一、肝癌细胞膜受体含pRSVB7特异性配基的构建（论文文献综述）
张洁[1]（2019）在《基于队列人群的中医体质与非酒精性脂肪肝的关系和Osteopontin中和抗体在大鼠脂肪性肝纤维化消退中的作用研究》文中研究说明研究背景与目的:非酒精性脂肪性肝病（fatty liver disease,NAFLD）是指一组因机体代谢紊乱所致的以肝细胞脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。NAFLD在早期是可逆的,发病进展过程中NAFLD的各危险因素变化是脂肪肝状态可能由NAFL发展到NASH甚至肝硬化或者表现为逐渐消退的重要影响因素。中医体质可以在很大程度上决定该个体对NAFLD内外致病因素的易感性及患病以后疾病可能表现的证型,更重要的是可以影响到个体对治疗效果的不同表现。因此,体质辨识及对NAFLD疾病影响的研究也就成了中医个性化论治研究的一个重要内容。研究中医体质因素和脂肪肝及危险因素各指标的关系,及其对脂肪肝发生与消退的影响,将为进一步防治NAFLD提供科学依据。骨桥蛋白（Ostepontin,OPN）是一种分泌性磷酸化糖蛋白,具有细胞因子的特点。近些年来一系列研究表明,在肝纤维化的发生发展过程中OPN具有促纤维化的作用,它不仅能够诱发肝星状细胞（HSC）的活化、增殖与迁移,也能引起肝脏内部I型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β受体m RNA（TGF-βm RNA）以及蛋白质的产生,并且对肝巨噬细胞也有明显的趋化作用。本研究是利用高校体检队列人群,研究中医体质对脂肪肝发生和发展过程的作用特点,不同中医体质NAFLD在人群中的分布特点及其临床特征,及其对脂肪肝发生与消退的影响。为进一步防治NAFLD等心血管疾病危险因素提供科学依据。本研究还利用体检队列人群资料,评价基线OPN对NAFLD发生和消退的预测价值及中医体质对其的影响。最后,本研究利用大鼠脂肪性肝纤维化模型,考察OPN中和抗体特异性结合OPN蛋白并拮抗OPN生物学功能,观察有无干预及不同干预方案下肝脏病理改变和相关促纤因子的变化情况,以此初步评价OPN免疫中和方案治疗肝纤维化是否可行及效果如何。深入研究与OPN相关的肝纤维化的机制,有助于探索防治脂肪性肝纤维化的新策略或新的药物靶点。研究内容:1、基于队列人群的中医体质与非酒精脂肪肝的关系研究:2、血清Osteopontin对非酒精性脂肪肝发生和消退的预测评价;3、Osteopontin中和抗体在大鼠脂肪性肝纤维化消退中的作用研究;第一部分基于队列人群的中医体质与非酒精脂肪肝的关系研究目的:基于体检队列人群采用横断面和队列人群调查相结合的方法,研究中医体质因素与非酒精脂肪肝（NAFLD）及危险因素的分布及变化的关系,中医体质类型特点对非酒精脂肪肝发生与消退的影响。方法:采用横断面和队列人群调查相结合的方法,调查某高校连续五年参加体检的40岁以上人群,检测各项体检指标和中医体质问卷,对调查数据进行统计学描述和分析。结果:横断面调查:1、非酒精脂肪肝在人群的构成是以痰湿质、气虚质、湿热质为主;无论中度还是轻度脂肪肝人群都是痰湿质占比最多;湿热质以中度脂肪肝为主,气虚质以轻度脂肪肝为主。2、从易患非酒精脂肪肝的倾向性上,在湿热质、血瘀质、气郁质、平和质的男性脂肪肝检出率明显高于同体质类型女性,差异有统计学意义（P<0.05）;在阴虚质、阳虚质的女性脂肪肝检出率高于同体质类型男性,差异有统计学意义（P<0.05）。3、非酒精脂肪肝的总检出率是伴随着年龄的增长而增加的。气虚质、平和质人群随年龄增加非酒精脂肪肝检出率逐步增加,湿热质人群随年龄增加检出率逐步减少。50-55岁年龄段是男女脂肪肝检出率变化的交叉点,交叉点前女性脂肪肝检出率低于男性,交叉点后女性脂肪肝检出率高于男性。队列人群调查:1、非酒精脂肪肝的年发病率明显高于年消退率,总的趋势是患病人数不断增加。2、新发脂肪肝人群以气虚质、湿热质、痰湿质为主,脂肪肝消退人群以痰湿质、气虚质、湿热质为主;新发脂肪肝的转化率从高到低依次为:气虚质、痰湿质、湿热质;脂肪肝消退的转化率从高到低依次为:气虚质、气郁质、阳虚质为主。第二部分血清Osteopontin对非酒精性脂肪肝发生和消退的预测评价目的:通过比较不同随访结局的研究对象基线血清骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）水平的差异,评价基线OPN对NAFLD发生和消退的预测价值。方法:研究对象来自某高校体检人群。从完成3年随访的人群中选择随访研究资料完整且符合标准的360名受试者纳入为研究对象,按随访终止时脂肪肝有无及变化结局分为以下四个组别:未发生组、新发组、维持组、消退组。全部研究对象均完成了肝脏超声诊断、体格检查、中医体质辨识、血清OPN浓度、各项糖脂代谢指标和肝酶的实验室检测。用logistic回归方法分析基线血清OPN在NAFLD的发生和消退中的预测作用。结果:新发生NAFLD人群基线血清OPN水平显着高于未发生NAFLD的人群48.47ng/ml（40.1,62.9）vs 38.18 ng/ml（34.2,51.2）,（P<0.001）。维持组人群基线血清OPN水平显着高于消退组的人群54.16 ng/ml（33.2,71.3）vs 50.71 ng/ml（36.7,75.9）,（P<0.05）。在维持组内可见易患脂肪肝体质人群的血清OPN水平明显高于非易患脂肪肝体质人群,59.11 ng/ml（55.2,73.5）vs 50.96 ng/ml（47.8,70.8）,（P<0.05）,未发生组、新发组、消退组未见有此明显差异。多元逐步回归显示基线血清OPN水平和BMI是预测NAFLD的独立预测危险因素,ROC曲线分析显示基线血清OPN+BMI预测模型对3年后NAFLD发生有很好的预测价值（曲线下面积为0.821,95%CI 0.773–0.839）。第三部分Osteopontin中和抗体在大鼠脂肪性肝纤维化消退中的作用研究目的:考察Osteopontin（OPN）中和抗体对脂肪性肝纤维化大鼠的干预效果,发掘其潜在的治疗价值;研究OPN中和抗体对脂肪性肝纤维化大鼠干预后,肝脏纤维化的表达变化及其与糖脂代谢的关系。方法:1)60只SD大鼠,其中对照组（N=8）、NAFLD造模组（N=52）采用经典CCl4诱导加高脂饮食喂养方法进行脂肪性肝纤维化造模,第6周造模成功后随机抽取8只大鼠作为模型组处死收集样本,再随机抽取24只分为自然消退组、OPN中和抗体干预组、秋水仙碱组。OPN中和抗体干预组从7周开始每隔一天通过尾静脉注射OPN抗体（滴度:1:15）,持续4周（每次0.15m L）;秋水仙碱组在第7周开始秋水仙碱干预治疗,对大鼠按照0.02mg/100g体重进行药水灌胃给药,持续4周;NAFAD自然消退组在第7周起停止高脂饮食,恢复为正常饮食,持续4周。分别于0周末、4周末、6周末、8周末、10周末随机抽取造模组各5、5、8、5、5只大鼠做生化、病理及western blot检测,评估造模及相关指标的变化情况。2)用real-time PCR和免疫印迹方法检测大鼠肝组织OPN和α-SMA的表达;用酶联免疫吸附试验检测肝纤维化相关指标;用病理组织学的HE和Masson染色方法检测大鼠肝纤维化的病理变化;采用大鼠血清检测肝功能指标、TC、TG、FBG、FINS、计算HOMA-IR、ISI。结果:1)OPN抗体干预组大鼠的OPN和α-SMA的m RNA水平及蛋白表达水平均显着低于自然消退组和模型组（P<0.01）。2)OPN抗体干预后,大鼠肝组织病理面积减少,纤维组织肥大,炎症细胞浸润减少。3)抗体干预组与秋水仙碱组的ColⅠ、PCⅢ、MMP-3、TGF-β1、α-SMA、TNF-α均明显低于自然消退组（P<0.05或P<0.01）。4)抗体干预组FPG、FINS、HAMO-IR、TG明显低于自然消退组（P<0.05或P<0.01）;抗体干预组的FPG、FINS、HAMO-IR、TG、ISI、TG明显低于秋水仙碱组（P<0.05）,而两组的TC指标未见明显统计学差异。结论:1、体检队列人群的中医体质与非酒精性脂肪肝分布特点如下:1)构成比:非酒精脂肪肝以痰湿质、气虚质、湿热质体质人群为主;易患性:痰湿质、气虚质、湿热质体质更易于患脂肪肝;在男性血瘀质、气郁质、湿热质体质更易于检出脂肪肝,在女性阴虚质、阳虚质体质更易于检出脂肪肝。2)非酒精脂肪肝发生和消退变化:新发脂肪肝人群以气虚质、湿热质、痰湿质为主,新发脂肪肝转化率从高到低依次为:气虚质、痰湿质、湿热质;脂肪肝消退人群以痰湿质、气虚质、湿热质为主;脂肪肝消退的转化率从高到低依次为:气虚质、气郁质、阳虚质。2、人体血清OPN水平是NAFLD发生的独立危险因素,可以成为预测NAFLD的新型血清标志物。易患脂肪肝的中医体质类型也是NAFLD发生的独立风险因素。3、在大鼠脂肪性肝纤维化建模过程中,OPN的高表达或激活α-SMA,上调下游HSC相关机制导致肝纤维化,而靶向抑制OPN能够显着改善大鼠非酒精脂肪肝所致肝纤维化,同时也能明显改善胰岛素抵抗和降低血清TG水平。
范媛媛[2]（2017）在《多种金属离子的单细胞分析及细胞膜蛋白的单分子检测》文中指出在生物体内,各种各样的生物分子发挥着至关重要的作用。如基因能够调控信号传递及代谢通路,蛋白质组学则在一定程度上反应基因表达水平,金属离子在神经系统中能够促进神经递质的释放和分泌、调节神经突触的形成及生长等。各种生物分子之间彼此关联、协同作用、相互影响,一种生物分子的异常表达往往会引起一系列的变化,因此各种生物分子与细胞功能的正常运作、各种疾病的发生与发展以及相关治疗密不可分。目前已发展了多种针对细胞内生物分子的研究方法,包括电化学检测、质谱以及光学检测等,其中荧光法由于检测灵敏度高等优点已得到广泛应用。但是目前的方法对于单细胞水平甚至是单分子水平的生物分子的检测仍然存在许多困难,如生物分子的尺度一般为纳米级,检测方法需具有较高的空间分辨;某些分子含量较少,低灵敏度的方法难以实现其精确的检测;另外由于细胞成分较为复杂,如何消除其他分子的信号干扰也是一大挑战。因此,急需发展高灵敏的单细胞内生物分子检测方法。针对这些困难与挑战,本论文致力于发展高灵敏度的检测方法用于细胞内生物分子的检测。首先我们在单细胞的水平上,发展了一种单细胞内多组分的同时定量检测的方法,并且进一步提高了检测灵敏度,构建了一种单分子水平上的细胞膜蛋白的检测方法。论文主要包括以下四个部分:第一章为绪论,首先概述了目前细胞内各种生物分子检测的研究进展,其中包括生物分子的重要生理功能及荧光检测方法的简介;随后介绍了单细胞水平上的生物分子的检测重要性及单细胞内多种金属离子同时定量检测的重要性,并总结了用于单细胞检测的微流控方法的优势;最后介绍了单分子检测的研究进展以及单分子水平上细胞膜蛋白检测的意义及方法。第二章介绍了基于目前单细胞水平上多种金属离子检测的困难,为了解决这些困难我们发展了一种基于微流控系统同时定量检测单个神经细胞内Na+,K+,Ca2+,Mg2+四种金属离子的新方法,并将该方法应用于研究Aβ25-35诱导的PC-12细胞内四种离子的变化情况。该方法为单细胞内多种金属离子的研究提供了一种新的思路,同时研究结果也为多种金属离子如何在神经疾病的调节中发挥协同作用提供了新的启示。第三章在单细胞检测的基础上,进一步提高检测灵敏度,发展了一种单分子水平上的细胞膜蛋白的检测方法。选取了细胞膜蛋白PTK7作为研究对象,利用核酸适配体高效靶向目标膜蛋白,并通过引入滚环扩增反应来实现信号的放大,从而发展一种灵敏度好、毒性小、可进行细胞原位单分子成像检测的方法。该方法的检测灵敏度也能够满足低丰度的细胞膜蛋白的单分子检测。最后对本论文所建立的单细胞及单分子检测方法进行了总结。本论文在提高检测灵敏度的角度上,针对单个细胞内的多种金属离子实现了同时定量检测,并进一步提高检测灵敏度,研究了单分子水平上的细胞膜蛋白。这两种方法逐渐递进,本质都是针对细胞内生物分子的研究。而基于本论文建立的方法,细胞内其他生物分子的单细胞及单分子水平的检测还需更进一步的探索。
