一、DHA高产菌Schizochytriumsp.FJU-512脂肪酸组成与18S rRNA基因序列分析（论文文献综述）
龚定芳[1]（2019）在《高产DHA裂殖壶菌的诱变选育及转录组分析》文中进行了进一步梳理二十二碳六烯酸（DHA）属于多不饱和脂肪酸中的ω-3系列,因对人体有益而颇受关注,目前普遍应用在婴幼儿奶粉、孕妇DHA补充剂和保健品当中。DHA的市场需求与日俱增,传统方法获取DHA存在一定局限性,利用微生物发酵法生产DHA具有诸多优点,但是产量较低,DHA合成机理尚不明确。本论文旨在通过ARTP诱变提高裂殖壶菌中DHA的产量,并通过转录组分析揭示DHA产量提高的机理。主要的研究内容如下:（1）利用ARTP对原始菌株SR21型裂殖壶菌进行诱变处理,处理时间为15 s,使用不同浓度的丙二酸平板、碘乙酸平板、丙二酸与碘乙酸混合平板筛选高产菌株。最终,在添加1.2 g·L-1丙二酸的固体培养基上筛选得到一株性状稳定且DHA产量较高的诱变株,命名为NA2。摇瓶发酵120h后,其生物量、油脂总量、DHA产量分别达到36.00 g·L-1、22.24 g·L-1、6.59 g·L-1,与原始菌株相比分别提高18.11%、14.87%和46.12%。（2）在5 L发酵罐中比较出发菌株SR21和诱变菌株NA2在分批发酵条件下的发酵特性,NA2的最终DHA产量比SR21提高27.5%。进一步对NA2菌株在5 L发酵罐中的底物流加策略进行优化,比较了四种底物流加策略下的发酵性能:①间歇流加碳源、不流加氮源;②间歇流加碳源、间歇流加氮源;③碳源浓度恒定、间歇流加氮源;④DO-Stat策略流加碳源、间歇流加氮源。结果表明,NA2菌株在恒定葡萄糖浓度、间歇补加氮源的条件下可以获得最好的发酵性能,此时最终的生物量、油脂总量和DHA产量分别达到81.83 g·L-1、53.23 g·L-1和 13.66 g·L-1。（3）对原始菌株SR21和诱变菌株NA2进行转录组测序,对基因进行功能注释和代谢通路的分类,寻找差异表达基因,并将这些基因归类到相关的代谢途径中,探讨了诱变菌NA2中DHA产量提高的可能机理。结果表明:与原始菌株相比,诱变菌NA2中参与氨基酸代谢的ECHS1基因和能量代谢的tpiA基因表达量上调,为DHA的合成提供了大量的前体物质、还原力以及能量。利用实时荧光定量PCR验证基因的差异表达情况,结果与转录组分析一致。
任良栋,许团辉,徐权汉,刘思喜,夏伟,张浩[2]（2016）在《一株高产DHA菌株的筛选及其发酵条件优化》文中认为采用松花粉垂钓法分离得到一株DHA高产菌Schizochytrium sp.ZR-01,通过研究培养基和培养条件对菌株发酵生产DHA的影响,确定了菌株的最适发酵条件为:葡萄糖50 g/L,大豆蛋白胨10 g/L,酵母粉4 g/L,海水晶15 g/L,发酵温度28℃,初始p H 6.0,500 m L三角瓶装液量150 m L。在最适发酵条件下培养3 d,菌体干重和DHA含量分别达到23.5 g/L和6.9 g/L。此外考察了10 L发酵罐补料分批发酵过程,通过流加50%的葡萄糖和后期的低温胁迫,最终菌体干重和DHA含量分别高达72.1 g/L和21.7 g/L。
周立树[3]（2014）在《裂殖壶菌发酵产DHA的优化及发酵补料方式的研究》文中研究表明二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid, DHA）具有降血脂、抑制脑血栓形成、消除炎症和促进癌细胞凋亡等多种生物活性，利用裂殖壶菌发酵生产DHA具有含量高、产品质量和产量稳定、不含鱼腥味等众多优点，因此研究利用裂殖壶菌发酵生产DHA具有一定的理论意义和潜在的应用价值。论文首先研究了Schizochytrium limacinum JN168胞内油脂的提取方法，比较了酸热法、超声辅助提取法以及索式提取法三种常用的的油脂提取方法对于实验菌株的油脂提取能力，最终确立了最佳的提取方法为酸热提取法，提取溶剂体系为氯仿甲醇的等体积混合溶液；其后，研究了脂肪酸中DHA的纯化过程，首先将提取出的油脂用氢氧化钾的甲醇溶液处理成游离脂肪酸，然后通过尿素包埋和高效液相色谱相结合的方法对脂肪酸中的DHA进行了纯化，经尿素包埋富集后，DHA在脂肪酸中的比例由最初的42.27%提高到80.44%，初次富集后的样品经高效液相色谱进一步纯化，DHA含量升高至95.55%。为了提高DHA的产量，论文采用单因素实验、正交试验和均匀设计等实验方法对S. limacinum JN168液态发酵产DHA的培养基和培养条件进行了优化，确定了最佳的发酵培养基配方为：葡萄糖120g·L-1，酵母粉11g·L-1，乙酸铵1.5g·L-1，NaCl8g·L-1，MgSO4·7H2O4.6g·L-1，KCl0.5g·L-1，CaCl2·2H2O3.5g·L-1。最佳的培养条件为：培养基初始pH6.0，装液量50mL/250mL三角瓶，培养温度25℃，转速200r·min-1，发酵时间96h，此时DHA的产量为11.12g·L-1。论文最后对S. limacinum JN168发酵产DHA进行了5L发酵罐实验，根据裂殖壶菌的生长特性，研究了间歇补料、低速恒速补料、中速恒速补料和变速补料四种不同的补料策略对DHA产量的影响。在各种发酵方式中，变速补料模式所得的DHA产量和DHA平均产率最高，分别为15.60g·L-1和130.00mg·L-1·h-1，比分批发酵提高了39.04%和11.23%，其Yx/s和Yp/s也是所有发酵模式中最高的，因此确定变速补料为DHA的最佳发酵生产工艺。
