一、ANALYSIS OF TYPE I AND TYPE Ⅱ CYTOKINES PROFILE OF LYMPHOCYTE IN PLEURAL EFFUSION OF NON SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS（论文文献综述）
Raymond C-F Yuen,Shiu-Ying Tsao[1]（2021）在《Embracing cancer immunotherapy with vital micronutrients》文中研究说明Immunotherapy is now commonly prescribed to cancer patients, but autoimmune-related adverse events are considerable. For severe, life-threatening side effects, cessation of therapy seems unavoidable, let alone intensive medical care required for patching up the adverse events. Even without serious adverse events, the response rates are too low and various combinatory regimens have been tried. However, toxicities are also added on, unless the adjuvant agents have remarkably few side effects. Actually, micronutrients are usually taken by a majority of cancer patients as nutritional support or to boost the immune function, let alone hoping to counteract treatment side effects. Recent studies have shown that combinations of micronutrients exert pleiotropic effects in controlling tumor growth and metastasis by modulating the tumor microenvironment, enhancing gut microbiota immune functions, and providing adjunct nutritional support to micronutrient deficient cancer patients. A higher than recommended dietary allowance micronutrient dose is proposed to reduce the toxic free radicals generated as a result of immunotherapy and tumor metabolism. This is not only helpful for managing treatment side effects but also enhancing treatment efficacy. As micronutrient supplementation is also useful to improve patients’ quality of life, prolong survival, and sustain compliance to immunotherapy, further investigations are mandatory.
MUHAMMAD ISHFAQ[2]（2021）在《黄芩苷通过调控NLRP3-自噬通路和能量代谢干预鸡毒支原体诱导的炎症反应机制》文中提出鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）属于柔膜菌纲类,是无细胞壁并能够进行胞外自我复制的最小微生物。MG是导致鸡慢性呼吸系统疾病的主要病原体,可引起鸡采食量减少,体重减轻,产蛋量下降,并导致雏鸡死亡。目前多用大环内酯类和氟喹诺酮类药物治疗,但存在产生细菌耐药性和药物残留等问题,故开发用于防治MG感染的安全有效药物尤为重要。黄芩苷（Baicalin）为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的主要成分,属黄酮类化合物,具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗惊厥、抗氧化、保肝和神经保护等多种药理作用,前期实验室研究已证明黄芩苷对MG感染具有良好的保护作用,但其潜在的分子作用机制仍不清楚。本文拟利用鸡MG感染模型和鸡巨噬细胞（HD11细胞）感染模型进行黄芩苷通过调控NLRP3-自噬通路和能量代谢干预MG诱导的炎症反应机制研究,旨在为其临床应用提供理论依据。（1）黄芩苷通过调控NLRP3-自噬通路减轻MG诱导的HD11细胞氧化应激和炎症反应的研究经CCK-8试验确定,以MG 400 MOI浓度作用6 h作为构建HD11细胞MG感染模型的最佳剂量和作用时间,选择50、100和150μg/m L浓度的黄芩苷进行后续试验。ELISA结果显示,MG感染组氧化应激指标,如MDA、LDH、GSH-Px、CAT和ROS等含量发生明显改变,而黄芩苷处理组可明显恢复这些酶的正常水平。病理组织学观察发现,与正常对照组相比,MG感染组细胞脱落,胞体收缩,线粒体和细胞损伤,核膜消失,而黄芩苷处理组这些异常的病理结构变化减轻,并能够阻止MG感染对细胞线粒体膜电位（ΔΨM）的破坏。ELISA检测结果显示,MG感染组细胞炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-18活性增加,而黄芩苷组则呈剂量依赖性降低这些因子的活性。q RT-PCR检测结果显示,与正常对照组相比,MG感染组细胞TLR-2A、NF-κB、MYD88、TNF-α、Cox-1、Cox-2、caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18的m RNA表达均升高（p<0.05）。与MG感染组相比,黄芩苷处理组这些基因的m RNA表达明显降低。Western blot检测结果显示,MG感染HD11细胞后,TLR-2、p-p65、p-IKB-α、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表达显着增加,而黄芩苷呈剂量依赖性降低这些蛋白的表达。此外,黄芩苷干预也可降低IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-18的活性。同时,本实验对黄芩苷的自噬通路进行了研究,q RT-PCR和Western blot检测结果显示,MG感染组细胞的雷帕霉素靶蛋白（m TOR）的m RNA和蛋白表达降低,Beclin-1、自噬相关基因ATG-7、微管相关蛋白1轻链3（MAP1-LC3）、ATG-5和Unc-51样自噬激活激酶（ULK-1）的m RNA或蛋白表达升高。与MG感染组相比,黄芩苷处理组m TOR m RNA和蛋白水平恢复,并呈剂量依赖性增强Beclin-1、ATG-7、MAP1-LC3、ATG-5、ULK-1的m RNA表达和ATG-5、P62蛋白表达。以上结果证明了黄芩苷可通过调控NLRP3-自噬通路减轻MG诱导的HD11细胞氧化应激和炎症反应。（2）黄芩苷通过恢复能量代谢减轻MG致鸡肺脏炎症和凋亡的作用研究将7日龄来航鸡随机分为对照组、MG感染组（1×109 CCU/m L,0.2 m L,左侧气囊注射接种）,黄芩苷单独给药组（450 mg/kg）和黄芩苷治疗组（MG感染+450 mg/kg黄芩苷）。治疗7 d后收集血清、肺脏、胸腺和法氏囊（BOF）样品进行实验分析。经ELISA测定,MG感染组鸡血清中TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β活性升高（p<0.05）,而黄芩苷可降低这些炎性因子的活性。HE组织病理学检查显示,MG感染的鸡肺部可见炎性细胞浸润,中性粒细胞增多,肺泡壁增厚和出血,超微结构分析显示线粒体肿胀,核固缩,膜破裂。而黄芩苷治疗这些异常病理变化明显减轻。q RT-PCR和Western blot检测结果显示,与对照组相比,MG感染组肺脏TLR-2A、NF-κB、MYD88、IL-6、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（i NOS）、前列腺素E2受体2（PTGE）、IFN-γ、Cox-1、Cox-2的m RNA表达均增强（p<0.05）,NF-κB、IL-6和IL-1β的蛋白表达增强（p<0.05）。与MG感染组相比,黄芩苷治疗组炎症相关基因m RNA和蛋白表达水平均降低。TUNEL检测显示,MG感染组较对照组凋亡细胞阳性染色核数量明显增加（p<0.05）,而黄芩苷干预后阳性核数量显着减少（p<0.05）。同时,MG感染鸡Mg2+-ATPase,Ca2+ATPase,Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性显着下降（p<0.05）,能量代谢相关基因如磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）、乌头酸酶2（ACO2）、己糖激酶1（HK）1、HK2、琥珀酸脱氢酶复合体B（SDHB）、乳酸脱氢酶（LDH）A和LDHB基因的m RNA表达下降（p<0.05）。另外,除ACO2外,PK、PFK、HK1和HK2的蛋白表达量显着降低（p<0.05）。而黄芩苷治疗组可显着恢复Mg2+-ATPase、Ca2+ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及PFK、PK、ACO2、HK1、HK2、SDHB、LDHB、LDHA的m RNA表达量和PFK、PK、HK1、HK2的蛋白表达量。以上结果证明了黄芩苷可通过恢复能量代谢减轻MG导致的鸡肺脏炎症和凋亡。（3）黄芩苷通过Nrf2/HO-1保护通路减轻MG致鸡胸腺氧化应激和凋亡的作用研究经EILSA测定,MG感染组鸡胸腺组织中SOD、CAT和GSH-Px活性显着降低（p<0.05）,MDA含量和γ-谷氨酰基转移酶（γ-GT）活性显着提高（p<0.05）,而与MG感染组比,除GSH-Px活性外,黄芩苷治疗组显着恢复CAT、SOD、MDA和γ-GT活性的变化。HE组织病理学检查显示,MG感染组胸腺细胞炎症细胞浸润增加,可见核碎片,并有少量空泡,超微结构检查显示线粒体肿胀、核固缩、细胞损伤等凋亡特征,而黄芩苷治疗组这些异常的形态学和超微结构改变部分消失。经ELISA检测,MG感染组胸腺TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8活性均高于对照组,而黄芩苷治疗组可减轻MG诱导的这些炎性因子的活性升高。q RT-PCR检测结果显示,与对照组相比,MG感染组凋亡基因p53、细胞色素C、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的m RNA表达水平显着升高（p<0.05）,Bcl-2的m RNA表达水平显着降低（p<0.05）。而黄芩苷治疗组以上基因的m RNA异常表达得到明显改善,这些基因的Western blot蛋白表达结果相同。更重要的是,黄芩苷能有效调控Nrf2/HO-1通路相关基因Nrf2、NAD（P）H醌脱氢酶1（NQO1）、血红素加氧酶1（HO-1）和谷胱甘肽s-转移酶A2（GSTA2）的m RNA和蛋白表达。以上结果证明了黄芩苷可通过Nrf2/HO-1保护通路减轻MG诱导的鸡胸腺氧化应激和凋亡。（4）黄芩苷通过调控细胞自噬减轻MG对鸡法氏囊的免疫损伤及抑制炎症和凋亡作用的研究组织病理学检查发现,MG感染组的鸡法氏囊出现淋巴细胞浸润和间质细胞增多,线粒体肿胀,线粒体嵴断裂,而黄芩苷治疗组法氏囊的上述异常病理和超微结构改变得到部分改善。q RT-PCR和Western blot检测结果显示,与对照组相比,MG感染组法氏囊NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白表达水平均升高（p<0.05）,而与MG感染组相比,黄芩苷显着抑制NF-κB通路相关基因的m RNA和蛋白表达（p<0.05）,并降低MG引起的TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β活性升高。与对照组相比,MG感染组的Bax、p53和细胞色素C的m RNA表达显着增强（p<0.05）,Bcl-2 m RNA表达显着降低（p<0.05）。同样,除Bcl-2外,Bax、p53和细胞色素C蛋白表达水平显着增加（p<0.05）。而与MG感染组相比,黄芩苷可显着减轻法氏囊组织中凋亡相关基因m RNA和蛋白表达水平的变化,并减少阳性染色的凋亡细胞核数量。此外,MG感染显着降低法氏囊组织中MAP1-LC3、ATG5、F-actin、Dynein、α-tubulin和Beclin-1的m RNA表达（p<0.05）,使m TOR的m RNA和蛋白表达显着升高（p<0.05）,Beclin-1和ATG5蛋白表达水平降低（p<0.05）,也显着提高了鸡法氏囊组织中动力相关蛋白1（DRP1）和线粒体分裂因子（Mff）蛋白的表达,视神经萎缩1（Opa1）蛋白表达降低。而黄芩苷治疗后明显恢复了上述自噬和线粒体动力学相关基因的m RNA和蛋白表达。同时,MG感染也显着降低了鸡法氏囊中CD8+细胞的数量,而与MG感染组相比,黄芩苷明显可以恢复CD8+细胞的数量,表明黄芩苷可通过恢复法氏囊组织中CD8+细胞的数量来减轻线粒体动力学功能障碍和免疫损伤。综上所述,本研究结果表明黄芩苷可保护鸡巨噬细胞、肺脏、胸腺和法氏囊组织的结构完整性,有效抑制MG感染导致的组织和细胞氧化应激、炎症及凋亡,并保护线粒体和能量代谢功能。同时,黄芩苷可通过激活Nrf2信号通路,抑制NLRP3炎性小体和TLR-2-NF-κB信号通路激活自噬来保护组织细胞,进而发挥抗MG感染的作用。本研究可为寻找和开发对抗MG感染的靶标药物提供新策略,并为黄芩苷在兽医临床的推广应用提供理论依据。
