一、诱导性一氧化氮合酶的表达与胃癌肿瘤血管形成及预后的关系（论文文献综述）
邹丹[1]（2021）在《内皮型一氧化氮合酶影响胃癌腹膜转移的机制及其作为胃癌治疗靶点的研究》文中进行了进一步梳理目的:内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS,NOS3）是一氧化氮合酶家族成员之一,是参与细胞内一氧化氮生成的催化酶。近几年的研究结果证实了NOS3在乳腺癌、肠癌、胰腺癌及前列腺癌中参与促进血管生成、肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制免疫反应和肿瘤细胞凋亡等。但是,目前关于NOS3在恶性肿瘤中表达情况的研究仍然较少,并且其影响肿瘤发生发展的机制研究还不全面,有待深入挖掘。胃癌是目前最常见的恶性肿瘤之一。在我国,多数胃癌患者在诊断时已经是进展期,虽然以胃癌根治切除术为核心的治疗方案一定程度上改善了患者的预后,但仍有约1/3的胃癌患者手术后复发。在胃癌中,腹膜播散几乎占胃癌复发的50%,发生腹膜转移的胃癌患者的中位生存时间只有7-16个月。因此,进一步探索预防和治疗胃癌腹膜转移的诊疗方案对改善胃癌患者的预后,延长生存时间具有重要的意义。NOS3作为胃癌患者预后标志物及其作为胃癌腹膜转移治疗靶点的价值还没有研究报道。蟾毒灵提取自常见的中药蟾酥,是其有效成分之一,作为华蟾素的主要有效成分,蟾毒灵被广泛用于治疗多种恶性肿瘤。蟾毒灵可以促进多种肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和其他恶性生物学过程。然而,蟾毒灵对胃癌腹膜转移的作用并且NOS3在此过程中扮演的角色还不清楚。研究方法:1.从UCSC Xena、GEO数据库和CCLE数据库下载肿瘤组织、正常组织及人类癌细胞系中NOS3 mRNA表达数据和肿瘤患者的表型数据;2.分别比较肿瘤组织、正常组织及癌细胞系中NOS3 mRNA的表达水平;3.t-检验比较各肿瘤类型中肿瘤组织和正常组织的NOS3表达水平;4.t-检验比较各肿瘤类型中早期肿瘤和晚期肿瘤的NOS3表达水平;5.Kaplan-Meier、Log-rank和COX回归分析检验各肿瘤类型中NOS3表达与患者预后之间的关系;6.免疫组化实验检测收集的90例胃癌患者病历组织中NOS3表达水平,并分析其与患者临床数据和生存之间的关系;7.使用siRNA或NOS3抑制剂（L-NAME）干预胃癌细胞中NOS3的表达,或者使用蟾毒灵处理胃癌细胞;8.MTT实验检测胃癌细胞的增殖能力;9.粘附实验检测胃癌细胞粘附于基质胶的能力;10.伤口愈合实验和Transwell实验检测胃癌细胞的侵袭和迁移能力;11.Western blot实验检测胃癌细胞中NOS3、p-NOS3（Ser-1177）、EMT过程关键蛋白、MAPK通路关键蛋白的表达;12.使用MKN-45P细胞构建胃癌腹膜转移裸鼠模型,统计终止实验时裸鼠的腹膜转移瘤数量和质量、腹水体积,免疫组化实验检测NOS3、E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达情况。结果:第一部分:基于泛癌症分析研究NOS3在胃癌中的表达及临床意义。1.1 NOS3 mRNA在各种肿瘤类型中的表达水平是不同的,其中在胃癌组织中的表达水平最高;1.2 NOS3 mRNA表达水平位列前三名的细胞系为在胃腺癌、结肠腺癌以及神经系统肿瘤组织的细胞系;1.3 NOS3 mRNA在直肠腺癌、胃腺癌、胰腺癌、卵巢浆液性囊性腺癌、皮肤黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌中表达水平显着高于正常组织;1.4皮肤黑色素瘤中,NOS3在分期较晚的患者中表达更高。胃腺癌中,NOS3表达与肿瘤分期之间未显示出显着的关联;1.5 NOS3 mRNA表达水平较高的胃癌患者总生存时间显着缩短;1.6综合TCGA-STAD和GSE29272数据集分析,发现NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素;1.7免疫组化实验检测我们收集的90例胃癌患者病理组织发现NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素。第二部分:NOS3在胃癌腹膜转移过程中的作用及机制。2.1选择胃癌细胞系MGC-803和胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P进行细胞实验,使用siRNA敲低NOS3表达后,胃癌细胞黏附、侵袭和迁移能力显着降低,EMT过程被逆转;2.2 L-NAME抑制NOS3表达后,胃癌细胞黏附、侵袭和迁移能力显着降低,EMT过程被逆转;2.3生物信息学分析发现胃癌中NOS3可能通过MAPK通路调控胃癌的恶性生物学行为;2.4胃癌细胞中干预NOS3表达后,ERK和p38的磷酸化水平显着降低,MAPK通路活化被抑制。第三部分:蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌腹膜转移的影响。3.1蟾毒灵通过与NOS3蛋白结合降低其磷酸化（Ser1177）水平;3.2蟾毒灵处理胃癌细胞MGC-803和胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P后,胃癌细胞的黏附、侵袭和迁移能力被明显抑制,EMT过程被逆转;3.3使用胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P构建胃癌腹膜转移裸鼠模型,结果发现实验组（蟾毒灵单药,L-NAME单药和双药组）裸鼠的腹膜转移瘤数量、质量和腹水体积明显减少;3.4实验组裸鼠腹膜转移瘤中NOS3蛋白表达降低,E-钙粘蛋白表达增多而波形蛋白表达降低。结论:通过分析公共数据集以及收集的胃癌患者病理组织,我们证实了NOS3的高表达与胃癌患者的预后不良有关,NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素。NOS3通过MAPK信号通路调控胃癌细胞的侵袭、迁移和定植能力以及EMT过程。NOS3可能通过MAPK通路正向调节胃癌的腹膜转移过程,导致胃癌患者的不良预后。Ser1177磷酸化是NOS3的主要活性形式之一,通过筛选发现蟾毒灵是以NOS3为靶标的临床治疗药物,它可以降低NOS3的磷酸化水平来抑制NOS3的活性。蟾毒灵可通过抑制NOS3-MAPK信号通路阻止胃癌腹膜转移的进程。这些结果提示我们NOS3可能是胃癌患者预测总生存时间的生物标志物,并且是胃癌治疗的潜在靶点。蟾毒灵可能通过抑制NOS3活性,下调MAPK通路的活化,进而抑制胃癌的腹膜转移进程。本研究为蟾毒灵腹腔内灌注治疗胃癌腹膜转移提供了更多的证据支持。
