一、睾丸未成熟生精细胞体外培养的研究进展（论文文献综述）
朱文倩[1]（2021）在《牛睾丸组织冻存体系的优化及应用》文中研究指明睾丸组织冷冻保存作为雄性遗传资源多样性保护的重要策略之一,为生殖细胞保存、珍稀濒危物种保护及未成年雄性辅助生殖提供了新的途径。目前,啮齿类睾丸组织冻存体系及体外生精的研究已取得显着进展,但牛等大家畜的相关研究仍处于探索阶段。由于睾丸组织结构复杂,各类细胞的大小、低温耐受能力、膜渗透压等均存在差异,冻存-复苏过程中睾丸组织和细胞的生理活性一般会显着降低。因此,现有的睾丸组织冻存体系仍需完善,特别是在牛等大家畜方面。基于前期基础,本研究探索了海藻糖对牛睾丸组织冻存的适宜浓度,优化了冷冻体系及精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）培养体系,进而应用于冻存复苏后睾丸组织的体外培养、移植及透射电镜样品制备,通过电镜观察、免疫组化染色和细胞培养,鉴定分析了新型间质细胞——特络细胞（Telocytes,TCs）的形态特征、定位分布及生物学特性,评估了复苏后组织的活性及生精上皮发育能力。冻存体系优化结果显示,冻存液（freezing medium,FM）中添加不同浓度的海藻糖对牛睾丸组织长期低温保存（6个月）具有显着影响。采用含10%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、10%血清替代物（Knockout serum replacement,KSR）和20%海藻糖的FM5,结合非程控慢速冷冻（uncontrolled slow freezing,USF）程序,对牛睾丸组织冻存的效果较好。与其它浓度海藻糖添加组（FM1-FM4,FM6）+USF体系相比,FM5组睾丸组织复苏后结构完整、生精细胞排列规则、细胞凋亡率低且存活率高,利于UCHL1（SSCs标记）阳性SSCs的保存。因此,后续实验均采用FM5组冻存的组织。在此基础上,分离获得成年牛生精上皮细胞悬液,差速贴壁以富集SSCs,探讨了牛SSCs在自体睾丸细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）饲养层共培养体系中的差异。荧光定量PCR分析显示,自体睾丸细胞共培养体系可维持其多能性基因（Sox2,Pou5f1）、SSCs标记基因（Gfrα-1,Uchl1）的高水平表达,产生较多SSCs克隆。这表明该体系更有利于牛SSCs体外培养。在复苏后睾丸组织培养方面,以琼脂凝胶为支撑,通过凝胶底部吸收培养液中营养物质,将待培养组织置于气液界面上,维持和促进未成熟睾丸组织发育的方法已在啮齿类和人的研究中取得进展。基于前人的研究,本实验比较了复苏后犊牛睾丸组织在有、无琼脂凝胶培养条件下体外发育的差异。培养18、27 d后分析显示,与贴壁培养相比,琼脂凝胶培养法有利于维持睾丸组织结构和生精上皮的发育,可显着降低细胞凋亡,上调睾丸组织中SSCs标记（Gfrα-1,Uchl1）、减数分裂标记（Sycp3）、成熟精子标记（Crisp1）及体细胞标记（Star,Sox9,Acta2）基因的表达,促进生精细胞的增殖、分化和发育。我们还观察到,贴壁培养组织的周围迁移出大量有狭窄-膨大节段交替形成的念珠样长突起的TCs样细胞,此类细胞表达特异性标记分子CD34、VIM、PDGFRα,具有TCs的典型特征。因冻存-复苏组织的细胞活性与其良好的微细结构保持有密切关系,为检验复苏后牛睾丸组织微细结构的完整性,本研究制备了透射电镜样品以观察超微结构,进而探明上述TCs在牛睾丸组织中的定位分布及形态学特征。结果显示:成年牛和犊牛睾丸组织超微结构完好,TCs均位于曲细精管基膜和管周肌样细胞（peritubular myoid cell,PMC）外侧,胞体较小,呈椭圆形或三角形,有2-3条细长的节结状突起（telopodes,Tps）,可与同类细胞或其他类型细胞相互连接,在间质内形成复杂的3D网络;其核内异染色质多,核外胞质少,内有线粒体等细胞器。睾丸组织切片免疫组化染色结果与上述超微结构观察一致,成年牛及犊牛的TCs特异性标记分子CD34主要分布在曲细精管基膜外侧。表明TCs主要位于间质中,这为进一步了解牛睾丸生理结构奠定了基础。