祁永浩[3]（2018）在《TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤新靶点的分子机制研究》文中认为肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）具有独特的生物学功能和结构特异性。它还在人体免疫系统,肿瘤发生和细胞转移中发挥重要作用。TRAF6不仅调节TNFR超家族的细胞内信号转导,而且介导IL-1/TLR超家族信号转导。TRAF6的RING结构域具有E3连接酶活性,能够导致AKT和TAK1两者的活化并促进细胞存活,同时TRAF6的ZINC结构为RING结构域的活性提供了重要的结构支持。另一方面,TRAF6的C末端结构域已被证明主要参与免疫信号转导,并且在调节先天免疫,适应性免疫,应激反应和炎症反应方面至关重要。因此,筛选可与TRAF6特异性相互作用的小分子化合物有助于发现不影响TRAF6的免疫功能的新型抗癌靶标。在这项研究中,选择TRAF6的RING结构域作为开发新的化学治疗剂的作用靶点并且通过体内和体外实验探究其抗肿瘤活性。通过计算机辅助的虚拟筛选,我们发现了天然存在的金鸡纳生物碱可以与Ubc13竞争性结合TRAF6的RING结构域。MTT实验检测发现这些天然产物能够抑制肿瘤细胞的增殖,并且流式细胞术进一步证明它们可以诱导肿瘤细胞的早期凋亡。Western blot和免疫沉淀实验检测TRAF6介导的信号通路,验证这些化合物能抑制AKT和TAK1的激活,进而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达同时促进促凋亡蛋白Bax的表达。此外,动物实验表明,在体内化合物刺激的小鼠的肿瘤增殖率显着低于未刺激组。TUNEL染色结果显示,化合物刺激组的TUNEL阳性细胞多于未刺激组。同时,通过T淋巴细胞亚群和细胞因子的检测分析,我们发现金鸡纳碱化合物可以促进TNF-α,IFN-γ和IgG的分泌,并且不会对CD4+T/CD8+T的比值产生明显的影响,从而说明了金鸡纳碱化合物在诱导肿瘤细胞凋亡的同时不影响TRAF6的C末端结构域,反而增强抗肿瘤免疫性。最后,我们选择金鸡纳碱代表化合物辛可宁,设计合成了一种荧光标记的辛可宁和阻滞活性羟基的辛可宁衍生物。此外,我们还构建了低表达TRAF6的细胞系。免疫荧光实验显示荧光标记的辛可宁可以与细胞中的TRAF6结合,从而验证辛可宁自身与TRAF6的结合。MTT实验结果表明,阻滞羟基活性的辛可宁对细胞增殖的影响明显低于正常辛可宁。最后,低表达TRAF6水平的细胞对这些生物碱的敏感性明显低于正常细胞。这些研究共同表明,天然存在的金鸡纳生物碱可以阻断TRAF6与Ubc13的结合来抑制肿瘤细胞的生长并且对与TRAF6的C端结构域的活性有关的免疫应答具有最小的影响。研究阐明了TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤靶点的可能性,为抗癌新药研发提供坚实的理论基础,为肿瘤的靶向治疗开辟新途径。
周霞[4]（2018）在《HLA遗传多态性与MDR/RR-TB和HIV易感性的关联研究及其在新型结核诊断肽筛选中的应用》文中研究表明研究背景:人免疫缺陷病毒感染（HIV）及其引起的获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的流行、耐多药/利福平耐药结核（MDR/RR-TB）的传播已成为导致世界范围内结核疫情复燃及蔓延的重要原因。而个体是否容易罹患AIDS或MDR/RR-TB,除与病原体传播有关,还与宿主是否携带易感基因有关。来自世界各地的研究表明,HIV或TB感染及其疾病进展的宿主遗传易感性部分取决于人类白细胞抗原（HLA）系统。TB/HIV双重感染对结核诊断构成了巨大的挑战,由于艾滋病继发的严重免疫缺陷,易使现有结核诊断方法,甚至以ESAT-6和CFP-10作为反应刺激物的结核感染IFN-γ释放实验呈假阴性。研究目的:研究一调查湖北汉族人群中耐多药/利福平耐药结核病（MDR/RR-TB）患者的人类白细胞抗原（HLA）A、B、DRB1位点的高分辨率等位基因和单体型频率的分布特征,并与同一地区药物敏感结核病（DS-TB）患者相比较,拟发现HLA-A、B、DRB1等位基因及其单体型与耐多药/利福平耐药结核（MDR/RR-TB）易感性的关系。研究二调查华中地区HIV/AIDS人群HLA-A、B、C位点的高分辨率等位基因的分布特征,以筛选HIV/AIDS人群经典MHC-Ⅰ高频分子（MHC-Ⅰa）,利用高频率MHC-Ⅰa限制性表位筛选针对该群体的结核分枝杆菌特异性刺激抗原肽,刺激结核特异性CD8+细胞分泌IFN-γ,以提高HIV/AIDS人群结核感染的早期诊断率。研究方法:在第一项研究中,我们抽取来自湖北汉族人群的174例耐多药/利福平耐药结核病患者（观察组）和838例药物敏感结核病患者（对照组）的血样,使用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针（PCR-SSOP）技术进行4位数HLA-A、B、DRB1等位基因分型,比较两组间HLA-A、B、DRB1等位基因和单体型频率。使用Arlequin ver 3.5软件分析两组HLA-A、B、DRB 1等位基因和单体型的频率,使用Epi Info 7软件和SPSS22.0软件分析两组间HLA等位基因的差异。第二项研究分以下2步进行:1.HIV/AIDS人群MHC-Ⅰa高频分子的筛选:将424名HIV-1感染者作为研究对象,以836名同一地区HIV阴性健康人群为对照,采用PCR-SSOP及PCR-SBT技术进行HLA-A、B、C等位基因的基因分型。使用Arlequin ver3.0软件分析两组HLA-A、B、C等位基因和单体型的频率,使用Epi Info 7软件和SPSS18.0软件分析华中地区HIV/AIDS人群的经典Ⅰ类人类白细胞抗原（HLA-A、B、C）等位基因分布特点,确定该人群经典MHC-Ⅰ高频分子。2.以结核分枝杆菌差异区（region of differences,RD）编码蛋白为候选抗原,通过计算机软件预测候选抗原上与HIV/AIDS人群MHC-Ⅰa高频分子高度亲和的表位。人工合成含HIV/AIDS人群经典MHC-Ⅰ高频分子高亲和力表位的多肽作为刺激原,以培养证实的结核病患者去除CD4+、CD56+细胞的外周血单个核细胞（PBMC）为阳性样本,以有BCG接种史的健康对照的外周血单个核细胞（PBMC）为阴性样本,进行IFN-γELISpot,选择对TB样本有刺激效应且对健康对照无刺激效应的多肽。用筛选所得混合多肽池为IGRA试剂,与重组结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6-培养滤液蛋白10融合抗原（recombinant fusion protein of early secretory antigenic target 6 k Da and culture filtrate protein10 k Da,r ESAT6/CFP10）比较在HIV感染人群中的灵敏度和特异度,以验证CD8抗原肽是否能提高r EAST6/CFP10刺激TB/HIV患者外周血IFN-γ释放反应率及强度。研究结果:研究一,对所测数据进行统计分析显示,对照组的所有位点均不偏离哈迪-温伯格平衡（HWE）。多因素Logistic回归分析显示,除年龄较大（p<0.0001;OR=10.9,95%CI 7.6–15.8）、既往治疗史（p<0.0001;OR=11.0,95%CI 7.2–16.7）和治疗依从性差（p<0.0001;OR=12.9,95%CI 8.4-20.0）外,等位基因DRB1*08:01（p<0.0001;OR=174.5,95%CI 15.3–1987.2）是MDR/RR-TB的独立预测因子。而在初治结核病例亚组中,DRB1*08:01（p<0.0001;OR=80.3,95%CI 7.0-917.1）和年龄较大（p<0.0001;OR=3.9,95%CI 2.4-6.4）是原发MDR/RR-TB的独立易感因素。研究二,首先测得华中地区HIV/AIDS人群MHC-Ⅰa高频分子为HLA-A*11:01（27.7%）、HLA-B*46:01（16.7%）、HLA-A*24:02（15.6%）、HLA-A*02:07（14.2%）、HLA-B*40:01（12.7%）、HLA-C*12:02（10.7%）、HLA-C*03:04（9.4%）、HLA-A*02:01（9.0%）、HLA-C*07:02（8.0%）、HLA-B*13:01（7.5%）、HLA-A*33:03（6.6%）、HLA-C*07:01（5.8%）、HLA-C*03:01（5.5%）、HLA-C*04:05（5.3%）、HLA-B*58:01（5.3%）,通过调整年龄和性别混杂因素后的多因素Logistic回归分析显示,HIV-1阳性组的HLA-A*02:06、HLA-B*15:01等位基因亚型频率高于HIV-1阴性组。然后,利用网络表位预测工具Net MHCpan3.0服务器预测并筛选与HIV感染人群MHC-Ⅰa高频分子高度亲和的免疫优势表位,并通过体外筛选试验,最终获得8个重叠多肽池,Rv0222176-191、Rv1980c122-138、Rv1985c105-120、Rv3425141-165、Rv3873133-151、Rv3873158-166、Rv387878-86、Rv3879c673-690,可刺激结核患者外周血CD8+T淋巴细胞产生γ干扰素,但对健康对照外周血单个核细胞无刺激效应。在检测25例TB/HIV双重感染血样时,由这8个重叠多肽池混合而成的IGRA刺激剂（CP）的灵敏度与r ESAT6/CFP10（EC）的灵敏度均较低（68%vs 48%,p>0.05）,但二者共同作为IGRA刺激剂（CP+EC）时灵敏度达92%,显着高于r ESAT6/CFP10（χ2=11.5238,p=0.00068）,且不影响特异性。结论:研究一,推证了人类自身遗传因素中HLA基因多态性影响个体对MDR/RR-TB的易感性。我们的研究结果表明,综合结核病患者的临床和宿主遗传信息可能有助于MDR/RR-TB的预测和早期发现。研究二,根据HIV/AIDS人群HLA-A、B、C等位基因分布特点筛选出来的经典MHC-Ⅰ限制性结核抗原肽,有提高IGRAs在HIV/AIDS人群中的结核感染检测灵敏度的潜力。
王逢源[5]（2018）在《慢性肺部烟曲霉菌丝感染小鼠模型的建立及免疫反应的研究》文中指出背景及目的烟曲霉（Aspergillus fumigatus,A.fumigatus）是一种广泛存在于我们生活环境中重要致病菌,可以引起人类、畜及禽类的感染,最常见的感染是肺部感染。A.fumigaius可以产生分生孢子,直径只有2-3μm,被吸入肺部后,可到达肺泡,随后出芽,产生菌丝,侵犯肺组织。肺部感染可因宿主免疫状态、肺部疾病状况、吸入烟曲霉总量及频率的不同,产生不同类型的感染,如侵袭性曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillosis,IA）、慢性肺曲霉菌病（chronic pulmonary aspergillosis,CPA）、变应性支气管肺曲霉菌病（allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA）等。其中,IA及ABPA已有较多研究,其发病机制及治疗方法也比较明确,而由于缺少动物模型,CPA的发病机制及治疗手段研究较少。CPA主要发生于免疫力正常但有基础肺病（肺结核）或有轻度免疫力下降的患者。CPA死亡率非常高,已成为全球范围内威胁人类健康的疾病。因此,建立CPA的动物模型势在必行。之前已有学者尝试着建立CPA的模型,他们通过将包裹在琼脂球中的A.fumigatus孢子接种至小鼠肺部,使之不易被清除,建立了长达28天的肺部烟曲霉感染模型。然而,在这个模型中,包裹在琼脂球中的烟曲霉无法与免疫细胞进行充分的接触,且琼脂本身可引起肺部的免疫反应,这两点使得他们所检测的免疫反应出现较大的偏差。在2015年,我们实验室曾经从一名有肺结核病史的CPA患者肺组织中分离出了一株不产孢、只有菌丝形态的烟曲霉。此外,由于在CPA病程中,A.fumigatus也主要是以菌丝形态慢性定植于小鼠肺部,因此建立肺部A.fumigatus菌丝慢性定植的动物模型,对于研究CPA的发病机制及治疗手段的评价具有重要参考意义。此外,既往有研究证明,A.fumigatus孢子及菌丝形态可引起不同的免疫反应,但是研究结果具有较大争议。因此,我们将建立肺部A.fumigatus菌丝的慢性定植模型来模拟人类CPA。另外我们以小鼠肺部A.fumigatus的孢子感染为对照,研究A.fumigatus孢子及菌丝引起不同的固有免疫及适应性免疫反应。实验方法本研究用绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）标记A.fumigatus标准菌株Af293,并将其制作成为直径在150-250 u m的结构紧密的菌丝球,接种至免疫力正常的小鼠肺部,并通过小鼠肺部活体成像、小鼠肺部病理（PeriodicAcid-Schiff stain,PAS染色）及小鼠肺部真菌负荷检测Af293在小鼠肺部存留时间,判断小鼠是否为慢性感染。同时监测小鼠体重变化,及一般情况变化,如大小便性状变化、毛发变化、肺部症状。利用流式细胞仪检测小鼠肺部A.fumigatus孢子及菌丝形态感染引起的不同免疫反应。实验结果1.GFP 标记 Af293 菌株（Af293-GFP）将GFP基因序列转染至Af293菌株的基因序列中,使Af293菌株带有明亮的绿色荧光,且在小鼠体内28天不会淬灭。2.Af293-GFP菌丝球的制作将Af293-GFP菌丝制作成为结构紧密的菌丝球,其直径为150-250 μm。3.小鼠肺部Af293-GFP分布在对照组,小鼠肺部无荧光;在肺部感染孢子组,小鼠肺部在感染后第1,7天可见绿色荧光,7天之后无荧光;在肺部感染菌丝球组,小鼠肺部在感染后1,7,14,21及28天均可见绿色荧光:在感染后第1天及第7天,小鼠肺部荧光较强;从第14天至21天,小鼠肺部荧光一直较弱;而在感染后第28天,小鼠肺部荧光明显强于第14天及第21天,且荧光明显变得弥散。4.小鼠肺部病理结果（PAS染色）在孢子感染组,感染后第1天,病理结果可见烟曲霉Af293孢子被巨噬细胞吞噬;感染后第7天,病理结果显示气管腔内大量品红色气管分泌物;感染后14、21及28天,小鼠病理结果均未见明显异常。在菌丝球感染组,菌丝可在小鼠肺部存留长达28天。在小鼠感染菌丝球后第1天,大量的中性粒细胞及巨噬细胞均被募集至感染区;在感染后第7天,气管腔内的菌丝球生长为较大的菌丝块,充满支气管管腔,菌丝块内有大量的中性粒细胞及巨噬细胞浸润;在感染后第14、21天,管腔内大部分烟曲霉菌丝已被清除,且气管腔壁已被破坏,感染区被大量巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞包饶;感染后第28天,感染区为大量中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润,肺部出现实变。各个时间点感染病灶局限,均未见菌丝侵袭肺间质及肺部血管。这与人类CPA病理表现相类似。5.小鼠肺部真菌负荷在孢子感染组,小鼠肺部真菌负荷逐渐减少。在菌丝球感染组,小鼠肺部真菌负荷在感染后第1天及第7天几乎维持不变,表明了小鼠肺部烟曲霉在被炎症细胞吞噬的同时,也有一定的生长;在感染后第14、21天,小鼠肺部真菌负荷维持不变,但相较于第7天明显下降;而在感染后第28天,小鼠肺部真菌负荷有了较大的增长,表明了小鼠肺部真菌感染出现了复燃,这与人类CPA具有高复发率相吻合。6.小鼠体重变化及一般情况观察未感染组、孢子感染组及菌丝球感染组的小鼠体重变化趋势无明显差异。三组小鼠均未出现大小便性状变化、皮毛杂乱及喘息等呼吸道症状。此外,三组小鼠在接种24小时之后,均未出现死亡。7.固有免疫研究结果固有免疫主要探究了巨噬细胞及中性粒细胞在烟曲霉感染中的作用。在孢子感染组,接种后支气管腔内出现大量巨噬细胞及少量的中性粒细胞,且在感染后第7天,两种细胞数量达到最大值,之后则逐渐降低。在管腔周围,整个感染过程中均未见巨噬细胞及中性粒细胞浸润,而在感染后第28天,管腔周围有少量淋巴细胞浸润。在菌丝球感染组,感染后支气管腔内聚集有大量巨噬细胞及中性粒细胞,且在感染后第7天数量达到最大值,随后逐渐降低。在管腔周围,同样有大量巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞浸润。其中,巨噬细胞及淋巴细胞在感染后第1天数量达到最大值,其后即逐渐下降。而中性粒细胞数量在感染后第7天达到顶峰,其后逐渐下降。8.适应性免疫研究结果在孢子感染组,Th1、Th2及Th17细胞数量均从感染后第1天开始增加,至第7天达到最大值,之后逐渐下降,但仍高于未感染组。这与既往研究结果不相符,而从感染后第1天至第21天,孢子感染组Treg细胞均高于未感染组。在菌丝球感染组,在整个感染过程中,Th1细胞均未见升高,而Th2及Th17细胞在感染后第7天有一过性的升高,后逐渐降低。Treg细胞在感染后第1天即升高,在第7天达到最大值,随后逐渐降。结论本研究建立了一个肺部A.fumigatus菌丝慢性定植的小鼠模型来模拟人类CPA,为研究CPA的发病机制及新的治疗方法提供了动物模型,也为不产孢烟曲霉引起的CPA的研究提供了动物模型。此外,此研究也探讨了烟曲霉孢子及菌丝引起的不同的免疫反应。