李杏[2]（2021）在《L-NIL通过调控CXCL5/CXCR2信号抑制MDSCs浸润抗口腔鳞癌肺转移的研究》文中研究表明研究目的:口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC）是口腔颌面头颈部最常见的恶性肿瘤,约占90%。近年来随着传统治疗手段如手术治疗、放疗和化疗等的提高,患者的预后得到一定改善,但5年生存率仍约为50%左右。口腔鳞癌患者的死亡原因主要为向远处脏器转移,尤其是肺转移,而传统的治疗手段常常对晚期的肺转移患者没有疗效。因此探讨影响口腔鳞癌肺转移的机制,对于开发新的治疗药物,改善患者预后和延长生存率具有重大的临床意义。转移的过程十分复杂,包含肿瘤细胞在原发灶生长迁移,进入血管,在外周血循环中生存,穿出血管,到达转移部位定植并生长繁殖。转移的过程中肿瘤细胞与其他细胞相互作用,帮助其完成种植转移。髓样细胞（Myeloid Cells）即由骨髓发育而来的细胞,主要包含肿瘤相关巨噬细胞（Tumor Associated Macrophages,TAMs）和骨髓来源抑制细胞（Myeloid Derived Suppressor Cells,MDSCs）。MDSCs可分为单核细胞样骨髓来源抑制细胞（Monocytic MDSCs,M-MDSCs）和多个核细胞的骨髓来源抑制细胞（Polymorphonucler MDSCs,PMN-MDSC）。TAMs和MDSCs在肿瘤组织中大量存在,与癌症的侵袭和转移密切相关,参与肿瘤转移的各个过程。研究发现髓样细胞一方面可直接影响肿瘤细胞的迁移侵袭;另一方面可通过影响其他肿瘤间质来促进癌症转移如促进肿瘤中异常血管形成,增加血管通透性,利于肿瘤细胞进出血管;抑制T细胞的免疫反应,帮助肿瘤细胞免疫逃逸;以及重塑肿瘤细胞外基质,降解胶原纤维,促进癌细胞侵袭转移。但是目前髓样细胞在口腔鳞状细胞癌中的作用,尤其是对转移的影响并不十分清楚。本研究旨在探讨髓样细胞TAMs和MDSCs对口腔鳞癌转移的影响,从而为未来口腔鳞癌肺转移的治疗提供理论指导和思路。研究发现诱导性一氧化氮合酶（Induced Nitric Oxide Synthase,i NOS）在多种肿瘤组织中高表达,主要由TAMs和MDSCs产生。其可降解精氨酸产生一氧化氮（Nitric Oxide,NO）,过氧硝酸盐等代谢产物,促进肿瘤发生发展。同时i NOS还是TAMs和MDSCs发挥功能的重要因子,靶向调节i NOS可通过调控髓样细胞进而抑制肿瘤的发生发展。有学者发现i NOS在口腔癌组织中高表达,并且与不良预后有关。L-NIL为i NOS选择性抑制剂,可通过多种方式抑制肿瘤的生长,但是对肺转移的影响目前还未有人有研究。其在口腔鳞癌中的作用尚不清楚。本实验拟探究L-NIL对口腔鳞癌生长转移的影响及作用机制。研究方法:1、利用免疫组织化学染色检测口腔鳞癌组织中巨噬细胞和骨髓来源抑制细胞的分布及类型。2、体外采用佛波酯（Phorbol Myristate Acetate,PMA）和白介素-4（Interleukin-4,IL-4）诱导THP-1细胞极化为M2型TAMs,并利用q PCR及免疫荧光进行M2型TAMs的表型鉴定。3、利用M2型TAMs条件培养基（Conditioned Media,CM）处理肿瘤细胞,q PCR和免疫荧光检测M2型TAMs对肿瘤细胞上皮间充质转化（Epithelial Mesenchymal Transition,EMT）的影响。4、利用q PCR和免疫荧光检测M2型TAMs对肿瘤细胞干性的影响。5、采用划痕和Transwell侵袭实验观察M2型TAMs对肿瘤细胞迁移、侵袭的影响。6、体内利用Anti-Gr1抗体清除荷瘤小鼠体内MDSCs细胞,检测其对口腔鳞癌转移的影响。7、流式细胞术和免疫组化验证肿瘤及脾脏组织中MDSCs的清除效率。8、免疫组化检测i NOS在癌组织中的分布。9、体内应用L-NIL观察其对小鼠口腔鳞癌生长的影响。10、小动物活体成像和HE染色观察L-NIL对口腔鳞癌肺转移的作用。11、利用Kaplan-Meier方法进行小鼠生存率分析。12、硝酸盐/亚硝酸盐试剂盒检测NO代谢产物的改变。13、免疫组化检测L-NIL对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。14、质谱流式（Mass cytometry,Cy TOF）检测L-NIL对免疫微环境的作用。15、免疫组化和流式细胞术进一步验证L-NIL对肿瘤组织及脾中TAMs及MDSCs的影响。16、细胞因子array检测血浆及肿瘤组织中细胞因子的变化。17、体内应用CXCR2抑制剂SB225002观察其对口腔鳞癌转移的影响。18、流式细胞术和免疫组化染色验证CXCR2抑制剂SB225002对MDSCs浸润的影响。19、统计学分析:所有体外实验均重复3次,体内动物实验至少重复2次,实验结果按照平均数±标准差表示。符合正态分布的两组数据利用Student’s t检验进行统计学分析;不符合正态分布的数据采用非参数Mann-Whitney U检验进行分析。P<0.05表示具有统计学差异。研究结果:1、免疫组化染色结果显示口腔癌组织中分布大量CD68+的TAMs,且主要表现为CD163+的M2表型,癌组织中CD68+TAMs明显较正常上皮组织多;同时我们发现癌组织中CD14+的M-MDSCs和CD15+的PMN-MDSCs也明显较正常上皮组织多。2、q PCR结果显示和单纯PMA处理组相比,加入PMA+IL-4诱导处理48h后M2型巨噬细胞相关基因CD163,CD206和Arg1表达升高,免疫荧光实验进一步验证CD163和CD206蛋白也增多。