的转录因子（Transcription factor）是指能够与基因某些顺式作用元件结合,进而在转录水平对植物进行生物调节的特定蛋白。前人研究结果表明,同源异型-亮氨酸拉链（HD-Zip）蛋白是高等植物特有的一类转录因子,主要参与植物对逆境胁迫的应答反应、胚胎发育的调控以及光形态建成等植物生理进程。为探明Mfhb-1基因在植物逆境胁迫下的生物调控功能,本研究利用农杆菌介导法将苜蓿Mfhb-1基因分别转入了NC89野生型烟草和矮抗58小麦,对转基因烟草和小麦进行分子生物学鉴定,并在干旱胁迫条件下测定烟草的SOD和POD活性、MDA含量、叶绿素含量等生理生化指标,主要研究结果如下:（1）利用根癌农杆菌介导法完成Mfhb-1基因对烟草的遗传转化,通过侵染、共培养、脱菌、筛选等过程获得转基因烟草植株,并对遗传转化过程中烟草的抗性愈伤组织进行数量统计,确定了农杆菌介导法对烟草遗传转化的最适条件:侵染液OD600值为0.61,侵染时间为20 min。（2）对T2代转苜蓿Mfhb-1基因烟草进行筛选,以Hyg外源喷雾和PCR检测结合的方式获得了10株T3代纯合转Mfhb-1基因烟草株系。（3）对获得的T3代纯合烟草进行RNA提取并进行反转录,对反转录生成的c DNA进行RT-PCR检测,结果显示,转基因烟草植株和阳性质粒DNA均能扩增出200 bp长度目的条带,说明Mfhb-1基因在烟草中已经表达。（4）对转入苜蓿Mfhb-1基因的烟草植株进行不同时间的干旱胁迫,再进行干旱胁迫下烟草植株的表观形态观测以及多项生理指标测定,结果显示:（1）正常生长条件下,两种类型烟草的表观形态无明显差异,随着干旱胁迫时间的持续,野生型烟草植株呈现出较大的负面影响变化,包括叶片变黄、叶片卷曲度改变、茎干干枯等,转Mfhb-1基因烟草植株表观形态改变与野生型植株相似,但改变程度远不及野生型烟草,20 d干旱胁迫条件下,仍呈现较好的生长态势。（2）转Mfhb-1基因烟草的SOD活性在正常以及干旱胁迫下均显着高于野生型烟草,干旱胁迫20 d时活性最高;正常生长条件下,两种类型烟草的POD活性无显着差异,但在干旱胁迫条件下,转基因烟草POD活性提高量显着高于野生型烟草,干旱胁迫20 d时,其活性提高37.11%。（3）野生型及转Mfhb-1基因烟草植株含水率在正常生长条件下无显着差异,均在80%以上;干旱胁迫15 d条件下,两种类型烟草的含水率均有所下降,但此时两者的含水率差别较小,无显着差异;干旱胁迫20 d时,两者含水率持续下降,且转基因烟草在此时的含水率显着高于NC89野生型烟草;与烟草含水率相反,两种类型烟草的MDA含量在正常生长条件下无显着差异,处于同一水平含量,但干旱胁迫时间为15 d时,转基因烟草MDA含量已显着低于野生型烟草。（4）转基因烟草的可溶性糖和pro含量在正常生长条件下与野生型烟草无显着差异,但可溶性蛋白含量显着高于野生型烟草;干旱胁迫15 d条件下,转Mfhb-1基因烟草的Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量均显着高于野生型烟草,且pro含量差异性最大;干旱胁迫20 d时,转基因烟草的可溶性蛋白及可溶性糖含量显着高于NC89野生型烟草,但两者pro含量无明显差异。（5）处于正常生长条件下时,两种类型烟草的叶绿素含量无显着差异,均处于一个正常水平;干旱胁迫时间达到15 d时,两者的叶绿素含量均明显下降,且转基因烟草的叶绿素含量显着高于NC89野生型烟草;随着干旱胁迫时间的延长,两种类型烟草的含量持续下降,而转基因烟草叶绿素含量一直高于野生型烟草。（6）这些研究结果表明,无逆境胁迫条件存在的情况下,Mfhb-1转录因子不会对植物的生长生理状态产生影响,外源干旱胁迫出现后,Mfhb-1转录因子能够提高植物的保护酶类的活性,同时以增加渗透调节物质含量的形式增强细胞渗透势来提高细胞吸水性,从而减缓植株含水率的降低,暗示着Mfhb-1基因的表达可能受到外源干旱胁迫条件的诱导。（5）通过根癌农杆菌介导法和抽真空法相结合的形式对小麦进行Mfhb-1基因遗传转化,利用潮霉素对小麦萌发以及生长期间进行初步筛选,初步筛选出对Hyg具有抗性的小麦植株,再对筛选出的小麦进行PCR检测,琼脂凝胶电泳结果显示,转基因小麦植株以及大肠杆菌质粒DNA均出现了1300 bp长度的清晰条带,可以进一步确认Mfhb-1基因已成功转入小麦中去。（6）对经PCR鉴定为阳性的小麦植株进行数量统计,结合对小麦进行遗传转化时的不同条件,得出小麦遗传转化成功率最高时,侵染液OD600值为0.41,真空状态持续时间为30 s时,转化成功率为2.4%。综上所述,本研究初步明确了Mfhb-1基因的抗旱功能,通过对转基因烟草的多个生理指标测定发现,与野生型烟草植株相比,导入Mfhb-1基因的烟草在正常和不同干旱胁迫时间的情况下,SOD、POD、MDA含量、Pro含量等生理指标均有不同程度的变化,变化情况均指向抗旱性增强,为进一步研究HD-Zip转录因子的功能以及作用机理提供了理论依据和实验支撑。此外,通过以抽真空法作为辅助手段的根癌农杆菌介导法成功将苜蓿Mfhb-1基因导入了小麦中去,为进一步研究单子叶植物的转基因技术提供参考。
王慧杰[3]（2021）在《三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究》文中研究说明水稻遗传转化技术已成为水稻分子生物学研究不可或缺的研究技术。农杆菌介导法是水稻遗传转化的主流方法,但农杆菌介导法转化水稻具有很强的基因型依赖性,一些顽拗型水稻品种的遗传转化仍然较为困难。本研究以粳稻品种日本晴,籼稻品种明恢86、9311作为遗传转化材料,探究了不同筛选标记基因、不同培养条件、两个胚形态建成基因和三元载体系统对水稻遗传转化效率的影响,建立了一种用于水稻遗传转化的三元载体系统。主要研究结果如下:以日本晴和明恢86成熟胚作为遗传转化材料,探究不同筛选标记基因Hpt、Bar对遗传转化效率的影响。结果显示,Hpt基因在两个品种中的筛选效率均优于Bar基因,且前者遗传转化周期明显短于后者。以明恢86成熟胚为遗传转化材料,探究形态调节基因BBM和WUS2对籼稻成胚效率和遗传转化效率的影响,但最终结果表明本实验中构建的含形态调节基因的载体与普通载体的遗传转化效率无明显差异。以日本晴成熟胚为遗传转化材料,比较含有相同目的基因RFP的双T-DNA载体（单质粒双T-DNA）和三元载体（双质粒双T-DNA）的转化效率。结果表明,目的基因的转化效率在双T-DNA载体系统中高于三元载体系统。而在三元载体系统中,p VS1相较于RK2更加适合作为辅助质粒的复制子。以明恢86、9311成熟胚为遗传转化材料,比较不同培养条件下籼稻遗传转化效率。结果显示,在预分化阶段之前,共培养、恢复、筛选等阶段共28天的连续黑暗培养更加适用于籼稻遗传转化。四种三元载体系统转化明恢86、9311成熟胚愈伤组织。结果表明,三元载体系统引入额外的毒力基因vir提高了农杆菌侵染效率。相较于双元载体,三元载体有效提高了明恢86的遗传转化效率。在9311中,三元载体转化效率仍是不高,最高转化率仅为2.6%,仍需进一步完善。
胡懋[4]（2021）在《根癌农杆菌介导黑曲霉外源基因表达系统的建立及优化》文中研究表明黑曲霉（Aspergillus niger）作为一类重要的发酵工业菌种,内含多种性能优良的酶系,可用于生产糖化酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶等数十种酶制剂。此外,由于黑曲霉拥有大肠杆菌表达系统所不具备的优越性,是真核活性蛋白的优良载体。因此,黑曲霉在饲料工业、食品工业、医药等领域有极大的应用价值。但是,传统遗传转化方法对黑曲霉的转化效率和遗传稳定性不高,极大限制了丝状真菌表达系统的开发。本研究借助根癌农杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）建立了黑曲霉的遗传转化体系。以黑曲霉CICC2629为宿主菌,优化转化条件提升了转化效率,成功赋予宿主菌潮霉素抗性。此外,以增强型绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescent protein gene,e GFP）为标记基因,在黑曲霉中研究了不同启动子对目的基因表达水平的影响,进而筛选出最适用于本宿主菌表达外源基因的启动子。我们利用葡聚糖酶基因在黑曲霉中进行验证,并进行酶学性质测定。初步探究了真核序列Kozak sequence（GCCACC）对黑曲霉蛋白翻译水平的影响。最后,对黑曲霉发酵条件进行了优化。研究结果如下:1.通过对8株黑曲霉的生长特性及其潮霉素敏感度分析,最终选定CICC2629做为本研究宿主菌,并用ATMT技术成功将潮霉素磷酸转移酶基因（Hygromycin B phosphotransferase gene,hph）整合到宿主菌基因组中。优化后ATMT转化条件为:选用农杆菌AGL-1,AS浓度为200μmol/L,黑曲霉孢子浓度5.0×106个/m L-1.0×107个/m L,以玻璃纸为共培养基质,22℃避光正置共培养48 h后转膜,最高可以获得75±5个转化子,最高阳性率达到93.9%,平均保持在89.92%以上,较优化前转化效率提升了2.03倍,连续传代5次仍然能检测到hph基因,遗传稳定性良好。2.选择三个启动子gpd A、gla A和Tox A分别驱动e GFP基因在黑曲霉中的表达。通过对荧光强度和像素值分析,检测出三种启动子启动外源基因表达能力为:gpd A>gla A>Tox A。同时通过q PCR检测e GFP基因的相对表达量,启动子gpd A启动基因表达能力分别是gla A和Tox A的3.26倍和4.82倍。3.以启动子gpd A和gla A介导了葡聚糖酶基因（An-pi Glu）基因在黑曲霉中的表达,最终测定该酶的酶活为74.43 U/m L,最适温度为60℃,最适p H值为6.5,在37℃和50℃耐受60 min分别能保持63.1%和49.4%以上的相对酶活,60℃和65℃的半衰期分别为15 min和7 min;在p H值3.0–11.0的缓冲液中处理60 min仍能保持66.1%以上的相对酶活。β-巯基乙醇、DTT、丙三醇对此酶的激活作用最强,依次是未处理的1.94倍、1.91倍和1.79倍,Li+、Tween80、Triton X100、乙酸、乙醇、甲醇、PEG4000、乙酸乙酯、尿素同样对此酶有激活作用。Ag+和Hg2+对此酶有强烈抑制作用。An-pi Glu基因表达量结果:gla A+Kozak-An-pi Glu基因表达量较未添加Kozak序列组上调了1.71倍,gpd A+Kozak组上调了1.50倍,表明Kozak序列能增强黑曲霉基因表达水平。4.优化了黑曲霉发酵条件,蛋白表达水平较初始发酵提升了5.05倍。优化发酵条件:发酵温度为30℃,时间为168 h,按3%接种浓度为1.0×107/m L的新鲜孢子悬浮液。最佳发酵培养基基于原始配方,碳源可选择微晶纤维素、维生素C、木聚糖,选择黄豆饼粉作为氮源,蛋白表达水平均明显提高。综上所述,以上研究结果有助于建立稳定高效的丝状真菌表达体系,为丝状真菌遗传转化、蛋白表达、发酵工艺方面的研究提供参考。