张健[6]（2015）在《抗结核治疗对结核性胸膜炎巨噬细胞的作用及机制》文中指出目的：结核性胸膜炎在肺外结核病中占有很大比例，在其所处的免疫微环境可观察到典型的由巨噬细胞诱导的迟发型超敏反应。巨噬细胞在机体抗结核分枝杆菌感染的免疫反应中发挥重要作用，它是机体抗结核杆菌感染的首要防线，同时亦是结核菌在宿主体内长期寄生的场所。巨噬细胞的功能状态与结核病的发生、发展及转归密切相关。目前，临床仍采用标准四联疗法治疗结核病，对药物的抗菌作用及机制研究已很深入及明确，然而药物对免疫细胞尤其对巨噬细胞的功能是否存在调节，目前研究并不深入。有限的研究仅停留在以动物实验、人巨噬细胞的体外实验、以及人外周血为观察对象的间接证据上，缺少针对人体结核病灶微环境进行的系统阐述。鉴于此，本研究拟通过对结核性胸膜炎患者经抗结核治疗后胸膜巨噬细胞表型、功能与基因型的检测，以及体外药物对胸膜巨噬细胞的直接刺激，观察胸膜巨噬细胞的上述变化，探讨四种抗结核药物对巨噬细胞产生的直接作用及调节机制，进而阐明巨噬细胞在结核病治疗中发挥的作用及机制，如能明确其作用靶点，可为结核性胸膜炎的治疗及转归提供重要的理论依据，对结核病化疗方案的调整、预后分析以及抗结核药物研发等方面均具有重要临床意义及价值。方法：流式细胞术检测胸膜巨噬细胞百分率的变化与其表面标志物的表达，以及胸膜巨噬细胞的吞噬功能；ELISA法检测抗结核治疗后胸腔积液中细胞因子的变化；对抗结核治疗前后的标本中的纯化巨噬细胞进行深度测序，qPCR对其进行验证；采用qPCR方法检测IS6110基因，对胸腔积液中结核菌进行绝对定量分析；抗结核药物单药及联合体外刺激纯化的巨噬细胞，流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物表达，qPCR方法检测基因表达水平。结果：在体：1经抗结核药物治疗后，患者胸膜巨噬细胞表面标志物CD14、CD80、CD163及CD206荧光强度明显升高（MFI：p=0.045，p=0.026，p=0.016，p=0.005），后三种因子阳性细胞百分率亦增高（Percentage：p=0.041，p=0.006，p=0.003）;群体水平即非配对样本分析,与上述结果一致（MFI：p=0.017，p=0.0001，p<0.0001，p=0.0001; Percentage：p=0.002，p<0.0001，p=0.0003），CD86荧光强度升高（MFI：p=0.004）。2T细胞亚群CD3+CD4+及CD3+CD8+在治疗前后百分率略有降低，CD3-CD19+及CD3-CD56+仅个别样本有升高或降低，但均无统计学差异（p=0.578，p=0.424，p=0.602，p=0.923）, CD3+CD4+/CD3+CD8+亦无统计学意义（p=0.225）3同一样本经抗结核药物治疗前后，巨噬细胞吞噬多个Beads的细胞平均百分数从79.74±8.30%增至84.37±6.28%（p=0.035）。4抗结核治疗后胸腔积液中促炎因子IFN-γ及TNF-α水平均较治疗前降低（p<0.0001，p=0.045），抗炎因子IL-10水平亦降低（p<0.0001）。5经抗结核治疗后胸膜巨噬细胞有230个基因表达发生变化，其中156个基因表达上调，74个基因表达下调。与杀菌作用相关的基因COLEC12、CHI3L1、FNBP1L表达均上调（p=0.0363，0.0022，0.0034）；巨噬细胞产生的趋化因子CCL18及CXCL5表达增加（p=0.0024，0.0013）；促炎凋亡因子Caspase5表达量减少（p=0.0036）；而受干扰素调节的IFIT3、IFIT2及IFIT1表达均降低（p=0.0006，0.0015，0.0187）；趋化因子CXCL10及CCL8表达下调（p=0.0105，0.0155）。离体：6体外抗结核药物处理胸膜巨噬细胞，给药组巨噬细胞表面标志物CD14、CD80、CD86、CD163、CD206荧光强度不同程度增高，CD14、CD80、CD86、CD206的平均荧光强度以联合作用组药物作用最为明显（MFI: p=0.031, p=0.027, p=0.042, p=0.038）。7利福平或吡嗪酰胺单独处理细胞，均可增强CD80及CD86的表达（利福平MFI: p=0.041, p=0.024,吡嗪酰胺MFI: p=0.039,p=0.044）。8抗结核药物吡嗪酰胺或四种药物联合在Cmax剂量作用下分别使胸膜巨噬细胞CHI3L1mRNA表达上调（p=0.038，0.042）；异烟肼与吡嗪酰胺均可上调FNBP1L的表达，四药联合应用亦可使其表达升高（p=0.018，0.025，0.022）；吡嗪酰胺与四药联合应用上调CCL18的表达（p=0.036，0.045），吡嗪酰胺单药与四种药物联合作用于巨噬细胞的结果比较无差异。结论：1抗结核治疗结核性胸膜炎，促进病灶局部胸膜巨噬细胞的活化，对该处的淋巴细胞不产生明显作用。2抗结核药物联合应用，可直接刺激胸膜巨噬细胞表面标志物的表达升高，其中利福平与吡嗪酰胺发挥了重要作用。3抗结核药物联合应用，能直接增强胸膜巨噬细胞的吞噬功能，与吡嗪酰胺及异烟肼促CHI3L1或FNBP1L的基因表达有关。4吡嗪酰胺可以促进胸膜巨噬细胞趋化因子CCL18的表达上调，与结核性胸膜炎胸膜损伤后的修复有关。5在体抗结核药物联合应用，降低胸腔积液微环境中的促炎因子及抗炎因子水平，进而下调干扰素诱导基因IFIT的表达，可进一步抑制巨噬细胞对促炎因子的释放，使病灶微环境趋于稳态。6在体抗结核药物治疗可使结核性胸膜炎巨噬细胞在基因表达水平产生明显改变，与其参与的免疫防御反应密切相关，以杀菌作用相关基因的表达上调和干扰素介导的免疫反应相关因子的表达下调为主。
吕明明[7]（2014）在《MiR-141-CXCL1调控Treg机制的研究》文中研究指明背景非小细胞肺癌是全球癌症死亡的主要原因。15%的肺癌患者可能在诊断初期就有恶性胸腔积液（malignant pleural effusions,MPE）,一半的患者在后期会发展恶性胸腔积液。恶性胸腔积液是非小细胞肺癌患者预后不良的一个标志。尽管其治疗方式的较以前有了进展,但是恶性胸腔积液患者的中位生存期依然有限。恶性胸腔积液被认为是一种有利于非小细胞肺癌发展的特殊肿瘤微环境。然而,研究者关注更多关注的是原发肿瘤,对恶性胸腔积液发生发展的机制研究较匮乏。微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是一种短（18-25nt）的非编码的内源性RNA,通过调控基因的表达发挥生物学功能,包括凋亡、分化和细胞增殖等。人类癌症中异常表达的miRNAs,参与调控肿瘤的发生与发展。因此,miRNAs可能成为肺癌诊断和预后的生物标志物。然而,到目前为止,还未发现可以作为非小细胞肺癌恶性胸腔积液临床预后标志物的miRNA。调节性T细胞（Treg）在肿瘤的生长和转移中起着重要的作用。然而,肿瘤微环境中Treg细胞显着上调的具体机制还尚未明确,尤其是恶性胸腔积液中。研究表明,趋化因子CXCL1在肿瘤微环境中可以促进肿瘤的发生发展,但其在恶性胸腔积液微环境中具体的促肿瘤机制仍不完善。更重要的是,至今,miRNAs影响恶性胸腔积液发展的具体机制也未阐明。因此,有必要进一步揭示他们在恶性胸腔积液中的调控作用。研究内容免疫细胞、microRNA和细胞因子水平对肿瘤进程意义重大,肺癌胸腔积液是复杂的微环境,并且存在异常。针对肺癌胸腔积液微环境的的异常,我们分析肺癌胸腔积液中主要免疫细胞、microRNA以及细胞因子的变化；microRNA作为良好的生物标志物,可能成为肺癌诊断和预后的生物标志物,是否可以作为肺癌恶性胸腔积液临床预后标志物的；并进一步分析变化的细胞、细胞因子以及microRNA之间是否存在关联,是否会影响肺癌胸腔积液患者预后,进而阐明肺癌胸腔积液中microRNA及免疫细胞调控肺癌胸腔积液进展的相关机制。方法1.收集89例非小细胞肺癌患者的恶性胸腔积液及其外周血,另外收集44结核患者的良性胸腔积液、外周血和16例正常人外周血作为对照。分离积液与外周血中的淋巴细胞,流式细胞术检测上述样本中Treg、NK和Th17细胞的变化。2.收集184例非小细胞肺癌胸腔积液。挑选出10例预后不同的非小细胞肺癌胸腔积液样本,利用MiRNA芯片技术和生物信息学筛选出肺癌胸腔积液中差异表达的1niRNAs。在184例样本中（随机分成数目相等的实验组和验证组）,利用Q-PCR验证筛选出的差异表达miRNAs,基于miRNAs表达模式进行风险评分,收集患者生存期等临床资料进行相关性分析。3.收集268例非小细胞肺癌患者的样本,有的已发展恶性胸腔积液。患者的肿瘤组织或恶性胸腔积液以及外周血纳入本实验。流式细胞术检测积液和外周血中Treg细胞的水平。利用人细胞因子抗体芯片（Proteome Profiler Array）初步筛选表达差异的细胞因子并用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）验证。qRT-PCR检测相关基因mRNA水平的表达量。通过荧光素酶报告系统验证miRNA与靶基因的作用位点。用细胞趋化性试验分析评价不同条件对Treg的趋化能力。构建动物模型说明：mRNA和细胞因子的抗肿瘤作用。结果1.非小细胞肺癌胸腔积液中Treg细胞显着高于患者外周血,高于结核对照组,远高于正常人外周血；肺癌胸腔积液患者中CD56dimCD16+NK细胞显着低于患者外周血和正常人外周血；Th17细胞在组间没有显着差异。2.在肺癌胸腔积液患者预后不同的两个组中初步筛选出33个差异表达的miRNAs,其差异表达倍数>2。miR-141和miR-93等在预后好的患者中显着性高表达,并且发现一组miRNAs （miRNA-93,miRNA-100,miRNA-134, miRNA-151和miRNA-345）的表达水平与病人生存期显着相关。在实验组和验证组中,高表达miR-100与低表达：niRNA-93,miRNA-134,miRNA-151和miRNA-345的MPE患者预后不良。根据miRNA的表达量对所有患者进行风险评分。与低风险评分的患者相比,高风险评分患者的预后较差。由IniRNA菱达水平得到的风险评分可作为独立预测患者预后的一个因子,且不依赖其他因素。3.非小细胞肺癌胸腔积液中Treg细胞的水平显着上调,且与患者的预后呈显着性负相关（P<0.001,R=-0.67）。非小细胞肺癌恶性胸腔积液中高水平的趋化因子CXCL1与Treg细胞显着相关（P<0.01,R=0.45）。miR-141可以调控肺癌细胞中CXCL1的表达和分泌,且双萤光素酶报告基因检测系统确认miR-141与CXCL1存在靶向关系。细胞趋化分析实验说明miR-141-CXCL1可以可以调控Treg细胞的迁移,且CXCR2参与其中。构建的肿瘤动物模型说明miR-141-CXCL1对Treg细胞的调控在体内也有潜在的抗肿瘤作用。结论非小细胞肺癌MPE是一种特殊的微环境,免疫细胞与肿瘤细胞共生于此。MPE中上调的Treg细胞,可能会抑制肿瘤抗原特异性T细胞的杀伤作用；下调的CD56dimCD16+ NK细胞,可能会导致天然免疫细胞毒杀伤力显着低于正常人外周。miRNAs表达模式在非小细胞肺癌胸腔积液中发生了系统性的变化。非小细胞肺癌胸腔积液中的一组miRNAs,可以用来预测肺癌患者的预后,有助于进一步研究晚期非小细胞肺癌的发展和靶向治疗策略。本研究揭示了niRNAs与MPE两者之间的关系,miR-141在MPE中低表达,标志着患者预后不良。其影响恶性胸腔积液预后的可能机制是：恶性胸腔积液中低表达miR-141的患者,积液内趋化因子CXCL1的分泌增多,通过CXCR2促进了Treg细胞在NSCLC恶性胸腔积液中的招募,促进了肺痛胸腔积液的讲展与恶化,不利于患者预后。