3、利用q PCR我们发现上皮和细胞连接相关基因E-cadherin、Occudin和ZO-1表达减少;间质的标志Vimentin和Snail1升高。同时免疫荧光结果进一步验证E-cadherin蛋白减少,Vimentin蛋白升高。4、q PCR和免疫荧光结果显示M2型TAMs CM处理后口腔癌细胞获得干性,表现为干性基因Sox2,Oct4和Nanog上调,干性蛋白CD44和CD105表达增多。5、划痕和侵袭实验表明M2型TAMs可增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。6、体内应用Anti-Gr1中和抗体可有效清除MDSCs,并且清除MDSCs后可明显抑制口腔鳞癌的肺转移。7、免疫组化染色结果发现i NOS在小鼠口腔癌组织中大量表达。8、利用小动物活体成像和HE染色观察发现:与对照组相比,体内应用i NOS抑制剂L-NIL可抑制小鼠口腔鳞癌的生长和转移。9、免疫组织化学染色结果显示L-NIL处理后:Ki67+的增殖的肿瘤细胞减少,Cleaved-caspase3+的凋亡的肿瘤细胞变多。10、质谱流式Cy TOF结果表明L-NIL处理后肿瘤组织中MDSCs大量减少,TAMs少量减少。11、流式细胞术和免疫组化进一步验证发现:L-NIL处理小鼠后,肿瘤组织内的Ly6G+PMN-MDSCs和Ly6C+的M-MDSCs均变少,但对脾脏中的MDSCs无影响。同样,我们发现肿瘤及脾脏中F4/80+的巨噬细胞、CD163+的M2型巨噬细胞和CD86+的M1型巨噬细胞都没有明显改变。12、细胞因子array结果显示:L-NIL处理组小鼠血浆中趋化因子CXCL5明显降低。13、与对照组相比,体内应用CXCL5特异性受体CXCR2抑制剂SB225002后可明显抑制MDSCs在肿瘤中的浸润,并且CXCR2抑制剂SB225002组的肺转移数量明显减少。结论:髓样细胞可促进口腔鳞癌侵袭转移;i NOS抑制剂L-NIL可能通过调控CXCL5/CXCR2信号抑制MDSCs浸润进而抑制口腔鳞癌的生长和转移。CXCR2抑制剂SB225002可抑制口腔鳞癌肺转移。
刘宥苡[3]（2021）在《GCH-1调控胃腺癌BH4水平抑制肿瘤生长的研究》文中认为[目 的]胃癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一。其生物学行为涉及到肿瘤细胞增殖浸润、血性转移、淋巴转移等。从细胞层面看,肿瘤细胞有别于正常细胞的异常生物合成和物质代谢水平与肿瘤增殖能力和侵袭力相关,肿瘤微环境中各类细胞的代谢产物和炎症因子对于调节肿瘤细胞和免疫细胞活性至关重要。细胞内的物质代谢水平的波动可能会对肿瘤的进展造成促进或是抑制作用。肿瘤发展常常伴有慢性炎症的发生,而慢性炎症会刺激诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达增加,催化产生NO、H2O2、O2-等产物导致氧化应激状态,在这一反应中四氢生物喋呤（BH4）是辅助iNOS发挥活性的重要因子,其浓度直接影响iNOS还原酶亚基与氧化酶亚基之间的耦合或去耦合,从而影响代谢产物,改变氧化应激平衡。此外,BH4作为氧化磷酸化过程中的重要中间体,对于细胞的能量代谢、自噬、凋亡等方面也有重要意义。体内BH4从头合成途径的相关酶包括GTP环氧水合酶-1（GCH-1）、丙酮酰四氢喋呤合成酶（PTS）以及墨喋呤还原酶（SPR）,其中限速酶是GTP环氧水合酶-1（GCH-1）,通过调控GCH-1导致体内BH4水平变化,能够导致肿瘤微环境的变化并影响肿瘤的发展。本研究通过慢病毒转染使胃癌细胞株过表达GCH-1进行体外实验,以转染细胞及非转染细胞分别建立BALB/c-nu小鼠荷瘤模型,并通过予以GCH-1特异性抑制剂DAHP进行体内实验,通过PCR、Western blot、ELISA、Griess试剂法等检测技术进行以下研究:①通过转染GCH-1过表达慢病毒载体使胃癌细胞株过表达GCH-1,增加细胞内源性BH4水平,促进NO的合成;②探究BALB/c-nu小鼠荷瘤模型肿瘤组织内BH4及其合成通路相关蛋白以及NO水平与肿瘤进展的关系,并探索其可能的机制,有望为胃癌诊疗提供新的思路和靶点。[方 法]1、无菌细胞培养技术培养MKN-45、SGC7901、MGC803等三株胃癌细胞,通过PCR筛选其GCH-1表达水平较低的胃癌细胞株,通过慢病毒载体转染使其稳定过表达GCH-1基因。2、通过PCR和Western blot实验评估转染细胞株及同系非转染细胞株GCH-1表达情况,同时采用ELISA法测定BH4水平、Griess试剂法测定NO水平。3、培养足够数量的慢病毒转染胃癌细胞及同系非转染细胞,将30只2-5周龄BALB/c-nu小鼠通过随机数表法分为转染组（n=20）和非转染组（n=10）,分别皮下注射转染及非转染肿瘤细胞建立BALB/c-nu小鼠的人胃癌细胞株荷瘤模型,再经随机数表法将转染组20只小鼠分为两个亚组,即转染Saline组（n=10）、转染DAHP组（n=10）,转染DAHP组给予DAHP（80mg/kg/天）腹腔注射处理,转染Saline组和非转染（即非转染Saline组）组给予等体积生理盐水腹腔注射,处理三周后脱颈椎处死小鼠,剥取肿瘤组织,测量并记录肿瘤长径（A）以及短径（B）,通过公式V=0.5×A×B2计算小鼠肿瘤体积,比较转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组之间的差异。4、用ELISA法测定各组肿瘤组织中BH4的浓度,分别对转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组肿瘤组织中BH4浓度进行差异比较。5、用Griess试剂法测定各组肿瘤组织中NO的浓度,分别对转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组肿瘤组织中NO浓度进行差异比较。