李清,臧晓南,张学成,宋晓金,杨青[4]（2014）在《裂殖壶菌OUC88及10个派生菌株18S rDNA基因克隆和分析》文中研究说明用PCR方法从裂殖壶菌Schizochytrium limacinum OUC88及以其为出发菌株经紫外诱变筛选的10个菌株中扩增出18S rDNA基因序列（1751bp到1758bp）进行序列测定,以上序列已登录GenBank（HM042904-HM042914）并与已登录的裂殖壶菌属5条18S rDNA序列比对分析。结果表明,S.limacinum OUC88以及10个派生菌株间18S rDNA的遗传距离是0.0000.013,与Schizochytrium sp.FJU-512 18S rDNA（GenBank No.AY758384）的同源性最高,为98%99%;与S.limacinum（GenBank No.AB022107）的同源性为96%;与同属异种S.mangrovei（GenBank No.DQ100293）只有93%的同源性。并运用序列比对分析和MEGA4.0系统进化树,结果显示种内诱变产生的细微变异小于同属内不同物种之间的变异。本研究除了为裂殖壶菌这种重要的经济海洋真菌提供分子生物学资料以外,同时表明18S rDNA序列不仅在分子分类上是一个重要的标志,也可分析由突变引起的物种内细微的遗传变异。
侯盼[5]（2013）在《裂殖壶菌人工海水配方优化及pks3基因功能的初步研究》文中研究指明二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid, DHA）是ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3PUFAs），因具有抗病防癌、增强免疫、提高智力、保护视力等多种重要的生理功能而得到广泛应用。裂殖壶菌（Schizochytrium）是一种富含DHA的海洋真菌，因具有安全无害、易培养增殖、脂质含量高、品质优良且成分单一等优点而成为生产DHA的新生资源。目前，日本、美国及一些欧洲国家已经将裂殖壶菌生产DHA的工艺运用到了工业化生产中，而国内仍处于发展阶段，DHA产量不高成为亟待解决的问题，因此，利用各种技术手段和生物学方法提高裂殖壶菌的DHA产量显得尤为重要。本文从优化培养基中的离子浓度以提高裂殖壶菌DHA产量，以及裂殖壶菌DHA合成相关基因的克隆和功能研究两个方面开展了如下工作：1、本研究在利用人工海水替代裂殖壶菌培养基中天然海水的基础上，通过降低人工海水中的NaCl浓度，并探索性的在人工海水中加入KH2PO4和FeSO4·7H2O来提高裂殖壶菌OUC007的生长速度及DHA含量。结果表明，适量的减少人工海水中的NaCl以及添加KH2PO4和FeSO4·7H2O能一定程度的提高裂殖壶菌OUC007的生长速度和DHA含量，而浓度过高却会产生抑制作用。三种盐对裂殖壶菌生物量和DHA积累的最适浓度分别是：NaCl，200mmol/L；KH2PO4，10mmol/L；FeSO4·7H2O，2mmol/L。进一步对NaCl浓度，KH2PO4浓度和FeSO4·7H2O浓度进行三因素三水平正交实验，获得人工海水中钠盐、磷盐、铁盐的最优组合为：NaCl，200mmol/L；KH2PO4，15mmol/L；FeSO4·7H2O，3mmol/L。改良后的人工海水对裂殖壶菌OUC007生长和DHA积累都起到了显着的促进作用。最优组合实验组裂殖壶菌的生物量和DHA含量分别达到6.93g/l.d和19.66%，比使用天然海水的对照组生物量（4.68g/l.d）和DHA含量（12.78%）分别提高了48.08%和53.83%；比使用未改良人工海水的对照组生物量（4.97g/l.d）和DHA含量（13.35%）分别提高了39.44%和47.27%。2、本研究以GenBank中报道的pks3基因为参考，设计引物进行PCR扩增，并采用Genome Walking的方法克隆得到了裂殖壶菌聚酮合酶（polyketidesynthase）pks3基因，并对该基因进行了氨基酸序列的分析和高级结构的预测。结果表明裂殖壶菌聚酮合酶（polyketide synthase）的pks3基因仅由一个外显子组成，开放阅读框全长为3693bp，编码1230个氨基酸，其氨基酸序列与GenBank中报道的pks3基因的氨基酸序列有81%的相似性,含有两个保守的活性域，分别是3－酮酰－ACP还原酶酶域（KR酶域）和脱水/异构酶酶域（DH酶域）。本文分别以这两个酶域为同源重组位点，以Zeocin抗性基因Ble基因为抗性筛选标记基因，构建了基因敲除载体，希望通过基因敲除的方法来研究pks3基因的功能。结果表明，电转化同源重组载体后，经过传代、筛选和鉴定得到了两株稳定遗传的pks3基因缺失的裂殖壶菌，分别是KR酶域缺失的转化菌株KR-和DH酶域缺失的转化菌株DH-。这两株转化菌在菌落形态、菌体大小等方面都与出发菌株OUC168有很大差别，并且生产速度缓慢、生物量低、DHA积累量几乎为0。据推测这种现象是由于裂殖壶菌pks3基因被缺失后，其DHA的合成代谢的终止不仅使得DHA不能积累，也使得细胞自身的代谢平衡被打破，直接影响了细胞的正常的生理活动，导致细胞生长迟缓，生物量大幅降低。本文对人工海水配方的优化为提高裂殖壶菌的生物量和DHA积累提供了新的方法；对pks3基因的克隆和功能研究为揭示裂殖壶菌的DHA合成途径和研究DHA合成相关酶的功能打下了基础。