王晓春[8]（2014）在《结核分枝杆菌亚单位疫苗A1D4/MTO免疫原性及保护性研究》文中研究指明[目的]卡介苗（Bacille Calmette-Guerin, BCG）接种范围广,但免疫保护期短,对潜伏感染人群和成人缺乏有效的保护力。研究针对BCG免疫后的未感染人群或潜伏感染人群的新型疫苗,已成为结核病防控的当务之急。依据结核分枝杆菌的致病性及其表达抗原谱具有的阶段特异性,我们在本研究中首先采用基因工程技术表达纯化阶段性抗原。拟利用全血干扰素释放分析技术（Whole-blood IFN-γ release assay, WBIA）,比较不同抗原刺激中国M.tb感染者外周血分泌IFN-γ浓度的差异、以鉴定这些抗原是否可被中国M.tb感染者的细胞免疫识别,有助于筛选靶向M.tb感染后不同时期所表达的优势抗原,以利于新型疫苗的研制。然后,结合机体抗M.tb保护性的免疫机制、临床试验和应用的不同佐剂及其组分的特性,我们拟建立一种新型佐剂MTO。最后,拟构建包含M.tb多阶段靶抗原的融合蛋白A1D4,并联合佐剂MTO免疫小鼠,评价该亚单位蛋白疫苗的免疫原性和保护性。[方法]1、蛋白原核表达和纯化： M.tb对数生长期分泌的保护性抗原（Ag85B）和潜伏期高表达的靶抗原（Rvl813, Rv2660c, Rv2623, HspX）,以及以此为基础建立的融合蛋白A1D4,构建相应的重组原核表达质粒,并进行原核表达纯化、SDS-PAGE和Western blotting鉴定。2、评价A1D4和各亚组分蛋白是否被中国M.tb感染人群识别：先依据相应的临床诊断标准对受试人群进行初筛,区分为结核病患者、潜伏感染者（Latent tuberculosis infection, LTBI）和未感染者人群；再结合本实验室建立的rCM-WBIA技术及前期工作中公开发表的标准,确定中国M.tb高流行区的感染人群和未感染人群,以排除BCG免疫后影响。然后以WBIA技术检测和比较A1D4和各亚组分蛋白在不同人群中诱导抗原特异性IFN-γ的水平。3、亚单位蛋白疫苗的制备和免疫：将100μl MTO与100μl浓度为0.2μg/μl的A1D4蛋白混和,即得到A1D4/MTO亚单位疫苗。动物：SPF级C57BL/6小鼠。免疫途径：皮下注射。免疫分组：BCG阳性对照组,剂量为1.67×106CFU/200μl,免疫1次；阴性对照组PBS或MTO对照组；实验组A1D4/MTO组,单次注射200μl,每3周皮下免疫1次,共3次。4、亚单位蛋白疫苗的免疫原性分析：免疫9周后,处死小鼠,收集血清和脾细胞,进行免疫原性分析。（1）评价体液免疫应答：ELISA检测小鼠血清中A1D4特异性的抗体总IgG及亚类IgG1、IgG2a的水平。（2） ELISA检测A1D4抗原特异性的TNF-α、IFN-γ及IL-2水平,以PPD刺激为阳性对照,RPMI1640为阴性对照。5、流式细胞仪（FCM）结合胞内因子染色法（ICS）分析A1D4抗原特异性的CD4+T和CD8+T细胞中分泌TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+细胞总数,进一步分析单阳、双阳和三阳性多功能CD4+T和CD8+T细胞。以PPD刺激为阳性对照,RPMI1640为阴性对照。6、亚单位蛋白疫苗的免疫保护性分析：免疫C57BL/6小鼠9周后,尾静脉注谢M.tbH37Rv毒株（1.2×106CFU/只）攻击感染。感染4周后,分别检测小鼠肺脏和脾脏的细菌载量以及病理改变,观察短期存活率。[结果]1、蛋白表达纯化和鉴定：SDS-PAG和Western blotting证实原核表达纯化的A1D4蛋白及其亚组分蛋白具有较高的纯度和生物学活性。2、筛选抗原均可被中国M.tb感染人群T细胞所识别：各单个亚组分蛋白在M.tb为感染人群中刺激产生的抗原特异性IFN-γ浓度均显着高于未感染人群（P<0.05）。融合蛋白A1D4可诱导M.tb感染人群产生更高水平的A1D4特异性IFN-γ （P<0.05）,且高于单个亚组分蛋白水平。3、A1D4蛋白/MTO诱导产生显着高水平的A1D4特异性IgG抗体及其亚类,趋向于Thl型免疫应答。4、A1D4蛋白/MTO诱导产生抗原特异性的细胞免疫应答：（1）亚单位疫苗A1D4/MTO免疫小鼠脾细胞分泌高水平的A1D4抗原特异性的细胞因子IFN-γ,TNF-α和IL-2。（2）无论用PPD或特异抗原A1D4刺激,A1D4/MTO组小鼠脾脏分泌最多数量的总IFN-y+CD4+和CD8+T细胞,且相对于PBS组和MTO组明显上升（P<0.05）；A1D4/MTO组针对PPD刺激的总TNF-α分泌型CD4+T细胞数,以及针对A1D4刺激的总TNF-α分泌型CD4+T和CD8+T细胞数均显着性高于PBS组和MTO组。进一步分析多功能T细胞数量,A1D4/MTO组A1D4特异性IFN-y+单阳和IFN-γ+IL-2+双阳CD4+T细胞,分别显着高于MTO组和PBS组（P<0.05）；以及IFN-γ+单阳、IFN-γ+IL-2+双阳、IFN-γ+TNF-α+双阳和IFN-γ+IL-2+TNF-α+三阳性CD8+T细胞数,均相对于PBS组显着性升高（P<0.05）。甚至,IFN-γ+单阳和IFN-γ+TNF-α+双阳CD8+T细胞数量,相对于BCG组也显着增加。5、免疫保护性：与PBS免疫小鼠相比,A1D4蛋白/MTO组小鼠的肺脏荷菌量显着降低（p=0.001）；病理变化更轻微；肺脏切片有少量抗酸杆菌,短期存活率达83.33%。6、佐剂MTO的特性：与PBS免疫小鼠相比,MTO组免疫提供一定程度的非特异保护性,肺脏荷菌量显着降低（P<0.05）,病理变化相当,短期存活率达83.33%。MTO免疫小鼠脾细胞产生针对PPD或A1D4蛋白反应性高水平的TNF-α;和IL-2,PPD反应性总IFN-γ分泌型CD8+T细胞数,A1D4蛋白特异性总IFN-γ分泌型或总TNF-α分泌型CD4+和CD8+T细胞数,以及A1D4蛋白特异性IFN-γ+单阳CD8+T细胞数均较PBS组显着升高。[结论]以中国M.tb感染人群可免疫识别的,M.tb在感染后不同阶段表达的免疫优势抗原Ag85B,Rv1813,Rv2660c,Rv2623和HspX为基础,建立亚单位疫苗A1D4/MTO,免疫小鼠能提供显着的抗结核分枝杆菌急性感染的保护性,尽管其保护性不及BCG。其保护性主要与其诱导产生的A1D4抗原特异性的CD4+Th1型应答相关,尤其是与具体包括A1D4抗原特异性分泌IFN-γ+IL-2+双阳CD4+T细胞数量,以及IFN-γ+单阳、IFN-γ+IL-2+双阳、IFN-γ+TNF-α+双阳和IFN-γ+IL-2+TNF-α三阳性CD8+T细胞数量的显着增加有关。另外,A1D4抗原特异性IFN-γ+单阳和IFN-γ+TNF-α+双阳CD4+T细胞、以及IFN-γ+单阳和IFN-γTNF-α+双阳CD8+T细胞数量显着增加,表明该蛋白疫苗具备弥补BCG的免疫效应的不足的特性。本研究为进一步评价该疫苗在动物模型中作为BCG初免后的增强型疫苗的效果奠定了基础。
潘雪[9]（2014）在《可溶性PD-L1分子在结核性胸腔积液中的表达特性及生物学意义》文中研究表明肺结核是长期严重危害人类健康的慢性传染病，也是单因素所致感染性疾病中病死率最高的疾病之一。结核性胸膜炎作为肺外结核的类型之一，约占肺结核患者的10%-20%，其中约10%-30%的结核性胸膜炎患者临床有胸腔积液表现。结核性胸腔积液作为常见的渗出性胸腔积液之一，胸水Th1细胞介导的免疫反应起主导作用，但近来研究结果表明，除了Th1型免疫反应，Th2、Th9、Th17、Th22等免疫细胞亚群及协同刺激分子在结核性胸腔积液的发生、发展中亦具有重要的作用。研究发现，协同刺激分子PD-L1（programmed death-1ligand1，程序性死亡配体1，又名B7-H1）在激活的T淋巴细胞、B淋巴细胞及单核-巨噬细胞等多种免疫细胞表面表达增高，并与机体的免疫抑制相关。业已证明，肺结核患者外周血中PD-1、PD-L1表达显着增高，可能与结核病免疫耐受及慢性化炎症相关。许多协同刺激分子如OX40、OX40L（OX40配体）、B7-H3和CTLA-4（细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4）等除膜型外，还以可溶性的形式存在。既往对肺癌患者外周血可溶性PD-L1（sPD-L1）检测发现，肺癌患者血清sPD-L1表达异常增高，并与肿瘤分期、转移和疗效相关。而胸腔积液中是否存在sPD-L1及sPD-L1在结核性胸腔积液中的生物学意义的研究并不多见。本研究中，我们采用苏州大学生物技术研究所自主研发的特异性人sPD-L1的酶联免疫吸附法（ELISA）检测体系对结核性胸腔积液患者开展深入研究，检测结核性胸腔积液中sPD-L1的表达，分析其临床指导意义，揭示sPD-L1和PD-1/PD-L1协同刺激信号与结核性胸腔积液疾病发生、发展的关系，进一步探究sPD-L1在结核性胸腔积液中的生物学意义。为免疫学方法在结核性胸腔积液中的治疗提供依据。一、可溶性PD-L1在结核性胸膜炎患者胸腔积液和外周血中的表达水平及临床意义【目的】检测结核性胸膜炎患者胸腔积液和外周血中可溶性PD-L1的表达水平并探讨其临床意义。【方法】筛选2012年6月至2013年3月苏州大学附属第二医院呼吸科收治的初诊胸腔积液患者68例，其中结核性胸腔积液组共24例，恶性胸腔积液组共30例，非结核、非恶性胸腔积液组14例。收集上述人群胸腔积液和外周血清并记录其临床资料。采用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测胸腔积液和外周血中sPD-L1的水平。流式细胞法（FCM）检测胸腔积液和外周血中CD4+T细胞的表达、CD8+T细胞的表达、PD-1在CD4+T细胞上的表达（CD4+-PD-1）、PD-1在CD8+T细胞上的表达（CD8+-PD-1）、CD14+单核细胞和PD-L1在CD14+单核细胞上的表达（CD14+-PD-L1）。反转录PCR法检测胸腔积液中PD-L1、基质金属蛋白酶3（MMP-3）基因表达。受试者工作特征（ROC）曲线分析sPD-L1对结核性胸腔积液的诊断价值。【结果】结核性胸腔积液中sPD-L1含量显着高于恶性组和非结核、非恶性组（P<0.0001）；所有患者胸腔积液中的sPD-L1平均含量显着高于外周血中（P=0.0033）。结核组胸腔积液中CD8+细胞比例和PD-L1在CD14+单核细胞表达（CD14+-PD-L1）比例均高于恶性组及非结核、非恶性组（P=0.0001，P<0.0001）。反转录PCR结果显示结核性胸腔积液中PD-L1mRNA表达增高，且与MMP-3表达水平相关（r=0.887，P<0.0001）。ROC曲线分析显示，单因素检测胸腔积液sPD-L1诊断结核性胸腔积液的敏感度为82.6%，特异度为82.9%，曲线下面积为0.840。【结论】 sPD-L1反映了不同病因胸腔积液微环境中不同的免疫功能状态，结核性胸腔积液中sPD-L1表达明显增高，可能与结核性胸腔积液的发生、发展相关，胸水中sPD-L1检测有助于结核性胸腔积液的鉴别诊断。二、结核性胸腔积液中IFN-γ和IFN-的表达及PD-1/PD-L1协同刺激信号在结核性胸膜炎中的免疫学作用【目的】检测结核性胸腔积液中IFN-γ和IFN-的表达水平并分析其临床意义；探讨PD-1/PD-L1协同刺激信号在结核性胸膜炎中的免疫学作用。【方法】收集上述68例胸腔积液患者胸腔积液标本，采用ELISA法检测胸腔积液中IFN-γ和IFN-的表达水平。分离健康成人外周血单个核细胞（PBMCs），以不同浓度结核性胸腔积液刺激培养后采用流式细胞术（FCM）检测PBMCs细胞表面PD-L1的表达变化，CCK-8掺入法检测PBMCs增殖的改变。免疫磁珠法分选结核性胸腔积液中T淋巴细胞和CD14+单核细胞，CCK-8掺入法检测共培养体系中T细胞增殖的改变。【结果】结核性胸腔积液组中IFN-γ含量显着高于恶性组和非结核、非恶性组（P<0.0001）；而三组患者胸腔积液中IFN-含量无统计学差异（P>0.05）。胸腔积液中sPD-L1表达与Th1型主要细胞因子IFN-γ及胸腔积液腺苷脱氨酶（ADA）表达成正相关（P=0.0004，P<0.0001）。联合胸腔积液sPD-L1、CD14+-PD-L1、IFN-γ及ADA可使诊断结核性胸腔积液的敏感度达87.0%，特异度达100%，曲线下面积达0.981。结核性胸腔积液可体外刺激CD14+单核细胞表面PD-L1的表达及PBMCs的增殖。高表达PD-L1的胸腔积液单核细胞能通过PD-1/PD-L1信号抑制T淋巴细胞的增殖和活化，采用抗PD-L1抗体特异性阻断该抑制信号可部分恢复T淋巴细胞的增殖活性（P=0.005）。【结论】结核性胸腔积液中IFN-γ表达增高，与胸腔积液中sPD-L1表达成正相关；联合IFN-γ及各临床指标检测有助于结核性胸腔积液的鉴别诊断；高表达的Th1型细胞因子IFN-γ可能与PD-1/PD-L1协同刺激信号在结核性胸膜炎中的免疫作用相关。综上所述，本课题研究获得了以下研究结果：（1）结核性胸腔积液中sPD-L1、Th1型细胞因子IFN-γ、CD8+细胞表达和PD-L1在CD14+单核细胞表达增高，sPD-L1单因素检测或联合各临床指标有助于结核性胸腔积液的诊断。（2）结核性胸腔积液可体外促进CD14+单核细胞表面PD-L1的表达及外周血单个核细胞的增殖，增高表达的PD-L1与T细胞表面PD-1受体相结合，抑制了机体的免疫效应，可能与结核性胸腔积液的发生、发展相关。（3）通过抗PD-L1单抗阻断PD-1/PD-L1途径可部分恢复T淋巴细胞增殖能力，为结核性胸腔积液的免疫治疗提供了依据。
张星[10]（2014）在《肺结核病生物学标志物miRNAs筛选、鉴定及miRNA和MRC1 SNPs与肺结核病易感性的研究》文中进行了进一步梳理第一部分血清miRNAs作为肺结核病新分子标志物的筛选与鉴定研究背景：结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的慢性感染性疾病,可侵及许多脏器,以肺部结核（Pulmonary Tuberculosis, PTB）感染最为常见,占各器官结核病总数的80-90%,发展成为肺结核病。肺结核病是一种严重威胁人类健康的疾病之一。肺结核病防治最突出的难点是缺乏疾病特异性的早期诊断标志物,无法获得早期诊断,导致肺结核病高发和死亡率的上升。为此,迫切需要研究肺结核病特异生物学标志物,建立一种快速、敏感、高效的肺结核病诊断和鉴别的新方法,防止肺结核病蔓延。本研究从血清miRNAs的表达谱中,筛选能作为肺结核病生物标志物,建立血清miRNA组合物,作为临床诊断的潜在新分子标志物。研究方法：本研究收集血清样本326例,其中健康对照者108例,肺结核病患者128例,鉴别诊断组疾病患者90例,包括肺癌、肺炎和慢性阻塞性病患者各30例。应用Solexa测序技术进行初步筛查,检测20例肺结核病患者和20例健康对照者中血清miRNAs;应用荧光定量PCR方法,在108例肺结核病患者、88例健康对照者,以及90例鉴别诊断组疾病患者血清样本中验证差异表达的血清miRNAs;通过ROC曲线和Logistic回归模型分析,对单个血清miRNAs和miRNAs组合对肺结核病诊断的灵敏度和特异性进行比较和分析；最后应用预测miRNAs调控的靶基因和全基因组转录概况,构建与肺结核病相关的靶基因和miRNAs的网络图。研究结果：应用Solexa测序技术检测肺结核病患者和健康对照者的血清miRNAs,在肺结核病患者中,选择具有显着性差异的15个血清miRNAs,其中10个血清miRNAs表达量上调,5个血清miRNAs表达量下调；通过荧光定量PCR方法发现,在肺结核病患者和健康对照者中,有6个血清miRNAs （hsa-miR-378、 hsa-miR-483-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-29c、hsa-miR-101和hsa-miR-320b）具有显着性差异（P<0.001）。并且在肺结核患者和鉴别诊断组之间进行比较均具有显着性差异（P<0.05）；通过对这6个血清miRNAs单个的ROC曲线进行分析,显示单个血清niRNAs的AUC在0.702到0.880之间；通过Logistic回归模型方法计算6个血清miRNAs组合物的AUC为0.982（95%CI,0.929-0.998）,灵敏度为95.0%和特异性为91.8%。