王伟[5]（2020）在《玉米高效遗传转化受体材料的筛选》文中提出遗传转化技术已经成为生物学研究的重要手段之一,玉米高效遗传转化体系的建立对于玉米在生物学方面的研究具有重要的意义。玉米高效遗传转化体系的构建可以从优化培养体系、构建高效遗传转化载体、筛选高效受体材料等方面入手。本研究对实验室收集的64个玉米自交系进行了农杆菌介导的遗传转化实验,实验过程中取材以及侵染阶段的操作步骤均参考本实验室最常用的实验方法;实验过程中使用的培养体系是本实验室之前筛选出的适用于大多数玉米自交系的培养体系。本研究在对所有玉米自交系进行完整的遗传转化实验以后,对转化效率和获得绿苗所用培养时间进行了统计分析,筛选出了113、130和166（具体材料名称见补充表1）三种可用于玉米高效遗传转化体系构建的受体材料,其转化效率分别为11.99%、8.78%和9.09%,对照材料B104和Z31的转化效率分别是13.16%和10.39%,三种材料的转化效率与对照材料没有明显差距;三种材料获得绿苗所用组织培养时间分别是51天、48天和45天,自交系B104和Z31的培养时间分别是55天和52天,三种材料的组织培养时间均较对照材料有所缩短。在本研究中,为了找出遗传转化过程中主要性状与转化效率之间的关系,在实验过程中,按照组织培养的时间顺序对所有自交系的瞬时转化率、初级愈伤组织诱导率、稳定转化率、胚性愈伤组织诱导率进行了统计分析,发现（1）当材料的瞬时转化率或稳定转化率很低时,材料可直接淘汰;（2）当材料具有高水平的初级愈伤组织诱导能力或胚性愈伤组织诱导能力时,不能代表该材料具有高水平的转化效率;（3）胚性愈伤组织诱导能力较低的材料有可能具有高效的转化效率。本研究分析了基因型对于瞬时转化能力、初级愈伤组织诱导能力、稳定转化能力、胚性愈伤组织诱导能力四个性状的影响程度,发现瞬时转化能力、稳定转化能力、胚性愈伤组织诱导能力三个性状受基因型的影响十分明显,而初级愈伤组织诱导能力受基因型的影响程度很低,在以后的实验中可以不再把初级愈伤组织诱导能力作为评价玉米自交系转化效率的参考依据。
覃雪晶[6]（2020）在《几个蓝莓品种离体叶片再生及遗传转化体系的优化》文中指出蓝莓（Vaccinium spp.）是一种极具经济价值和保健价值的果实,随着市场多样化需求的增加,通过生物技术育种,提升蓝莓果实产量和品质迫在眉睫。利用生物技术进行的根癌农杆菌介导的植物遗传转化已经在多种果树中成功应用,但在蓝莓中仍然存在品种转化效率低下、转化困难等问题。本研究以高丛蓝莓品种‘北陆’（Northland）、‘圣蓝’（Millennia）、‘喜来’（Sierra）、‘莱格西’（Legacy）、‘蓝源’（Bluesouth）为材料,通过不同激素组合和浓度试验,优化蓝莓叶片不定芽再生体系及建立蓝莓叶片愈伤组织再生体系;通过分析根癌农杆菌侵染浓度和时间、共培养天数、抑菌剂浓度等因子的影响效果,以期对蓝莓遗传转化体系进行优化,为后续蓝莓基因功能的研究和育种工作提供技术支撑。主要研究结果如下:（1）优化了4个蓝莓品种‘北陆’、‘圣蓝’、‘喜来’、‘莱格西’叶片再生不定芽体系,筛选出4个品种诱导不定芽培养基以WPM+4.0 mg/L ZT+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂粉为佳。其中,‘北陆’叶片不定芽诱导率为60%,‘圣蓝’叶片不定芽诱导率为81.67%,‘喜来’叶片不定芽诱导率为83.33%,‘莱格西’叶片不定芽诱导率为26.67%。（2）成功诱导‘北陆’、‘莱格西’两个品种的叶片愈伤组织,叶片诱导愈伤组织培养基以WPM+1.0 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂粉为佳,光照条件以黑暗培养效果为佳,叶片愈伤组织诱导率可达到100%。（3）成功继代‘北陆’、‘莱格西’两个品种的叶片愈伤组织,愈伤组织继代培养基以WPM+1.5 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂粉为佳,光照条件以黑暗培养效果为佳。（4）针对蓝莓遗传转化中的卡那霉素筛选浓度、农杆菌侵染浓度和侵染时间、抑菌剂浓度进行了优化试验,筛选出‘北陆’和‘圣蓝’叶片卡那霉素最优浓度分别是15mg/L和20 mg/L;农杆菌侵染OD600值分别为0.9和0.3-0.4;侵染时间为60 min,共培养时间为6 d;脱菌使用WPM+300 mg/L头孢噻肟钠（Cef）与WPM+4.0 mg/L ZT液体培养基搭配;筛选培养基使用WPM+4.0 mg/L ZT+300 mg/L Cef+卡那霉素,诱导周期为50-60 d,蓝莓叶片存活率最高,能直接再生出卡那霉素抗性芽。其中农杆菌OD600值为0.3时,‘圣蓝’抗性芽诱导率为2%,OD600值为0.4时,‘圣蓝’抗性芽诱导率为2.04%;OD600值为0.9时,‘北陆’抗性芽诱导率为2.5%。
周静[7]（2020）在《抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究》文中研究说明毛白杨生长迅速,树干通直挺拔,是我国重要的速生用材树种和园林绿化树种,在我国林业经济、生态建设和城乡绿化中发挥着重要的作用。但病虫危害严重影响毛白杨的正常生长,而叶色单一在一定程度上影响了毛白杨的观赏度。随着生物技术的发展,利用多基因聚合转化技术创制同时具有抗虫和彩叶特性的毛白杨新材料,对于毛白杨种质创新具有重要意义。Btcry Ⅱ基因编码的毒蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂Bbi基因对鳞翅目害虫具有高毒力,CmOr基因可调控类胡萝卜素含量以改变叶色,本实验采用IRES元件构建了多基因聚合表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOrIRES-Luc;利用农杆菌介导法将其和抗虫基因表达载体p CAMBIA1304-Bbi分别转入毛白杨TC1521无性系中,通过抗性筛选、PCR鉴定获得一批转基因阳性植株;进一步通过RT-PCR、qRT-PCR对外源基因的表达情况进行了分析,为后续进行抗虫试验、叶片色素测试等生理生化指标分析奠定了工作基础。本研究主要结果如下:1.以pCAMBIA1304质粒为骨架,构建了基于IRES元件的多基因聚合表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOr-IRES-Luc,通过PCR检测,证明外源基因Btcry Ⅱ和CmOr已经成功整合到表达载体上。2.利用冻融法将多基因表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOr-IRES-Luc和抗虫基因表达载体p CAMBIA1304-Bbi导入农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导法将其分别转入毛白杨TC1521,经过植物组织培养和潮霉素（Hyg）筛选,得到40株转抗虫、彩叶双价基因的生根抗性苗和18株转Bbi基因的生根抗性苗。经PCR鉴定,获得双价基因阳性植株8株和抗虫基因Bbi阳性植株7株。3.采用RT-PCR和qRT-PCR技术,对8个转双价基因的阳性植株进行外源基因的表达分析,检测结果表明,在其中7个转基因株系中都能够检测到Btcry Ⅱ和CmOr基因,且相对表达量明显高于野生型植株（WT）;对7个转Bbi基因阳性植株进行RT-PCR检测,在2个转基因株系中检测到该基因的转录本,说明Bbi基因不仅已经整合到毛白杨TC1521的基因组中,而且能够正常转录。4.对上述7个转Btcry Ⅱ、CmOr双价基因株系和2个转Bbi抗虫基因株系进行扩繁,共获得转双价基因植株24株,转Bbi抗虫基因植株16株,并移栽到温室进行培养。这些工作为后续抗虫测试和叶片色素分析奠定了工作基础。
刘雨佳[8]（2020）在《玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）转录因子ChhapX基因功能初步研究》文中研究表明异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）引起的玉米小斑病是一种重要的玉米叶部病害。目前对玉米小斑病菌致病力的研究主要集中在T和O两个生理小种的基因组获得以及T小种毒素合成的分子机制。玉米小斑病菌在侵入寄主过程中需要应对多种自身或寄主产生的应激反应,同时生产毒素,维持致病力。此过程涉及多个转录因子的参与。转录因子HapX是铁稳态的主要调节剂,对多种病原真菌维持毒力至关重要。玉米小斑病菌中的ChhapX对铁稳态及致病力的影响,以及其是否通过已证实的保守铁调节系统来响应铁离子变化协调自身铁平衡,尚不明确。本研究以玉米小斑病菌ChhapX为研究对象,建立并优化农杆菌介导的玉米小斑病菌遗传转化体系,获得ChhapX敲除突变体,分析转录因子ChhapX对玉米小斑病菌铁稳态、生长发育及致病力的影响,为明确玉米小斑病菌致病机制奠定基础。其方法及结果如下:1.玉米小斑病菌转录因子ChhapX基因序列克隆及蛋白质理化性质分析。本文根据烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的HapX基因序列,经NCBI比对获得玉米小斑病菌ChhapX基因全序列,并对其进行生物信息学分析,结果表明玉米小斑病菌ChhapX基因全长1440bp,含1个开放阅读框,编码422个氨基酸,定位于细胞核,含有一个bZIP型结构域。系统进化树分析表明,玉米小斑病菌ChhapX与玉米弯孢叶斑病菌HapX系统进化关系最近。2.玉米小斑病菌ATMT遗传转化体系的建立、优化及△ChhapX突变体的获得。农杆菌介导的玉米小斑病菌遗传转化的最优体系为:玉米小斑病菌分生孢子浓度为105个/mL,在25℃黑暗条件下萌发8h后与浓度为OD600=0.5的含有潮霉素和绿色荧光蛋白基因双元载体的农杆菌AGL-1,按照1:1比例混合,诱导30min后,共培养48h,转化效率为每转化105个孢子可产生85个转化子。