朱贵州[3]（2016）在《OGT催化HDAC1的O-GlcNAc修饰在肝细胞肝癌中的作用》文中指出目的:研究N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（N-acetyl glucosamine transferase,OGT）对组蛋白去乙酰化酶1（histone deacet ylases 1,HDAC1）的O-连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetyl glucosamine,O-GlcNAc）修饰的调节作用,并探讨其在肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的发生发展作用及其分子机制。方法:1.通过免疫共沉淀和麦胚外源凝聚素方法证明HDAC1是否存在O-GlcNAc修饰;通过OGA的抑制剂PUGNAC处理肝癌细胞,检测HDAC1的O-GlcNAc修饰情况;通过免疫共沉淀和Western Blot,在组织水平和细胞水平上检测OGT、HDAC1及其糖基化表达情况;运用质谱分析HDAC1的O-GlcNAc糖基化位点,并将其糖基化位点突变后检测HDAC1的O-GlcNAc水平。2.通过免疫共沉淀检测OGT与HDAC1的内源性相互作用;通过GST-pull down、免疫共沉淀证明OGT与HDAC1外源性相互作用;通过免疫荧光共聚焦研究OGT与HDAC1的共定位情况;通过过表达外源性OGT,分析OGT对HDAC1的O-GlcNAc调节情况。3.通过HDAC荧光活性分析试剂盒、Western Blot和免疫共沉淀检测HDAC1的O-GlcNAc修饰对HDAC1酶活性的影响以及HDAC1糖基化和磷酸化之间的关系。4.通过流式细胞术分析HADC1的O-GlcNAc修饰对肝癌细胞周期的影响;运用CCK-8实验检测OGT、HDAC1及其O-GlcNAc修饰对肝癌细胞增殖的影响,并通过免疫印迹检测细胞周期蛋白分子的表达情况;运用免疫印迹和RT-PCR检测HDAC1的O-GlcNAc突变对p21蛋白和mRNA水平表达的影响;通过荧光素酶报告基因和染色体免疫共沉淀检测HDAC1的O-GlcNAc修饰对p21启动子活性及Sp1转录活性的影响。通过划痕实验和细胞Transwell侵袭实验分析HDAC1的O-GlcNAc修饰对肝癌细胞迁移及侵袭的影响,并运用Western Blot和RT-PCR检测HDAC1糖基化对E-cadherin蛋白和mRNA表达水平的影响。结果:1.OGT催化HDAC1的O-GlcNAc修饰,并且质谱分析和免疫共沉淀确定主要的糖基化位点为Thr114和Ser263;HDAC1的O-GlcNAc修饰在肝癌组织和细胞上表达增加。2.在肝癌细胞中,OGT与HDAC1存在相互作用,并且免疫共聚焦显示两者共定位于细胞核;过表达OGT可促进HDAC1的O-GlcNAc修饰。3.HDAC1的O-GlcNAc修饰可促进其组蛋白去乙酰化酶活性,并且糖基化的增加可促进HDAC1的磷酸化修饰。4.HDAC1的O-GlcNAc突变可促进p21的表达并且抑制肝癌细胞的生长,这种机制是通过影响Sp1转录活性完成;同样,HDAC1的O-GlcNAc突变可抑制肝癌细胞的迁移及侵袭,同时E-cadherin的表达增加。结论:1.OGT可催化HDAC1的Thr114和Ser263发生O-GlcNAc修饰,并且HDAC1的O-GlcNAc修饰在肝癌中高表达。2.在肝癌中,OGT与HDAC1结合,并促进HDAC1的O-GlcNAc修饰。3.HDAC1的O-GlcNAc修饰可通过促进其磷酸化修饰增强其组蛋白去乙酰化酶活性。4.HDAC1的O-GlcNAc修饰可通过抑制p21的表达促进肝癌细胞的增殖;HDAC1的O-GlcNAc糖基化修饰通过调节E-Cadherin表达促进肝癌细胞的迁移及侵袭。上述结果表明HDAC1的O-GlcNAc修饰可促进肝癌的发生发展。
任亮[4]（2015）在《趋化因子CXCL12及其受体CXCR4/CXCR7在人早孕期母—胎界面的表达及其生物学功能》文中研究指明成功的妊娠需要具有发育潜能的胚胎、良好的子宫内膜容受性和母-胎免疫微环境稳态三个必要条件。从免疫学角度而言,胚胎着床类似于同种异体物移植,母体对携带父系抗原的胚胎不仅不排斥,还可通过持续的母-胎对话（maternal-fetal crosstalk）建立独特的母-胎界面免疫微环境（maternal-fetal interface microenvironment）,保护胚胎免受母源性免疫系统的攻击,为其提供营养支持直至分娩。母-胎免疫调节可被认为是母-胎免疫微环境免疫耐受的核心所在,在细胞和分子层面上表现为胎源性的滋养层细胞和母源性的免疫活性细胞群在子宫局部互相作用,产生的各种细胞因子、生长因子、免疫因子等,从而形成了一个持续的免疫调节网络,直至妊娠的完成。这个调控网络不仅存在于子宫局部,还存在于母体全身。当免疫微环境调控机制发生紊乱时,母体对胎儿产生排斥反应,可导致不孕症、先兆子痫、自然流产、胎儿宫内生长受限等病理妊娠相关疾病发生。母-胎界面免疫微环境调控网络的“面纱”仍未完全解开,许多研究结果提示了趋化因子及其受体在其中发挥极其重要的作用。母-胎界面存在着丰富的趋化因子及其受体表达。趋化因子是一类可特异性介导免疫细胞定向移动的小分子细胞因子,与位于细胞膜上的趋化因子受体结合后,可活化下游相关信号通路,参与调控机体发育、炎症反应、免疫应答、血管生成和肿瘤细胞迁移侵袭等多种病理生理过程。趋化因子受体CXCR7新近被鉴定为趋化因子CXCL12的第二受体,打破了CXCL12 与 CXCR4一一配对的经典关系。作为非典型趋化因子受体,CXCR7具有不活化经典G蛋白偶联受体信号通路和“清道夫”受体双重属性,其在生殖领域尤其是母-胎界面的表达和功能尚不清楚。课题组前期对趋化因子CXCL12/CXCR4信号通路在母-胎界面有一定的研究基础。因此,本课题拟建立人早孕期母-胎免疫微环境三种功能学细胞的体外分离、培养体系,探讨CXCR7在免疫微环境中的表达及其可能的生物学功能。我们推测CXCR7参与了CXCL12/CXCR4信号通路,且作为重要桥梁介导母-胎界面免疫微环境功能学细胞间的对话和交流,研究结果将为完善趋化因子及受体CXCL12/CXCR7CXCR4轴在母-胎免疫耐受的调节机制提供依据,进而为免疫相关的病理妊娠临床防治策略提供新的研究方向。第一部分 建立人早孕期母-胎界面免疫微环境功能学细胞的体外分离培养体系目的：体外建立稳定的人早孕期母-胎界面绒毛滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞的分离、培养和鉴定体系,获得纯度高和生长活性好的研究载体。方法：收集健康育龄期妇女早孕6-10周行人工流产术后的无菌绒毛组织和蜕膜组织,采用胶原酶IV、胰蛋白酶和DnaseⅠ联合消化模式,应用网筛分离、Percoll密度梯度离心法、时间差异贴壁法和ECM胶（Extra Cellular Matrix,细胞外基质）包被培养板,获得绒毛滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞。应用免疫细胞化学法和CCK-8法 （Cell Counting Kit 8,细胞增殖与毒性检测试剂盒）对其纯度和体外生长活性进行鉴定。结果：体外成功分离获得绒毛滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞。免疫细胞化学法结果显示,上皮细胞来源的滋养细胞和蜕膜腺上皮细胞表达角蛋白7,不表达波形蛋白；间质细胞来源的蜕膜基质细胞表达波形蛋白,不表达角蛋白7,三种细胞的纯度可达90%以上,CCK-8法结果显示三种细胞体外生长活性良好。结论：建立稳定的人早孕期绒毛滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞的体外分离培养体系。目标细胞群数量和活力良好,纯度达90%以上,满足后续实验需求。应用ECM胶可促进绒毛滋养细胞和蜕膜腺上皮细胞粘附生长。第二部分趋化因子受体CXCR7在人早孕期母-胎界面免疫微环境的表达目的：解析趋化因子受体CXCR7在人早孕期母-胎界面滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞的表达情况。方法：应用免疫组织化学法检测健康育龄期妇女孕6-10周行人工流产术后的绒毛和蜕膜组织中CXCL12/CXCR7/CXCR4的表达情况；应用间接免疫荧光法、免疫细胞化学法和流式细胞术检测绒毛滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞CXCR4/CXCR7的定位和表达水平。结果：免疫组织化学结果显示：绒毛组织中不同类型的滋养细胞中CXCR7均呈阳性着色；蜕膜组织中基质细胞和上皮细胞也呈棕褐色阳性着色。应用间接免疫荧光法在绒毛滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞的细胞膜、细胞质和核膜均可观察到CXCR4和CXCR7的荧光表达。免疫细胞化学法显示：CXCR7和CXCR4及其配子CXCL12在三种细胞中共表达模式。应用Image-Pro Plus 6.0软件分析：滋养细胞中,CXCR7染色平均光密度值（1.649±0.052）低于CXCR4（1.763±0.084）；蜕膜基质细胞中,CXCR7染色平均光密度值（1.786±0.035）低于CXCR4（1.938±0.043）：而蜕膜腺上皮细胞中,CXCR7染色平均光密度值（1.276土0.033）高于CXCR4 （1.058±0.029）,结果有统计学差异（P<0.05）。流式细胞术结果提示：滋养细胞膜CXCR4平均表达水平为1.8±0.3%,CXCR7为5.56±2.08%；蜕膜腺上皮细胞膜CXCR4平均表达水平为2.14±0.77%,CXCR7为5.6±1.91%；蜕膜基质细胞膜CXCR4平均表达水平为20.28±8.78%vs50.86±13.26%（未破膜vs破膜）,CXCR7为6.78±2.68% vs 16.22±6.44%（未破膜vs破膜）,数据均有统计学差异（P<0.05）。结论：绒毛滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞存在CXCL12/CXCR4/CXCR7共表达,CXCR7在母胎界面功能学细胞间不同的表达模式差异可能是其协助CXCL12/CXCR4信号通路发挥调控作用的关键所在。第三部分CXCL12/CXCR7/CXCR4轴在母-胎界面免疫微环境调控作用初探目的：探讨CXCR7是否参与母-胎界面滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞的体外增殖和侵袭过程,C XCL12/CXCR7/CXCR4信号通路对三种细胞的体外增殖和侵袭能力影响,探讨蛋白CXCR4和CXCR7间相互关系。方法：制备滋养细胞条件培养液,设计分组分别添加重组人CXCL12（100ng/ml）、重组人CXCL12 （100ng/ml）+CXCL12中和抗体（25μg/m1）、重组人CXCL12（100ng/ml）+CXCR4中和抗体（20μg/m1）、重组人CXCL12（100ng/ml） +CXCR7中和抗体（10μg/ml）, CCK-8试剂盒检测三种细胞的体外增殖能力；流式细胞术检测添加上述不同组处理因素后蜕膜基质细胞总CXCR4和CXCR7的表达情况；建立滋养细胞-蜕膜基质细胞共培养模型,应用侵袭实验探讨重组人CXCL12和滋养细胞条件培养液对蜕膜基质细胞的体外侵袭能力的影响。