MiRNAs-Gene网络结构图显示miRNAs可能是调控机体的免疫通路相关基因,参与肺结核病的发生过程。结论：（1）建立Solexa测序技术结合qRT-PCR检测技术,可快速稳定灵敏地构建肺结核血清miRNAs指纹图谱检测技术；（2）筛选了肺结核病相关特异的6个血清miRNAs,为建立肺结核病临床早期快速特异诊断的标准,提高肺结核病的防治水平奠定基础；（3）鉴定和构建血清miRNAs组合可能是肺结核病的诊断潜在的新分子标志物,为进一步研究miRNAs在肺结核病中的致病机制奠定基础。第二部分Mir-146a, miR-149, miR-196a2和miR-499SNPs与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群肺结核病易感性的研究研究目的：MiRNAs是一类非编码RNA,以mRNA为靶标并抑制mRNA表达蛋白。单核苷酸多态性发生在miRNAs的前体中,通过影响miRNAs的表达或者成熟导致其正常功能的发挥,并且可能通过修饰miRNAs调控影响表型类型和疾病易感性。人类miRNAs基因中的数个SNP可能影响miRNAs的生物合成和功能,可能参与肺结核病的发生机制。本实验首次研究miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C、miR-196a2T﹥C和miR-499A﹥G SNPs位点与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群肺结核病易感性,揭示这4个miRNAs SNPs位点基因可能是肺结核病的候选易感基因。研究方法：应用PCR-PFLR方法分析SNPs的分布频率。本研究共收集654例南方汉族人群血样（健康对照组300例,肺结核病组354例）、662例维吾尔族人群血样（健康对照组361例,肺结核病组301例）和612例哈萨克族人群血样（健康对照组361例,肺结核病组251例）。对基因型及基因频率分布进行检测,并对遗传模式和连锁不平衡进行分析。研究结果：在维吾尔族人群中miR-499A﹥G SNP位点的等位基因A（P=0.003； OR=1.563;95%CI,1.162-2.103）和基因型GG型（P=0.001; OR=5.344；95%CI,1.803-15.83）在肺结核病组和健康对照组之间存在显着性差异；在年龄和性别校正后,发现miR-499A﹥G SNP位点在共显性（P=0.0014；OR=5.37；95%CI,1.81-15.92）、显性（P=0.029；OR=1.47；95%CI,1.04-2.09）、隐性（P=7e-04；OR=4.95；95%CI,1.68-14.55）和加性模式（P=0.0027; OR=1.57；95%CI,1.16-2.11）下与肺结核病存在显着相关性；连锁不平衡分析,发现构建的单体型CTCC与肺结核病的发生具有显着相关性（P=0.044; OR=7.19；95%CI,1.01-51.14）; MiR-146a C﹥G、miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs位点的等位基因频率和基因型在肺结核病组和健康对照组之间的分布均无显着性差异（P>0.05）。在哈萨克族人群中,miR-146a C﹥G位点的等位基因G （P=0.023；OR=1.33;95%CI,1.04-1.69）和CC型（P=O.013；OR=1.84；95%CI,1.14-2.98）在两组之间存在显着性差异；同时miR-196a2T﹥C SNP位点的等位基因C（P=0.008；OR=O.73；95%CI,0.58.0.92）和基因型TT型（P=0.013；OR=0.54；95%CI,0.33-0.88）在两组之间存在显着性差异；经年龄和性别校正后,发现miR-146a C﹥G SNP位点在共显性（P=0.019；OR=1.87；95%CI,1.15-3.03）、隐性（P=0.005；OR=1.84；95%CI,1.20-2.81）和加性模式（P=0.022；OR=1.33；95%CI,1.04-1.69）下与肺结核病存在显着相关性；miR-196a2T﹥C SNP位点在共显性（P=O.029；OR=0.54；95%CI,0.33-0.88）、显性（P=0.014；OR=0.65；95%CI,0.46-0.92）和加性模式（P=0.0083；OR=0.73；95%CI,0.58-0.92）下与肺结核病存在显着相关性；miR-149T﹥C和miR-499A﹥G SNPs位点的基因型频率在健康对照组与肺结核病组之间的分布均无显着性差异（P>0.05）。在南方汉族人群中,构建的单体型TCCC （P=0.044; OR=0.23；95%CI,0.05-0.96）和CCCT（P=0.024；OR=0.03；95%CI,0.01-0.63）与肺结核病的保护效应具有显着相关性。结论：（1）利用病例-对照方法,结合统计学分析,首次对miR-499A﹥G、 miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs位点与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群结核病的易感性进行关联研究；（2） miR-499A﹥G SNP位点与维吾尔族人群肺结核病的易感性相关,可能增加肺结核病的发生风险；miR-146a C﹥G、 miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs与维吾尔族人群肺结核病的不存在相关性；（3） miR-146a C﹥G和miR-196a2T﹥C SNPs位点与哈萨克族人群肺结核病发生的相关；miR-149T﹥C和miR-499A﹥G SNPs与哈萨克族人群肺结核病的不存在相关性；（4） miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C、 miR-196a2T>C和miR-499A﹥G SNPs位点与中国南方汉族肺结核病易感不存在相关性。提示miRNA SNPs与肺结核易感具有种族差异性。第三部分在中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群中的MRCl基因多态性与肺结核病易感性的研究研究背景：机体识别结核分枝杆菌并介导免疫应答主要依赖T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等固有免疫细胞表面的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PRRs）。 MRC1基因编码的PRRs家族的甘露糖受体,属于C型凝集素超家族成员,可通过胞外区识别和结合结核分枝杆菌、递呈抗原和保持内环境稳定中发挥作用。目前尚没有MRC1基因SNPs与结核病易感性报道。本实验研究中国新疆地区维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群MRC1基因第7号外显子基因多态性与肺结核病易感性,揭示MRC1基因可能是肺结核病的候选易感基因。研究方法：应用PCR和DNA测序技术,对中国新疆地区595例维吾尔族人群血样（健康对照组345例,肺结核病组250例）、513例哈萨克族人群血样（健康对照组325例,肺结核病组188例）和454例南方汉族人群血样（健康对照组226例,肺结核病组230例）MRC1基因第7号外显子的6个单核苷酸多态性（G1186A、G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T）基因型及基因频率分布进行检测,并对6个位点进行连锁不平衡分析。研究结果：研究发现在维吾尔族人群中MRC1基因的G1186A位点的等位基因G的分布频率在肺结核病组（0.464）中低于健康对照组（0.536）,并且在维吾尔族肺结核病组和健康对照组之间的分布具有显着性差异（P=0.029；OR=1.29；95%CI,1.02-1.63）；基因型分析发现MRCl基因的G1186A位点基因型AA型在肺结核病组的频率低于健康组,在两组之间也存在显着性差异（P=0.037；OR=1.66；95%CI,1.05-2.61）；在年龄和性别校正后,MRC1基因的G1186A位点在加性模式下与肺结核病存在相关性（P=0.039；OR=1.27；95%CI,1.01-1.60）。从MRC1基因SNPs位点的连锁不平衡分析,发现构建的GGTCCT单体型（P=0.034；OR=0.75；95%CI,0.57-0.98）和GGTCCC单体型（P=0.043；OR=0.57;95%CI,0.33-0.98）与肺结核病存在显着的相关性,其余5个SNP位点（G1195A、T1212C、 C1221G、C1303T和C1323T）与肺结核病的易感性不存在显着相关性（P>0.05）。在哈萨克族人群中发现MRCl基因的6个SNPs位点的等位基因频率和基因型频率在肺结核病组和健康对照组之间的分布均无显着性差异（P>0.05）。在汉族人群中MRCl基因的G1186A等位基因G的分布频率在肺结核病组中高于正常健康组,两组间分布存在显着差异（P=0.023；OR:0.76；95%CI,0.57-0.95）。基因型分析也表明该位点的AG型在汉族人群正常健康组与肺结核病存在显着相关性（P=0.0076; OR=0.55；95%CI,0.36-0.85）。在年龄和性别校正后,G1186A位点在显性（P=0.0057；OR=0.57；95%CI,0.38-0.85）、超显性（P=0.039；0R=0.68;95%CI,0.47-0.98）和加性模式（P=0.03；OR=0.75;95%CI,0.58-0.97）下,与肺结核病存在显着相关性。而其它5个SNP位点（G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T）与肺结核病无相关性（P>0.05）结论：（1）利用病例-对照方法,结合统计学分析,首次对MRCl基因第7号外显子区域的6个SNPs位点与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群结核病的易感性进行关联研究；（2）MRC1基因的G1186A位点与维吾尔族人群肺结核病的易感性相关,可能增加肺结核病发病率；可能是南方汉族人群肺结核的保护因子,并且可能减少中国汉族人群感染肺结核病的风险；与哈萨克族肺结核病的易感性没有关联；（3）MRC1基因的G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T SNPs与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族肺结核病均不存在显着的相关性。结果表明,肺结核病的易感性可能与遗传因素造成的个体差异密切相关,同时为阐明中国人群肺结核病的发病机制,提供了新的实验依据。
二、ANALYSIS OF TYPE I AND TYPE Ⅱ CYTOKINES PROFILE OF LYMPHOCYTE IN PLEURAL EFFUSION OF NON SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ANALYSIS OF TYPE I AND TYPE Ⅱ CYTOKINES PROFILE OF LYMPHOCYTE IN PLEURAL EFFUSION OF NON SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS（论文提纲范文）
（1）Embracing cancer immunotherapy with vital micronutrients（论文提纲范文）
| INTRODUCTION |
| CANCER IMMUNOTHERAPY:IRAES |
| ROLE OF VITAL MICRONUTRIENTS IN IMMUNE FUNCTION AND INFECTION |
| CLINICAL IMPACT OF MICRONUTRITION IN CANCER TREATMENT |
| CONTROVERSY OVER USE OF MICRONUTRIENTS IN CANCER THERAPY |
| VITAL MICRONUTRIENTS—ROLE IN AMELIORATING IRAES AND ENHANCING IMMUNOTHERAPY |
| Tumor microenvironment modification |
| Enhancing gut microbiota immune functions |
| Adjunct nutrition support for cancer patients |
| Protecting normal healthy cells |
| MICRONUTRIENTS:VENTURING TO REDUCE AUTOIMMUNE-RELATED IRAES |
| Immunomodulating micronutrients enhances immunotherapy |
| DISCUSSION |
| CONCLUSION |
（2）黄芩苷通过调控NLRP3-自噬通路和能量代谢干预鸡毒支原体诱导的炎症反应机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 Introduction |
| 1.1 Introduction to Mycoplasma gallisepticum (MG) |
| 1.2 Effect of MG infection on chicken and losses to poultry industry |
| 1.2.1 Effect of MG infection on chicken respiratory tract and inflammatory response |
| 1.2.2 Effect of MG infection on chicken like macrophages (HD11 cells) |
| 1.3 Effect of MG infection on chicken thymus and bursa of fabricius (BOF) |
| 1.3.1 Effect of MG infection on chicken thymus |
| 1.3.2 Effect of MG infection on chicken BOF |
| 1.4 MG infection, oxidative stress and cell signaling pathways |
| 1.4.1 MG infection caused oxidative stress damage in chickens |