采用Overlap PCR和无缝克隆方法构建玉米小斑病菌ChhapX敲除载体pPZP100ChhapX,利用电击法将敲除载体导入农杆菌菌株AGL-1后,基于玉米小斑病菌ATMT遗传转化最优体系,获得候选转化子,单孢纯化经PCR验证得到△ChhapX菌株。3.ChhapX对不同铁离子下玉米小斑病菌生长发育、抗胁迫能力以及致病力的影响。在不同铁离子浓度下△ChhapX菌丝生长与野生型相比无明显差异,但突变体菌落变薄,菌丝干重显着降低,产孢量增多;在铁充足和铁过量条件下,△ChhapX细胞色素合成减少;细胞壁完整性、氧化胁迫和离子胁迫处理后,在铁缺乏和铁充足时,△ChhapX菌株对刚果红、SDS和NaCl的敏感性增加,对H2O2敏感性降低;在铁过量条件下,△ChhapX菌株对SDS的敏感性增加,对刚果红和NaCl的敏感性降低。与野生型相比,△ChhapX接种在玉米B73后,致病力显着降低。表明转录因子ChhapX影响菌丝生长、产孢、色素合成、抗胁迫能力及致病力。4.ChhapX响应不同铁离子浓度影响铁稳态及氧化应激反应相关基因的表达。实时荧光定量PCR结果显示,玉米小斑病菌ChhapX基因能够响应不同的铁离子浓度,在低铁时ChhapX表达显着上调。铁稳态相关的基因NRPS6,NRPS2,SidA,mirB和CYCA在不同铁离子浓度下的表达受ChhapX调控,在铁缺乏时,SidA,NRPS6和NRPS2表达显着下调,CYCA表达下调;在铁充足时,SidA,NRPS6,NRPS2和mirB表达下调;在铁过量时,SidA,NRPS6,mirB表达显着上调。表明ChhapX能够在低铁和高铁条件下调控铁吸收和铁消耗途径。氧化应激相关的基因SOD1,SOD2,CAT1,CAT3,NOX2,NOX4,NOX5,GR和GSS,在铁缺乏时,CAT3和NOX4的表达显着上调;在铁充足时,SOD1表达上调,CAT1,CAT3,NOX2,NOX5和GR显着下调;在铁过量时,SOD1,SOD2,CAT1,NOX2,NOX4和GSS表达下调。表明ChhapX与玉米小斑病菌的氧化应激反应具有相关性。
曾繁丽[9]（2020）在《农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化体系的建立》文中指出乌菜（Brassica campestris L.ssp.Chinensis）是十字花科芸薹属白菜亚种的变种之一,属于二年生草本植物,从宋元时期便已经广泛栽培。因其富含维生素C,被称为维生素菜。作为江淮流域最主要的叶菜品种之一,乌菜在我国大部分地区均有栽培,特别是安徽、江苏、上海等地,是调剂“冬缺”和“春淡”的理想蔬菜。近年来,人们主要利用传统育种方法,如杂种优势育种等方法来提高乌菜的品质及产量,由于传统育种方法周期长、效率低、育种目标不定向等缺点,限制了育种工作的发展。随着现代生物技术的快速发展,转基因技术取得了很大的进步,农杆菌介导法是植物遗传转化中最常用的方法之一,具有简单方便、费用低、周期短等特点,可以弥补传统育种的不足,加快新品种开发。但是,采用组织培养获得再生植株途径,进行植物遗传转化,不仅工作量大,而且遗传转化效率低。采用农杆菌介导花药非组织培养进行遗传转化,不仅操作简单,而且可以避免植物愈伤组织培养过程,从而节省大量时间,为作物的定向遗传改良提供了有效快速的方法。本试验采用乌菜WS-1材料为试材,进行农杆菌介导遗传转化,研究分析影响花药遗传转化的因素,建立农杆菌介导花药非组织培养遗传转化体系,并分析其遗传转化细胞生物学机理。主要研究成果:1.以WS-1为试材,优化了共培养基（CCM）中BAP、As和Silwet的浓度,共培养基p H值、暗培养时间、花蕾大小与处理方式以及农杆菌接种方法等影响遗传转化的因素,建立了农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化体系:将农杆菌悬浮在CCM中(MS+2.0 mg?L-1 BAP+40 mg?L-1 As+0.03%Silwet+0.5 g?L-1 MES+5%sucrose,p H5.8;OD650=0.3),选择3-5 mm大小的花蕾并剖除萼片和花瓣,采用液滴接种法接种,并进行2 d暗培养,应用优化后的程序,瞬时表达频率91.59%。之后正常培养植株即可获得转基因种子。2.利用GUS组织化学染色法,对农杆菌侵染乌菜花蕾组织进行显微观察,分析农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化的细胞生物学机理。研究结果表明,农杆菌遗传转化乌菜花蕾组织,是通过雄配子（花粉）,而非雌配子（胚珠）介导的。
周嫦嫦[10]（2020）在《MtCOMT基因克隆、CRISPR/Cas9载体构建及转化蒺藜苜蓿的研究》文中研究说明木质素（Lignin）是一种复合的芳香性高聚物,在植物生长发育过程中主要起机械支撑作用。草食类牲畜对苜蓿的消化利用除了可溶性蛋白外,主要是细胞壁中的纤维素、半纤维素等多糖类物质。但由于细胞壁中木质素的存在,严重阻碍了这些多糖类生物大分子在草食类牲畜瘤胃中的消化和吸收。咖啡酸-O-甲基转移酶（Caffeic acid O-methyltransfease,COMT）是一种邻位甲基转移酶,在木质素单体生物合成过程中发挥重要作用,其决定丁香酰基（S型）木质素单体的合成。由此可以通过抑制苜蓿中COMT表达来降低其木质素的含量。CRISPR/Cas9系统作为第三代基因组编辑技术,是一种可靠、简便、高效的基因组编辑工具。该系统能够通过转基因技术手段对作物自身基因组进行遗传操作,最终获得与天然突变体类似的种质新资源,在作物基因组编辑的研究中起着举足轻重的作用。基于以上原因,本研究以蒺藜苜蓿R108为研究对象,克隆MtCOMT基因,并利用基于毛状根培养系统的高效苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑平台,对R108中MtCOMT基因进行定点编辑,获得编辑纯合的毛状根根系,并再生出MtCOMT基因突变的苜蓿遗传资源,为苜蓿品质的遗传改良奠定分子基础。主要研究结果如下:1、蒺藜苜蓿MtCOMT基因克隆利用Phytozome资源数据库,获得蒺藜苜蓿MtCOMT基因的电子序列（基因号为Medtr3g092900）,以此设计PCR引物进行植物克隆,以获得蒺藜苜蓿R108的Mt COMT基因。Mt COMT基因序列含有1098个核苷酸,编码365个氨基酸。该蛋白相对分子量为39.921KDa,理论等电点为5.67。利用NCBI protein BLAST分析,该蛋白在34-85氨基酸内有一个Dimerization结构域,在140-345氨基酸内有一个Methyltransf 2保守结构域,在Methyltransf 2结构域内含有S-腺苷甲硫氨酸结合位点。且发现蒺藜苜蓿MtCOMT和紫花苜蓿MsCOMT的亲缘关系高度相近,具有99.73%的同源性。两者在保守结构域内只有一个氨基酸的突变,在第80个氨基酸处丝氨酸被替换成亮氨酸。2、CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建根据蒺藜苜蓿MtCOMT基因的电子序列,在MtCOMT基因的第一、第二外显子上各设计了1个sgRNA靶点。在pYLCRISPR/Cas9-P35S骨架载体上连入适合双子叶植物发动sgRNA转录的AtU3b启动子和BsaI酶切位点,并引入2个tRNA保守序列,将2个20nt-sgRNA间隔开,将sgRNA和Cas9的表达盒组装在同一载体上。成功的构建了pYLCRISPR/Cas9-AtU3b-tRNA-COMT植物表达载体。3、编辑纯合毛状根根系的筛选利用发根农杆菌介导的叶圆盘转化法,将pYLCRISPR/Cas9-AtU3b-t RNACOMT植物表达载体转化蒺藜苜蓿,获得抗性毛状根。利用2×CTAB法提取具有抗性毛状根样品的DNA,以Cas9基因引物、Bar基因引物、RolB基因引物和MtCOMT基因引物分别进行PCR鉴定,阳性克隆进行BsaI酶切鉴定。经PCR/RE法鉴定,初步获得了3个编辑纯合的毛状根根系。将经酶切初步预判为纯合编辑的毛状根根系进一步测序分析。结果表明,这3种根系在第1靶点上均未发生突变,在第2靶点上均发生100%的突变,进一步证明所获得的3种毛状根根系为编辑纯合。4、编辑纯合毛状根根系的扩繁与再生将已鉴定获得的编辑纯合毛状根根系继续培养,使用诱导培养基将单一的毛状根根系扩大培养,为后续深入研究准备试验材料。同时,将部分编辑纯合毛状根转移到愈伤诱导、分化再生和生根培养基上,经过愈伤培养、分化再生并生根,最后获得了MtCOMT被编辑的蒺藜苜蓿再生植株。
二、根癌农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、根癌农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展（论文提纲范文）
（1）玉米PEPC基因在烟草和紫花苜蓿中的表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物光合作用的过程及机理 |
| 1.2 C_4植物光合优势 |
| 1.2.1 C_3植物与C_4植物碳同化途径的不同 |
| 1.2.2 C_3植物与C_4植物叶片解刨结构的不同 |
| 1.2.3 C_3植物与C_4植物固定碳素(CO_2)酶的不同 |
| 1.2.4 C_3植物与C_4植物CO_2补偿点的不同 |
| 1.2.5 C_3植物与C_4植物光合呼吸速率的不同 |
| 1.3 C_4光合关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)研究进展 |
| 1.3.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)分子生物学研究 |
| 1.3.2 转PEPC基因对C_3植物光合作用及产量的影响 |
| 1.3.3 转PEPC基因对C_3植物抗旱性影响 |
| 1.4 植物转基因的常用方法 |
| 1.4.1 根癌农杆菌介导法 |
| 1.4.2 基因枪法 |
| 1.4.3 花粉管通道法 |
| 1.4.4 电击法 |
| 1.5 烟草转基因研究进展 |
| 1.6 紫花苜蓿生物学特性及遗传转化体系研究进展 |
| 1.6.1 紫花苜蓿的生长条件及其生物学特性 |
| 1.6.2 紫花苜蓿的遗传转化体系研究 |
| 1.7 本课题研究意义及研究目标 |
| 1.7.1 研究意义 |
| 1.7.2 本课题的研究目标 |