结果：增殖实验结果显示,与对照组相比,添加重组人CXCL12和滋养细胞条件培养液明显提高滋养细胞体外增殖能力,添加CXCR4和CXCR7中和抗体后,细胞增殖能力明显下降,数据有统计学差异（P<0.05）；重组人CXCL12和滋养细胞条件培养液对蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞体外增殖能力无影响,组间比较无统计学差异（P>0.05）。流式细胞术分析CXCL12对DSC的CXCR4表达的影响,发现与对照组相比,给予重组人CXCL12可提高总CXCR4的表达水平,且添加CXCL12、CXCR4和CXCR7中和抗体,细胞总CXCR4呈现不同下降趋势,组间有差异（P<0.05）；添加重组人CXCL12后CXCR7的表达水平上升,但添加三种中和抗体后,CXCR7表达虽呈下降趋势,组间无差异（P>0.05）。Transell侵袭实验发现,滋养细胞来源的CXCL12可通过CXCL12/CXCR4信号通路诱导蜕膜基质细胞侵袭,且不能完全被CXCL12口CXCR4中和抗体阻断。结论：CXCL12/CXCR4/CXCR7信号通路可介导绒毛滋养细胞的体外增殖过程,对蜕膜基质细胞和蜕膜腺上皮细胞的体外增殖能力无影响。重组人CXCL12可上调蜕膜基质细胞总CXCR4和CXCR7的表达。重组人CXCL12因子和滋养细胞条件培养液均可明显提高蜕膜基质细胞体外侵袭和运动能力,应用CXCL12和CXCR4中和抗体可部分阻断滋养细胞条件培养液对基质细胞的促侵袭作用。在早孕期胚胎着床、滋养细胞分化侵袭和内膜蜕膜化的过程中,子宫蜕膜不只是被动的被侵袭,而是主动包绕容纳滋养细胞,促进其侵袭,协助胚胎植入,这种主动识别和接纳能力或许是解析子宫内膜容受性形成的关键。
张振松[5]（2013）在《AFP158-166特异性T细胞的检测及体外诱导的实验研究》文中认为目的：检测肝细胞癌患者外周血AFP158-166特异性T细胞比例,并利用健康志愿者外周血淋巴细胞,体外诱导AFP158-166特异性T细胞,为肝癌的免疫治疗奠定基础。方法：1、采用FITC荧光标记的HLA-A2抗体及HLA-A2基因分型高分辨检测试剂盒（PCR-SSP）,筛选HLA-A0201患者。取外周血,密度梯度离心法分离获取外周血单个核细胞（PBMC）,流式细胞技术检测T细胞亚群；通过R-PE标记的MHC-AFP158-166肽五聚体,流式细胞技术检测患者外周血中AFP158-166特异性T细胞的比例。2、筛选HLA-A0201的健康志愿者,分离PBMC,按如下两种方法分别刺激特异性T细胞增殖。（1）培养T2杂交瘤细胞,负载HLA-A0201抗原表位肽AFP158-166,γ射线照射（75Gy）处理,与PBMC1:1混合,反复刺激,IL-2维持。（2）以含人GM-CSF、IL-4及TNF-α细胞因子的培养基培养PMBC,贴壁粘附培养法培养收获树突状细胞（DC）,将DC负载HLA-A0201表位肽AFP158-166,与新鲜淋巴细胞以1：10比例混合,含细胞因子IL-2培养液培养。待出现细胞大量增殖后收获细胞,MHC-AFP158-166肽五聚体检测AFP158-166特异性T细胞,细胞毒性实验检测其对靶细胞的特异性杀伤能力。结果：（1）28例肝细胞肝癌患者中,筛选出基因型HLA-A0201阳性者18例,2ml外周血可分离PBMC约1x107个,未能检测出CD8+五聚体+T细胞。（2）T2细胞与AFP158-166共同孵育,细胞表面HLA-A2分子表达增加,随着肽浓度增加,HLA-A2平均荧光强度及表达率逐渐增加,在抗原肽浓度为45μg/ml与60μg/ml时达到最大结合效力,90μg/ml时HLA-A2分子的表达下降。10例健康志愿者,基因型HLA-A0201阳性者3例,每20ml外周血培养的细胞中可收获DC细胞（1.94±0.79）×106个,培养至第7天检测表面抗原： CD83、CD80、CD86和HLA-DR阳性率分别为（62.6±4.2）%、（90.4±2.4）%、（98.2±0.3）%和（87.9±4.2）%。（3）DC负载AFP158-166与淋巴细胞混合培养14d左右出现大量细胞增殖,流式检测CD8+MHC-AFP158-166五聚体+细胞7.5%,与负载AFP158-166的T2细胞混合培养的淋巴细胞中,未检测到CD8+MHC-AFP158-166五聚体+细胞。（3）细胞毒性实验显示,DC激活的淋巴细胞对AFP+肝癌细胞HepG2和负载AFP的T2细胞的杀伤率显着高于对未负载AFP的T2细胞和负载Her2抗原肽的T2细胞的杀伤率,差异具有统计学意义（p<0.05）（效靶比20：1时分别为45.12±10.60%和39.06±±6.48%vs14.83±9.82%和2.51±0.14%）；T2激活的淋巴细胞依效靶比20：1对上述细胞杀伤率分别为：HepG2（14.03±11.17）%,负载AFP的T2（8.49±±7.34）%,T2（3.26±0.32）%,负载Her2的T2（3.36±2.45）%,与DC激活的淋巴细胞对HepG2、负载AFP的T2细胞的杀伤作用比较,差异具有统计学意义（p<0.05）。结论：MHC-肽五聚体检测未能从AFP+肝癌患者外周血中检出AFP158-166特异性T淋巴细胞,提示患者免疫系统对AFP产生耐受或无能。DC负载抗原肽AFP158-166可体外刺激健康志愿者外周血PBMC,获得AFP158-166特异性T淋巴细胞,可特异性杀伤AFP+肝癌细胞。本研究结果为肝癌的过继细胞免疫治疗研究提供了实验基础。
杨飞华[6]（2013）在《CXCR7拮抗剂的构建与表达》文中指出一、背景乳腺癌是目前女性发病率和死亡率排名第一的常见恶性肿瘤。2011年美国Cancer Journal for Clinicians杂志公布的统计数据显示,美国2011年有230480例女性罹患乳腺癌,其中57650例为新增原发性乳腺癌,占女性新发恶性肿瘤的30%。同样,在发展中国家或地区乳腺癌现在也是女性癌症死亡的主因,较十几年前以宫颈癌为常见的癌症死亡原因发生了转变。乳腺癌具有发病率高、侵袭性强、病程进展缓慢、隐蔽性强、不易早期诊断、易于转移等特点。因此,对乳腺癌的发生、发展及转移的机制研究十分重要。乳腺癌是一种血管高度依赖性肿瘤。肿瘤微环境的改变、原发性乳腺癌的局部肿瘤微血管生成以及侵袭细胞外基质和基底膜等每一环节都与趋化因子及其受体密切相关。趋化因子（chemokine）,也称趋化激素或化学激素,是一类由不同类型的细胞分泌的、能使细胞发生趋化运动的、对免疫细胞具有趋化作用、相对低分子质量（8-12kD）的小分子细胞蛋白家族。趋化因子受体是能够特异性结合趋化因子的细胞膜蛋白,属于七次跨膜的G蛋白偶联受体家族,并选择性地表达在靶细胞表面。趋化因子与其受体结合,启动或调节相关的信号传导,参与各种生理、病理过程。趋化因子CXCL12,又称基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1, SDF-1）,是骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白,有两种主要形式：SDF-1α和SDF-1β,是已知唯一能与受体CXCR4结合并能激活它的趋化因子。SDF-1广泛地表达于多种细胞和组织中,包括免疫细胞、肺、肾、脑、心脏等,是调节B淋巴细胞、造血干细胞生成及淋巴细胞迁移的关键因子。趋化因子SDF-1对淋巴细胞有强烈的趋化作用并在发育中起着重要的作用。在胚胎发育中,SDF-1诱导造血干细胞从胎儿肝脏到骨髓的迁徙。在SDF-1缺失的小鼠,其早期胚胎的心脏及大脑发育异常。SDF-1通过与CXCR4结合介导肌动蛋白聚合,启动下游信号通路,引起MEK/ERK磷酸化和胞内游离的钙离子增加。同时,通过形成伪足、调控肿瘤细胞表面某些黏附因子的表达或活性等方式,从而参与形成肿瘤迁移（migration）和转移的有利微环境,进而调控肿瘤细胞的生长、存活、转移及肿瘤新生血管形成。CXCR7是SDF-1新发现的另一个受体,与SDF-1结合能力比CXCR4更强。由于CXCR7缺乏趋化因子受体典型的G蛋白偶联受体序列,故SDF-1活化CXCR7后,并不能引起细胞钙流变化和细胞迁移,也不会激活细胞内促分裂原活化蛋白激酶（MAP）或PI1激酶/PKB等级联信号通路。Ulrike Naumann等发现,CXCR7能清除其配体SDF-1（CXCL12）及I-TAC （CXCL11）,降低其浓度。在斑马鱼及哺乳动物细胞,无论配体是否存在,CXCR7都不断的在质膜与细胞质之间的循环。有观点认为,SDF-1与诱饵受体CXCR7结合后,并不激活典型的G蛋白信号通路,却能通过β-arrestin激活促分裂原活化蛋白激酶（MAP）。利用CXCR7拮抗剂或β-arrestin siRNA可显着地减弱内源性表达CXCR7的血管平滑肌细胞的迁移。可见,介导CXCR7信号通路的是β-arrestin, CXCR7是一个独立的β-arrestin受体。虽然,目前对CXCR7的具体功能尚未研究确切,但其在免疫、肿瘤以及血管生成中所发挥的重要作用毋庸置疑的。CXCR7能促进癌细胞的存活,低表达CXCR7的野生型MDA-MB-435s乳腺癌细胞难以在低血清（1%FBS）培养基中存活,而转染CXCR7质粒的MDAMB-435s细胞却能在同样条件下存活,进入对数生长期。Wang等发现,CXCR7在前列腺癌中高度表达。高密度组织染色微数列显示,在侵袭性较强的肿块,CXCR7蛋白的表达量更多。CXCR7的表达促进癌细胞的黏附、侵袭、增殖及存活,CXCR7对多种参与肿瘤侵袭的分子的表达都有影响,如CD44、钙黏着蛋白-11（CDH11）、lL-8、血管内皮生长因子、TGF-β。基于CXCR7的功能多样性,特异性阻断CXCR7有望成为癌症治疗的新策略。一些小分子抑制剂如CCX733、CCX266、siRNA及封闭性抗体已经应用在体内、外实验研究中。但总的来说,CXCR7的表达调控机制、介导生物效应的信号通路尚未研究清楚,有待更进一步的深入研究。本课题组曾对SDF-1进行基因改造,获得一种CXCR4竞争性拮抗剂：SDF-1/54R,并证实SDF-1/54R可诱导CXCR4内吞,使细胞膜表面CXCR4迅速消失,随之由CXCR4介导的肿瘤细胞迁移受到抑制,并且不激活由其介导的下游信号通路,表现出很好的抗癌作用。但由于获得的SDF-1/54R蛋白为无生物活性的包涵体,虽较易获得大量的包涵体蛋白,但后期变性、复性操作繁琐,活性蛋白得率也较低。基于SDF-1新受体CXCR7的发现和本课题组对SDF-1/54R的前期研究结果,我们推测SDF-1突变体SDF-1/54R也是一种CXCR7特异性拮抗剂,能够竞争性抑制SDF-1/CXCR7介导的乳腺癌增殖与转移。为验证该假说,本课题拟利用基因工程技术更换SDF-1突变体SDF-1/54R的表达载体,以获得可溶表达的目的蛋白SDF-1/54R。同时,通过流式细胞术筛选到高表达CXCR7的乳腺癌细胞,并利用该细胞考察获得的SDF-1/54R蛋白对CXCR7介导的乳腺癌细胞增殖和转移的抑制作用,为将SDF-1/54R开发成以CXCR7的靶点的新型多肽类抗癌药物奠定必要的前期工作基础。二、目的利用基因工程技术更换SDF-1突变体SDF-1/54R的表达载体,以获得可溶表达的目的蛋白SDF-1/54R,并通过体外实验证实SDF-1/54R对SDF-1/CXCR7介导的乳腺癌细胞增殖和转移的抑制作用。三、研究方法1、流式细胞术筛选高表达CXCR7的乳腺癌细胞培养各种乳腺癌细胞包括MCF-7、MDA-MB-231等,待生长状态良好后胰酶消化,收集细胞后用PBS洗涤1次、调整细胞浓度。再将细胞重悬于200μL的PBS中,制成单细胞悬液,并分成体积相等的两组。