| 1.4.2 MG infection and TLR2-NF-κB signaling pathway |
| 1.4.3 MG infection and NLRP3 inflammasome signal ing pathway |
| 1.4.4 MG infection and host cell apoptosis |
| 1.4.5 MG infection and mitochondrial dynamics proteins |
| 1.4.6 MG infection and host cell autophagy |
| 1.4.7 MG infection and Nrf2/HO-1 signaling pathway |
| 1.4.8 MG infection and energy metabolism |
| 1.5 Baicalin and its intervention mechanisms against MG infection |
| 1.5.1 Research overview of baicalin |
| 1.5.2 Protective effects of baicalin against MG infection in chicken and HD11 cells |
| 1.6 Objectives and significance of research |
| 2 Materials and methods |
| 2.1 Experimental materials |
| 2.1.1 Drugs and chemical reagents |
| 2.1.2 Main equipments |
| 2.1.3 Preparation of solutions |
| 2.2 Baicalin alleviated MG-induced oxidative stress and inflammation via modulating NLRP3 inflammasome-autophagy pathway in HD11 cells |
| 2.2.1 Experimental cells |
| 2.2.2 Culture of MG strain R low |
| 2.2.3 Culture of HD11 cells |
| 2.2.4 Detection of cells viability by CCK-8 assay |
| 2.2.5 Experimental groups and treatments of HD11 cells |
| 2.2.6 Detection of oxidant status in HD11 cells |
| 2.2.7 Detection of reactive oxygen species (ROS) by flow cytometry |
| 2.2.8 Detection of mitochondrial membrane potential (ΔΨM) |
| 2.2.9 Transmission electron microscopic examination of HD11 cells |
| 2.2.10 Detection of inflammatory markers by ELISA assays |
| 2.2.11 Detection of mRNA expression of inflammation-related genes |
| 2.2.12 Detection of protein expression of inflammation-related genes |
| 2.2.13 Detection of autophagy-related genes in MG-infected HD11 cells |
| 2.3 Study on the molecular mechanisms of baicalin on MG-infected chickens |
| 2.3.1 Experimental animals |
| 2.3.2 Experimental groups and treatments of chickens |
| 2.3.3 Sample’s collection and processing |
| 2.3.4 Detection of oxidant status in tissues samples |
| 2.3.5 Detection of inflammatory markers by ELISA assays |
| 2.3.6 Detection of ATPase activities |
| 2.3.7 Histopathological examination |
| 2.3.8 Extraction of total proteins and western blotting |
| 2.3.9 Transmission electron microscopic examination of tissue samples |
| 2.3.10 Terminal deoxynucleotidyl transferase–mediated dUTP nick endlabeling(TUNEL) assay |
| 2.3.11 Immunofluorescence microscopic examination |
| 2.3.12 Baicalin alleviated inflammation in MG-infected chickens |
| 2.3.13 Baicalin inhibited apoptosis in MG-infected chickens |
| 2.3.14 Baicalin restored energy metabolism in MG-infected chickens |
| 2.3.15 Effects of baicalin and/or MG on mitochondrial dynamics |
| 2.3.16 Baicalin activated autophagy in MG -infected chickens |
| 2.3.17 Baicalin upregulated Nrf-2/HO-1 signaling pathway in MG-infected chickens |
| 2.4 Data analysis |
| 3 Results |
| 3.1 Baicalin alleviated MG-induced oxidative stress and inflammation via modulating NLRP3 inflammasome-autophagy pathway in HD11 cells |
| 3.1.1 Effects of MG infection on cells viability |
| 3.1.2 Effects of baicalin on cells viability |
| 3.1.3 Baicalin alleviated the morphological changes in MG-infected HD11 cells |
| 3.1.4 Baicalin alleviated oxidative stress in MG-infected HD11 cells |
| 3.1.5 Baicalin alleviated MG-induced ROS in HD11 cells |
| 3.1.6 Baicalin alleviated the disruption in mitochondrial membrane potential (ΔΨM) |
| 3.1.7 Baicalin alleviated MG-induced ultrastructural changes in HD11 cells |
| 3.1.8 Baicalin alleviated MG-induced increase in inflammatory cytokine activities |
| 3.1.9 Baicalin suppressed TLR2-MYD88-NF-kB pathway at mRNA level |
| 3.1.10 Baicalin suppressed TLR2 -MYD88-NF-κB pathway at protein level |
| 3.1.11 Baicalin suppressed NLRP3 inflammasome pathway at mRNA level |
| 3.1.12 Baicalin suppressed NLRP3 inflammasome pathway at protein level |
| 3.1.13 Baicalin modulated autophagy in MG-infected HD11 cells at mRNA level |
| 3.1.14 Baicalin modulated autophagy in MG-infected HD11 cells at protein level |
| 3.2 Baicalin attenuated MG-induced inflammation and apoptosis by restoring energymetabolism in chicken lungs |
| 3.2.1 Baicalin attenuated MG -induced increase in serum inflammatory markers |
| 3.2.2 Histopathological assessment of chicken lungs |
| 3.2.3 Ultrastructural examination of chicken lungs |
| 3.2.4 Baicalin attenuated the increased mRNA expressions of NF-κB pathway in lungstissues |
| 3.2.5 Baicalin attenuated the increased protein expressions of NF-κB pathway at proteinlevel |
| 3.2.6 Baicalin suppressed MG-induced apoptosis in lung tissues |
| 3.2.7 Baicalin attenuated MG-induce decrease in ATPase activities |
| 3.2.8 Baicalin restored the mRNA expressions of energy metabolism-related genes |
| 3.2.9 Baicalin restored the protein expressions of energy metabolism-related genes |
| 3.3 Baicalin mitigated MG-induced oxidative stress and apoptosis in chicken thymusthrough the Nrf2/HO-1 defence pathway |
| 3.3.1 Baicalin ameliorated oxidative stress in chicken thymus tissues |
| 3.3.2 Histopathological examination of chicken thymus tissues |
| 3.3.3 Ultrastructural examination of chicken thymus tissues |
| 3.3.4 Effects of baicalin and/or MG infection on cytokine activities |
| 3.3.5 Baicalin inhibited the mRNA expression of apoptosis-related genes |
| 3.3.6 Baicalin inhibited the protein expressions of apoptosis-related genes |
| 3.3.7 Detection of apoptosis by TUNEL assay |
| 3.3.8 Baicalin upregulated the m RNA expression of the Nrf2/HO-1 pathway in chickenthymus |
| 3.3.9 Baicalin upregulated the protein expression of the Nrf2/HO-1 pathway in chickenthymus |
| 3.4 Baicalin attenuated immune impairment in chicken BOF through modulation ofautophagy and inhibited inflammation and apoptosis |
| 3.4.1 Histopathological examination of BOF |
| 3.4.2 Transmission electron microscopic examination of chicken BOF |
| 3.4.3 Baicalin suppressed NF-κB pathway at mRNA level in chicken BOF |
| 3.4.4 Baicalin suppressed NF-κB pathway at protein level in chicken BOF |
| 3.4.5 Baicalin suppressed proinflammatory cytokines activities in chicken BOF |
| 3.4.6 Baicalin attenuated the increased mRNA expressions of apoptosis-related genes |
| 3.4.7 Baicalin attenuated the increased protein expressions of apoptosis-related genes |
| 3.4.8 Detection of apoptosis by TUNEL assay |
| 3.4.9 Baicalin increased the protein expression of CD8+cells in chicken BOF |
| 3.4.10 Effects of baicalin and/or MG infection on mitochondrial dynamics |
| 3.4.11 Baicalin modulated autophagy at mRNA level in chicken BOF |