为进一步评估冻存-复苏后犊牛睾丸组织的活性及其生精上皮的发育分化能力,本研究还将其进行了小鼠背部皮下异种移植实验。结果显示,牛睾丸组织移植28天后,保留了曲细精管样结构;生精细胞在相关基因水平启动分化机制,与正常30日龄的牛睾丸发育状态基本保持一致。这表明移植的组织确有活性,其生精上皮和间质组织有一定的发育分化能力。综上,本研究筛选建立了添加20%海藻糖的牛睾丸组织冻存优化体系FM5+USF,确证自体睾丸细胞共培养体系对牛SSCs短期培养更为适宜,琼脂凝胶法有利于睾丸组织培养,冻存-复苏的组织移植后可存活发育,证实睾丸冷冻技术联合组织培养及移植技术应用的可行性,同时也明确了TCs在牛睾丸中的存在和分布特征,为进一步了解大型经济动物的睾丸生理结构,保存雄性种质资源提供参考。
周文钧[2]（2017）在《大鼠睾丸开放活检导致生精小管形态改变》文中提出研究背景及目的:笔者以前参与的研究表明,成年大鼠睾丸开放活检,导致了生精细胞团向生精小管腔内突出的形态改变。本文拟进一步研究确定大鼠睾丸活检导致的生精小管形态改变,同时利用连续切片观察生精小管的形态以探讨活检所致形态改变的形成机制。材料与方法:14只成年大鼠麻醉后在一侧睾丸作切口挤出组织块,浸润固定整个睾丸后切取挤出的组织块（未游离活检块）。另8只成年大鼠麻醉后在一侧睾丸作切口挤出组织块并立即切下,然后固定（游离活检块）。这22只动物的另一侧睾丸,浸润固定后切取睾丸组织块（原位组织块）。所有组织块都用甲基丙烯酸树脂包埋,从每个包埋块切取1张切片（25μm厚）。另外,从每个游离活检块再切平均46张连续切片。所有切片用过碘酸-席夫试剂和苏木精染色,然后进行组织学观察分析。结果:与原位组织块相比,未游离活检块的生精小管基本正常,而在切自游离活检块的切片上,有约一半的生精小管轮廓腔内可见单独的生精细胞团,这些生精细胞团几乎都是由精母细胞及精子细胞组成。连续切片观察提示,这些生精细胞团来自某处的生精小管壁,开放活检过程中被挤出或突向邻近的生精小管腔。结论:成熟睾丸开放活检可导致生精细胞团从生精上皮脱落,突向管腔,这可能是活检时游离组织块内生精小管的局部收缩所致。
李文静[3]（2017）在《睾丸组织体外培养诱导精子发生的探索性研究》文中进行了进一步梳理第一部分KM幼鼠睾丸组织体外培养诱导精子发生的验证性研究目的验证体外标准组织培养方法gas-liquid界面法在KM小鼠睾丸组织培养过程中的效果。方法选取SPF级7天龄KM雄性小鼠睾丸,获取幼鼠睾丸组织,眼科剪处理至1mm3大小,加入400ml培养基（RPMI+10%FBS+1%双抗+1mM RA）制成混悬液,接种至六孔板内的低熔点琼脂糖凝胶块表面,34℃,5%CO2培养箱中培养。分别于7d、14d、21d、28d收取标本进行荧光定量PCR,以及病理包埋切片,HE染色观察生精小管形态学变化,以及kit,crem,sycp3和Acr各阶段标志性基因的表达情况。同时与7,14,21天和28天正常KM小鼠作为对照组进行比较。免疫组化鉴定各时期Acr的表达情况。结果7天KM小鼠生精小管为单层的精原细胞,未见精子发生,正常KM小鼠28开始部分生精小管中可见长形精子。随着培养时间的延长,睾丸生精小管内出现精母细胞,生精小管开始饱满,培养7天后与正常14天小鼠对比生精小管形态基本一致,KM-21D与KM28两组比较生殖细胞标记基因表达有统计学差异,Acr mRNA表达逐渐升高,sycp3培养第七天表达水平有所下降。随后kit和crem mRNA表达趋势与对照组一致。免疫组化发现在KM-21天有Acr的表达的精子细胞样细胞。结论该研究结果进一步证明界面法体外培养KM小鼠睾丸组织能成功启动减数分裂,诱导精子发生。使该方法应用于人睾丸组织培养诱导精子发生提供了一定的实验基础与理论依据。第二部分体外培养非梗阻性无精症患者睾丸组织诱导精子发生的初步研究目的探索体外标准组织培养方法gas-liquid界面法在非梗阻性无精症患者睾丸组织培养过程中的效果。方法收集来我院就诊的行显微取精患者的废弃睾丸组织,新鲜处理。PBS洗涤2′3min,眼科剪剪碎至1mm3大小,加入400ml培养基（RPMI+10%FBS+1%双抗+1mM RA）制成混悬液,接种至六孔板内的低熔点琼脂糖凝胶块表面,34℃,5%CO2培养箱中培养,分别于7d,14d,21d收取标本进行荧光定量PCR,以及病理包埋切片,HE染色,免疫荧光观察生精细胞内变化。