| 1.8 本课题前期工作基础 |
| 1.9 技术路线 |
| 1.9.1 技术路线1 |
| 1.9.2 技术路线2 |
| 第二章 根癌农杆菌介导的玉米 PEPC 全长基因转化烟草及分子生物学鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 工程菌 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要试剂及药品 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 无菌烟草苗的培养 |
| 2.2.2 农杆菌菌液的制备 |
| 2.2.3 根癌农杆菌介导转化烟草 |
| 2.2.4 转基因烟草T3代转基因植株的筛选 |
| 2.2.5 T3代转基因烟草植株PCR检测 |
| 2.2.6 T3 代转基因烟草RNA的提取、质量检测及RNA反转录 |
| 2.2.7 T3 代转基因烟草植株RT-PCR检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 转玉米C_4型PEPC基因烟草再生植株与T3 代转基因烟草植株筛选结果与分析 |
| 2.3.2 T3代转基因烟草植株PCR电泳结果分析 |
| 2.3.3 T3代转基因烟草植株RNA提取质量检测结果分析 |
| 2.3.4 T3 代转基因烟草植株RT-PCR检测结果分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 影响烟草遗传转化的主要因素 |
| 2.4.2 烟草遗传转化过程中抗性筛选剂PPT的最适浓度 |
| 2.4.3 烟草叶片总RNA提取的优化 |
| 第三章 T3代转基因烟草光合相关酶活性和生理特性及农艺性状检测分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 对T3代转基因烟草不同生长期磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性检测 |
| 3.2.2 对T3 代转基因烟草1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)活性检测 |
| 3.2.3 对T3代转基因烟草叶绿素含量及叶绿素荧光参数检测 |
| 3.2.4 对T3代转基因烟草净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO_2浓度的检测 |
| 3.2.5 对T3代转基因烟草不同生长期的农艺性状进行测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 对转基因烟草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性检测结果及分析 |
| 3.3.2 对转基因烟草1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)活性检测结果及分析 |
| 3.3.3 对转基因烟草叶绿素含量及叶绿素荧光参数的检测结果及分析 |
| 3.3.4 对转基因烟草净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO_2浓度的检测 |
| 3.3.5 对转基因烟草不同生长期农艺性状的测量结果及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 转玉米C_4型PEPC基因对烟草光合相关酶活性影响讨论分析 |
| 3.4.2 转基因烟草光合相关酶的活性与叶绿素含量相关性讨论分析 |
| 3.4.3 转基因烟草光合相关酶的活性与净光合速率相关性讨论分析 |
| 3.4.4 转玉米C_4型PEPC基因对烟草农艺性状的影响 |
| 第四章 T3代转基因烟草抗旱性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 在干旱处理条件下对T3代转基因烟草的叶绿素含量检测 |
| 4.2.2 在干旱处理条件下对T3代转基因烟草的净光合速率检测 |
| 4.2.3 在干旱处理条件下对T3代转基因烟草的SOD活性检测 |
| 4.2.4 在干旱处理条件下对T3代转基因烟草的POD活性检测 |
| 4.2.5 在干旱处理条件下对T3代转基因烟草的CAT活性检测 |
| 4.2.6 在干旱处理条件下对T3代转基因烟草的MDA活性检测 |
| 4.2.7 在干旱处理条件下对T3代转基因烟草的可溶性糖含量测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 对干旱处理条件下T3代转基因烟草的叶绿素含量测定结果与分析 |
| 4.3.2 对干旱处理条件下T3代转基因烟草的净光合速率测定结果与分析 |
| 4.3.3 对T3代转基因烟草的SOD活性检测结果与分析 |
| 4.3.4 对T3代转基因烟草的POD活性检测结果与分析 |
| 4.3.5 对T3代转基因烟草的CAT活性检测结果与分析 |
| 4.3.6 对T3代转基因烟草的MDA含量检测结果与分析 |
| 4.3.7 对T3代转基因烟草的可溶性糖含量测定结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 转玉米PEPC基因烟草在干旱胁迫下具有更强的光合优势 |
| 4.4.2 转玉米PEPC基因烟草在干旱胁迫下抗氧化保护酶活性更高 |
| 第五章 根癌农杆菌介导的玉米PEPC全长基因转化紫花苜蓿及分子生物学鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 工程菌 |
| 5.1.3 培养基 |
| 5.1.4 主要试剂 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 紫花苜蓿苗的培养 |
| 5.2.2 农杆菌菌液的制备 |
| 5.2.3 根癌农杆菌介导转化紫花苜蓿 |
| 5.2.4 转基因紫花苜蓿植株PCR检测 |
| 5.2.5 转基因紫花苜蓿植株RT-PCR检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 转基因紫花苜蓿阳性植株筛选结果与分析 |
| 5.3.2 转基因植株PCR电泳结果与分析 |
| 5.3.3 紫花苜蓿RNA提取质量检测与RT-PCR检测结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 影响紫花苜蓿遗传转化率的主要因素 |
| 5.4.2 紫花苜蓿对抗性筛选剂PPT最佳选择压 |
| 第六章 全文讨论与结论 |
| 6.1 农杆菌介导法玉米PEPC基因转入烟草及分子生物学鉴定 |
| 6.2 转玉米PEPC基因烟草具有更高的光合相关酶活性和叶绿素含量 |
| 6.3 玉米PEPC基因对烟草光合效率及农艺性状的影响 |
| 6.4 玉米PEPC基因对烟草的抗旱性影响 |
| 6.5 农杆菌介导法玉米PEPC基因转入紫花苜蓿及分子生物学鉴定 |
| 6.6 下一步工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1对烟草和小麦的遗传转化及抗旱性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词中英文对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物抗旱性研究进展 |
| 1.1.1 干旱胁迫对植物的影响 |
| 1.1.2 植物对干旱胁迫的响应 |
| 1.2 植物转录因子研究进展 |
| 1.2.1 植物转录因子的结构 |
| 1.2.2 植物转录因子的分类 |
| 1.2.3 植物转录因子的生物学功能 |
| 1.3 植物HD-Zip转录因子研究进展 |
| 1.3.1 植物HD-Zip转录因子的结构及分类 |
| 1.3.2 植物HD-Zip转录因子的生物调控功能 |
| 1.3.3 影响植物HD-Zip转录因子基因表达的因素 |
| 1.3.4 苜蓿HD-Zip类转录因子Mfhb-1 |
| 1.4 植物遗传转化方法研究进展 |
| 1.4.1 农杆菌介导法 |
| 1.4.2 花粉管通道法 |
| 1.4.3 基因枪介导法 |
| 1.5 前期研究基础 |
| 1.6 本课题研究目标及意义 |
| 1.6.1 研究目标 |
| 1.6.2 研究意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1 对烟草的遗传转化及分子生物学检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 根癌农杆菌工程菌及质粒 |
| 2.1.3 试剂与仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 烟草外植体准备 |
| 2.2.2 根癌农杆菌活化培养及侵染液制备 |
| 2.2.3 侵染及共培养 |
| 2.2.4 脱菌培养 |
| 2.2.5 筛选培养 |
| 2.2.6 生根培养 |
| 2.2.7 转基因烟草的分子检测及T_3代纯合筛选 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 烟草Mfhb-1基因遗传转化再生结果及分析 |
| 2.3.2 根癌农杆菌最适侵染时间及浓度确定 |
| 2.3.3 T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草PCR电泳结果及分析 |
| 2.3.4 RNA提取质量检测 |
| 2.3.5 T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草RT-PCR电泳结果及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 烟草组织培养及筛选过程的优化 |
| 2.4.2 烟草遗传转化体系优化 |
| 2.4.3 植物叶片RNA的提取优化 |
| 第三章 干旱胁迫下转Mfhb-1基因T_3代纯合烟草的的表观观测及生理指标测定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 烟草植株干旱胁迫 |