| 3.4.12 Baicalin modulated autophagy at protein level in chicken BOF |
| 4 Discussion |
| 4.1 Anti-oxidant effects of baicalin on MG infection |
| 4.1.1 Imbalance of oxidant status |
| 4.1.2 MG-induced oxidative stress and baicalin interventions |
| 4.2 Anti-inflammatory effects of baicalin on MG infection |
| 4.2.1 Damage caused by MG-induced inflammatory response |
| 4.2.2 Mechanisms of baicalin intervening MG-induced inflammation |
| 4.3 Baicalin alleviated MG -induced apoptosis |
| 4.3.1 Mechanisms of apoptosis and diseases |
| 4.3.2 Baicalin inhibited MG-induced apoptosis and associated signaling pathways |
| 4.4 Baicalin modulated autophagy and mitochondrial dynamics |
| 4.4.1 Autophagy machinery and homeostasis |
| 4.4.2 Baicalin modulated autophagy during MG infection |
| 4.4.3 Baicalin restored the imbalance in mit ochondrial dynamics |
| 4.5 Baicalin restored energy metabolism in chicken lungs |
| 4.5.1 Dysfunction in energy metabolism linked diseases |
| 4.5.2 Baicalin attenuated energy metabolism dysfunction |
| 5 Conclusion |
| Acknowledgement |
| References |
| Papers published in the period of Ph.D. education |
（3）TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤新靶点的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 现代医学对肿瘤的认识和治疗 |
| 1.1.1 肿瘤认识的发展 |
| 1.1.2 肿瘤产生的病理研究 |
| 1.1.3 肿瘤的预防 |
| 1.1.4 肿瘤的治疗 |
| 1.2 TRAF6 简介 |
| 1.2.1 TRAF超家族的结构特点和功能 |
| 1.2.2 TRAF6 的结构特点 |
| 1.2.3 TRAF6 相关信号通路的研究 |
| 1.2.4 TRAF6 与肿瘤的关系 |
| 1.3 靶向抗肿瘤研究进展 |
| 1.3.1 以分子量分类的靶向抗肿瘤药物 |
| 1.3.2 以作用靶点分类的靶向抗肿瘤药物 |
| 1.4 靶向TRAF6 抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 利用miRNA调节TRAF6 的表达来抑制肿瘤细胞的增殖 |
| 1.4.2 利用TRAF6 的干扰剂抑制肿瘤细胞的增殖 |
| 1.4.3 根据TRAF6 独特的结构,通过计算机模拟筛选出能够和TRAF6结合的小分子化合物抑制肿瘤细胞的增殖 |
| 1.5 靶向TRAF6的RING-Zn结构域的抗肿瘤研究位点的选取 |
| 1.5.1 泛素化系统简介 |
| 1.5.2 RING-Zn结构域作为抗肿瘤靶点的选取 |
| 1.5.3 研究优势 |
| 1.5.4 本研究设计思路 |
| 第2章 计算机辅助药物设计与小分子化合物的筛选 |
| 2.1 实验材料和筛选软件 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 计算机筛选所需软件及用途 |
| 2.2 计算机辅助药物设计理论基础 |
| 2.2.1 计算机辅助药物设计的原理 |
| 2.2.2 计算机辅助药物设计的研究思路 |
| 2.2.3 计算机辅助药物设计的方法 |
| 2.2.4 计算机辅助药物设计的发展趋势 |
| 2.3 利用分子对接筛选小分子化合物 |
| 2.3.1 分子对接法基本原理 |
| 2.3.2 分子对接方法 |
| 2.3.3 计算机模拟分子对接的流程 |
| 2.3.4 筛选能与TRAF6的RING-Zn结构域结合的小分子化合物 |
| 2.4 小分子化合物抗肿瘤活性的初步筛选 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 细胞传代 |
| 2.4.3 细胞冻存 |
| 2.4.4 细胞复苏 |
| 2.4.5 细胞计数 |
| 2.4.6 MTT法检测化合物对细胞增殖的影响 |
| 2.4.7 统计学分析 |
| 2.5 分子对接法筛选结果 |
| 2.5.1 分子对接筛选能与Ubc13 竞争性结合TRAF6的RING-Zn结构域的化合物 |
| 2.5.2 MTT实验结果 |
| 2.5.3 竞争性结合TRAF6的RING-Zn结构域的化合物的确定 |
| 2.5.4 化合物与TRAF6 的结合 |
| 2.6 本章小结和讨论 |
| 第3章 靶向RING-Zn结构域的化合物对细胞早期凋亡的影响及其分子机制的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 抗体和试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.2 化合物对细胞早期凋亡的影响 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 流式细胞术检测合物对HeLa细胞早期凋亡的影响 |
| 3.3 免疫印迹法检测蛋白水平的变化 |
| 3.3.1 细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.3.3 SDS-PAGE凝胶的制备 |
| 3.3.4 蛋白上样 |
| 3.3.5 电泳 |
| 3.3.6 半干转法转膜及蛋白印迹检测 |
| 3.4 免疫沉淀检测蛋白之间的相互作用 |
| 3.4.1 免疫沉淀法实验步骤 |
| 3.4.2 检测蛋白之间的相互作用 |
| 3.5 统计学方法 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 细胞中TRAF6 表达量的检测 |
| 3.6.2 化合物对HeLa细胞凋亡的检测结果 |
| 3.6.3 化合物对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.4 化合物处理后对AKT活化的影响 |
| 3.6.5 化合物刺激细胞后对TAK1 活化的影响 |
| 3.7 本章小结和讨论 |
| 第4章 动物体内抗肿瘤机制的研究和对免疫系统的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系和实验动物 |
| 4.1.2 抗体和试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 肿瘤模型的构建和抗肿瘤活性的检测 |
| 4.2.1 构建宫颈癌小鼠模型 |
| 4.2.2 检测金鸡纳碱化合物在体内的抗肿瘤活性 |
| 4.3急性毒性实验 |
| 4.4 TUNEL法检测化合物对肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 4.4.1 制备肿瘤组织切片 |
| 4.4.2 TUNEL法实验步骤 |
| 4.5 化合物刺激后对免疫系统的影响 |
| 4.5.1 金鸡纳碱化合物对外周血中T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.5.2 金鸡纳碱化合物对脾脏细胞中T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.5.3 金鸡纳碱化合物对血清中TNF-α、IFN-γ、IgG表达水平的影响 |
| 4.6 统计学方法 |
| 4.7 实验结果 |
| 4.7.1 C57BL/6J小鼠肿瘤的增长曲线 |
| 4.7.2 化合物对C57BL/6J小鼠宫颈癌模型的抑瘤作用 |
| 4.7.3 化合物对小鼠急性毒性的影响 |
| 4.7.4 金鸡纳碱化合物对小鼠宫颈癌模型肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 4.7.5 金鸡纳碱化合物对肿瘤模型小鼠的胸腺和脾脏的影响 |
| 4.7.6 金鸡纳碱化合物对小鼠宫颈癌模型外周血中淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.7.7 金鸡纳碱化合物对小鼠宫颈癌模型脾脏中淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.7.8 金鸡纳碱化合物对小鼠宫颈癌模型血清中的TNF-α、IFN-γ、IgG表达水平的调节 |
| 4.8 本章小结和讨论 |
| 第5章 TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤靶点的验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系 |
| 5.1.2 抗体和试剂 |
| 5.1.3 仪器 |
| 5.1.4 溶液配制 |
| 5.2 通过免疫荧光实验检测辛可宁和TRAF6 在细胞内的结合 |
| 5.2.1 带荧光标签的辛可宁的合成 |
| 5.2.2 免疫荧光法检测辛可宁和TRAF6 的结合 |
| 5.3 构建TRAF6 低表达的HeLa细胞系并检测其对化合物的敏感性 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 利用siRNA干扰TRAF6在HeLa细胞中的表达 |
| 5.3.3 TRAF6 cDNA的获得 |
| 5.3.4 Quantitative real time-PCR法进行细胞m RNA水平检测 |
| 5.3.5 Western blot法对TRAF6 蛋白表达检测 |
| 5.3.6 利用MTT法检测TRAF6 低表达细胞对金鸡纳碱化合物的敏感性 |
| 5.4 带有惰性集团的辛可宁对HeLa细胞增殖的影响 |
| 5.4.1 合成惰性辛可宁(Cinchonine-OMe) |
| 5.4.2 利用MTT法检测惰性辛可宁(Cinchonine-OMe)和辛可宁对HeLa细胞和NHDF细胞增殖的影响 |
| 5.5 统计学方法 |
| 5.6 实验结果 |
| 5.6.1 带荧光标签的辛可宁的合成 |
| 5.6.2 细胞中TRAF6 和辛可宁的相互作用 |
| 5.6.3 qRT-PCR检测TRAF6 mRNA水平 |
| 5.6.4 Western blot法分析TRAF6 蛋白表达水平 |
| 5.6.5 化合物对TRAF6 低表达HeLa细胞增殖的影响 |
| 5.6.6 惰性辛可宁Cinchonine-OMe的合成 |
| 5.6.7 惰性辛可宁和辛可宁对HeLa细胞和NHDF细胞增殖的影响 |
| 5.7 本章小结和讨论 |
| 第6章 结论和展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 本论文的创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）HLA遗传多态性与MDR/RR-TB和HIV易感性的关联研究及其在新型结核诊断肽筛选中的应用（论文提纲范文）
| 中英文对照缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 实验研究部分 |
| 研究一 湖北汉族群体HLA遗传多态性与MDR/RR-TB易感性的关联研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究二 新型结核抗原肽的鉴定及在人免疫缺陷病毒感染人群结核诊断中的应用价值研究 |
| 第一部分 华中地区HIV/AIDS群体经典MHC-Ⅰa类抗原基因型分布特点分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 针对HIV感染人群的结核感染γ干扰素释放测定试剂的筛选研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（5）慢性肺部烟曲霉菌丝感染小鼠模型的建立及免疫反应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 、烟曲霉介绍 |
| 1.1 种属分类 |
| 1.2 生长与繁殖 |
| 1.3 分生孢子与菌丝 |
| 2. 烟曲霉引起的疾病 |
| 2.1 曲霉菌病概述 |
| 2.2 侵袭性曲霉菌病(IA) |
| 2.3 慢性肺曲霉菌病(CPA) |
| 2.3.1 曲霉菌球(Aspergilloma) |
| 2.3.2 慢性空洞型肺曲霉菌病(CCPA) |
| 2.3.3 慢性纤维化肺曲霉菌病(CFPA) |
| 2.3.4 曲霉结节(Aspergillus nodule) |
| 2.3.5 亚急性侵袭性曲霉菌病(SAIA) |
| 2.4 气管支气管曲霉菌病(Tracheobronchial aspergillosis) |
| 2.5 变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA) |
| 3. 烟曲霉引起的免疫反应 |
| 3.1 固有免疫 |
| 3.1.1 皮肤黏膜屏障 |
| 3.1.1.1 机械清除 |
| 3.1.1.2 上皮细胞吞噬 |
| 3.1.2 固有免疫细胞 |
| 3.1.2.1 肺泡巨噬细胞(AM) |
| 3.1.2.2 中性粒细胞 |
| 3.1.2.3 树突状细胞(DCs) |
| 3.1.2.4 NK细胞 |
| 3.1.2.5 嗜酸性粒细胞 |
| 3.1.2.6 肥大细胞 |
| 3.1.2.7 血小板 |
| 3.1.3 可溶性的杀菌分子 |
| 3.2 适应性免疫 |