分别检测减数分裂前GPR125,DDX4,减数分裂期DMRT1,STRA8以及减数分裂后PRM2和CREM等六个基因m RNA及蛋白质表达水平。最后,采用ACR基因鉴定是否又含有顶体的精子细胞形成。结果该培养体系以及培养方法能够使NOA患者睾丸组织长期存活,促进精子发生。NOA患者STRA8,DDX4,DMRT1和PRM2基因表达在各时期不稳定,极低表达甚至不表达,但CREM和GPR125基因表达量相对稳定,GPR125为精原细胞标记基因,在培养第7天m RNA水平下降,随后逐渐升高;CREM为减数分裂后的标记基因,随着培养时间延长,m RNA表达量并未下降,并有逐渐升高趋势。免疫荧光结果显示GPR125和CREM两个基因蛋白均能稳定表达。经ACR免疫荧光鉴定该患者培养前弱表达,culture-14d、culture-21d以及culture-33d发现ACR表达显着。结论该研究结果证明,该方法应用于NOA患者睾丸组织精子发生的诱导取得了积极的效果。不仅维持了精原细胞的增殖,而且进一步促进和维持了减数分裂的发生。该研究结果提示动物体外精子发生模型应用于人体诱导精子发生具有一定的指导意义,受实验样本例数及组织量局限,因此仍需进一步验证实验结果以及探索和优化培养条件。
蔡春红,何大维,扶溢瑶,曾广平,刘星,林涛,魏光辉[4]（2015）在《人未成熟睾丸组织体外生殖细胞发育的实验研究》文中研究表明目的初步探讨人未成熟睾丸组织在体外培养条件下其生殖细胞发育情况。方法截取睾丸肿瘤术中的瘤旁睾丸组织进行体外培养,分别培养417周后苏木素伊红（HE）染色观察培养睾丸组织的组织学结构,测量曲细精管横截面积和直径,RT-PCR检测Piwil2基因在培养组织中的表达,免疫组化检测Piwil2蛋白在生殖细胞中的表达。结果人睾丸组织培养初期（4周）曲细精管横截面积和直径逐渐增大,培养后期有减小趋势,1岁时取材的睾丸组织曲细精管直径在培养前、培养4周、培养8周分别为（38.08±4.67）μm、（56.65±8.71）μm、（52.58±6.43）μm;2.9岁时取材的直径相应时间点分别为（38.40±2.33）μm、（56.81±7.71）μm、（54.15±5.44）μm;8.5岁时取材的直径相应时间点分别为（49.97±4.94）μm、（58.78±2.74）/μm、（53.40±5.04）μm。1岁时取材的睾丸组织曲细精管横截面积在培养前、培养4周、培养8周分别为（1150.52±150.94）μm2、（2579.68±842.91）μm2、（2203.97±549.04）μm2;2.9岁时取材的横截面积相应时间点分别为（1162.30±143.57）μm2、（2581.21±700.53）μm2、（2326.26±468.48）μm2;8.5岁时取材的横截面积相应时间点分别为（1979.91±386.05）μm2、（2719.61±246.98）μm2、（2259.42±433.24）μm2。培养8周后曲细精管中观察到类初级精母细胞,Piwil2免疫组化染色提示生殖细胞具有更新分化能力。结论在体外培养条件下人未成熟睾丸组织中精原细胞可发育成精母细胞。培养8周生殖细胞仍然具有自我更新和分化能力,之后生殖细胞发育逐渐衰退。
檀大羡,莫毅,陈自洪,张海英,刘琼东,牛向丽,孙燕萍[5]（2014）在《非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞体外培养后受精能力的研究》文中研究说明目的:探讨非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞体外培养后的受精能力。方法:选取8例非梗阻性无精子症患者的睾丸组织制备成生精细胞,经体外培养后得到长形精子细胞显微注射到卵细胞内,观察其受精情况。结果:8例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化、成熟。将培养后接近成熟的精子细胞通过显微注射到卵细胞内,卵细胞受精率为4.52%,荧光原位杂交试验结果显示卵细胞有受精。结论:非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞经体外培养后有潜在的受精能力。