| 3.2.2 烟草表观形态观测 |
| 3.2.3 抗氧化保护酶SOD和 POD活性测定 |
| 3.2.4 渗透调节物质Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量测定 |
| 3.2.5 含水率及MDA含量测定 |
| 3.2.6 叶绿素含量测定 |
| 3.2.7 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 干旱胁迫下T_3纯合转Mfhb-1基因烟草形态变化 |
| 3.3.2 干旱胁迫下T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草保护酶SOD和 POD活性测定结果及分析。 |
| 3.3.3 干旱胁迫下T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草渗透调节物质Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量测定结果及分析 |
| 3.3.4 干旱胁迫下T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草含水率及MDA含量测定结果及分析 |
| 3.3.5 干旱胁迫下T_3代纯合转Mfhb-1基因烟草叶绿素含量测定结果及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 干旱胁迫条件下,Mfhb-1基因转入对烟草表观形态的影响 |
| 3.4.2 干旱胁迫条件下,Mfhb-1基因转入对烟草保护酶活性及渗透调节物质的影响 |
| 3.4.3 干旱胁迫条件下,Mfhb-1 基因转入对烟草MDA、叶绿素及含水率的影响 |
| 第四章 HD-Zip类转录因子Mfhb-1 基因对小麦的遗传转化及分子生物学检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 工程菌及质粒 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 试剂配制 |
| 4.2.2 植物材料准备 |
| 4.2.3 工程菌制备及侵染液的制备 |
| 4.2.4 真空辅助遗传转化 |
| 4.2.5 共培养 |
| 4.2.6 筛选培养 |
| 4.2.7 春化及移植 |
| 4.2.8 转基因烟草的PCR检测及数量统计 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 小麦Mfhb-1基因遗传转化结果及分析 |
| 4.3.2 转Mfhb-1 基因小麦的PCR电泳结果及分析 |
| 4.3.3 小麦遗传转化最适条件确定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 小麦遗传转化体系的确定 |
| 4.4.2 根癌农杆菌介导下小麦遗传转化体系的优化 |
| 第五章 全文讨论及结论 |
| 5.1 Mfhb-1基因烟草转化植株的再生及分子生物学检测 |
| 5.2 根癌农杆菌介导法最适转化条件研究 |
| 5.3 干旱胁迫下Mfhb-1转录因子对烟草表观形态影响 |
| 5.4 T_3代转Mfhb-1基因烟草抗旱性鉴定 |
| 5.5 Mfhb-1转录因子影响植物抗旱性的可能机理 |
| 5.6 下一步研究工作设想 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（3）三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 农杆菌侵染机制 |
| 1.2 农杆菌介导水稻遗传转化研究进展 |
| 1.3 影响农杆菌转化水稻的几个关键因素 |
| 1.3.1 基因型 |
| 1.3.2 外植体 |
| 1.3.3 外源添加物 |
| 1.3.4 筛选标记 |
| 1.3.5 农杆菌菌株及载体系统 |
| 1.4 三元载体系统 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 受体植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.2 化学试剂与酶类 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌DH5α感受态制备及转化 |
| 2.3.2 农杆菌感受态的制备及转化 |
| 2.3.3 农杆菌Ti质粒的提取 |
| 2.3.4 质粒DNA酶切 |
| 2.3.5 DNA片段回收 |
| 2.3.6 PCR反应及产物电泳检测 |
| 2.3.7 连接反应 |
| 2.3.8 水稻遗传转化与筛选 |
| 2.3.9 水稻DNA的提取 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 水稻LAZY1基因敲除载体p1300Cas9-lazy1的构建 |
| 3.2 Bar基因为筛选标记的载体构建 |
| 3.3 形态调节基因载体的构建 |
| 3.4 双T-DNA与三元载体的构建 |
| 3.5 三元载体系统载体构建 |
| 3.6 不同筛选标记对水稻遗传转化的影响 |
| 3.7 形态调节基因的籼稻遗传转化 |
| 3.8 双T-DNA位于同一载体和不同载体的遗传转化效率比较 |
| 3.9 不同培养条件下的籼稻遗传转化 |
| 3.10 三元载体系统的籼稻遗传转化 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 水稻遗传转化效率的提升 |
| 4.2 三元载体系统中的辅助质粒 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）根癌农杆菌介导黑曲霉外源基因表达系统的建立及优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 黑曲霉表达系统的概述 |
| 1.2.1 黑曲霉内外源基因的表达 |
| 1.2.2 黑曲霉优化表达量的方法 |
| 1.2.2.1 启动子的选择 |
| 1.2.2.2 信号肽的选择 |
| 1.2.2.3 密码子偏好性优化 |
| 1.2.2.4 Kozak序列的应用 |
| 1.2.3 黑曲霉遗传转化方法 |
| 1.2.4 农杆菌介导转化真菌的研究 |
| 1.2.4.1 农杆菌介导转化真菌的研究进程 |
| 1.2.4.2 ATMT技术的转化机制及实验步骤 |
| 1.2.4.3 ATMT 转化效率的影响因素 |
| 1.3 绿色荧光蛋白基因 GFP 在真菌中的应用 |
| 1.4 β-葡聚糖酶的研究概况 |
| 1.4.1 微生物来源的 β-葡聚糖酶 |
| 1.4.2 动物和植物来源的 β-葡聚糖酶 |
| 1.4.3 β-葡聚糖酶的研究进展 |
| 1.4.4 β-葡聚糖酶的应用 |
| 1.4.4.1 β-葡聚糖酶在饲料工业中的应用 |
| 1.4.4.2 β-葡聚糖酶在啤酒酿造业中的应用 |
| 1.4.4.3 β-葡聚糖酶在食品工业中的应用 |
| 1.4.4.4 β-葡聚糖酶在生物防治中的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 黑曲霉CICC2629遗传转化体系的建立及优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 2.1.4 常用溶液 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黑曲霉宿主菌的选择 |
| 2.2.1.1 不同黑曲霉菌株生长速度及产孢能力的监控 |
| 2.2.1.2 黑曲霉菌株对潮霉素敏感度测试 |
| 2.2.2 中间双元载体的构建 |
| 2.2.2.1 基础质粒的提取 |
| 2.2.2.2 潮霉素表达盒的制备. |
| 2.2.2.3 大肠杆菌感受态E.coli DH5α 的制备 |
| 2.2.2.4 基础双元质粒双酶切 |
| 2.2.2.5 潮霉素表达盒与线性化基础质粒pCAMBIA3301的连接转化 |
| 2.2.2.6 重组质粒转化子阳性鉴定. |
| 2.2.3 农杆菌感受态的制备 |
| 2.2.4 重组质粒转化农杆菌 |
| 2.2.4.1 农杆菌p CA-Hyg转化子阳性鉴定. |
| 2.2.5 根癌农杆菌介导黑曲霉的遗传转化 |
| 2.2.5.1 黑曲霉孢子悬浮液的制备 |
| 2.2.5.2 农杆菌避光诱导培养 |
| 2.2.5.3 黑曲霉孢子与农杆菌菌液诱导共培养 |
| 2.2.6 黑曲霉转化株鉴定 |
| 2.2.6.1 转化株基因组提取及PCR鉴定 |
| 2.2.6.2 转化株黑曲霉潮霉素稳定性检测 |
| 2.2.7 ATMT转化条件的优化 |
| 2.2.7.1 农杆菌种类的优化 |
| 2.2.7.2 共培养乙酰丁香酮浓度的优化 |
| 2.2.7.3 共培养膜基质的优化 |
| 2.2.7.4 共培养温度和时间的优化 |
| 2.2.7.5 黑曲霉孢子浓度的优化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 黑曲霉生长速度及产孢能力分析 |
| 2.3.2 潮霉素对黑曲霉抑制情况分析 |
| 2.3.3 中间双元载体的构建结果分析 |
| 2.3.3.1 潮霉素表达盒的制备结果 |
| 2.3.3.2 基础质粒 pCAMBIA3301 线性化结果 |
| 2.3.3.3 线性化质粒 pCAMBIA3301 与 gpd-hgy 片段连接转化及转化子鉴定 |
| 2.3.4 根癌农杆菌转化子阳性鉴定分析 |
| 2.3.5 农杆菌与黑曲霉诱导共培养分析 |
| 2.3.6 转化子基因组为模板PCR阳性鉴定及测序分析 |
| 2.3.7 转化子遗传稳定性分析 |
| 2.3.8 ATMT转化法最适条件分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第3章 eGFP基因在黑曲霉中的表达及启动子的选择 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 3.1.4 常用溶液 |
| 3.1.5 培养基 |
| 3.1.6 DNA测序与引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 三种eGFP双元表达载体的构建 |