其中,实验组加入1μLCXCR7一抗,混匀后4℃孵育；30min后用PBS充分洗涤细胞2次,重悬细胞于100μL的PBS中,加入0.5μL FITC标记的羊抗兔抗体,对照组加入0.5μLFITC标记的羊抗兔抗体,混匀后4℃孵育；30min后用PBS充分洗涤细胞2次,重悬细胞于200gL的PBS中,流式细胞仪检测细胞表面的CXCR7的表达。2、SDF-1/54R/pET-41a+的构建、表达及纯化为获得可溶表达的SDF-1/54R蛋白,以SDF-1/54R/pET-30a+质粒为模板,设计引物,PCR扩增SDF-1/54R基因,PCR产物双酶切后连接至载体pET-41a+,构建重组载体SDF-1/54R/pET-41a+。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）,经化学诱导剂IPTG诱导后,表达产物通过SDS-PAGE检测。然后通过优化表达条件,如IPTG浓度、诱导温度、时间等,确定最佳表达条件后大量制备SDF-1/54R蛋白。采用GST亲和层析系统纯化可溶表达的融合蛋白。还原型谷胱甘肽洗脱液洗脱,收集目标蛋白,SDS-PAGE检测。检测正确后,对纯化得到的融合蛋白溶液进行透析,以满足后续酶切条件。参考肠激酶说明书,预实验确定最佳酶切反应体系、时间、温度、浓度等条件,切除重组融合蛋白N端的GST-tag,并再次利用GST亲和层析系统对酶切产物进行二次分离纯化。收集洗脱下来的目的蛋白SDF-1/54R, SDS-PAGE检测分析。3、SDF-1/54R的活性检测利用细胞实验模型对SDF-1/54R的体外活性进行检测。首先利用已筛选到的CXCR7高表达的乳腺癌细胞MCF-7,通过流式细胞术检测SDF-1/54R诱导细胞表面受体CXCR7内化的能力,然后利用MTT法检测SDF-1/54R对CXCR7的乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用。趋化实验考察SDF-1/54R对CXCR7介导的细胞转移的抑制效应。四、结果1、流式细胞术筛选高表达CXCR7的乳腺癌细胞利用流式细胞仪检测乳腺癌细胞表面CXCR7的表达,结果发现,CXCR7在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中高表达,其表达量分别为68.64%和66.13%, CXCR7在乳腺癌细胞4T-1中不表达。2、SDF-1/54R/pET-41a+的构建、表达及纯化测序结果表明,重组表达载体SDF-1/54R/pET-41a+构建成功,转化大肠杆菌BL21（DE3）中,成功表达了可溶性融合蛋白GST-SDF-1/54R。在最佳条件下大量表达重组融合蛋白GST-SDF-1/54R,并经过优化纯化、透析、肠激酶酶切等相关技术路线,最后分离、纯化出较高纯度的目的蛋白SDF-1/54R。3、SDF-1/54R的活性检测利用流式细胞仪检测发现,SDF-1/54R能够显着降低MCF-7细胞膜表面CXCR7的表达。MTT法结果表明SDF-1/54R能在48小时内显着抑制CXCR7介导的乳腺癌细胞MCF-7的增殖。趋化实验表明SDF-1/54R能够竞争性抑制SDF-1/CXCR7诱导的MCF-7细胞的跨膜转移。五、结论1、检测的乳腺癌细胞中MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞表达CXCR7,其中MCF-7细胞表达量最高,达69.99%。2、成功利用原核表达系统,表达出可溶性GST-SDF-1/54R融合蛋白,为获得大量有活性的SDF-1/54R蛋白奠定基础。在成功表达后,优化条件,制备去掉GST标签的、具备生物活性的可溶性目的蛋白SDF-1/54R蛋白。3、SDF-1/54R能够诱导乳腺癌细胞MCF-7膜表面CXCR7的内在化消除,并显着抑制CXCR7介导的细胞增殖和转移,是一种良好的CXCR7特异性拮抗剂。为其进一步的功能研究和体内活性实验奠定了前期工作基础。
臧凌鹤[7]（2012）在《冬凌草甲素增强U937细胞吞噬凋亡小体的机制研究》文中进行了进一步梳理巨噬细胞对凋亡细胞快速有效的吞噬并清除,可防止毒性内容物释放,保护机体免受炎症损伤或自身免疫性疾病,有利于维持内环境的稳态。本文对冬凌草甲素增强分化的人组织淋巴瘤U937巨噬样细胞吞噬紫外线（UV）照射诱导U937凋亡的细胞机制进行了系统研究。实验结果表明,低剂量（0.6-2.5μM）的冬凌草甲素具有增强分化的U937巨噬细胞对UV照射（52.1J/m2）诱导凋亡的U937细胞的吞噬作用,此作用可能有利于冬凌草甲素的抗肿瘤活性。进一步研究发现,冬凌草甲素诱导的吞噬刺激被几种蛋白特异性抑制剂所抑制,包括：磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）家族特异性抑制剂wortmannin、磷脂酶C（PLC）特异性抑制剂U73122, Ras抑制剂,Raf1抑制剂,MAPK家族ERK抑制剂PD98059, NF-кB抑制剂PDTC以及COX-2抑制剂NS398。冬凌草甲素与U937细胞作用不同时间后,引起PI3K-Akt, PLC表达上调,Ras-Raf-ERK通路活化,NF-кB/COX-2/Caspase-1途径激活介导白细胞介素（IL-1β）的释放。说明冬凌草甲素激活以上信号途径,发挥调节吞噬的作用。2.5州冬凌草甲素增强吞噬作用的同时,通过激活ERK/NF-кB途径诱导U937巨噬细胞自噬,自噬发挥促进吞噬的作用。自噬特异性抑制剂3MA及自噬相关蛋白Beclin-1siRNA抑制了U937细胞对凋亡小体的吞噬。自噬通过正反馈调节ERK,负反馈调节NF-кB/IL-1β调节吞噬作用。研究还发现,2.5μM冬凌草甲素时间依赖性的诱导活性氧（ROS）的产生,H2O2及-OH是ROS的主要形式。ROS的清除剂NAC, H2O2清除剂CAT及·OH清除剂GSH,抑制了冬凌草甲素增强的吞噬作用。ROS清除剂同时抑制了自噬的发生。ROS通过诱导自噬,降低线粒体膜电位,激活PI3K-Akt及Ras-Raf-ERK途径促进冬凌草甲素诱导的吞噬作用。冬凌草甲素诱导ROS的产生对细胞ATP水平未见显着影响。同时,2.5μM冬凌草甲素时间依赖诱导一氧化氮（NO）的产生及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达。NOS抑制剂1400W及L-NAME抑制冬凌草甲素增强的吞噬及自噬,而NO供体硝普钠（SNP）以及炎性刺激剂脂多糖（LPS）与冬凌草甲素作用相似,诱导NO产生,促进对凋亡细胞的吞噬,诱导自噬。NO促进吞噬作用依赖自噬的发生,并通过激活NF-кB/COX-2途径诱导IL-1p释放发挥作用。NF-кB/COX-2/IL-1β途径正反馈NO的产生；而自噬负反馈调节NO的产生,清除过度炎症,发挥调节炎症与免疫平衡的作用。综上所述,冬凌草甲素通过激活PI3K-Akt, PLC γ-Ras-Raf-ERK及NF-кB-COX-2-Caspase-1信号途径从而介导IL-1β的释放刺激U937巨噬样细胞吞噬凋亡小体；这些通路的激活诱导自噬的发生,自噬正反馈调节ERK,负反馈调节炎症通路对吞噬起到促进作用；冬凌草甲素同时诱导ROS及NO的产生,ROS通过降低线粒体膜电位,并激活PI3K-Akt, PLC γ-Ras-Raf-ERK途径诱导自噬而促进吞噬,而NO激活NF-кB-COX-2-Caspase-1-IL-1β炎症通路,诱导自噬的发生,从而促进吞噬。
吴寒[8]（2012）在《肝癌患者CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞与肝癌复发转移关系的研究》文中提出肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一,在恶性肿瘤相关死亡率中位居第三位。我国是肝癌高发地区,约占全球肝癌病例一半以上。肝癌严重影响我国人民的健康事业,并带来了巨大的社会负担。由于肝癌早期诊断较难,患者就诊时往往已属晚期。虽然近来手术切除、肝移植、射频消融、肝动脉栓塞化疗和分子靶向治疗等手段对肝癌的治疗取得了很大的进步,但总体上术后高复发率和高死亡率近来未有明显改善。免疫治疗作为肿瘤最有希望的治疗手段越来越受到重视。同时肝脏作为免疫特惠器官又是免疫治疗理想的靶器官。既往对肝癌的研究集中在肝癌细胞本身的生物学行为上,忽略了肝癌演进过程中肝癌细胞与肿瘤微环境（tumor microenvironment）中各种免疫细胞之间的相互作用,而后者被认为在肿瘤的发展、侵袭中发挥重要的作用。具有免疫抑制性作用的调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）在肿瘤细胞逃避局部微环境的免疫监视从而发生免疫逃逸的过程中,扮演着重要的角色。本研究从肿瘤微环境中调节性T细胞的特异性表面标志入手,证实了在免疫微环境中CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞的浸润和表达,表现为更强的免疫抑制表型,并与肝癌的临床病理特征相关。进而我们通过全基因芯片筛选出较重要的调控肿瘤浸润调节性T细胞的免疫抑制功能相关的功能基因,分析肿瘤浸润调节性T细胞与肿瘤细胞相互作用的免疫信号通路。基于凝集素芯片检测HCC患者外周血调节性T细胞膜特征性的聚糖改变。最后通过对调节性T细胞与galectin-1在HCC中表达的相关性分析,为HCC预后的预测和免疫治疗提供新的选择。第一部分HCC患者CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞的表达和表型研究本部分研究旨在探索CD4+CD25+CD127loW/-CD49d-调节性T细胞在HCC患者体内不同部位（外周血、癌旁肝脏和癌灶）的分布和表达。我们通过梯度离心结合酶消化法,建立了稳定的获取外周血、组织内浸润淋巴细胞分离方法。借助于流式细胞仪,首次采用四色荧光分选淋巴细胞,配对比较分析了三处不同来源的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞的分布表达和表型。发现在HCC患者外周血、癌旁肝组织和癌灶中,CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞的分布和免疫表型截然不同。首先,HCC患者肿瘤微环境中存在高表达FoxP3的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞。其次,HCC患者外周血调节性T细胞占整个CD4+T细胞比例显着高于健康对照者。HCC患者肿瘤浸润调节性T细胞占整个CD4+T细胞比例显着高于配对的癌旁肝组织和外周血。最后,HCC患者癌灶浸润调节性T细胞表达较高的免疫抑制表型,如FoxP3、CTLA-4和GITR。混合淋巴细胞实验显示CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞对活化分子CD154的抑制率较对照明显增强,表明具有较强的免疫抑制能力。结合体外扩增实验结果,这群淋巴细胞分泌高水平的免疫抑制因子IL-10和TGF-B1,扩增后的细胞仍保持较高的抑制表型。我们分选出的肿瘤浸润的这群具有抑制能力的淋巴细胞较癌旁肝组织和外周血来源的显示出更强的免疫抑制能力。我们首次采用四色荧光分选出的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T淋巴细胞高表达调节性T细胞的特异性标志FoxP3,较其他相关研究文献可获得更高纯度的调节性T细胞,并且这群高表达FoxP3的T淋巴细胞保持活性状态,可用于下游的功能实验。CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T细胞高表达于肝癌肿瘤微环境中,表现出更强的免疫抑制表型,体现了肿瘤免疫微环境中调节性T细胞的免疫抑制功能,参与HCC的肿瘤生物学进程。第二部分基于全基因芯片的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞基因表达谱分析结合前部分研究结果和其他相关文献报道,我们可以认为癌灶浸润性调节性T细胞之所以表达增强的抑制表型,必然是受到肿瘤微环境中肿瘤细胞和其他免疫细胞的影响,导致其与免疫抑制功能相关的基因表达上调和信号通路激活。但具体参与的调控基因和信号通路尚未有系统的报道。在本部分研究中,我们利用Agilent全基因芯片对9例HCC患者配对的癌灶和癌旁肝组织中的调节性T细胞进行全基因表达谱的对比分析,以期找出与免疫抑制功能相关的关键差异基因及相应的信号通路。我们利用酶消化法和梯度离心法分离出癌灶和癌旁肝组织浸润淋巴细胞,再利用流式细胞仪分选CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞。细胞RNA抽提后与Agilent全基因芯片杂交,GenePix4000B芯片扫描仪扫描分析结果。结果显示Hierarchical聚类分析样本划分不同组别明显。将标准设为Fold Change≥2,P<0.05后,癌灶浸润调节性T细胞相对于癌旁肝组织浸润调节性T细胞共有1032个基因表达上调,1357个基因表达下调。PATHWAY结果显示两组间有7条上调通路和9条下调通路差异。GO分析显示癌灶浸润调节性T细胞相对于癌旁肝组织调节性T细胞有431条GO条目上调,237条GO条目下调。我们选取与肿瘤免疫和T细胞免疫相关的GO条目并按照Fold Change大小,从前15条中选取基因CD46、BCL6、TNFRSF11A、MDM4、P2RX7、CD276和IL6R进行分析,并对选取的基因进行RT-PCR验证。其中高表达RANK （TNFRSF11A基因编码）的调节性T细胞与高表达RANKL的HCC肿瘤细胞之间的RANK-RANKL信号通路,高表达IL-6R的调节性T细胞与高表达IL-6的HCC肿瘤细胞之间的IL6-IL-6R信号通路在HCC肿瘤免疫逃逸中可能起到很重要的作用。第三部分凝集素芯片检测CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞和肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L和Hep3B特征性糖基化改变肿瘤特征性糖基化改变影响着肿瘤细胞的恶性生物学行为。同样,异常的糖基化改变也影响着调节性T细胞的功能。目前,糖生物方兴未艾,是研究肿瘤发生发展的一个新的领域。肿瘤细胞异常的糖基化改变已证实与肿瘤细胞的恶性生物学行为相关。糖基转移酶调控糖基化改变。现已证实糖基化改变在淋巴细胞的成熟,阴性阳性分化选择,归巢,凋亡等过程中起着非常重要的作用。调节性T细胞的功能也必然伴随着糖基化的改变而改变。凝集素是一种可以与特定糖链结合的糖蛋白,利用此特性可以检测出特定糖链的表达和改变。国内目前尚未广泛开展基于凝集素芯片的肝癌相关研究。我们已于前期成功构建检测糖基化改变的凝集素芯片,并检测出不同来源的甲胎蛋白之间细微的聚糖改变,为我们这部分的实验奠定了基础。本部分实验首先在前期的基础上扩大凝集素芯片上凝集素的种类至32种,以便能够更准确地捕捉糖链的改变。我们构建的对细胞膜表面糖链可进行即时、高通量检测的凝集素芯片,优点在于将凝集素与芯片技术相结合,利用芯片高通量、高特异性、高灵敏度等优点,对提取的膜蛋白糖链进行自动捕获,成功地实现对细胞膜表面糖链进行高通量的检测分析,获得细胞膜表面糖链全面而综合的信息。甘露糖抑制实验和胎球蛋白实验充分显示我们构建的凝集素芯片具有糖链结合的特异性、准确性和稳定性。最后我们将分选的HCC患者与健康志愿者的外周血CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞提取细胞膜蛋白后与芯片杂交后发现HCC患者外周血调节性T细胞较健康对照的外周血调节性T细胞膜表面α1-6岩藻糖、α1-6甘露糖、GalNac、β型半乳糖链、复杂型N-聚糖增加。另外,我们选取转移潜能梯度降低的人肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L和几乎不转移的Hep3B,经细胞膜蛋白提取和Trizol提取RNA后,分别与凝集素芯片和糖基转移酶PCR芯片杂交。结果提示,HCCLM3相对于Hep3B,代表唾液酸糖链的MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA明显增加；代表甘露糖链的ConA和GNA明显增加；代表岩藻糖链的LTL、LCA、PSA和UEA-1明显增加；代表半乳糖链的BPL、EEL、jacalin, GSL-1增加；代表GlcNAc的PHA-L增加；代表GalNAc的VVA、DBA、SBA明显增加。糖基转移酶PCR芯片结果提示HCCLM3较Hep3B,ST3Ga11、FUT8和MGAT5等转移酶增高。其中MAL-Ⅰ,MAL-Ⅱ和WGA变化相对于ST3Gall, PSA、LCA相对于FUT8,PHA-L相对于MGAT5。因此我们可以认为调节性T细胞特征性糖基化改变可能伴随着免疫功能的变化。HCC细胞的特征性糖基化改变及相应的糖基转移酶改变为肿瘤的治疗从糖生物学的角度提供了新的方向。第四部分Galectin-1对HCC复发转移的影响及与调节性T细胞相关性的研究异常的糖基化改变影响着肿瘤的恶性生物学行为。Galectin-1是半乳凝素家族重要成员之一,通过与肿瘤细胞表面聚糖（glycan）形成galectin-glycan结构参与调控肿瘤的分化、迁移、凋亡和信号转导等生物学过程。在许多肿瘤中都发现galectin-1表达的增高与肿瘤的浸润、转移密切相关。许多高表达galectin-1的肿瘤都提示不良预后。近来研究表明调节性T细胞参与介导肿瘤细胞免疫逃逸的过程中受到肿瘤细胞来源的galectin-1的信号调控。同时,我们前面的实验结果也显示HCC患者外周血Treg膜表面表达较高的半乳糖链。目前在HCC中尚未有关galectin-1和Treg的表达及相关性的报道。在本部分研究中我们通过免疫组化的方法,对包含386例HCC患者的组织芯片检测FoxP3+Treg和galectin-1的表达,并通过生存分析观察galectin-1与预后的关系。同时通过流式细胞仪和ELISA分别检测31例HCC患者的外周血中的CD4+CD25+FoxP3+Treg和galectin-1的表达,以期发现两者在组织和外周血之间的相关性。最后我们利用ELISA法验证了147例HCC患者血清中galectin-1的表达水平。研究结果发现galectin-1在HCC肿瘤组织中高表达,是独立的预后指标。高表达galectin-1的HCC患者预后较差。Galectin-1与HCC的临床病理特征相关,如肿瘤大小、包膜是否完整和血管侵犯等等。在BCLC早期的HCC患者中,galectin-1也显示出预测预后的价值。肝癌组织中Galectin-1的表达与FoxP3+Treg数量两者呈正相关,但是在外周血中两者的表达无相关性。我们的结果提示肿瘤微环境中的galectin-1可能促进Treg在HCC中扩增,进而影响肿瘤的发展和预后,为肿瘤的免疫治疗提供了新的靶点。结论1.CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T淋巴细胞高表达调节性T细胞的特异性标志FoxP3。2.肿瘤浸润性调节性T细胞可能通过IL6WIL6、RANK/RANKL信号通路参与HCC肿瘤细胞的免疫逃逸。3.HCC患者外周血调节性T细胞较健康对照的外周血调节性T细胞膜表面α1-6岩藻糖、α1-6甘露糖、GalNac、p型半乳糖链、复杂型N-聚糖增加。调节性T细胞特征性糖基化的改变可能伴随着细胞免疫抑制功能的变化。4.肝癌细胞具有α2-3,α2-6唾液酸、岩藻糖、平分型GlcNAc等糖链表达上调,可能受糖基转移酶ST6GALNAC1、ST3Ga11、FUT8和MGAT5等调控。5. Galectin-1在HCC中的高表达伴随着调节性T细胞数量的增加,联合调节性T细胞和galectin-1可增加预测HCC患者预后的准确性。可作为HCC免疫治疗的靶点。创新点1.首次在HCC患者中分选出具有活性的可供功能实验所需的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞。2.首次提出IL6WIL6、RANK/RANKL信号通路可能参与HCC肿瘤浸润性调节性T细胞介导的肿瘤免疫逃逸。3.HCC患者外周血调节性T细胞特征性糖基化的改变可能伴随着细胞免疫抑制功能的变化。4.首次报道galectin-1在HCC患者预后中的作用。研究展望1.进一步研究HCC肿瘤浸润性调节性T细胞的免疫相关差异表达基因和信号通路的作用机制,为HCC的治疗提供更为准确的治疗靶点。2.进一步研究调节性T细胞和肿瘤细胞特征性糖基化改变及相关性,从新的角度研究肿瘤的侵袭、转移机制。
朴秉国[9]（2011）在《表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用》文中指出本研究对具有肿瘤特异性复制和肿瘤靶向性杀伤功能的重组腺病毒Ad-HP和Ad-HT的肝癌（BEL-7402）抑制作用进行了探讨。本研究首先利用MTT染色等方法,探讨了Ad-HT和Ad-HP对体外培养的人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可有效抑制BEL-7402细胞的增殖,且其作用在一定条件下呈现剂量和时间依赖关系。本研究利用台盼蓝染色、AO/EB染色、Annexin V染色和DAPI染色对Ad-HT和Ad-HP抑制BEL-7402细胞的方法进行了探讨。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可造成BEL-7402细胞的细胞膜通透性增加、细胞核凝聚、磷脂膜外翻。虽然不同检测方法所得到结果不尽相同,但仍可推断,Ad-HT和Ad-HP能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞的增殖。本研究利用流式细胞术、Western blot等方法探讨表达NDV HN基因重组腺病毒对细胞凋亡信号转导系统内线粒体膜电位、活性氧水平和Caspase酶活性等关键控制点信号分子的影响。实验结果表明,Ad-HP和Ad-HT均可不同程度的上调BEL-7402细胞Caspase酶活性和活性氧水平,并不同程度的降低BEL-7402细胞线粒体膜电位。可以推断,表达NDV HN基因重组腺病毒通过线粒体途径诱导BEL-7402细胞发生凋亡,从而体现其对BEL-7402细胞的抑制作用。本研究利用小鼠肝癌的肺转移和实体肿瘤模型探索了Ad-HP和Ad-HT在体内的抑瘤作用。结果表明,Ad-HP和Ad-HT具有减缓肿瘤组织生长速度、延长模型动物平均生存期和刺激免疫的作用。