| 3.3 烟曲霉感染过程中细胞受体及相关通路 |
| 3.3.1 烟曲霉的致病因子 |
| 3.3.2 细胞受体及相关通路 |
| 3.3.2.1 Toll样受体(Toll-like receptor, TLR) |
| 3.3.2.2 C型凝集素受体(C-type lectin receptor, CLR) |
| 3.3.2.3 NOD样受体(NOD-like receptor, NLR)及视黄酸诱导基因I受体( RIGI-like receptors, RLR) |
| 3.3.2.4 cGAS/Sing通路 |
| 4. 曲霉菌病动物模型 |
| 4.1 侵袭性曲霉菌病(IA)动物模型 |
| 4.2 变应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)动物模型 |
| 4.3 慢性肺曲霉菌病(CPA)动物模型 |
| 5. 研究内容、思路及方法 |
| 5.1 研究内容及研究思路 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.3 研究意义及价值 |
| 第二章 烟曲霉标准菌株AF293的荧光标记 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 菌株、培养基及试剂 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 DNA载体及引物设计 |
| 2.4 绿蛋白荧光(GFP)标记Af293菌株(Af293-GFP) |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论与总结 |
| 第三章 肺部烟曲霉菌丝慢性定植小鼠模型的构建 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 菌株及培养基 |
| 2.2 试剂及仪器 |
| 2.3 接种液的制备 |
| 2.3.1 孢子悬液接种液的制备 |
| 2.3.2 菌丝球悬液接种液的制备 |
| 2.4 构建肺部慢性菌丝感染小鼠模型 |
| 2.4.1 小鼠饲养 |
| 2.4.2 小鼠麻醉 |
| 2.4.3 气管插管接种 |
| 2.4.4 小鼠体重记录及一般情况观察 |
| 2.4.5 小鼠肺部真菌分布 |
| 2.4.6 小鼠肺部病理 |
| 2.4.7 小鼠肺部真菌负荷 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 显微镜下菌丝球结构 |
| 3.2 小鼠体重变化及一般情况观察 |
| 3.3 小鼠肺部真菌分布 |
| 3.4 小鼠肺部病理 |
| 3.5 小鼠肺部真菌负荷 |
| 4. 讨论与总结 |
| 第四章 慢性肺部烟曲霉菌丝感染的免疫反应 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 试剂及仪器 |
| 2.2 慢性肺部烟曲霉菌丝感染的免疫反应检测 |
| 2.2.1 肺泡-支气管灌洗液 |
| 2.2.2 肺组织消化液 |
| 2.2.3 流式细胞仪检测免疫反应 |
| 2.2.4 数据分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 固有免疫及适应性免疫反应 |
| 3.2 T细胞亚群分类 |
| 3.3 流式细胞仪检测代表结果 |
| 4. 讨论与总结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1. 全文总结 |
| 2. 研究的创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 综述: 曲霉菌病的防治原则 |
| 参考文献 |
| 已发表及待发表论文 |
| 已发表文章首页 |
| 致谢 |
（6）抗结核治疗对结核性胸膜炎巨噬细胞的作用及机制（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 巨噬细胞亚型的研究进展 |
| 1.1.1 巨噬细胞的分型及功能 |
| 1.1.2 巨噬细胞亚型与疾病的关系 |
| 1.2 结核分枝杆菌的免疫学 |
| 1.2.1 结核分枝杆菌及其感染的概况 |
| 1.2.2 机体免疫力在抵抗结核分枝杆菌方面的作用 |
| 1.2.3 对结核分枝杆菌有防御功能的细胞类型 |
| 1.3 巨噬细胞抗结核分支杆菌活动 |
| 1.3.1 巨噬细胞作用于结核分枝杆菌的产物 |
| 1.3.2 巨噬细胞对结核杆菌生长的限制 |
| 第2章 实验研究 |
| 2.1 实验 1 抗结核药物对结核性胸膜炎胸膜巨噬细胞表型与功能的影响 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 实验 2 抗结核药物对结核性胸膜炎胸膜巨噬细胞基因谱的影响 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 实验 3 体外抗结核药物处理对巨噬细胞基因、表型及功能的影响及机制 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）MiR-141-CXCL1调控Treg机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 恶性胸腔积液与MICRORNA研究背景 |
| 1 恶性胸腔积液研究背景 |
| 1.1 恶性胸腔积液介绍 |
| 1.2 恶性胸腔积液的发病机制 |
| 1.3 临床症状与诊断 |
| 1.4 进展与治疗 |
| 2 MICRORNA的研究进展 |
| 2.1 microRNA简介 |
| 2.2 microRNA的产生与成熟 |
| 2.3 microRNA与肿瘤 |
| 3 参考文献 |
| 第二章 肺癌胸腔积液中主要免疫细胞的分析 |
| 1 前言 |
| 1.1 肺癌胸腔积液 |
| 1.2 肺癌胸腔积液中免疫细胞的研究现状 |
| 1.2.1 调节性T细胞(Treg) |
| 1.2.2 Th17细胞 |
| 1.2.3 NK细胞 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本的收集 |
| 2.2.2 胸腔积液中细胞的分离 |
| 2.2.3 外周血中淋巴细胞的分离 |
| 2.2.4 细胞流式抗体的标记 |
| 2.2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 样本临床资料 |
| 3.2 肺癌胸腔积液中Treg细胞水平上调 |
| 3.3 肺癌胸腔积液中Th17细胞与外周无显着性差异 |
| 3.4 肺癌胸腔积液中CD56~(dim)CD16~+NK细胞显着低于正常水平 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 肺癌胸腔积液中差异表达MICRORNA的筛选及预后标志物的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本的收集 |
| 2.2.2 样本的处理 |
| 2.2.3 miRNA芯片检测 |
| 2.2.4 差异MicroRNA的筛选 |
| 2.2.5 差异MicroRNA生物信息学分析 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 Q-PCR验证芯片中差异表达的miRNA |
| 2.2.8 数据分析统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 肺癌胸腔积液中miRNA表达的检测及初步分析 |
| 3.2 功能性miRNAs的生物信息学分析 |
| 3.3 差异表达miRNAs与患者生存期相关性分析 |
| 3.4 5个差异表达miRNA的临床意义 |
| 3.5 肺癌胸腔积液中miRNA表达模型不依赖于其他因素 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 肺癌胸腔积液中MIR-141-CXCL1调控TREG机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本的收集 |
| 2.2.2 流式检测胸腔积液和外周血中Treg细胞的表达水平 |
| 2.2.3 microRNA的转染及检测 |
| 2.2.4 细胞周期的检测 |
| 2.2.5 CFSE检测细胞增殖 |
| 2.2.6 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 Q-PCR检测miRNA和mRNA的表达 |
| 2.2.8 Proteome Profiler Array和ELISA检测细胞因子的表达 |
| 2.2.9 Western blot检测蛋白表达水平 |
| 2.2.10 免疫荧光染色确定肿瘤细胞分泌CXCL1 |
| 2.2.11 质粒构建与报告基因检测 |
| 2.2.12 细胞趋化性实验评估肺癌胸腔积液对Treg的趋化能力 |
| 2.2.13 肺癌小鼠模型的构建与处理 |
| 2.2.14 数据分析统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 样本临床资料 |
| 3.2 Treg细胞在非小细胞肺癌胸腔积液中高表达 |
| 3.3 Treg细胞水平与患者生存期成负相关性 |
| 3.4 CXCL1在肺癌胸腔积液中高表达 |
| 3.5 CXCL1与肺癌积液中总高水平的Treg成正相关性 |
| 3.6 miR-141调控肺癌细胞中CXCL1的表达 |
| 3.7 miR-141不影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和周期 |
| 3.8 非小细胞肺癌胸腔积液中miR-141与CXCL1成负相关性 |
| 3.9 miR-141-CXCL1途径调控Treg细胞向恶性胸腔积液的募集 |
| 3.10 CXCR2参与miR-141-CXCL1对Treg细胞的调控 |
| 3.11 miR-141-CXCL1调控Treg在动物肿瘤模型中的验证 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 结论 |
| 博士研究生期间发表及待发表论文列表 |
| 致谢 |
（8）结核分枝杆菌亚单位疫苗A1D4/MTO免疫原性及保护性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）可溶性PD-L1分子在结核性胸腔积液中的表达特性及生物学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 可溶性 PD-L1 在结核性胸膜炎患者胸腔积液和外周血中的表达水平及临床意义 |
| 1.主要试剂与材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 结核性胸腔积液中 IFN-γ和 IFN-α的表达及 PD-1/PD-L1 协同刺激信号在结核性胸膜炎中的免疫学作用 |
| 1.主要试剂与材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 本课题获得的基金资助 |
| 致谢 |
（10）肺结核病生物学标志物miRNAs筛选、鉴定及miRNA和MRC1 SNPs与肺结核病易感性的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 基金资助 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 血清miRNAs作为肺结核病新分子标志物的筛选与鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 MiR-146a,miR-149,miR-196a2和miR-499 SNPs与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群肺结核病易感性的关联研究 |
| 7 前言 |
| 8 材料 |
| 9 方法 |
| 10 结果 |
| 11 讨论 |
| 12 结论 |
| 第三部分 在中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群中的MRCl基因多态性与肺结核病易感性的研究 |
| 13 前言 |
| 14 材料 |
| 15 方法 |
| 16 结果 |
| 17 讨论 |
| 18 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
四、ANALYSIS OF TYPE I AND TYPE Ⅱ CYTOKINES PROFILE OF LYMPHOCYTE IN PLEURAL EFFUSION OF NON SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS（论文参考文献）
- [1]Embracing cancer immunotherapy with vital micronutrients[J]. Raymond C-F Yuen,Shiu-Ying Tsao. World Journal of Clinical Oncology, 2021(09)
- [2]黄芩苷通过调控NLRP3-自噬通路和能量代谢干预鸡毒支原体诱导的炎症反应机制[D]. MUHAMMAD ISHFAQ. 东北农业大学, 2021
- [3]TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤新靶点的分子机制研究[D]. 祁永浩. 天津大学, 2018(06)
- [4]HLA遗传多态性与MDR/RR-TB和HIV易感性的关联研究及其在新型结核诊断肽筛选中的应用[D]. 周霞. 华中科技大学, 2018(05)
- [5]慢性肺部烟曲霉菌丝感染小鼠模型的建立及免疫反应的研究[D]. 王逢源. 南京大学, 2018(09)
- [6]抗结核治疗对结核性胸膜炎巨噬细胞的作用及机制[D]. 张健. 吉林大学, 2015(08)
- [7]MiR-141-CXCL1调控Treg机制的研究[D]. 吕明明. 南京大学, 2014(08)
- [8]结核分枝杆菌亚单位疫苗A1D4/MTO免疫原性及保护性研究[D]. 王晓春. 华中科技大学, 2014(07)
- [9]可溶性PD-L1分子在结核性胸腔积液中的表达特性及生物学意义[D]. 潘雪. 苏州大学, 2014(11)
- [10]肺结核病生物学标志物miRNAs筛选、鉴定及miRNA和MRC1 SNPs与肺结核病易感性的研究[D]. 张星. 浙江大学, 2014(09)