左珊珊,林艳丽,张伟[6]（2012）在《DHA与EPA的研究进展》文中研究指明二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,22∶6n3,DHA）和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,20∶5n3,EPA）均属于n3类多不饱和脂肪酸（Polyunsatumted fatty acids,PUFAs）,能够在一定程度上预防和治疗糖尿病、类风湿性关节炎、自身免疫紊乱等疾病,对人体健康非常重要,因而受到越来越多的关注。本文对DHA与EPA的生理功能、合成机制及其在微藻和真菌中合成的研究现状进行了综述,并对利用转基因技术在哺乳动物体内生产EPA和DHA的前景进行了展望。
高媛媛,刘静,黄建忠[7]（2012）在《裂殖壶菌可溶性蛋白的提取及双向电泳方法的建立》文中研究指明裂殖壶菌Schizochytrium是目前用于商业化生产DHA的高产菌株之一。研究比对了多种裂殖壶菌可溶性蛋白的提取方法及纯化方式,并对IPG胶条的pH范围、胶条长度等双向电泳条件进行了优化。结果表明,裂殖壶菌可溶性蛋白的制备采用玻璃珠破碎结合TCA/丙酮沉淀的方法,并采用长度为24 cm,pH 3～10的IPG胶条进行等电聚焦效果最佳。并利用此电泳体系初步分析了37℃高温培养对裂殖壶菌可溶性蛋白表达的影响。
张东辉[8]（2012）在《球等鞭金藻Δ6脂肪酸去饱和酶基因的克隆、鉴定及橘林油脂酵母发酵条件的优化》文中指出多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids, PUFAs）具有调节血脂，抗肿瘤以及提高机体免疫力等一系列重要的生理功能。海洋微藻中富含PUFAs，但是利用海洋微藻生产多不饱和脂肪酸受环境影响较大，产量不稳。随着人们认识到多不饱和脂肪酸对人体的重要性以及多不饱和脂肪酸来源的日益短缺，许多研究者在尝试用基因工程技术来改变微生物体内脂肪酸的代谢途径，进而获得所需的多不饱和脂肪酸。球等鞭金藻（Isochrysis sphaerica）中的△6脂肪酸去饱和酶基因可以作为构建基因工程菌株的良好基因资源；油脂酵母可以作为与脂肪酸合成有关基因的表达宿主而且利用油脂酵母生产油脂具有生产周期短、成本低、容易大规模工业化生产等优势。本研究一方面以球等鞭金藻为实验材料，从中克隆△6脂肪酸去饱和酶基因并进行基因鉴定；另一方面以橘林油脂酵母（Lipomyces kononenkoae CICC1714）为实验材料，在摇瓶水平上对影响油脂积累的发酵条件进行了初步研究，为下一步将△6脂肪酸去饱和酶基因转化到油脂酵母中，组合高含油量和高不饱和脂肪酸两个特性奠定基础。具体取得的一些结果如下：（1）利用简并PCR、染色体步移以及RACE等方法，首次从球等鞭金藻中克隆到Δ6脂肪酸去饱和酶基因，命名为isfad6。isfad6全长1398bp，编码465个氨基酸。（2）将isfad6转入毕赤酵母（Pichia pastori）GS115中，经发酵培养后分析毕赤酵母重组子的脂肪酸组成。（3）以橘林油脂酵母（Lipomyces kononenkoae CICC1714）为实验材料，通过设计单因素实验，确定了摇瓶发酵培养的最佳产油条件为：氮源为硫酸铵，碳源为葡萄糖，培养温度28℃，接种量10%，初始pH值为7.0，最适碳氮比为99。优化后批次发酵的生物量为7.01g/L，油脂含量15.91%，油脂产量1.12g/L。经半连续发酵后最终的生物量为24.13g/L，油脂产量为3.06g/L，分别比原来增加了372%，363%。
李清[9]（2012）在《裂殖壶菌遗传转化体系的研究及其在DHA合成途径研究中的应用》文中研究表明二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一种极其重要的ω-3系列不饱和脂肪酸，具有抗心血管病、抗癌、降血脂、促进智力发育和保护视力等重要生理作用。裂殖壶菌（Schizochytrium）是一类类藻的海洋真菌，因其富含DHA，有重要的经济价值而备受关注。对裂殖壶菌DHA合成途径的研究将对提高裂殖壶菌的DHA含量有重要意义，因此本论文针对裂殖壶菌18S rDNA序列分析、遗传转化体系研究，克隆DHA合成相关基因并进行基因缺失等方面开展工作，为研究裂殖壶菌的DHA合成途径奠定基础。首先，本论文从裂殖壶菌Schizochytrium limacinum OUC88及以其为出发菌株经紫外诱变筛选的10个菌株中扩增出18S rDNA基因序列（序列长度为1751bp-1758bp），与GenBank中的18S rDNA序列比对分析。结果表明，S.limacinum OUC88以及10个派生菌株与同物种的Schizochytrium sp FJU-512（GenBank No.AY758384）、S. limacinum（GenBank No.AB022107）的同源性均在96%以上；与同属异种的S. mangrovei（GenBank No.DQ100293）只有93%的同源性。并通过计算遗传距离及构建系统进化树，结果显示种内诱变产生的细微变异小于同属内不同物种之间的变异，表明18S rDNA序列鉴定可作为诱变、转基因等基因工程育种后物种鉴定的有效方式。