宋小敏[6]（2012）在《体外培养生精细胞的增殖分化效应及显微授精研究》文中认为目的：通过细胞培养介质的改进探讨新生小鼠睾丸组织生精细胞在体外培养条件下的增殖分化效应，以期提高生精细胞体外存活率，增殖率、分化率及存活时间。方法：对78日龄小鼠生精细胞进行混合细胞培养，采用基础培养液（A组）、条件培养液（B组（）基础培养液+20ng/ml EGF+10ng/ml GDNF）、分别含浓度为20%、40%、80%睾丸液（testicular abstract, TA）的基础培养液（C1、C2和C3组）和分别含浓度为20%、40%、80%TA的条件培养液（D1、D2和D3组），通过细胞形态学观察、存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析，探讨TA、GDNF和EGF对小鼠生精细胞体外培养增殖分化效应。结果：①形态学观察对照组和实验组在培养3～4天后均可观察到正在分裂的细胞。B组培养7～8天后可观察到细胞集落，集落间可见散在圆形精子细胞，培养10天后，细胞集落爆发出现，并可见变形精子细胞和带鞭毛精子细胞，培养20天后，可见部分生精细胞和支持细胞凋亡。含TA（C1、C2和C3）组和（D1、D2和D3）组细胞生长速度介于A组和B组之间，培养7～8天后也可见少量细胞集落，其中正在分裂细胞偏多，圆形精子细胞少见，培养10天后，细胞集落增加，并可观察到各期生精细胞，但细胞密度低于B组，培养15天后，细胞集落铺满培养皿底部。对实验各组传代培养，A组传代后细胞生长不良，B组传代至2～3代后细胞生长明显减慢，且细胞暗沉发黑、贴壁性差，而C1、C2、C3组和D1、D2、D3组传代培养4个月之后仍可观察到细胞生长。②生精细胞计数培养各时间阶段B组生精细胞数均显着高于其余组（P＜0.05），而A组生精细胞数则显着低于其余各组（P＜0.05），其余各组间无显着性差异；③生精细胞存活率培养第5、10和15天A与B组间细胞存活率无显着性差异，但培养第20天A组细胞存活率显着低于B组（P＜0.05），其余组在培养各阶段与A、B组相比细胞存活率无显着性差异；④TP1/P19A组在培养15天时TP1/P19显着高于B组（P＜0.05），B组在培养20天时显着高于其余组（P＜0.05），其余各培养组均无显着性差异；⑤单倍体精子细胞比例B组在培养第15天和20天时单倍体细胞比显着高于其余组（P＜0.05），其余各培养组均无显着性差异。结论：在生精细胞与支持细胞混合培养体系中，基础培养液中添加适量GDNF和EGF可显着提高生精细胞体外培养的增殖分化效应，但不能延长其体外培养时间；基础培养液中加入适量TA，可增加生精细胞体外培养的细胞数及时间；在含最佳浓度细胞因子培养液中加入适量TA，降低生精细胞体外培养增殖分化效应，但显着增加生精细胞体外培养的时间。目的：对体外培养获得的圆形和长形精子细胞行卵胞浆内显微注射术（roundspermatid injection, ROSI; elongated spermatid injection, ELSI），观察其受精率、卵裂率、桑囊胚形成率，探讨体外培养所获单倍体精子细胞的受精能力以及受精后胚胎的发育潜能。方法：对78日龄小鼠生精细胞混合细胞体外培养后获得的圆形/长形精子细胞和成年小鼠睾丸内的圆形和长形精子细胞以及成熟精子进行卵胞浆内显微授精，比较其受精率、卵裂率及桑囊胚形成率。结果：成年小鼠睾丸内单倍体精子细胞和体外培养获得的单倍体精子细胞行ROSI/ELSI后，前者4-8细胞及桑囊胚形成率高于后者，但两组间受精率、卵裂率及桑囊胚形成率均无显着性差异。成熟精子ICSI的受精率、卵裂率、4-8细胞及桑囊胚形成率均显着高于两组ROSI。结论：体外培养所获单倍体精子细胞的受精能力与成年小鼠睾丸内的精子细胞无显着性差异，但前者的胚胎发育潜能略低于后者。成熟精子的显微授精能力及胚胎发育潜能显着高于两组单倍体精子细胞。