| 3.2.1.1 eGFP 表达盒 gpdA-eGFP-trp C、glaA-eGFP-trp C、ToxA-eGFP-NOS 各组分基因的制备 |
| 3.2.1.2 中间双元质粒pCAMBIA-gpdA-hyg的双酶切 |
| 3.2.1.3 表达盒 gpdA-eGFP-trpC、gla A-eGFP-trp C、ToxA-eGFP-NOS 各片段的连接及转化 |
| 3.2.1.4 重组质粒转化子阳性鉴定 |
| 3.2.2 重组eGFP表达质粒转化农杆菌 |
| 3.2.2.1 农杆菌eGFP转化子鉴定 |
| 3.2.3 根癌农杆菌介导黑曲霉的遗传转化 |
| 3.2.4 黑曲霉转化子鉴定 |
| 3.2.4.1 荧光显微镜检查转化子 |
| 3.2.4.2 eGFP转化子剖面荧光强度分析 |
| 3.2.4.3 eGFP转化子基因组 PCR 鉴定 |
| 3.2.5 qPCR测定eGFP基因相对表达量 |
| 3.2.5.1 eGFP转化子RNA提取 |
| 3.2.5.2 RNA反转录cDNA |
| 3.2.5.3 实时荧光定量 PCR |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 eGFP表 达质粒p CAMBIA-gpd A-eGFP-trp C、p CAMBIA-gla A-eGFP-trp C和p CAMBIA-Tox A-eGFP-NOS的构建结果分析 |
| 3.3.2 重组质粒转化子阳性验证及测序分析 |
| 3.3.3 三种eGFP表达质粒转化农杆菌及转化子阳性验证 |
| 3.3.4 黑曲霉转化株鉴定 |
| 3.3.4.1 荧光显微镜检查转化子 |
| 3.3.4.2 转化子基因组模板PCR鉴定 |
| 3.3.4.3 转化子剖面荧光强度分析 |
| 3.3.5 实时荧光定量PCR测定eGFP基因相对表达量 |
| 3.3.5.1 eGFP转化子RNA提取 |
| 3.3.5.2 eGFP基因转录水平检测. |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第4章 葡聚糖酶在黑曲霉中的表达及酶学性质的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 4.1.4 所用溶液 |
| 4.1.5 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 葡聚糖酶表达载体pCA-gpdA-An-Glu 和 pCA-glaA-An-piGlu的构建 |
| 4.2.1.1 葡聚糖酶基因的制备 |
| 4.2.1.2 质粒pGH-glaA-box 和 pGH-gpdA-box 的线性化 |
| 4.2.1.3 gpdA-An-Glu和 glaA-An-Glu 基因与线性化载体的连接转化 |
| 4.2.1.4 重组质粒转化子阳性鉴定 |
| 4.2.1.5 gpdA-An-Glu-box 和 glaA-An-Glu-box 的制备 |
| 4.2.1.6 葡聚糖酶表达盒与线性化中间双元载体pCAMBIA3301-gpdA-hyg的连接及转化 |
| 4.2.1.7 葡聚糖酶双元表达质粒的阳性鉴定 |
| 4.2.2 提高表达量质粒的改造及验证 |
| 4.2.3 葡聚糖酶表达载体转化农杆菌及转化子鉴定 |
| 4.2.4 含有葡聚糖酶表达载体的根癌农杆菌介导转化黑曲霉及转化子鉴定 |
| 4.2.5 黑曲霉的发酵及SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.2.5.1 黑曲霉的发酵 |
| 4.2.5.2 葡聚糖酶的SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.2.6 葡聚糖酶An-Glu的酶学性质测定 |
| 4.2.6.1 DNS法原理及实验方法 |
| 4.2.6.2 1%(W/V)葡聚糖底物的准备 |
| 4.2.6.3 DNS法标准曲线的绘制 |
| 4.2.6.4 最适反应pH及pH稳定性测定 |
| 4.2.6.5 最适反应温度及温度稳定性测试 |
| 4.2.6.6 化学试剂及金属离子对葡聚糖酶An-Glu酶活力影响的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 An-Glu表达载体p CA-gpd A-An-Glu和p CA-gla A-An-Glu的构建结果 |
| 4.3.2 An-Glu黑曲霉转化子的鉴定 |
| 4.3.3 黑曲霉表达An-Glu及SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.3.4 Kozak序列优化后表达量情况及An-Glu基因表达水平分析 |
| 4.3.5 DNS法标准曲线的绘制及An-Glu酶学性质的分析 |
| 4.3.5.1 DNS标准曲线的绘制 |
| 4.3.5.2 葡聚糖酶An-Glu pH活性和pH稳定性的测定 |
| 4.3.5.3 葡聚糖酶 An-Glu 的热活性和热稳定性测定 |
| 4.3.5.4 金属离子与有机试剂对 An-Glu 酶活力的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 黑曲霉发酵条件的优化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 氮源的优化 |
| 5.2.2 碳源的优化 |
| 5.2.3 发酵温度的优化 |
| 5.2.4 发酵时间的优化 |
| 5.2.5 孢子悬浮液接种量的优化 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 最优氮源的测定 |
| 5.3.2 最优碳源的测定 |
| 5.3.3 发酵温度的优化 |
| 5.3.4 发酵时间的优化 |
| 5.3.5 孢子悬浮液接种量的优化 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 黑曲霉遗传转化体系的建立及优化 |
| 6.1.2 eGFP基因在黑曲霉中的表达 |
| 6.1.3 葡聚糖酶在黑曲霉中的表达 |
| 6.1.4 黑曲霉发酵条件的优化 |
| 6.2 创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 实验中所用到的缓冲液及配方 |
| A1 不同pH的柠-磷缓冲液配方 |
| A2 不同pH的甘氨酸-Na OH缓冲液 |
| 附录B 本研究涉及到的基因核苷酸序列 |
| B1 gpdA启动子及信号肽的核苷酸序列(5?-3?) |
| B2 glaA启动子及信号肽的核苷酸序列(5?-3?) |
| B3 trpC终止子核苷酸序列(5?-3?) |
| B4 ToxA-eGFP-NOS表达盒核苷酸序列(5?-3?) |
| B5 葡聚糖酶基因An-Glu核苷酸序列(5?-3?) |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
（5）玉米高效遗传转化受体材料的筛选（论文提纲范文）
| 缩略词说明 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 转基因技术简介 |
| 1.1.1 植物遗传转化技术的发展历程 |
| 1.1.2 转基因作物的应用 |
| 1.2 玉米组织培养技术 |
| 1.2.1 基因型的影响 |
| 1.2.2 外植体的影响 |
| 1.2.3 培养基的影响 |
| 1.2.4 植物生长调节剂的影响 |
| 1.3 玉米遗传转化技术 |
| 1.3.1 玉米遗传转化受体系统 |
| 1.3.2 玉米遗传转化方法 |
| 1.3.3 标记基因及阳性植株筛选方法 |
| 1.3.4 玉米遗传转化效率评估 |
| 1.3.5 玉米遗传转化技术的发展方向 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 材料种植方式 |
| 2.1.3 载体与菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 培养基系统 |
| 2.2.2 农杆菌的准备 |
| 2.2.3 玉米幼胚的取材与侵染实验 |
| 2.2.4 玉米的组织培养过程 |
| 2.2.5 材料转化状态的鉴定方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 玉米高效遗传转化受体材料的筛选 |
| 3.1.1 转化效率的统计分析 |
| 3.1.2 组织培养时间的统计分析 |
| 3.1.3 材料异地种植转化效率的相关性分析 |
| 3.2 遗传转化过程中的主要性状对材料转化效率的影响 |
| 3.2.1 瞬时转化能力对转化效率的影响 |
| 3.2.2 初级愈伤组织诱导能力对转化效率的影响 |
| 3.2.3 稳定转化能力对转化效率的影响 |
| 3.2.4 胚性愈伤组织诱导能力对转化效率的影响 |
| 3.2.5 绿苗分化能力与转化效率的关系 |
| 3.2.6 筛选剂浓度分析 |
| 3.3 遗传转化过程中的主要性状与材料转化效率之间的关系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 玉米高效遗传转化受体材料的筛选方向 |
| 4.2 受体材料的转化效率优化方向 |
| 4.3 主要性状与转化效率之间的联系 |
| 4.3.1 瞬时转化能力 |
| 4.3.2 稳定转化能力 |
| 4.3.3 筛选压的调整 |
| 4.3.4 再生效率与转化效率之间的关系 |
| 4.3.5 基因型与组织培养性状之间的关系 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）几个蓝莓品种离体叶片再生及遗传转化体系的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 木本植物组织培养研究进展 |
| 1.3 蓝莓组织培养研究进展 |
| 1.3.1 植物生长调节剂种类及浓度 |
| 1.3.2 外植体类型 |
| 1.3.3 基因型 |
| 1.4 木本植物遗传转化研究进展 |
| 1.4.1 影响农杆菌介导木本植物遗传转化效率的因素 |