然后，作为建立遗传转化体系的基础，本论文研究Zeocin、两性霉素B（Amphotericin B）、G418、氯霉素（Cm）、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Km）、链霉素（Str）七种基因工程常用抗生素对裂殖壶菌Schizochytrium limacinum生长的影响。结果表明：S. limacinum对Zeocin最敏感，在2.5-4μg/ml Zeocin中成活率降至2.10-2.79%（P <0.01）；S. limacinum对两性霉素B、G418、氯霉素较敏感，在14-20μg/ml两性霉素B中的成活率降至5%以下（P<0.01），在140μg/ml G418中的成活率为2.08%（P<0.01），在25.5-68μg/ml氯霉素中成活率13%左右（P<0.05）；S. limacinum对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素不敏感，50-300μg/ml的氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素不能抑制其生长，成活率仍在80%以上（P>0.05）。本研究为裂殖壶菌基因工程筛选标记的选择提供了实验基础。随后，本实验参考NCBI的Genbank数据库中报道的pks基因序列，克隆了裂殖壶菌OUC168（S. limacinum OUC168）的pks1（3908bp）和pks2（4272bp）基因。采用Zeocin作为抗性筛选标记，构建带有Zeocin抗性基因和部分pks基因的载体（pTEF1/Zeo-pks1-U-D、pTEF1/Zeo-pks1-M-D、 pTEF1/Zeo-pks2-U-D、pTEF1/Zeo-pks2-M-D），分别以pks1基因和pks2基因作为同源重组位点，通过电转化，得到6株转化菌株，经Zeocin抗性基因扩增及Southern blotting证实裂殖壶菌pks基因已成功实现定点突变。6株转化菌株分别为：一株pks1基因中缺失2452bp的菌株（pTEF1/Zeo-pks1-U-D转化株，1④），两株pks1基因中插入Zeocin抗性基因的菌株（pTEF1/Zeo-pks1-M-D转化株，2③和2④），两株pks2基因中缺失2689bp的菌株（pTEF1/Zeo-pks2-U-D转化株，3①和3④）和一株pks2基因中缺失1143bp的菌株（pTEF1/Zeo-pks2-M-D转化株，4③）。由于基因缺失和插入突变，6株转化菌株与S. limacinum OUC168比较，形态变化很大，细胞很小，细胞内没有脂肪粒，有的有异味；生长速度变慢，其中2④基本处于不生长状态，发酵培养6天后生物量最多的不足S. limacinum OUC168的一半，少的仅有0.5g/L左右；6株转化菌株合成DHA的PKS途径被打断，发酵6天后总脂含量和DHA含量都基本为零。本论文为研究裂殖壶菌DHA合成的特殊的PKS途径，以及揭示DHA合成途径中某些关键酶基因的功能和表达打下基础，为采用基因工程方法从根本上提高DHA产量，改造裂殖壶菌提供一条新的途径。
刘静,高媛媛,江贤章,毛若雨,田宝玉,柯崇榕,吴松刚,黄建忠[10]（2010）在《低温胁迫对裂殖壶菌DHA生物合成及SOD表达的影响》文中研究表明培养温度对裂殖壶菌产油脂中二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）含量以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）表达水平均有重大影响。细胞干重测定和气相质谱联用法检测了不同温度下裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512的生长和脂肪酸组成,荧光定量PCR法比较各温度下SOD mRNA表达量。结果表明,低温有利于DHA的合成,低温胁迫下SOD mRNA表达量最高。探讨裂殖壶菌耐低温胁迫的机制可能是低温增加培养基中溶解氧水平,氧化应激造成SOD的高表达,加快活性氧自由基的清除,促进DHA等不饱和脂肪酸的积累,增强膜的流动性以适应低温环境。其次,从DHA高产菌株裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512 EST文库筛选出SOD基因,并应用生物信息学分析该氨基酸序列。
二、DHA高产菌Schizochytriumsp.FJU-512脂肪酸组成与18S rRNA基因序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DHA高产菌Schizochytriumsp.FJU-512脂肪酸组成与18S rRNA基因序列分析（论文提纲范文）
（1）高产DHA裂殖壶菌的诱变选育及转录组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸简介 |
| 1.2 DHA简介 |
| 1.2.1 DHA的性质 |
| 1.2.2 DHA的生理功能 |
| 1.2.3 DHA的市场应用及前景预测 |
| 1.2.4 DHA的来源 |
| 1.3 裂殖壶菌积累DHA的研究概况 |
| 1.3.1 裂殖壶菌简介 |
| 1.3.2 裂殖壶菌生产DHA的研究现状 |
| 1.3.3 裂殖壶菌中DHA积累机制与代谢调控研究 |