6、用PCR技术定量检测各组肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR基因相对表达量,分别对转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组中上述基因表达量进行比较。7、用Western lot法检测各组肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR蛋白表达情况,通过ImageJ分析蛋白灰度值,以内参蛋白（GAPDH）作为参照,计算出各组目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值,即为目标蛋白的相对表达量,分别对转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组中上述蛋白的相对表达量进行比较。[结 果]1、通过PCR筛选胃癌细胞株,MGC803细胞系GCH-1表达呈低表达,选择MGC803作为实验细胞株进行转染。2、以非转染MGC803细胞株作为对照（即1）,PCR结果显示转染后MGC803细胞株GCH-1、PTS、SPR表达均增高。3、Western blot结果表明,转染后MGC803细胞株GCH-1、PTS、SPR蛋白表达均较非转染MGC803细胞株增高。4、ELISA法测定各组BH4浓度,结果显示MGC803转染组BH4水平高于非转染 MGC803 组（234.60±23.74ng/LVs 172.21±18.59ng/L,t=-4.627,p=0.002）,差异具有统计学意义。5、Griess试剂法测定细胞NO浓度,结果显示MGC803转染组NO水平高于非转染 MGC803 组（9.17±1.71 μ mol/gprot Vs 7.82±1.78 μ mol/gprot,t’=-2.313,p=0.027）,差异具有统计学意义。6、BALB/c-nu小鼠移植瘤取材后分析,非转染Saline组肿瘤较转染Saline组增大（309.19±105.14mm3 Vs 179.40±81.79mm3,t=3.081,p=0.006）,转染DAHP组肿瘤较转染 Saline 组增大（301.59±105.06mm3 Vs 179.40±81.79mm3,t=2.902,p=0.009）,以上差异均有统计学意义。7、ELISA法检测小鼠肿瘤组织BH4水平,转染Saline组中BH4含量高于非转染 Saline 组（287.36±14.54ng/LVs 231.53±19.51ng/L,t=-7.255,p<0.001）;转染 Saline 组中 BH4 含量高于转染 DAHP 组（287.36±14.54ng/L Vs 223.92±16.74ng/L,t=9.049,p<0.001）,以上差异均有统计学意义。8、Griess试剂法测定小鼠肿瘤组织NO浓度,转染Saline组中NO浓度高于非转染 Saline 组（9.02±3.85 μ mol/gprot Vs 3.11±1.34 μ mol/gprot,t=4.591,p<0.001）;转染Saline组中NO高于转染DAHP组（9.02±3.85 μ mol/gprot Vs 6.01±2.22 μmol/gprot,t=2.144,p=0.046）,以上差异均有统计学意义。9、采用PCR法测定各组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR通路基因mRNA转录情况,结果表明,以非转染Saline组作为对照（即1）,转染Saline组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR基因表达水平均高于非转染Saline组（GCH-1:1.87±0.25 Vs 1.00±0.08,t=10.450,p<0.001;PTS:1.63±0.15 Vs 1.00±0.07,t’=11.843,p＜0.001;SPR:1.79±0.16Vs 1.00±0.06,t’=14.722,p<0.001）;以转染S aline组作为对照（即1）,转染Saline组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR基因表达水平均高于转染DAHP组（GCH-1:1.01±0.14 Vs 0.55±0.11,t=8.382,p<0.001;PTS:1.00±0.09 Vs 0.59±0.05,t=12.511,＜0.001;SPR:1.00±0.09Vs 0.55±0.05,t=14.092,p<0.001）。以上差异均有统计学意义。。10、采用Western blot法测定各组BALB/c-nu小鼠肿瘤组织内GCH-1、PTS及SPR蛋白表达情况,结果表明,转染Saline组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR蛋白表达水平均高于非转染Saline组（GCH-1:0.87±0.12 Vs 0.63±0.15,t=3.999,P=0.001;PTS:0.66±0.14Vs 0.47±0.09,t’=3.531,p=0.002;SPR:0.99±0.11 Vs 0.78±0.09,t=4.518,p<0.001）;转染Saline组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR蛋白表达水平均高于转染DAHP组（GCH-1:0.87±0.12Vs 0.48±0.17,t=5.905,p<0.001;PTS:0.66±0.14Vs 0.32±0.11,t=5.919,p＜0.001;SPR:0.99±0.11 Vs 0.67±0.18,t=4.820,p<0.001）。以上差异均有统计学意义。[结 论]GCH-1过表达可抑制胃腺癌MGC803 BALB/c-nu荷瘤小鼠肿瘤增长,其机制与GCH-1过表达引起其下游PTS、SPR表达增加,促进BH4合成,BH4促进iNOS亚基间耦合而促进肿瘤组织NO的合成有关。