| 1.4.2 根癌农杆菌介导蓝莓遗传转化的研究进展 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂及常用培养基配制 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 蓝莓叶片再生不定芽试验 |
| 2.3.2 蓝莓愈伤组织再生体系的建立 |
| 2.3.3 蓝莓遗传转化体系的优化 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 叶片再生不定芽优化试验 |
| 3.1.1 不同培养基配方对不同蓝莓品种叶片再生不定芽的效果 |
| 3.2 蓝莓愈伤组织再生体系的建立 |
| 3.2.1 不同造伤方式对叶片生成愈伤组织的效果 |
| 3.2.2 不同光照处理对蓝莓叶片生成愈伤组织的效果 |
| 3.2.3 不同培养基配方对蓝莓叶片愈伤组织诱导的效果 |
| 3.2.4 不同继代方式对愈伤组织生长的作用 |
| 3.2.5 不同培养基配方对蓝莓叶片愈伤组织继代的效果 |
| 3.3 蓝莓遗传转化体系的优化 |
| 3.3.1 各蓝莓品种叶片卡那霉素选择压浓度筛选试验 |
| 3.3.2 根癌农杆菌侵染时间试验 |
| 3.3.3 共培养时间筛选试验 |
| 3.3.4 根癌农杆菌侵染浓度试验 |
| 3.3.5 不同浓度抑菌剂对农杆菌的抑制试验 |
| 3.3.6 蓝莓Km抗性芽获得 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同因素对蓝莓叶片再生的影响 |
| 4.2 不同因素对诱导蓝莓叶片愈伤组织的影响 |
| 4.3 不同因素对蓝莓叶片遗传转化效率的影响 |
| 4.4 对蓝莓遗传转化体系的展望 |
| 5 结论 |
| 5.1 蓝莓叶片再生不定芽试验优化结果 |
| 5.2 蓝莓愈伤组织再生试验结果 |
| 5.3 蓝莓遗传转化体系优化结果 |
| 附录A 缩写表 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（7）抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 抗虫转基因研究进展 |
| 1.2.1 Bt毒蛋白分类和杀虫机理 |
| 1.2.2 国内外Bt毒蛋白抗虫转基因研究进展 |
| 1.2.3 蛋白酶抑制剂基因杀虫机理 |
| 1.2.4 国内外蛋白酶抑制剂抗虫转基因研究进展 |
| 1.3 彩叶转基因研究进展 |
| 1.3.1 橙基因CmOr变色机理 |
| 1.3.2 国内外彩叶转基因研究进展 |
| 1.4 多基因聚合的研究进展 |
| 1.4.1 杂交聚合转化法 |
| 1.4.2 多次转化法 |
| 1.4.3 多载体共转化 |
| 1.4.4 多基因单载体共转化 |
| 1.5 基因工程在杨树上的研究进展 |
| 1.5.1 抗虫转基因 |
| 1.5.2 抗病转基因 |
| 1.5.3 抗除草剂转基因 |
| 1.5.4 抗逆转基因 |
| 1.6 常用转基因方法 |
| 1.6.1 农杆菌介导法 |
| 1.6.2 花粉管通道法 |
| 1.6.3 基因枪法 |
| 1.6.4 低能离子束介导法 |
| 1.6.5 超声波诱导植物组织基因转移法 |
| 1.7 转基因筛选和检测方法 |
| 1.7.1 标记基因 |
| 1.7.2 DNA水平分析 |
| 1.7.3 RNA水平分析 |
| 1.7.4 蛋白表达水平分析 |
| 1.8 研究目的与内容 |
| 1.8.1 研究目的 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 2 多基因聚合表达载体设计与构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 酶与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 培养基配制 |
| 2.1.5 抗生素配制 |
| 2.1.6 引物序列 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 载体鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 植物表达载体结构图 |
| 2.3.2 载体的PCR鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 3 根癌农杆菌介导的植物表达载体在毛白杨中的遗传转化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 遗传转化材料 |
| 3.1.2 载体 |
| 3.1.3 培养基配制 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 工程菌的制备与检测 |
| 3.2.2 毛白杨的遗传转化 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 表达载体转化农杆菌的PCR检测 |
| 3.3.2 毛白杨遗传转化 |
| 3.4 讨论 |
| 4 转基因植株的分子检测 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 检测材料 |
| 4.1.2 试验所需试剂耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 转化植株的PCR检测 |
| 4.2.2 转基因植株的RT-PCR检测 |
| 4.2.3 转基因植株的q RT-PCR检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转化植株的PCR检测 |
| 4.3.2 转基因植株的RT-PCR检测 |
| 4.3.3 转基因植株的q RT-PCR检测 |
| 4.3.4 转基因植株的扩繁与移栽 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（8）玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）转录因子ChhapX基因功能初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 玉米小斑病菌致病机制、调控铁稳态转录因子及丝状真菌遗传转化方式研究进展 |
| 1.1 玉米小斑病及其病原菌生理分化 |
| 1.1.1 玉米小斑病概况 |
| 1.1.2 玉米小斑病菌生理分化现象 |
| 1.2 植物病原真菌铁稳态及其相关转录因子的研究进展 |
| 1.2.1 bZIP型转录因子调控铁稳态的机制研究 |
| 1.2.2 GATA型转录因子调控铁稳态机制的研究 |
| 1.3 丝状真菌遗传转化方法研究进展 |
| 1.3.1 物理和化学诱变 |
| 1.3.2 聚乙二醇氯化钙(CaCl_2-PEG)介导的原生质体转化法 |
| 1.3.3 基因编辑技术 |
| 1.3.4 根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)技术 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 玉米小斑病菌ChhapX基因生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 软件及网站 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 ChhapX核苷酸序列获得 |
| 2.2.2 ChhapX的系统进化分析 |
| 2.2.3 开放阅读框分析 |
| 2.2.4 理化性质分析 |
| 2.2.5 亚细胞定位预测 |
| 2.2.6 跨膜结构域分析 |
| 2.2.7 蛋白质结构域预测 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 玉米小斑病菌ATMT遗传转化体系的建立及△ChhapX菌株的获得 |
| 第一节 玉米小斑病菌ATMT体系建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 玉米小斑病菌潮霉素耐受性测定 |
| 3.2.2 玉米小斑病菌分生孢子萌发时间确定 |
| 3.2.3 农杆菌菌悬液浓度对转化效率的影响 |
| 3.2.4 分生孢子孢悬液浓度对转化效率的影响 |
| 3.2.5 分生孢子孢悬液与农杆菌菌悬液混合比例对转化效率的影响 |
| 3.2.6 诱导时间对转化效率的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第二节 玉米小斑病菌ChhapX敲除载体的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 玉米小斑病菌敲除载体构建 |
| 3.2.2 玉米小斑病菌ChhapX敲除载体转入农杆菌 |
| 3.3 小结 |
| 第三节 △ChhapX菌株的获得 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 △ChhapX菌株的获得 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 ChhapX对玉米小斑病菌生长发育及致病力的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同铁离子浓度下ChhapX对玉米小斑病菌菌丝生长的影响 |
| 4.2.2 不同铁离子浓度条件下ChhapX对玉米小斑病菌色素合成的影响 |
| 4.2.3 不同铁离子浓度条件下ChhapX对玉米小斑病菌产孢量及孢子萌发的影响 |
| 4.2.4 不同铁离子浓度条件下ChhapX对玉米小斑病菌抗胁迫的影响 |
| 4.2.5 ChhapX对 C.heterostrophus致病力的影响 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 ChhapX对玉米小斑病菌铁稳态调控及氧化应激反应相关基因的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同铁离子条件下ChhapX的表达差异分析 |
| 5.2.2 不同铁离子条件下玉米小斑病菌铁稳态相关基因表达差异分析 |