| 1.4 转录组分析 |
| 1.4.1 转录组学简介 |
| 1.4.2 转录组学在裂殖壶菌研究中的运用 |
| 1.5 课题的立题意义与主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器及设备 |
| 2.3 原始菌株 |
| 2.4 培养基组成 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 菌种保藏 |
| 2.5.2 菌种培养 |
| 2.5.3 生物量、葡萄糖、氨基氮的测定 |
| 2.5.4 油脂的提取 |
| 2.5.5 DHA含量的测定 |
| 2.5.6 呼吸参数测定 |
| 2.6 常压室温等离子诱变(ARTP) |
| 2.7 转录组分析 |
| 2.7.1 RNA测序及数据处理 |
| 2.7.2 测序数据分析 |
| 2.7.3 实时荧光定量PCR验证(RT-qPCR) |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 ARTP诱变提高裂殖壶菌DHA产量 |
| 3.1.1 原始菌株SR21 基本发酵特性研究 |
| 3.1.2 ARTP诱变时间的确定 |
| 3.1.3 筛选条件的确定 |
| 3.1.4 诱变选育 |
| 3.1.5 遗传稳定性分析 |
| 3.2 诱变菌株NA2 发酵工艺优化 |
| 3.2.1 原始菌株与诱变菌株分批发酵性能比较 |
| 3.2.2 补料分批发酵性能研究(流加碳源) |
| 3.2.3 补料分批发酵性能研究(同时流加碳源和氮源) |
| 3.2.4 不同培养条件下胞内油脂及DHA含量比较 |
| 3.3 诱变菌株NA2 高产DHA的机理分析 |
| 3.3.1 总RNA样品质量评估 |
| 3.3.2 测序数据质量评估 |
| 3.3.3 基因功能注释 |
| 3.3.4 基因差异表达 |
| 3.3.5 RT-qPCR验证 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）一株高产DHA菌株的筛选及其发酵条件优化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验菌种 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 松花粉垂钓法筛选高产DHA菌株[18] |
| 1.2.2 培养方法 |
| 1.2.3 菌体干重分析 |
| 1.2.4 脂类提取和甲酯化 |
| 1.2.5 DHA含量测定 |
| 1.2.6 葡萄糖质量浓度的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 裂殖壶菌分离 |
| 2.2 高产DHA菌株筛选 |
| 2.3 菌株ZR-01高产DHA的培养基和发酵条件优化 |
| 2.3.1 培养基优化 |
| 2.3.1. 1 碳源优化 |
| 2.3.1. 2 氮源优化 |
| 2.3.2 发酵条件优化 |
| 2.3.2. 1 最适发酵温度的选择 |
| 2.3.2. 2 初始p H的选择 |
| 2.3.2. 3 最适装液量的选择 |
| 2.4 10 L发酵罐发酵实验 |
| 3 结论 |
（3）裂殖壶菌发酵产DHA的优化及发酵补料方式的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 DHA 的简介 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的分类 |
| 1.1.2 DHA 的结构及理化性质 |
| 1.1.3 DHA 的生理作用 |
| 1.1.4 DHA 的传统来源 |
| 1.1.5 DHA 的微生物来源 |
| 1.2 多不饱和脂肪酸的检测 |
| 1.2.1 气相色谱法 |
| 1.2.2 高效液相色谱法 |
| 1.3 DHA 的分离纯化方法 |
| 1.3.1 低温结晶法 |
| 1.3.2 尿素包埋法 |
| 1.3.3 柱层析法 |
| 1.3.4 超临界流体萃取法 |
| 1.3.5 脂肪酶富集法 |
| 1.4 论文的立题依据和研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 复杂试剂的配制 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种保藏 |
| 2.2.2 种子液的制备 |
| 2.2.3 摇瓶培养 |
| 2.2.4 生物量的测定 |
| 2.2.5 油脂提取方法的建立 |
| 2.2.6 DHA 的检测 |
| 2.2.7 尿素包埋法富集 DHA |
| 2.2.8 高效液相色谱法进一步纯化 DHA |
| 2.2.9 S. limacinum JN168液态发酵产 DHA 的研究 |
| 2.2.10 S. limacinum JN1685 L 发酵罐实验 |
| 2.3 数据分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 S. limacinum JN168油脂的提取及 DHA 的纯化 |
| 3.1.1 S. limacinum JN168菌体油脂提取方法的研究 |
| 3.1.2 酸热法提取溶剂的选择 |