王嘉鑫[4]（2020）在《氧化应激诱导的胃癌iNOS表达与顺铂化疗敏感性关系的研究》文中认为[背 景]目前,我国胃癌五年生存率较低,主要原因是多数胃癌患者确诊时即为晚期、且临床化疗容易出现耐药。肿瘤化疗耐药显着影响着患者的生存期,因此,有关化疗及化疗耐药机制的研究正在不断探索中。一些研究表明,代谢重新编程是癌症的标志之一,且其在化疗及化疗耐药过程中也扮演着重要角色。其中,在化疗药物的作用下,肿瘤细胞可呈现氧化应激状态,可产生活性氧分子,其所造成的氧化损伤是化疗药物致癌细胞死亡的重要事件。然而,活性氧分子（ROS）在胃癌化疗过程中的作用和其具体的作用机制尚不清楚。活性氧分子在化疗期间的变化是否与胃癌化疗的效果呈相关性,尚未阐明。另外,也有部分试验及研究结果表明,不同种类的化疗药物作用于癌细胞后产生的活性氧分子参与相应癌种化疗耐药的形成。然而,活性氧分子如何参与调节胃癌化疗耐药,其具体作用机制仍然不明确。[目 的]本研究采用病理免疫组化、MTT、Western-blot等技术检测不同分期的胃腺癌组织中诱导性一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase,iNOS）和核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）的表达状态;以及 H2O2、顺铂、H2O2+顺铂干预胃癌MKN-45细胞后iNOS和NF-κB的表达状态。探索氧化应激和顺铂化疗对胃癌iNOS表达的影响,及其相互作用,并通过体外细胞试验来探索相关机制,以揭示iNOS在化疗和化疗耐药中的作用,可望为扭转进展期胃癌化疗耐药事件提供新靶点,以提高晚期或难治性胃腺癌治疗效果。[方法]1、临床上收集78例来自胃腺癌患者的癌组织标本,并收集其分期、病理结果、化疗方案等相关临床资料。2、通过病理免疫组化分析新辅助化疗+手术组及单纯手术组、早期及进展期组胃腺癌组织iNOS蛋白表达情况。3、使用卡方检验分析新辅助化疗+手术组及单纯手术组、早期及进展期组胃腺癌组织中iNOS蛋白阳性表达率。4、用体外细胞培养方法培养足够数量的MKN-45人胃癌细胞,将其传代为等细胞数量的4组后继续培养,培养至所需目标数量后,实验组分别给予H202、顺铂、顺铂+H2O2处理,对照组用等体积的相同的完全培养液培养。5、用MTT实验法检测不同浓度的H2O2、顺铂、顺铂+H2O2分别作用于MKN-45细胞后的最适宜作用浓度,计算IC50值,并检测最佳作用时间。6、用Western blot法检测t-BHP、顺铂、顺铂+t-BHP及对照组胃癌细胞中iNOS蛋白表达情况,用Quantity one软件（Bio-Rad）分析iNOS和NF-κB蛋白的灰度值,并与内参蛋白β-actin相比较,计算出iNOS及NF-κB蛋白的表达量,并进行两两比较。[结 果]1、病理免疫组化检测结果显示直接行胃癌根治术的进展期胃癌患者癌组织中iNOS表达明显高于早期患者,差异显着（P<0.05）。2、病理免疫组化结果显示,对于进展期患者,直接手术组胃癌患者癌组织中iNOS表达明显高于新辅助化疗+手术组,差异有统计学意义（P<0.05）。3、MTT检测结果显示:与单纯H2O2组相比,H2O2+CDDP组在等量的CDDP的培养孔中,依次加入不同浓度的H2O2,其对MKN-45细胞的抑制率显着提高。其中,0.0001%H2O2+CDDP较单用0.0001%H202抑制率从38.69%提升至 69.24%,提升约 2 倍。H2O2+CDDP 组的 IC50=1.523e-006（8.192e-007to 2.833e-006）。H2O2+CDDP组的IC50明显比H2O2组的IC50低,差异显着（P<0.001）。在 0.60ug/ml的 CDDP 中,加入 1.523e-006%的 H202,即可对胃癌MKN-45细胞达到50%的抑制率。4、Western-blot检测显示CDDP组iNOS的表达明显下降;H2O2组与CDDP组比较,iNOS蛋白表达差异显着（P=0.007）;与CDDP处理胃癌细胞组相比,H2O2+CDDP干预组iNOS蛋白的表达量明显上升,两组之间差异显着（P=0.0138）。5、Western-blot检测显示CDDP组NF-κB表达明显下降;H2O2组与CDDP组比较,NF-κB蛋白表达差异显着（P=0.013）;与CDDP处理胃癌细胞组相比,H2O2+CDDP干预组NF-κB蛋白的表达量明显上升,两组之间有明显的差异（P=0.027）。[结论]H2O2促发的氧化应激明显提高了胃癌iNOS和NF-κB表达。而顺铂化疗则下调了胃癌iNOS与NF-κB蛋白的表达,在减轻胃癌病灶炎症状态的同时却诱导了耐药发生。H202可诱导肿瘤细胞内的氧化应激状态,通过增加iNOS蛋白的表达,以提高胃癌细胞对顺铂的敏感性,实现耐药逆转,研究结果有望为难治性胃癌提供新的治疗策略。
王千里[5]（2019）在《线粒体NOS1调控结肠癌化疗耐药与Ⅰ型干扰素通路的研究》文中研究指明研究背景和目的一氧化氮（NO）是一种性质活跃的气体信号分子,发挥血管舒张、突触传递及免疫防御等多种生理功能。目前的研究还发现NO与肿瘤关系密切,调控肿瘤的起始、转移、耐药和免疫逃逸等一系列过程。内源性的NO主要由三种一氧化氮合酶（NOS）催化生成。其中NOS1和NOS3为组成型表达,合成低浓度的NO;而NOS2为诱导性型表达,合成高浓度的NO。不同的NOS产生NO的浓度及持续时间不同,决定了其生物学效应的不同。近年来越来越多的研究表明,不同NOS的亚细胞定位也是决定其功能的重要因素之一。目前发现不同的NOS亚型可以定位于细胞膜、溶酶体、高尔基体及细胞核等不同的亚细胞结构中。既往已经有研究显示NO参与了结肠癌发生、发展及转移等一系列过程,但NOS1在结肠癌发生发展中的作用目前尚未见报道。本研究的主要目的是探讨NOS1是否通过其特殊的亚细胞定位参与结肠癌的进展。研究结果1.NOS1定位于结肠癌细胞线粒体:分析TCGA数据库显示NOS1表达量与结直肠腺癌患者的临床分期呈负相关,并且NOS1高表达提示预后较差。为了深入研究NOS1对结肠癌的影响,我们构建了稳定过表达NOS1的结肠癌细胞株。应用差速离心法提取线粒体,结果显示过表达的NOS1蛋白在线粒体内表达。荧光共聚焦显微镜也显示NOS1蛋白与线粒体有共定位的关系。最后我们发现NOS1增加线粒体内NO含量。2.