赵承梅[10]（2011）在《纳米载体介导干预免疫识别的实验研究》文中指出本实验构建针对大鼠的Ⅱ类主要组织相容性复合物反式转录激活因子（classⅡ major histocompability complex transactivator,CⅡTA）和髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88,MyD88）基因的短发夹状 RNA（small hairpin RNA,shRNA）质粒和纳米阳离子高分子脂质体;应用两者偶合形成纳米载体于体外转染大鼠骨髓源树突状细胞（dendritic cell,DC）,观察其介导RNA干扰对CⅡTA和MHC-Ⅱ以及MyD88基因表达的抑制,并筛选相对高效的载shRNA纳米载体;评价其介导RNA干扰目的基因沉默干预免疫识别的效果;研究纳米载体介导RNA干扰CⅡTA和MyD88干预免疫识别在控制移植免疫排斥反应中的作用和探讨其机制。一、纳米载体的构建及体外转染实验目的:构建载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体并偶合为纳米载体,观察其体外转染HCT-116细胞的转染效率,确定实验转染方案。方法:构建针对大鼠CⅡTA和MyD88基因载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体;对纳米阳离子高分子脂质体进行表征;应用体外培养HCT-116细胞,经MTT法验证纳米阳离子高分子脂质体的生物安全性;通过载shRNA质粒与纳米阳离子高分子脂质体偶合实验,确定两者最佳结合比;应用载shRNA质粒与纳米阳离子高分子脂质体偶合形成纳米载体,分别设置空白对照组、Lipofectamine组、单纯质粒组和以不同质量比载shRNA质粒与纳米阳离子高分子脂质体偶合形成的纳米载体组（两者质量比分别为1:0.5,1:1,1:2,1:3和1:4）,于体外转染HCT-116细胞,采用倒置荧光显微镜观察和流式细胞术（FCM）观察转染效果,比较转染效率。结果:载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体构建成功;纳米阳离子高分子脂质体理化性能稳定、安全低毒（IC50=7.605×10-2g/L）且免疫原性低,跨膜能力强,可用于构建载shRNA纳米载体;载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体偶合形成纳米载体的最佳结合质量比为1:2;在载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体以最佳结合比偶合形成纳米载体时,其转染HCT-116细胞的转染效率最高（28.19±5.38%）,且优于转染剂Lipofectamine组（P<0.01）。结论:纳米阳离子高分子脂质体制备简便、安全低毒,免疫原性低;其与载shRNA质粒于最佳结合比偶合成功构建纳米载体转染HCT-116细胞,具有高效和稳定的转染效率,可用于介导RNA干扰抑制免疫识别相关基因CⅡTA和MyD88表达的研究。二、纳米载体介导沉默免疫识别相关基因表达的研究目的:观察纳米载体介导RNA干扰对免疫识别相关基因CⅡTA和MyD88表达的抑制效果以及CⅡTA基因对于MHC-Ⅱ基因表达的调控作用。方法:体外培养大鼠骨髓源DC;应用针对大鼠CⅡTA和MyD88基因的各三个纳米载体,分别设置空白对照组、单纯纳米组、pHK-纳米载体阴性对照组和三个pCⅡTA-纳米载体干预组或三个pMyD88-纳米载体干预组,分别转染DC,以荧光实时定量 PCR、FCM 和 Western blot 检测 DC 转染后 CⅡTA 和 MHC-Ⅱ 及 MyD88 的表达变化。结果:大鼠骨髓源DC培养成功;与空白对照组、单纯纳米组、pHK-纳米载体阴性对照组相比,三个pC Ⅱ TA-纳米载体干预组DC转染后CⅡ TA和MHC-Ⅱ mRNA转录水平及MHC-Ⅱ蛋白表达水平均显着性减低（P<0.01）,CⅡTA与MHC-Ⅱ基因表达呈高度正相关;pC ⅡTA 2-纳米载体干预组对CⅡTA与MHC-Ⅱ基因表达的抑制更为明显,CⅡTA mRNA转录水平为0.12±0.04,MHC-Ⅱ mRNA 转录水平为 0.10±0.04,MHC-Ⅱ 蛋白表达水平为 22.08±3.07%;三个pMyD88-纳米载体干预组DC转染后MyD88 mRNA转录水平及MyD88蛋白表达水平均显着性减低（P<0.01）,MyD88的mRNA转录水平及蛋白表达水平呈高度正相关;pMyD88 1-纳米载体干预组对目的基因表达抑制更为明显,MyD88的mRNA转录水平为0.11±0.04,MyD88蛋白表达水平为0.11±0.05。结论:应用成功构建pC ⅡTA-纳米载体转染大鼠骨髓源DC,可显着抑制DC的CⅡTA和MHC-Ⅱ基因表达;CⅡTA与MHC-Ⅱ的基因表达具有高度正相关,提示CⅡTA严格调控MHC-Ⅱ表达,纳米载体介导RNA干扰CⅡTA可明显抑制MHC-Ⅱ基因表达;应用成功构建pMyD88-纳米载体转染大鼠骨髓源DC,可显着抑制DC的MyD88基因表达;pCⅡTA 2-纳米载体和pMyD88 1-纳米载体介导RNA干扰相对高效,两者可进一步应用于评价纳米载体介导干预免疫识别的实验研究。三、纳米载体介导干预免疫识别作用的研究目的:评价PCⅡTA 2-纳米载体和pMyD88 1-纳米载体介导RNA干扰干预免疫识别的效应,探讨免疫识别相关基因沉默影响免疫识别的作用机制。方法:分别应用pCⅡTA 2-纳米载体和pMyD88 1-纳米载体转染大鼠DC;设置阳性对照组、单纯纳米组、阴性HK纳米载体组、CⅡTA或MyD88沉默干预组和阴性对照组;与异系大鼠脾淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养,分别经MTT法和流式细胞术观察CⅡTA沉默干预DC对淋巴细胞增殖状态及T细胞表型的影响,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白介素-2（IL-2）、γ-干扰素（IFN-γ）的含量。通过脂多糖刺激实验,应用荧光实时定量PCR和Western Blot检测LPS刺激后MyD88沉默干预DC MyD88表达水平,分别采用ELISA及FCM,检测LPS刺激后MyD88沉默干预DCIL-2和IFN-y分泌水平,以及MHC-Ⅱ蛋白抗原表达。结果:混合淋巴细胞培养后,与阳性对照组、单纯纳米组和阴性HK纳米载体组比较,CⅡTA沉默干预组淋巴细胞增殖刺激指数明显降低（1.15±0.14,P<0.01）,上清液中细胞因子INF-y和IL-2含量显着减少（INF-γ42.39±7.68 pg/mL,IL-2 67.83±18.35pg/mL;P<0.01）,CD4 阳性细胞百分比减低（48.38±8.63%,P<0.01）和 CD4+/CD8+比值下降（1.89±0.26,P<0.01）,而 CD8 阳性细胞百分比的差异未见显着性（P>0.05）;经脂多糖刺激后,与阳性对照组、单纯纳米组和阴性HK纳米载体组比较,MyD88沉默干预组DC的MyD88 m RNA转录水平和蛋白表达明显降低（0.22±0.08,0.16±0.04;P<0.01）,其分泌细胞因子 INF-y 和 IL-2 分泌水平显着下降（32.49±5.65pg/mL,21.08±4.13pg/mL;P<0.01）,MHC-Ⅱ蛋白抗原的表达也明显减少（45.21±5.09%,P<0.01）。结论:纳米载体介导CⅡTA和MyD88基因沉默有效地抑制了免疫识别过程,减轻了免疫应答。其机制为免疫原性降低及免疫识别信号转导通路阻断,抑制了 T细胞增殖与活化及抗原呈递细胞自身的分化成熟,导致针对外来抗原刺激的免疫识别显着减低,从而有效减轻免疫反应强度,有利于更好地抑制移植排斥反应。
二、肝癌细胞膜受体含pRSVB7特异性配基的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝癌细胞膜受体含pRSVB7特异性配基的构建（论文提纲范文）
（1）基于队列人群的中医体质与非酒精性脂肪肝的关系和Osteopontin中和抗体在大鼠脂肪性肝纤维化消退中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 综述 中医体质类型与非酒精性脂肪肝的关系研究 |
| 一、中医对脂肪肝的病因病机探讨 |
| 二、中医学对中医体质的理解和研究 |
| 三、中医体质对内分泌代谢疾病影响的研究进展 |
| 四、中医体质与非酒精性脂肪肝的研究 |
| 五、中医体质与证型的关系 |
| 六、中医体质及证型与非酒精性脂肪肝的关系 |
| 序言 |
| 第一部分 基于队列人群的中医体质与NAFLD的关系研究 |
| 引言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 一、基于基线水平的2011年体检人群的非酒精性脂肪肝检出率与中医体质分布情况的横断面研究: |
| 二、基于五年随访人群的脂肪肝新发与消退变化与中医体质类型的关系研究 |
| 讨论 |
| 一、横断面研究角度分析脂肪肝分布情况: |
| 二、分析纵向队列随访人群非酒精性脂肪肝状态变化: |
| 参考文献 |
| 第二部分 血清Osteopontin对非酒精性脂肪肝发生和消退的预测评价 |
| 引言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 一、统计临床试验样本基线情况 |
| 二、研究对象基线血清OPN水平 |
| 三、NAFLD发生前后的患者血清OPN水平变化 |
| 四、易患体质与非易患体质人群血清OPN水平的比较: |
| 五、基线OPN水平是预测NAFLD发生的独立危险因素 |
| 六、OPN预测脂肪肝发生模型的准确性评估 |
| 讨论 |
| 第三部分 Osteopontin中和抗体在大鼠脂肪性肝纤维化消退中的作用研究 |
| 引言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 1.脂肪性肝纤维化模型大鼠组织的OPN表达变化 |
| 2.不同干预方式对各组大鼠肝功能的影响 |
| 3.不同干预方式对各组大鼠肝组织的OPN和 α-SMA表达水平的影响 |
| 4.OPN抗体干预对大鼠肝组织的组织病理学影响 |
| 5.不同干预方式的各组大鼠血清肝纤维化指标的变化 |
| 6.不同干预方式的各组大鼠的糖脂代谢指标的变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文创新点及展望 |
| 创新点 |
| 不足及展望 |
| 攻读博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（2）多种金属离子的单细胞分析及细胞膜蛋白的单分子检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1 生物分子检测的研究进展 |
| 1.1 细胞内生物分子的检测意义 |
| 1.2 细胞内生物分子的荧光检测方法 |
| 1.2.1 无信号放大的检测方法 |
| 1.2.2 信号放大的检测方法 |
| 2 微流控系统用于单细胞组分的检测 |
| 2.1 单细胞检测的重要性 |
| 2.2 基于微流控系统的单细胞的检测 |
| 3 细胞膜蛋白的单分子检测 |
| 3.1 单分子检测的重要性 |
| 3.2 细胞膜蛋白检测的重要性 |
| 3.3 细胞膜蛋白的单分子检测方法 |
| 3.3.1 目前细胞膜蛋白的检测方法 |
| 3.3.2 细胞膜蛋白的单分子成像技术 |
| 4 本论文研究方法 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于微流控系统的单个类神经元细胞内K~+, Na~+, Mg~(2+), Ca~(2+) 的同时定量检测 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 样品的预处理 |
| 2.3 基于微流控芯片的K~+，Na~+，Mg~(2+)，Ca~(2+) 的测定 |
| 2.4 阿尔兹海默症模型 |
| 2.5 MTT实验 |
| 2.6 凋亡验证实验 |
| 2.7 Na~+/K~+-ATPase活性 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 三种荧光探针的相关表征 |