| 3.1.3 S. limacinum JN168脂肪酸组成分析 |
| 3.1.4 尿素包埋法富集 DHA |
| 3.1.5 高效液相色谱法进一步纯化 DHA |
| 3.2 S. limacinum JN168液态发酵产 DHA 的研究 |
| 3.2.1 S. limacinum JN168液态发酵的生长曲线 |
| 3.2.2 最佳接种时间的确定 |
| 3.2.3 S. limacinum JN168液态发酵产 DHA 碳源种类的选择 |
| 3.2.4 碳源浓度对 S. limacinum JN168发酵产 DHA 的影响 |
| 3.2.5 S. limacinum JN168液态发酵产 DHA 氮源种类的选择 |
| 3.2.6 氮源浓度对 S. limacinum JN168发酵产 DHA 的影响 |
| 3.2.7 碳氮正交试验 |
| 3.2.8 碳氮正交验证试验 |
| 3.2.9 氯化钠浓度对 S. limacinum JN168发酵产 DHA 的影响 |
| 3.2.10 常规无机盐对 S. limacinum JN168发酵产 DHA 的影响 |
| 3.2.11 三种常规无机盐的均匀设计寻优 |
| 3.2.12 验证试验 |
| 3.2.13 初始 pH 值对 S. limacinum JN168发酵产 DHA 的影响 |
| 3.2.14 装液量对 S. limacinum JN168发酵产 DHA 的影响 |
| 3.3 S. limacinum JN168流加发酵产 DHA 的研究 |
| 3.3.1 分批发酵 |
| 3.3.2 5 L 发酵罐初始糖浓度的确定 |
| 3.3.3 间歇补料发酵 |
| 3.3.4 恒速补料发酵 |
| 3.3.5 变速补料发酵 |
| 3.3.6 各种发酵结果的比较 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）裂殖壶菌OUC88及10个派生菌株18S rDNA基因克隆和分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 培养 |
| 1.2.2 总DNA的提取[8] |
| 1.2.3 18S r DNA的扩增和测序 |
| 1.2.4 序列分析和系统树的构建 |
| 1.3 对比序列 |
| 2 实验结果 |
| 2. 1 18S r DNA基因PCR扩增 |
| 2.2 18S r DNA基因序列分析 |
| 2.3 分子系统树的构建 |
| 3 分析与讨论 |
（5）裂殖壶菌人工海水配方优化及pks3基因功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 第一节 裂殖壶菌的研究概况 |
| 1、裂殖壶菌概述 |
| 2、裂殖壶菌的应用 |
| 第二节 n-3 多不饱和脂肪酸的研究进展 |
| 1、n-3 多不饱和脂肪酸的概述 |
| 2、n-3 多不饱和脂肪酸的生理功能 |
| 3、n-3 多不饱和脂肪酸的来源 |
| 3.1 高等生物体中 n-3 多不饱和脂肪酸的合成途径 |
| 3.2 微生物体中 n-3 多不饱和脂肪酸的合成途径 |
| （1）脂肪酸合成酶（FAS）途径 |
| （2）多不饱和脂肪酸（PUFA）合成酶途径 |
| 第三节 裂殖壶菌 DHA 合成途径的研究 |
| 第四节 研究基因功能的方法 |
| 1、基因功能的预测 |
| 2、基因功能的实验学验证 |
| 第五节 人工海水在裂殖壶菌培养中应用的可行性分析 |
| 第六节 论文研究意义和目的 |
| 第二章 人工海水配方优化及对裂殖壶菌 OUC007 生长和 DHA 含量的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1、材料 |
| 2、三种盐的浓度梯度设定 |
| 3、培养方法 |
| 4、测定指标及测定方法 |
| 第二节 结果与讨论 |
| 1、NaCl 浓度对 OUC007 生物量和 DHA 含量的影响 |
| 2、KH_2PO_4浓度对 OUC007 生物量和 DHA 含量的影响 |
| 3、FeSO_4·7H_2O 浓度对 OUC007 生物量和 DHA 含量的影响 |
| 4、正交实验设计 |
| 第三节 分析与总结 |
| 第三章 裂殖壶菌聚酮合酶（polyketide synthase）pks3 基因的克隆和分析 |
| 第一节 材料和方法 |
| 1、材料 |
| 2、实验方法 |
| 第二节 实验结果和分析 |
| 1、pks3 基因的 PCR 扩增结果 |
| 2、pks3 基因的测序结果 |
| 3、裂殖壶菌聚酮合酶（polyketide synthase）分子进化树的构建 |
| 4、裂殖壶菌聚酮合酶（polyketide synthase）高级结构预测 |
| 第三节 讨论 |
| 1、裂殖壶菌 pks 基因的克隆 |
| 2、pks3 基因中的重复序列 |
| 第四章 裂殖壶菌 pks3 基因中重要酶域功能的研究 |
| 第一节 材料和方法 |
| 1、材料 |
| 2、实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 1、基因重组载体的构建结果 |
| 2、基因敲除转化子阳性克隆筛选 |
| 3、转化菌株性状分析 |
| 第三节 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）DHA与EPA的研究进展（论文提纲范文）