黄静[7]（2012）在《化学激活在小鼠生精细胞体外受精中的应用》文中提出第一部分小鼠单倍体精子细胞显微注射方法学研究目的：探讨改良持卵针的显微操作系统在小鼠精子细胞体外授精中的应用价值。方法：通过反复锻烧将常规持卵针制作成喇叭形开口状，制成改良持卵针，辅以独特的显微注射操作手法，对小鼠生精细胞体外培养所获单倍体圆形精子进行卵胞浆内显微注射（ROSI），计算ROSI后30min昆明小白鼠卵母细胞的存活数和存活率，并与常规窄口持卵针行ROSI后的卵母细胞存活率进行比较。结果：分别采用常规和改良后的持卵针进行小鼠ROSI，每种方法各注射320个卵母细胞。改良持卵针组ROSI后30min的卵母细胞存活率显着高于未改进持卵针组（P<0.05）。结论：改良持卵针制备简单，易于操作，ROSI后卵母细胞存活率高，且不需依赖piezo系统，在小鼠单倍体精子细胞体外受精的研究中有较高的临床应用价值。第二部分化学激活在小鼠圆形精子体外受精中的应用目的：通过对生精细胞体外培养所获圆形精子显微注射后的小鼠卵母细胞进行单一和联合化学激活，寻找小鼠圆形精子体外受精的最佳激活方案。方法：选取乙醇（ethanol，EH）、钙离子载体A23187（calcium ionophore A23187，CIA）、离子霉素（ionomycin，Ion）、氯化锶（strontium chloride，SrCl2）、放线菌酮（cycloheximide，CHX）及6-二甲基苯胺嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-DMAP）作为外源性化学激活剂，采用不同浓度的单一化学激活剂对ROSI后的卵母细胞进行不同作用时间激活，观察其受精率、卵裂率和桑囊胚形成率。根据激活不同的途径，联合两种最佳激活浓度和激活时间的单一激活剂对ROSI后的卵母细胞进行联合激活，比较不同联合方案对卵母细胞的激活效果；并以成年小鼠睾丸内圆形精子ROSI作为对照，比较体内精子细胞和体外培养精子细胞的受精能力及胚胎发育潜能。结果：（1）单一激活时，各激活剂的最佳方案分别为①乙醇：7%、6min；②CIA：5μmol/L、5min；③Ion：5μmol/L、5min；④6-DMAP：2mmol/L、2h；⑤SrCl2：10mmol/L、1.5h；⑥CHX：10μg/mL、1.5h，其中10mmol/L SrCl2作用1.5h激活效果最佳，显着优于CHX方案，但与其它各组无显着性差异；（2）联合激活时，乙醇+6-二甲基苯胺嘌呤组桑囊胚率（29.63%）显着高于其它各组，以及除SrCl2以外所有单一激活方案（P<0.05），为最佳联合激活方案；（3）对成年小鼠睾丸中圆形精子ROSI后的卵母细胞进行乙醇+6-二甲基苯胺嘌呤激活后，其正常受精率、卵裂率及桑囊胚率与体外培养所获圆形精子间均无显着性差异。结论：单一激活方案中10mmol/L SrCl2单独作用1.5h，联合方案中7%EH作用6min+2mmol/L6-DMAP作用2h对体外培养所获圆形精子ROSI后的卵母细胞激活效果最佳；体外培养所获圆形精子ROSI后受精率、胚胎发育潜能与成年小鼠睾丸内圆形精子间无显着性差异。
朱晶晶,王达利,李三华,邓呈亮,孙广峰[8]（2012）在《不同温度对体外培养精原细胞精子发生相关基因的影响》文中研究表明目的:在32℃、37℃温度下体外培养生精细胞,探讨两种温度对精原细胞增殖相关基因的影响,为进一步探讨体腔温度（37℃）导致精子发生障碍的机制提供依据。方法:将分离的大鼠生精细胞分别置于不同温度（32℃、37℃）条件下与支持细胞进行体外共培养,观察其贴壁、增殖、形态学变化;培养第8天采用非连续Percoll密度梯度离心、差异性贴壁分离富集出精原细胞,以实时定量PCR和Western印迹分别检测不同温度下精原细胞c-kit、PI3K的mRNA和蛋白表达水平的变化;对体外培养第8天的精原细胞c-kit基因进行测序检测,了解其突变情况。结果:32℃组、37℃组均可见细胞贴壁、分裂、增殖;32℃组中,精原细胞c-kit和PI3K的mRNA及蛋白表达量均显着高于37℃组（P<0.05）;基因测序结果显示32℃组c-kit基因第9、11、13号外显子均未见突变,37℃组第11、13号外显子未见突变,在9号外显子附近区域可能有缺失或插入突变。结论:在体外37℃温度下培养生精细胞会抑制精原细胞增殖分化相关基因的表达,同时可能导致精原细胞c-kit基因发生突变。