线粒体NOS1通过增加SIRT3酶活性诱导结肠癌化疗耐药:首先我们发现NOS1抑制基础状态及顺铂处理后线粒体超氧阴离子（O2-）水平;并且抑制顺铂诱导的线粒体膜电位下降、细胞色素C释放及细胞凋亡。进一步实验结果显示这种抑制效应与NOS1诱导的SIRT3酶活性增加和SOD2的低乙酰化修饰有关。敲低SIRT3后,NOS1导致线粒体活性氧抑制和化疗耐药均被逆转。裸鼠皮下成瘤实验显示NOS1增加结肠癌的成瘤能力与化疗耐药。3.HSP90协助NOS1向线粒体内的转移:HSP90的C端抑制剂sylibum抑制HSP90与NOS1的结合,并阻止NOS1向线粒体内转移,sylibum逆转NOS1诱导的化疗耐药。4.线粒体NOS1通过增加过氧化氢（H2O2）抑制结肠癌细胞I型干扰素通路:流式细胞术显示NOS1抑制IFN α诱导的结肠癌细胞STAT1磷酸化水平（IFN β-p-STAT1）;进一步实验发现NOS1增加过氧化氢的生成;而过氧化氢酶能够逆转NOS1对IFN α-p-STAT1的抑制;最后RNA-seq转录组测序结果显示NOS1抑制IFNβ诱导的下游基因（ISGs）表达。研究结论结肠癌中NOS1在HSP90的协助下转移至线粒体内。一方面,线粒体NOS1通过mtNOS1-SIRT3-SOD2途径增强线粒体抗氧化应激能力,导致结肠癌的化疗耐药,敲低SIRT3或者HSP90抑制剂,能逆转NOS1诱导的化疗耐药。另一方面,线粒体NOS1促进线粒体O2转化为H202,H2O2由线粒体释放入胞浆,诱导结肠癌细胞I型干扰素通路障碍。本研究为靶向NOS1逆转结肠癌化疗耐药提供了理论依据,但是NOS1抑制I型干扰素通路对结肠癌免疫耐受的影响还有待在体内实验中进一步探讨。
闫志军[6]（2019）在《BH4/iNOS与胃腺癌组织中淋巴管生成关系的研究》文中认为[目 的]胃癌患者转移的主要途径是淋巴系统,淋巴结受累程度影响着患者的生存率。肿瘤细胞的增殖活性及肿瘤新生血管的形成对于实体肿瘤的生长起着关键性作用。许多研究表明,在预测肿瘤的进展方面,淋巴管形成是比血管形成更可靠的一个参数。然而,胃肿瘤细胞是如何通过潜在淋巴管转移及肿瘤相关的淋巴管形成在淋巴结转移进展中的生物作用仍然不清楚。本研究采用病理免疫组化、Griess试剂法、ELSA、Western blot等技术进行BH4/iNOS与胃腺癌组织中D2-40表达关系的研究、以及BH4/iNOS与胃腺癌组织中淋巴管密度（LVD）关系的研究。探索BH4/iNOS在胃腺癌组织中淋巴管生成的作用,并通过动物实验来阐明其作用机制,对揭示胃腺癌淋巴管生成分子机制有重要意义,可望为胃腺癌抗淋巴管生成治疗提供新的靶点,以提高晚期胃腺癌治疗效果。[方法]1、临床上收集40例来自胃腺癌患者的癌组织及癌旁组织标本,并收集其相关临床资料。2、通过免疫组化实验对人胃腺癌组织及癌旁组织中iNOS和D2-40蛋白表达情况进行探究。用D2-40单克隆抗体标记淋巴管内皮细胞,检测人胃腺癌组织及癌旁组织中淋巴管密度（LVD）。3、利用卡方检验统计学方法对人胃腺癌组织及癌旁组织中iNOS和D2-40蛋白阳性表达率进行分析,利用Spearman统计学方法进行iNOS和D2-40蛋白在人胃腺癌组织中表达相关性分析。4、通过无菌细胞培养方法先培养足够数量的MKN-45人胃癌细胞,利用BALB/c-nu小鼠建立稳定可靠的人胃癌细胞株MKN-45小鼠荷瘤模型。用随机数字表法将其分为2组,实验组（BH4组）给予BH4腹腔注射处理,对照组（Saline组）给予等量生理盐水处理。5、用免疫组化方法检测BH4组及Saline组中iNOS和D2-40蛋白的表达情况。D2-40是淋巴管内皮细胞特异性标记抗体,用于检测BH4组和Saline组中淋巴管密度（LVD）。6、用ELSA法（酶联免疫吸附测定）检测BH4组和Saline组肿瘤组织中BH4的水平,通过两独立样本t检验对BH4组和Saline组肿瘤组织中BH4水平进行统计学分析。7、用Griess试剂法（硝酸还原酶法）检测BH4组和Saline组肿瘤组织中NO的水平,通过两独立样本t检验对BH4组和Saline组肿瘤组织中NO水平进行统计学分析。8、用Western blot法检测BH4组和Saline组肿瘤组织中iNOS蛋白表达情况,通过Image-Pro Plus分析目的蛋白灰度值,与内参蛋白相比较,计算出两组中目的蛋白的相对表达量并进行比较。[结 果]1、通过免疫组化实验,检测结果显示人胃腺癌癌组织中iNOS和D2-40蛋白的阳性表达率明显高于癌旁组织中的阳性表达率,差异有统计学意义（P<0.05）。2、统计分析结果显示,人胃腺癌组织中iNOS和D2-40蛋白的表达水平与肿瘤浸润深度呈正相关,与淋巴结转移数目呈正相关（P<0.05）,与性别及年龄构成无关（P>0.05）。3、相关性分析结果显示,人胃腺癌组织中iNOS和D2-40蛋白的表达呈显着正相关（P<0.05）。4、动物试验免疫组化检测显示BH4组癌组织中iNOS和D2-40的阳性表达率明显高于Saline组的阳性表达率,差异有统计学意义（P<0.05）。5、ELISA法（酶联免疫吸附测定）检测显示BH4组癌组织中BH4水平明显高于Saline组,差异有统计学意义（P<0.05）。6、Griess试剂法（硝酸还原酶法）检测显示BH4组癌组织中NO水平明显高于Saline组,差异有统计学意义（P<0.05）。7、Western blot法检测显示BH4组癌组织中iNOS表达水平明显高于Saline组,差异有统计学意义（P<0.05）。[结 论]BH4/iNOS可促进胃腺癌淋巴管生成,其机制与BH4与iNOS偶联,诱导肿瘤局部高水平NO的产生有关,研究结果有望为胃腺癌淋巴管生成抑制提供新的可能依据。