| 1. DHA和EPA的生理功能及不良影响 |
| 1.1 DHA和EPA的生理功能 |
| 1.1.1 维护脑和视网膜的功能及延缓脑衰老: |
| 1.1.2 预防和治疗心脑血管疾病: |
| 1.1.3 抑制肿瘤生长: |
| 1.1.4 抗炎、抑过敏反应: |
| 1.2 DHA和EPA的不良影响 |
| 2. DHA和EPA的合成机制 |
| 2.1△4去饱和酶 |
| 2.2△5延长酶 |
| 3. 从微藻中获得DHA和EPA |
| 4. 真菌发酵生产DHA和EPA |
| 5. 展望 |
（7）裂殖壶菌可溶性蛋白的提取及双向电泳方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料与培养基 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌体发酵培养 |
| 1.2.2 可溶性蛋白样品制备 |
| 1.2.3 可溶性蛋白的双向电泳 |
| 1.2.4 图像采集与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 裂殖壶菌FJU-512可溶性蛋白的提取和除盐处理 |
| 2.2 IPG胶条pH范围的确定 |
| 2.3 IPG胶条长度的选择 |
| 2.4 温度对裂殖壶菌蛋白质成分的影响 |
| 3 讨论 |
（8）球等鞭金藻Δ6脂肪酸去饱和酶基因的克隆、鉴定及橘林油脂酵母发酵条件的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 PUFAs 的分类 |
| 1.3 PUFAs 的生物学功能 |
| 1.3.1 PUFAs 调节血压、血脂的功能 |
| 1.3.2 PUFAs 抗癌的功能 |
| 1.3.3 PUFAs 消炎的功能 |
| 1.3.4 PUFAs 影响细胞膜的功能 |
| 1.4 PUFAs 的实际应用 |
| 1.4.1 PUFAs 在奶粉中的应用 |
| 1.4.2 PUFAs 在鸡蛋中的应用 |
| 1.4.3 PUFAs 在饲料中的应用 |
| 1.5 PUFAs 的来源 |
| 1.5.1 PUFAs 的动物来源 |
| 1.5.2 PUFAs 的植物来源 |
| 1.5.3 PUFAs 的微生物来源 |
| 1.6 PUFAs 的代谢途径 |
| 1.7 脂肪酸去饱和酶简介 |
| 1.7.1 脂肪酸去饱和酶的概念 |
| 1.7.2 脂肪酸去饱和酶的种类 |
| 1.7.3 几种常见的脂肪酸去饱和酶 |
| 1.8 微生物油脂生产 |
| 1.8.1 油脂微生物 |
| 1.8.2 微生物油脂 |
| 1.8.3 影响微生物积累油脂的因素 |
| 1.8.4 微生物油脂制备过程 |
| 1.8.5 利用微生物生产油脂现状 |
| 1.9 本课题的研究意义和内容 |
| 第二章 球等鞭金藻△6 脂肪酸去饱和酶基因的克隆及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器和材料 |
| 2.2.1 菌种及相关载体 |
| 2.2.2 试剂及耗材 |
| 2.2.3 培养基及提取液 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 引物及测序 |
| 2.3 方法及步骤 |
| 2.3.1 球等鞭金藻的培养和前处理 |
| 2.3.2 球等鞭金藻总 DNA 的提取 |
| 2.3.3 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因核心区段的克隆 |
| 2.3.4 Δ6 脂肪酸去饱和酶结构基因全长序列的获得 |
| 2.3.5 利用 RACE 技术获得Δ6 脂肪酸去饱和酶 cDNA5’末端的编码序列 |
| 2.3.6 Δ6 脂肪酸去饱和酶全长 cDNA 序列克隆 |
| 2.3.7 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因在毕赤酵母中的表达 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因核心片段的克隆和序列分析 |
| 2.4.2 Δ6 脂肪酸去饱和酶结构基因全长的获得 |
| 2.4.3 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因鉴定 |
| 2.4.4 毕赤酵母重组子的鉴定 |
| 2.4.5 毕赤酵母重组子的脂肪酸成分气相色谱分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 橘林油脂酵母发酵条件的初步研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验用品及分析 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 实验药品 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 获取发酵种子 |
| 3.2.6 发酵条件优化 |
| 3.2.7 分析方法 |
| 3.3 发酵结果 |
| 3.3.1 接种量对橘林油脂酵母油脂积累的影响 |