邓呈亮[9]（2011）在《温度影响体外培养大鼠精原细胞SCF/c-kit增殖通路及细胞周期》文中进行了进一步梳理目的：通过在不同温度下体外培养大鼠生精细胞,探讨温度对精原细胞SCF/c-kit增殖通路及细胞周期的影响,为进一步研究体腔温度（37℃）导致精子发生障碍的机制提供基础研究资料。方法：采用机械法和酶消化法分离雄性成年SD大鼠生精细胞,分别置于不同温度（32℃、37℃）条件下与支持细胞进行体外共培养,观察其形态及细胞数变化等生长特性；培养第8天利用非连续密度梯度离心、差异性贴壁分离富集A型精原细胞：流式细胞技术检测细胞周期；实时定量-多聚酶链反应（Real time- Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot）分别检测SCF/c-kit增殖通路中c-kit及下游基因PI3K、CyclinD3 mRNA和蛋白的表达；Sanger双脱氧法检测c-kit基因第9、11、13号外显子序列。结果：体外共培养第1天,32℃组、37℃组均可见悬浮的呈圆形或卵圆形的生精细胞和贴壁的呈长梭形或不规则形的支持细胞；前3天,生精细胞数及生长状态没有明显的区别,从第4天开始,37℃组的生精细胞数、生长状态逐渐降低,第4天时,37℃组的生精细胞数为3.11±0.18×106/ml,32℃组为3.40±0.25×106/ml,第8天时,37℃生精细胞数为0.49±0.25×106/ml,明显低于32℃组的2.93±0.26×106/ml,差异有统计学意义（P<0.05）；体外共培养第8天,percoll分离结合差速贴壁法成功分离富集出A型精原细胞,流式结果显示32℃组处于S期A型精原细胞所占比例为49.35±1.04,明显高于37℃组的43.58±0.78；G0/G1期为40.99±0.76,明显低于37℃组的46.45±0.92,差异有统计学意义（P<0.05）；实时定量-多聚酶链反应（RT-PCR）及蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测结果显示：32℃组和37℃组A型精原细胞中均有c-kit、P13K及CyclinD3 mRNA和蛋白的表达,且32℃组中A型精原细胞c-kit、P13K及CyclinD3 mRNA和蛋白的表达量均高于37℃组,差异均有统计学意义（P<0.05）；基因测序结果显示32℃组c-kit基因第9、11、13号外显子均未见突变,37℃组第11、13号外显子未见突变,第9号外显子见套峰,提示在9号外显子附近区域可能有缺失或插入突变。结论：在含有FBS的DMEM/F12基础培养基中体腔温度（37℃）影响体外培养大鼠精原细胞的增殖,同时可能导致c-kit基因发生突变；37℃这种近似体腔的温度不宜用于研究体外培养体系中精原细胞正常增殖和分化。
孙静波[10]（2011）在《不同培养方法和细胞因子对小鼠生精细胞的增殖分化效应》文中研究说明目的:比较曲细精管片段培养和混合细胞共培养两种不同方法对小鼠生精细胞的增殖分化效应,旨在建立一个高效、稳定的小鼠生精细胞体外培养方法,获得更多接近成熟的单倍体精子细胞。方法:对78天龄小鼠生精细胞分别进行曲细精管片段培养和混合细胞共培养,通过细胞形态学观察、存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析,比较两种培养方法生精细胞的存活、增殖以及分化情况。结果:曲细精管片段培养法第1012天可见到圆形精子细胞,1314天出现少量带鞭毛的精子细胞或长形精子,第10天可检测出单倍体峰和单倍体精子细胞特异性基因TP1表达;混合细胞培养法57天可见圆形精子细胞,第5天即可检测出单倍体峰和单倍体精子细胞特异性基因TP1表达,810天少量精子细胞长出鞭毛或胞体渐变成长形。混合细胞培养法所获细胞数、存活率及单倍体精子细胞分化率均显着高于曲细精管片段培养法（P<0.05）。培养过程中,各级生精细胞随培养时间延长,存活率逐渐降低,细胞数减少,曲细精管片段培养和混合细胞培养分别在第3周和第4周出现大部分生精细胞和支持细胞脱落死亡。结论:曲细精管片段培养和生精细胞-支持细胞共培养均可获得单倍体精子细胞,较之曲细精管片段培养法,混合细胞共培养法存活率更高,可更早获得更多单倍体精子细胞。