| 3.2 基于微流控系统检测K~+，Na~+，Mg~(2+)，Ca~(2+) |
| 3.2.1 标准电泳谱图 |
| 3.2.2 分析方法性能 |
| 3.3 单个PC-12 细胞内K~+，Na~+，Mg~(2+)，Ca~(2+) 同时检测 |
| 3.4 离子通道激活剂/拮抗剂刺激的PC-12 细胞中四种离子浓度变化分析 |
| 3.5 Aβ_(25-35)诱导的单个PC-12 细胞内K~+，Na~+，Mg~(2+)，Ca~(2+) 的浓度变化及分析 |
| 3.5.1 Aβ_(25-35)诱导PC-12 细胞建立阿尔兹海默症模型 |
| 3.5.2 Aβ_(25-35)诱导的单个PC-12 细胞内K~+，Na~+，Mg~(2+)，Ca~(2+) 的同时定量检测 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于适配体和滚环扩增反应的信号放大进行膜蛋白的单分子检测 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 滚环扩增反应 |
| 2.4 荧光光谱检测 |
| 2.5 全内反射荧光成像及图像的处理 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 滚环扩增反应机理 |
| 3.2 方案可行性验证 |
| 3.3 特异性实验 |
| 3.4 实验反应条件优化 |
| 3.4.1 线形DNA环化过程条件优化 |
| 3.4.2 滚环扩增反应过程条件优化 |
| 3.5 细胞毒性实验 |
| 3.6 细胞的荧光共聚焦成像 |
| 3.7 细胞的单分子成像 |
| 4 结论 |
| 5 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者发表的学术论文及参加的课题 |
| 致谢 |
（3）OGT催化HDAC1的O-GlcNAc修饰在肝细胞肝癌中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题来源、研究的目的和意义 |
| 1.2 国内外研究概况 |
| 1.2.1 国外研究概况 |
| 1.2.2 国内研究概况 |
| 1.3 论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料及仪器设备 |
| 2.1.1 人的肝癌及癌旁组织 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验流程与方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.3 表达载体的构建 |
| 2.2.4 HDAC1糖基化突变体构建 |
| 2.2.5 T-A克隆 |
| 2.2.6 GST-pull down |
| 2.2.7 Western Blot |
| 2.2.8 细胞免疫荧光 |
| 2.2.9 细胞转染 |
| 2.2.10 免疫共沉淀 |
| 2.2.11 逆转录多聚酶链反应 |
| 2.2.12 麦胚凝聚素结合法 |
| 2.2.13 流式细胞分析术 |
| 2.2.14 Cell Counting Kit-8 assay |
| 2.2.15 细胞划痕实验 |
| 2.2.16 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.17 HDAC1酶活性分析 |
| 2.2.18 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.19 染色质免疫共沉淀 |
| 2.2.20 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 OGT催化HDAC1形成O-GlcNAc修饰 |
| 3.1.1 肝癌细胞中HDAC1存在O-GlcNAc修饰 |
| 3.1.2 HDAC1的O-GlcNAc修饰肝癌组织和细胞中高表达 |
| 3.1.3 HDAC1存在两个O-GlcNAc修饰位点 |
| 3.2 OGT可促进HDAC1的O-GlcNAc修饰 |
| 3.2.1 OGT与HDAC1存在相互作用 |
| 3.2.2 OGT促进HDAC1的O-GlcNAc修饰 |
| 3.3 HDAC1的O-GlcNAc修饰影响其组蛋白去乙酰化酶活性 |
| 3.4 HDAC1的O-GlcNAc修饰对肝癌细胞生物学行为的影响及其机制 |
| 3.4.1 HDAC1的O-GlcNAc修饰促进肝癌细胞的增殖 |
| 3.4.2 HDAC1的O-GlcNAc修饰对p21基因表达的影响 |
| 3.4.3 HDAC1的O-GlcNAc修饰促进肝癌细胞的迁移及侵袭 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| A：在国内外刊物上发表的论文 |
| B：所参加的项目 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 附录：攻读学位期间获得的主要荣誉 |
（4）趋化因子CXCL12及其受体CXCR4/CXCR7在人早孕期母—胎界面的表达及其生物学功能（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 人早孕期母-胎界面免疫微环境功能学细胞的体外培养体系建立 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 趋化因子受体CXCR7在人早孕期母-胎界面免疫微环境的表达 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 CXCL12/CXCR7/CXCR4轴在人早孕期母-胎界面免疫微环境调控作用初探 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（5）AFP158-166特异性T细胞的检测及体外诱导的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 第一部分 肝细胞癌患者外周血AFP_(158-166)特异性T细胞的检测 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象和材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 临床资料 |
| 1.2.2 流式检测T细胞分化抗原 |
| 1.2.3 流式检测AFP_(158-166)特异性T细胞 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 肝癌流行病学 |
| 1.3.2 AFP在肝癌诊治中的意义 |
| 1.3.3 T细胞亚群与肿瘤患者机体细胞免疫 |
| 1.3.4 AFP特异性T细胞的检测 |
| 1.3.5 体外培养AFP特异性T细胞的需求 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 甲胎蛋白抗原表位肽AFP_(158-166)特异性T细胞的体外刺激与培养 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象和材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 筛选基因分型为HLA-A0201的志愿者 |
| 2.2.2 T2的培养与鉴定 |
| 2.2.3 DC的培养与鉴定 |
| 2.2.4 体外诱导的AFP特异性T细胞克隆增殖结果 |
| 2.2.5 五聚体检测激活的AFP_(158-166)特异性T细胞 |
| 2.2.6 活化淋巴细胞对靶细胞的杀伤作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 HLA-A0201限制性AFP_(158-166)选择的治疗意义 |
| 2.3.2 人树突状细胞(DC)体外培养与鉴定 |
| 2.3.3 致敏DC的主要方法 |
| 2.3.4 AFP抗原肽特异性T细胞的激活与增殖 |
| 2.3.5 展望 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（6）CXCR7拮抗剂的构建与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 流式细胞术筛选高表达CXCR7的乳腺癌细胞 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 SDF-1/54R/pET-41a+的构建、表达及纯化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 SDF-1/54R的活性检测 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）冬凌草甲素增强U937细胞吞噬凋亡小体的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 对凋亡细胞的识别及吞噬机制研究进展 |
| 一、对凋亡细胞的识别、吞噬与清除一般特征 |
| 二、对凋亡细胞吞噬的主要调控因素 |
| 三、调节凋亡细胞吞噬的信号转导途径 |
| 第二节 细胞自噬研究进展 |
| 1. 自噬的概念 |
| 2. 自噬的分类 |
| 3. 自噬的启动及发生过程 |
| 4. 自噬的功能 |
| 5. 自噬的信号调控 |
| 第三节 活性氧的生成与作用 |
| 1. 活性氧的概述 |
| 2. 活性氧的产生 |
| 3. 活性氧的功能 |
| 第四节 一氧化氮 |
| 1. NO的生成与特性 |
| 2. NO的生理病理功能 |
| 3. NO与肿瘤的关系 |
| 第五节 冬凌草甲素研究进展 |
| 1. 冬凌草简介 |
| 2. 药理作用 |
| 2.1 抗肿瘤作用 |
| 2.2 抗菌消炎作用 |
| 2.3 抗突变作用 |
| 2.4 抗氧化作用 |
| 2.5 镇痛作用 |
| 2.6 其他作用 |
| 参考文献 |
| 第二章 冬凌草甲素增强U937细胞对凋亡小体的吞噬及其调节通路 |
| 一、实验材料 |
| 1. 细胞 |
| 2. 药品及试剂 |
| 3. 仪器 |
| 二、实验方法 |
| 1. 乳酸脱氢酶活力测定法(LDH方法)测定分化细胞贴壁率 |
| 2. 紫外线(UV)照射诱导细胞凋亡 |
| 3. 细胞形态学变化观察 |
| 4. 吞噬形态学观察 |
| 5. 吞噬作用检测 |
| 6. 流式细胞分析法 |
| 7. Western印迹法 |
| 8. 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 1. PMA诱导U937细胞分化为巨噬细胞 |
| 2. UV照射(52.1 J/m2)诱导凋亡小体的形成 |
| 3. 冬凌草甲素增强U937分化的巨噬细胞吞噬凋亡小体 |
| 4. 吞噬的形态学观察 |
| 5. PI3K-Akt及PLCγ参与冬凌草甲素诱导的吞噬刺激 |
| 6. Ras-Raf途径参与调节冬凌草甲素诱导的吞噬作用 |
| 7. MAPK在冬凌草甲素诱导的吞噬刺激中的作用 |
| 8. Ras/Raf1依赖性的ERK活化 |
| 9. NF-κB/COX-2/Caspase-1介导IL-1β释放参与调节冬凌草甲素诱导的吞噬 |