王强[7]（2019）在《基于网络药理及分子对接探讨断藤益母汤靶向MAP3K2治疗类风湿关节炎的作用机制》文中研究指明研究背景:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节滑膜组织炎症为特征的慢性疾病。治疗的主要目的是控制疼痛和炎症,减少关节损伤和残疾,维持或改善身体机能和生活质量。现代医学的药物治疗多针对单一靶点的调控,然而越来越多的治疗策略倾向于药物的联合使用。相比较于单靶标治疗策略,中医药复方所采取的多靶标的治疗策略显示出一定优势,在类风湿关节炎的治疗中发挥了重要作用。中医药治疗类风湿关节炎历史悠久,疗效显着。在“因地制宜”“辨证论治”理念的指导下,我们拟出了断藤益母汤这一临床使用有效的复方。前期的研究中,已经研究益母草碱、山奈酚、雷公藤甲素等单体成分的作用。然而,用单体成分代表复方整体疗效受到很多学者质疑,因此基于网络药理学的整体机制研究有一定意义。网络药理学已被广泛用于药物设计和发现,这一方法的使用基于这样一种假说,即许多有效药物通过调节多种靶点而非单一靶点发挥作用。系统生物学的进展揭示了与多靶点药物相比,高选择性化合物可能表现出低于预期的临床疗效。因此基于网络药理学的药物发现似乎有巨大的发展潜力。随着计算机技术和医学信息学的发展,分子对接不仅在药物筛选方面已经成为一种强大的工具和必不可少的技术,用于预测配体与蛋白质受体或酶结合时的可能性。在大多数情况下,研究者可以选择结合亲和力最优的配体和受体作为进一步生物化学实验和研究的对象。中药中含有大量有效活性成分。然而,如何确定中药中有效成分发挥作用的机制成为中医药作用机制研究不可避免的难题。MAP3K2（MEKK2）属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶激酶基因家族,参与调节多种MAPK信号通路,而MAPK信号通路对下游炎症反应有重要的调控作用。研究显示类风湿关节炎和骨关节炎滑膜组织中MEKK2的表达升高。在前期的研究中,我们已发现断藤益母汤对MAPK信号通路有调控作用,然而尚不清楚断藤益母汤能否对MAPK上游激活因子起到调控作用。一、基于网络药理学的断藤益母汤对类风湿关节炎的作用机制研究目的:1.断藤益母汤成分虚拟筛选2.断藤益母汤靶点预测3.类风湿关节炎靶点收集4.成分-靶点-通路网络构建及机制分析方法:将断藤益母汤中所含中药在TCMSP、TCMID及CNKI中进行检索。收集复方所含有的所有成分,然后根据药物ADME参数（吸收、分布、代谢、排泄）进行筛选。筛选结果为断藤益母汤潜在的活性成分。将筛选出的化合物在TCMSP数据库和HIT数据库中检索成分的潜在靶标。合并两个数据库中的结果,并去除重复靶点,以上结果即为断藤益母汤潜在靶点。在Drugbank数据库及TTD数据库中输入“rheumatoid arthritis”作为关键词,检索RA相关的靶点信息。合并两个数据库结果,去除重复项,得到类风湿关节炎相关靶点。将断藤益母汤靶点和类风湿关节炎靶点进行映射后取交集,得到断藤益母汤可能治疗类风湿关节炎的靶点。对共有靶点进行信号通路分析、蛋白-蛋白相互作用分析,构建成分-蛋白-信号通路网络图,进行可视化分析。结果:研究发现断藤益母汤中有四氢小檗碱、槲皮素、山奈酚等14个成分具有较好的ADME属性。14个成分可以靶向类风湿关节炎相关的42个靶点。这42个靶点参与多条信号通路,包括IL-17信号通路,TNF信号通路,Thl7细胞分化信号通路,NF-κB信号通路,破骨细胞分化等。结论:断藤益母汤可能通过多成分-多靶点-多通路的方式在类风湿关节炎中发挥治疗作用。其可作用的靶点主要与炎症反应相关或细胞凋亡相关。可能作用的信号通路涉及炎症反应和骨代谢。因此,断藤益母汤在类风湿关节炎中可能主要发挥抗炎活性。二、基于分子对接的断藤益母汤对MAP3K2的作用机制研究目的:1.断藤益母汤中潜在配体筛选。2.断藤益母汤与MAP3K2受体结合能力评估。方法:通过前期网络药理学的研究,从断藤益母汤中筛选出可以用于治疗类风湿关节炎的中药成分共14种。从TCMSP数据库下载单体的MOL2格式文件。在PyMoL数据库中转换为PDB格式。在AutoDock1.5.6程序中载入单体PDB格式文件,选择检测和可旋转root,保存为PDBQT格式,用于三维结构晶体网格的构建,以及配体和受体的对接。以上为配体的准备。利用PDB数据库寻找MEKK2（MAP3K2）三维晶体结构文件,以PDB格式保存三维结构。利用PyMOL软件对靶蛋白进行预处理,去除水分子,以及一些非活性位点的小分子,如甘油、锌、镁等。以上为受体文件的准备。将PDB格式受体三维晶体结构导入POCASA系统,导出受体蛋白活性口袋三维结构图。采用半柔性对接方法,将受体MEKK2与配体所有的可旋转键进行对接。根据AutoDock Vina评分函数计算出自由结合能排名前10的配体-受体复合物自由结合能,对构象进行评价。结果:MAP3K2蛋白表面共有3个活性口袋;断藤益母汤中,除槲皮素、樟脑苷、异鼠李素不直接MAP3K2活性口袋结合外,其他11个配体均可全部或大部结合于MAP3K2活性口袋。结论:DTYMD可能可以通过1 1个配体与MAP3K2直接结合于活性口袋而发挥作用。三、断藤益母汤对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MAP3K2表达的影响目的:1.研究断藤益母汤对MAP3K2蛋白及mRNA表达的影响。2.研究断藤益母汤对炎症因子表达的影响。方法:收集符合ACR1987年RA诊断标准的患者膝关节置换手术后的滑膜组织,采用组织块培养法培养成纤维样滑膜细胞。用不同浓度的断藤益母汤预处理细胞后,采用MTT法检测断藤益母汤对RA FLSs细胞生存率的影响;采用蛋白印迹法检测断藤益母汤对MAP3K2蛋白的影响;采用RT-qPCR法检测断藤益母汤对MAP3K2 mRNA的影响;采用ELISA法检测断藤益母汤对IL-6、TNF-cα、MMP-1的影响。结果:滑膜组织组织块培养5-7 d可见细长梭形细胞从组织块边缘移行出,呈放射状分布。断藤益母汤以浓度依赖方式抑制RA FLSs的活力,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。RT-qPCR检测结果显示,在炎症因子IL-1β刺激条件下,MAP3K2 mRNA表达水平显着升高,经过不同浓度断藤益母汤和MTX干预后,其表达水平相对于模型组均显着降低（P<0.05或P<0.01）。蛋白印迹分析发现与模型组相比,断藤益母汤高剂量、中剂量组对MAP3K2蛋白的表达有抑制作用,差异具有统计学意义（P<0.05）。ELISA法检测结果显示不同浓度断藤益母汤和MTX干预后,MMP-1、IL-6、TNF-α表达显着降低（P<0.001）。