目的:通过在生精细胞体外培养过程中添加不同浓度表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和干细胞因子（stem cell factor,SCF）,探讨两种细胞因子对生精细胞增殖、分化的最佳作用浓度以及它们之间的最佳组合浓度。方法:对78天龄小鼠生精细胞进行混合细胞体外培养,在培养基中分别添加不同浓度的EGF和SCF（分别为5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、100 ng/ml）,并进行EGF和SCF的交互实验,通过细胞形态学观察、存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析,探讨EGF和SCF对生精细胞的体外增殖分化效应。结果:加入EGF或SCF2-4天,各浓度组中可见不同程度增殖呈团或链状的细胞团紧密连接,以EGF 20ng/ml组和SCF 40ng/ml组较为明显,第5-7天出现圆形精子细胞,8-10天少部分精子细胞长出鞭毛或渐变成长形精子细胞,第4周出现大部分生精细胞和支持细胞脱落死亡。培养第7天,EGF浓度为20ng/ml、SCF浓度为40ng/ml时生精细胞数和存活率显着高于与其它各浓度组（P<0.05）,且浓度为40ng/ml的SCF可显着提高单倍体峰并降低P19/TP1比值（P<0.05）。EGF与SCF配伍时,EGF浓度为12 ng/ml时生精细胞增殖率最高,而SCF的作用效果呈线性递增趋势。结论:在混合生精细胞体外培养体系中,添加一定浓度的EGF和SCF可显着提高生精细胞数和存活率,而且SCF可提高体单倍体精子的形成率,两者交互实验时,对细胞增殖有相互叠加效应。
二、睾丸未成熟生精细胞体外培养的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、睾丸未成熟生精细胞体外培养的研究进展（论文提纲范文）
（1）牛睾丸组织冻存体系的优化及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 综述部分 |
| 第1章 睾丸组织冷冻保存研究进展 |
| 1.1 睾丸组织冷冻保存的方法 |
| 1.2 睾丸组织冷冻保护剂的应用 |
| 1.3 冷冻保存对睾丸组织的影响 |
| 1.4 结语 |
| 第2章 睾丸组织冷冻保存技术的应用 |
| 2.1 SSCS的分离富集 |
| 2.2 SSCS的移植 |
| 2.3 睾丸组织培养 |
| 2.4 睾丸组织移植 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 海藻糖对牛睾丸组织冷冻保存的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 冷冻保存犊牛睾丸组织的体外培养 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 冷冻保存牛睾丸组织微细结构观察及TC鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 冷冻保存犊牛睾丸组织的移植 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）大鼠睾丸开放活检导致生精小管形态改变（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：睾丸细胞的生物学特征及研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）睾丸组织体外培养诱导精子发生的探索性研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词一览表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 KM幼鼠睾丸组织体外培养诱导精子发生的验证性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体外培养非梗阻性无精症患者睾丸组织诱导精子发生的初步研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞体外培养后受精能力的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1. 1对象 |