| 10. NF-κB的活化依赖Ras-ERK途径 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 冬凌草甲素诱导的自噬增强U937细胞对凋亡小体的吞噬作用 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. 自噬形态学观察 |
| 2. 流式细胞术测定自噬阳性率 |
| 3. 吞噬作用检测 |
| 4. siRNA转染方法 |
| 5. Western印迹法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 2.5μM冬凌草甲素诱导U937细胞自噬形态学观察 |
| 2. 2.5 μM冬凌草甲素诱导U937细胞自噬阳性率测定 |
| 3. 2.5μM冬凌草甲素诱导自噬相关蛋白的表达 |
| 4. ERK、NF-κB、Caspase-1参与冬凌草甲素诱导的U937细胞自噬 |
| 5. 3MA抑制、Rapamycin促进冬凌草甲素诱导的U937细胞自噬 |
| 6. 3MA抑制、Rapamycin促进冬凌草甲素诱导的U937细胞对凋亡小体的吞噬 |
| 7. 3MA、Rapamycin影响自噬相关蛋白的表达 |
| 8. 3MA、Rapamycin影响ERK、NF-κB、Caspase-1及ProIL-1p的表达 |
| 9. Beclin-1 siRNA抑制冬凌草甲素诱导的自噬及对凋亡小体的吞噬 |
| 10. Beclin-1 siRNA影响自噬相关蛋白及ERK、NF-κB、Caspase-1、Pro IL-1β的表达 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 冬凌草甲素诱导活性氧及一氧化氮产生促进对凋亡小体的吞噬机制研究 |
| 第一节 冬凌草甲素诱导活性氧的产生促进U937细胞对凋亡小体的吞噬机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. ROS阳性细胞比率测定 |
| 2. 自噬形态学及流式细胞术测定自噬阳性率 |
| 3. 吞噬作用检测 |
| 4. 线粒体膜电位的检测 |
| 5. 细胞内ATP含量测定方法 |
| 6. Western印迹法 |
| 7. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 2.5μM冬凌草甲素时间依赖性诱导U937细胞产生ROS |
| 2. 冬凌草甲素诱导的ROS以H2O2及·OH为主要形式 |
| 3. ROS的清除剂抑制冬凌草甲素诱导的U937细胞对凋亡小体的吞噬 |
| 4. H2O2及·OH参与调节冬凌草甲素增强的U937细胞对凋亡小体的吞噬 |
| 5. 冬凌草甲素诱导U937细胞线粒体膜电位降低 |
| 6. ROS通过调节线粒体膜电位影响U937细胞对凋亡小体的吞噬 |
| 7. ROS对吞噬的调节不依赖于ATP的产生 |
| 8. ROS通过调节自噬影响U937细胞对凋亡小体的吞噬 |
| 9. ROS调节PI3K-Akt/PLCγ-PKC通路影响U937细胞对凋亡小体的吞噬 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二节 冬凌草甲素诱导一氧化氮的产生促进U937细胞对凋亡小体的吞噬机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. NO阳性细胞比率测定 |
| 2. Griess法测定NO含量 |
| 3. 流式细胞术测定自噬阳性率 |
| 4. 吞噬作用检测 |
| 5. ELISA试剂盒测定IL-1β含量方法 |
| 6. siRNA转染 |
| 7. Western印迹法 |
| 8. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 2.5μM冬凌草甲素时间依赖性诱导U937细胞产生NO |
| 2. 一氧化氮合酶抑制剂1400W及L-NAME抑制NO的产生及iNOS表达 |
| 3. 冬凌草甲素诱导的NO参与U937细胞对凋亡小体的吞噬 |
| 4. NO通过调节自噬影响U937细胞对凋亡小体的吞噬 |
| 5. NO对吞噬的调节需要自噬的参与,而自噬负反馈调节NO的产生 |
| 6. NO的产生促进IL-1β的成熟和分泌 |
| 7. NO的产生激活NF-κB/COX-2途径 |
| 8. NF-κB/COX-2正反馈调节NO的产生 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附件 |
（8）肝癌患者CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞与肝癌复发转移关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 HCC患者CD4~+CD25~+CD127~(low/-)CD49d~-调节性T细胞的表达和表型研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于全基因芯片的CD4~+CD25~+CD127~(low/-)CD49d~-调节性T细胞基因表达谱分析 |
| 前言 |
| 方法与材料 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 HCC患者外周血CD4~+CD25~+CD127~(low/-)CD49d~-调节性T细胞及HCC细胞特征性糖基化改变 |
| 前言 |
| 方法与材料 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 半乳糖凝集素-1对HCC复发转移的影响及与调节性T细胞相关性的研究 |
| 前言 |
| 方法与材料 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 肝细胞癌治疗方法的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 肝癌的流行病学 |
| 1.3 肝病的检查及鉴别诊断 |
| 1.4 肝癌的发病机理 |
| 1.5 局部治疗 |
| 1.6 手术疗法 |
| 1.7 当前肝癌的治疗手段 |
| 1.8 遗传图谱 |
| 1.9 肿瘤的基因治疗 |
| 1.10 展望 |
| 第2章 肝癌基因治疗的研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 分子发病机制的概述 |
| 2.3 分子治疗肝细胞癌 |
| 2.4 特殊药物对HCC的治疗 |
| 2.5 基因治疗 |
| 2.6 HCC与JNK1的激活作用 |
| 2.7 血管内皮生成因子的作用 |
| 2.8 复制腺病毒靶向的肿瘤病毒疗法 |
| 2.9 肿瘤微环境调节 |
| 2.10 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 Ad-HP和Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Ad-HP和Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制方式 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 Ad-HP和Ad-HT对信号分子的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 Ad-HP和Ad-HT的体内抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）纳米载体介导干预免疫识别的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、纳米载体的构建及体外转染实验 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 载shRNA质粒鉴定 |
| 1.2.2 载shRNA质粒扩增与提纯鉴定 |
| 1.2.3 纳米载体表征 |
| 1.2.4 纳米阳离子高分子脂质体的生物安全性 |
| 1.2.5 纳米阳离子高分子脂质体和载shRNA质粒偶合实验 |
| 1.2.6 HCT-116细胞培养 |
| 1.2.7 纳米载体应用体外转染效果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 病毒载体与研究进展 |
| 1.3.2 非病毒载体开发及应用 |
| 1.4 小结 |
| 二、纳米载体介导沉默免疫识别相关基因表达的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠骨髓源DC体外培养与鉴定 |
| 2.2.2 DC的体外转染 |
| 2.2.3 DC转染后CⅡTA及MHC-Ⅱ基因的表达 |
| 2.2.4 DC转染后MyD88基因的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 树突状细胞生物学特性及体外培养 |
| 2.3.2 MHC-Ⅱ、CⅡTA与移植免疫识别 |
| 2.3.3 Toll样受体、免疫识别信号转导和MyD88 |
| 2.4 小结 |
| 三、纳米载体介导干预免疫识别作用的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CⅡTA沉默干预DC对混合淋巴细胞培养的影响 |
| 3.2.2 LPS对MyD88沉默干预DC的刺激作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 CⅡTA沉默对免疫识别的干预作用 |
| 3.3.2 MyD88沉默对免疫识别的干预作用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 基因治疗与载体研究 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、肝癌细胞膜受体含pRSVB7特异性配基的构建（论文参考文献）
- [1]基于队列人群的中医体质与非酒精性脂肪肝的关系和Osteopontin中和抗体在大鼠脂肪性肝纤维化消退中的作用研究[D]. 张洁. 暨南大学, 2019(03)
- [2]多种金属离子的单细胞分析及细胞膜蛋白的单分子检测[D]. 范媛媛. 山东师范大学, 2017(01)
- [3]OGT催化HDAC1的O-GlcNAc修饰在肝细胞肝癌中的作用[D]. 朱贵州. 南通大学, 2016(12)
- [4]趋化因子CXCL12及其受体CXCR4/CXCR7在人早孕期母—胎界面的表达及其生物学功能[D]. 任亮. 武汉大学, 2015(07)
- [5]AFP158-166特异性T细胞的检测及体外诱导的实验研究[D]. 张振松. 天津医科大学, 2013(02)
- [6]CXCR7拮抗剂的构建与表达[D]. 杨飞华. 南方医科大学, 2013(03)
- [7]冬凌草甲素增强U937细胞吞噬凋亡小体的机制研究[D]. 臧凌鹤. 沈阳药科大学, 2012(11)
- [8]肝癌患者CD4+CD25+CD127low/-CD49d-调节性T细胞与肝癌复发转移关系的研究[D]. 吴寒. 复旦大学, 2012(03)
- [9]表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用[D]. 朴秉国. 吉林大学, 2011(05)
- [10]纳米载体介导干预免疫识别的实验研究[D]. 赵承梅. 天津医科大学, 2011(08)