| 3.3.2 温度对橘林油脂酵母油脂积累的影响 |
| 3.3.3 碳源对橘林油脂酵母油脂积累的影响 |
| 3.3.4 氮源对橘林油脂酵母油脂积累的影响 |
| 3.3.5 pH 值对橘林油脂酵母油脂积累的影响 |
| 3.3.6 碳氮比对橘林油脂酵母油脂积累的影响 |
| 3.3.7 验证实验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）裂殖壶菌遗传转化体系的研究及其在DHA合成途径研究中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述和立项依据 |
| 第一节 文献综述 |
| 1 裂殖壶菌的鉴定分类 |
| 2 裂殖壶菌 DHA 合成途径的研究进展 |
| 3 裂殖壶菌遗传转化体系的研究 |
| 第二节 本论文研究的立项依据及意义 |
| 第二章 裂殖壶菌 OUC88 及 10 个派生菌株 18S rDNA 基因克隆和分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 第三章 裂殖壶菌 OUC168 对七种抗生素的敏感性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 裂殖壶菌 pks 基因的克隆分析及其在 DHA 合成途径中的功能研究 |
| 第一节 裂殖壶菌聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)基因的克隆分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 第二节 裂殖壶菌同源重组载体构建 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 第三节 裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum OUC168）的转化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 第四节 转化菌株性状测定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 文章发表情况 |
（10）低温胁迫对裂殖壶菌DHA生物合成及SOD表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 DNA序列 |
| 1.1.3 培养基 (g/L) |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 温度对裂殖壶菌DHA含量的影响 |
| 1.2.2 荧光定量PCR法比较各温度下SOD mRNA表达量 |
| 1.2.2.1 SOD基因的筛选及确定 |
| 1.2.2.2 各温度下SOD mRNA表达量的差异比较 |
| 1.2.3 SOD蛋白序列的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 温度对裂殖壶菌DHA含量的影响 |
| 2.2 荧光定量PCR法比较各温度下SOD mRNA表达量 |
| 2.2.1 SOD基因的筛选及确定 |
| 2.2.1.1 同源基因的搜索 |
| 2.2.1.2 全长基因的克隆测序及目标序列的确定 |
| 2.2.2 各温度下SOD mRNA表达量的差异比较 |
| 2.3 SOD蛋白序列的生物信息学分析 |
| 2.3.1 蛋白质结构分析 |
| 2.3.1.1 理化表征分析 |
| 2.3.1.2 蛋白质活性结构域预测 |
| 2.3.1.3 空间结构预测 |
| 2.3.2 蛋白质疏水分析 |
| 2.3.3 进化树分析 |
| 3 讨论 |
四、DHA高产菌Schizochytriumsp.FJU-512脂肪酸组成与18S rRNA基因序列分析（论文参考文献）
- [1]高产DHA裂殖壶菌的诱变选育及转录组分析[D]. 龚定芳. 江南大学, 2019(12)
- [2]一株高产DHA菌株的筛选及其发酵条件优化[J]. 任良栋,许团辉,徐权汉,刘思喜,夏伟,张浩. 中国油脂, 2016(05)
- [3]裂殖壶菌发酵产DHA的优化及发酵补料方式的研究[D]. 周立树. 江南大学, 2014(02)
- [4]裂殖壶菌OUC88及10个派生菌株18S rDNA基因克隆和分析[J]. 李清,臧晓南,张学成,宋晓金,杨青. 海洋科学, 2014(01)
- [5]裂殖壶菌人工海水配方优化及pks3基因功能的初步研究[D]. 侯盼. 中国海洋大学, 2013(03)
- [6]DHA与EPA的研究进展[J]. 左珊珊,林艳丽,张伟. 中国生物制品学杂志, 2012(11)
- [7]裂殖壶菌可溶性蛋白的提取及双向电泳方法的建立[J]. 高媛媛,刘静,黄建忠. 药物生物技术, 2012(04)
- [8]球等鞭金藻Δ6脂肪酸去饱和酶基因的克隆、鉴定及橘林油脂酵母发酵条件的优化[D]. 张东辉. 中国农业科学院, 2012(10)
- [9]裂殖壶菌遗传转化体系的研究及其在DHA合成途径研究中的应用[D]. 李清. 中国海洋大学, 2012(03)
- [10]低温胁迫对裂殖壶菌DHA生物合成及SOD表达的影响[J]. 刘静,高媛媛,江贤章,毛若雨,田宝玉,柯崇榕,吴松刚,黄建忠. 药物生物技术, 2010(01)