| 1. 2 主要仪器、试剂 |
| 1. 3方法 |
| 2 结果 |
| 2. 1生精细胞体外培养的结果 |
| 2. 2卵胞浆内精子细胞显微注射后的结果 |
| 2. 3荧光原位杂交分析结果 |
| 3 讨论 |
（6）体外培养生精细胞的增殖分化效应及显微授精研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
（7）化学激活在小鼠生精细胞体外受精中的应用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（8）不同温度对体外培养精原细胞精子发生相关基因的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要设备及试剂 |
| 1.3 生精细胞分离与培养 |
| 1.4 精原细胞的分离与富集 |
| 1.5 实时定量PCR法检测各组精原细胞中c-kit和PI3K mRNA的表达 |
| 1.5.1 引物设计 |
| 1.5.2 总RNA的提取及逆转录 |
| 1.5.3 实时定量PCR PCR反应体系按照SYBR? Premix Ex TaqTM |
| 1.6 Western印迹检测c-kit及PI3K蛋白表达 |
| 1.7 c-kit基因测序 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 生精细胞体外培养形态及特点 |
| 2.2 c-kit及PI3K基因的表达 |
| 2.3 c-kit及PI3K蛋白的表达 |
| 2.4 c-kit基因测序 |
| 3 讨论 |
（9）温度影响体外培养大鼠精原细胞SCF/c-kit增殖通路及细胞周期（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:精原细胞体外培养的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）不同培养方法和细胞因子对小鼠生精细胞的增殖分化效应（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 第一部分 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 第二部分 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 3.7 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、睾丸未成熟生精细胞体外培养的研究进展（论文参考文献）
- [1]牛睾丸组织冻存体系的优化及应用[D]. 朱文倩. 吉林大学, 2021(01)
- [2]大鼠睾丸开放活检导致生精小管形态改变[D]. 周文钧. 川北医学院, 2017(01)
- [3]睾丸组织体外培养诱导精子发生的探索性研究[D]. 李文静. 华中科技大学, 2017(03)
- [4]人未成熟睾丸组织体外生殖细胞发育的实验研究[J]. 蔡春红,何大维,扶溢瑶,曾广平,刘星,林涛,魏光辉. 中华小儿外科杂志, 2015(11)
- [5]非梗阻性无精子症患者睾丸生精细胞体外培养后受精能力的研究[J]. 檀大羡,莫毅,陈自洪,张海英,刘琼东,牛向丽,孙燕萍. 中国性科学, 2014(02)
- [6]体外培养生精细胞的增殖分化效应及显微授精研究[D]. 宋小敏. 安徽医科大学, 2012(01)
- [7]化学激活在小鼠生精细胞体外受精中的应用[D]. 黄静. 安徽医科大学, 2012(01)
- [8]不同温度对体外培养精原细胞精子发生相关基因的影响[J]. 朱晶晶,王达利,李三华,邓呈亮,孙广峰. 中华男科学杂志, 2012(02)
- [9]温度影响体外培养大鼠精原细胞SCF/c-kit增殖通路及细胞周期[D]. 邓呈亮. 遵义医学院, 2011(06)
- [10]不同培养方法和细胞因子对小鼠生精细胞的增殖分化效应[D]. 孙静波. 安徽医科大学, 2011(06)