| 5.2.3 不同铁离子条件下ChhapX对 C.heterostrophus铁稳态相关基因表达差异分析 |
| 5.2.4 不同铁离子条件下玉米小斑病菌氧化应激反应相关基因表达差异分析 |
| 5.2.5 不同铁离子浓度下ChhapX对 C.heterostrophus氧化应激相关基因表达差异分析 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 讨论 |
| 6.3 下一步研究方向 |
| 6.4 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物转基因技术 |
| 1.1.1 转基因技术的原理 |
| 1.1.2 转基因技术的方法 |
| 1.2 农杆菌介导的植物转基因方法研究 |
| 1.2.1 转化机理 |
| 1.2.2 影响遗传转化的因素 |
| 1.2.3 转基因植株的检测方法 |
| 1.3 乌菜育种技术研究进展 |
| 1.3.1 乌菜概述 |
| 1.3.2 育种技术相关研究 |
| 1.4 本研究的主要内容 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 1.6 实验技术路线图 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要培养基的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 花药发育观察 |
| 2.2.2 农杆菌感受态制备 |
| 2.2.3 表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.4 遗传转化影响因素优化 |
| 2.2.5 农杆菌侵染与暗培养 |
| 2.2.6 GUS化学组织染色分析 |
| 2.2.7 转基因植株鉴定 |
| 2.2.8 数据分析与统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 花药发育的细胞学观察分析 |
| 3.2 遗传转化影响因素分析 |
| 3.2.1 BAP浓度对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.2 乙酰丁香酮(As)浓度对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.3 Silwet浓度对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.4 共培养基pH对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.5 花蕾大小对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.6 花蕾处理方式对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.7 农杆菌接种方式对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.8 暗培养天数对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.3 农杆菌介导乌菜花蕾最优遗传转化体系的建立 |
| 3.4 GUS组织化学染色分析 |
| 3.5 转基因植株筛选与鉴定 |
| 3.5.1 转基因植株筛选 |
| 3.5.2 PCR检测 |
| 3.5.3 GUS组织化学染色鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 花药发育对遗传转化的影响 |
| 4.2 乌菜遗传转化体系的建立 |
| 4.3 农杆菌侵染乌菜花蕾机理的分析 |
| 5 结论 |
| 5.1 建立了农杆菌介导乌菜花药遗传转化体系 |
| 5.2 明确了农杆菌侵染乌菜花蕾细胞生物学机理 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）MtCOMT基因克隆、CRISPR/Cas9载体构建及转化蒺藜苜蓿的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 我国苜蓿草产业的现状 |
| 1.2 COMT基因研究进展 |
| 1.2.1 木质素遗传操作的意义 |
| 1.2.2 木质素的合成代谢途径 |
| 1.2.3 COMT基因在植物木质素合成过程中的研究 |
| 1.3 植物遗传转化方法 |
| 1.3.1 农杆菌介导法 |
| 1.3.2 基因枪法 |
| 1.3.3 花粉管通道法 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 系统介导的基因组编辑 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9 系统 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 系统原理 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 系统介导的基因组编辑在植物中的应用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 蒺藜苜蓿Mt COMT基因克隆 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌种与载体 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 蒺藜苜蓿RNA的提取 |
| 2.3.2 cDNA的合成 |
| 2.3.3 PCR扩增目的基因 |
| 2.3.4 Mt COMT基因片段的回收 |
| 2.3.5 p MD18T-Mt COMT克隆载体的构建 |
| 2.3.6 Mt COMT基因的生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 Mt COMT基因的克隆 |
| 2.4.2 p MD18T-Mt COMT克隆载体的构建 |
| 2.4.3 Mt COMT基因序列的生物信息学分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 CRISPR/Cas9 载体的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 菌种与载体 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 sgRNA靶点序列的设计 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9 表达载体的引物设计 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9 载体构建 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 sgRNA靶点设计 |
| 3.4.2 CRISPR/Cas9 表达载体的构建 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 蒺藜苜蓿遗传转化及编辑纯合毛状根鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌种与载体 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 发根农杆菌介导的叶圆盘法转化苜蓿 |
| 4.3.2 编辑纯合毛状根的鉴定 |
| 4.3.3 编辑纯合毛状根的扩繁和再生 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 毛状根的获得 |
| 4.4.2 编辑纯合毛状根的鉴定 |
| 4.4.3 编辑纯合毛状根根系的扩繁和再生 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 Mt COMT对苜蓿木质素含量的影响 |
| 5.2 CRISPR/Cas9 系统编辑Mt COMT |
| 5.3 发根农杆菌侵染苜蓿诱导毛状根 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、根癌农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展（论文参考文献）
- [1]玉米PEPC基因在烟草和紫花苜蓿中的表达分析[D]. 李玉帅. 河南科技学院, 2021(07)
- [2]苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1对烟草和小麦的遗传转化及抗旱性研究[D]. 赵晓登. 河南科技学院, 2021(07)
- [3]三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究[D]. 王慧杰. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]根癌农杆菌介导黑曲霉外源基因表达系统的建立及优化[D]. 胡懋. 云南师范大学, 2021(08)
- [5]玉米高效遗传转化受体材料的筛选[D]. 王伟. 山东农业大学, 2020(01)
- [6]几个蓝莓品种离体叶片再生及遗传转化体系的优化[D]. 覃雪晶. 北京林业大学, 2020(02)
- [7]抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究[D]. 周静. 北京林业大学, 2020
- [8]玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）转录因子ChhapX基因功能初步研究[D]. 刘雨佳. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [9]农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化体系的建立[D]. 曾繁丽. 安徽农业大学, 2020(04)
- [10]MtCOMT基因克隆、CRISPR/Cas9载体构建及转化蒺藜苜蓿的研究[D]. 周嫦嫦. 哈尔滨师范大学, 2020(01)