结论:断藤益母汤可以下调类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MAP3K2蛋白及mRNA的表达,对炎症因子MMP-1、IL-6、TNF-α也有下调作用。四、断藤益母汤对CIA小鼠模型关节炎的治疗作用目的:观察断藤益母汤对CIA小鼠关节炎模型的治疗作用。方法:42只SPF级DBA/1雄性小鼠,8周龄,分为模型组,断藤益母汤（高、中、低剂量）组,甲氨蝶呤组（MTX）。以正常小鼠作为正常组,以MTX为阳性对照组。每组样本量为7只。使用胶原诱导关节炎模型,即CIA小鼠模型。实验各组在RA小鼠模型第二次免疫时即在造模第21天开始给予相应的处理。正常组、模型组予腹腔注射生理盐水0.1ml/kg/d,断藤益母汤低/中/高剂量组灌胃量分别为6.25g/kg、12.5g/kg、25g/kg,MTX给药量为2mg/kg。每周灌胃2次,连续灌胃4周。每2天观察检测小鼠一般情况,称体重并进行小鼠关节炎评分。小鼠取材后计算小鼠脾指数、踝关节采用HE染色观察其病理变化。结果:与正常组比较,其他各组体质量下降有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,其中高剂量组小鼠体质量大于其他组,但没有统计学意义（P>0.05）。与正常组比较,模型组小鼠脾指数有升高（P<0.01）。与模型组比较,断藤益母汤低剂量组脾指数有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。首次免疫后3-5天后,部分造模小鼠双侧踝关节开始出现关节红肿,加强免疫后大部分小鼠发病,严重者出现关节活动受限。而断藤益母汤高剂量组、中剂量组、MTX组踝关节红肿不明显,关节炎评分较模型组低（P<0.05）。结论:断藤益母汤可以减轻CIA小鼠模型的关节炎肿胀度,对维持小鼠体重、脾指数有一定作用。
潘书涵[8]（2019）在《基于TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路探讨大黄素干预类风湿关节炎的实验研究》文中提出目的研究大黄素对胶原诱导性关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）模型大鼠和人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis,RA-FLS）肿瘤坏死因子α（Tumor necrosi factor-α,TNF-α）、缺氧诱导因子 1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）以及一氧化氮（Nitric oxide,NO）水平的影响,探讨大黄素通过调控TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路干预RA的分子机理,为针对RA的新药研发和临床用药提供实验依据。方法1.采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）进行虎杖中大黄素提取与含量测定,然后根据测定结果配制相应浓度大黄素溶液。2.饲养SPF级Wistar雄性大鼠60只,随机分为正常组、模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性对照组。正常组除外,其余5组前20d建立CIA大鼠模型,然后药物干预20d（高、中、低剂量组分别予4g.L-1大黄素溶液80mg.Kg-1、40mg.Kg-1、20mg.Kg-1;阳性对照组予0.75g.L-1地塞米松溶液7.5mg.kg-1）。每周测定大鼠体重和双后足跖厚度,40d后拍取大鼠足爪图片与X-Ray,并且取大鼠肝脏、脾脏、膝关节滑膜以及血清。采用HE染色法观测大鼠膝关节滑膜组织及肝、脾组织形态病理学改变;采用免疫组化染色法检测大鼠膝关节滑膜组织中TNF-α、HIF-1α以及 iNOS 表达变化;采用酶联免疫（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法和硝酸还原酶法检测大鼠血清中TNF-α、HIF-1α、iNOS及NO表达变化;采用蛋白印迹（Western blot）法检测大鼠脾组织中TNF-α、HIF-1α以及iNOS表达变化;采用逆转录一聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测大鼠脾脏中 TNF-α、HIF-1α以及 iNOS mRNA 基因表达水平。3.培养来源于人的RA-FLS与正常-FLS,设立正常组、模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性对照组。正常组用正常-FLS,其余5组用RA-FLS。高、中、低剂量组分别给予80μmol.L-1、40μmol.L-1及20μmol.L-1的大黄素溶液。阳性对照组给予0.1mg.L-1地塞米松溶液。药物干预时间均设置24h、48h、72h、96h 4个时间段。用甲苯胺蓝染色法和HE染色法观测滑膜细胞的生长和形态学改变;用ELISA法与硝酸还原酶法检测滑膜细胞培养液中TNF-αa HIF-1α、iNOS及NO表达变化;用Western blot法检测滑膜细胞中TNF-α、HIF-1α以及iNOS表达水平。结果1.采用HPLC法测得虎杖中大黄素成分的得率是1.00%。2.（1）造模后大鼠逐渐出现倦怠、脱毛、腹泻、跛行、双后足爪红肿、畸形以及溶骨等现象,第20d上述病变症状表现最为严重,模型组体重较之正常组明显降低（P<0.05）,模型组足跖肿胀度较之正常组明显增加（p<0.05）。药物干预20d后大鼠上述病变症状得以改善,与模型组比较,各给药组大鼠足跖肿胀度逐渐下降,尤其是中剂量组（P<0.05）。（2）HE染色结果显示:正常组大鼠肝、脾以及膝关节滑膜组织形态未见异常。模型组滑膜细胞结构破坏,炎性细胞大量浸润,血管明显增生;脾脏红白髓明显增生,结构模糊,肉芽肿形成;肝脏细胞结构破坏,胞浆着色深重,胞核大幅度增多且分布紊乱。药物干预20d后,各给药组上述病变情况均有缓解,尤其是中剂量组。其中滑膜组织炎性细胞浸润与血管新生均被抑制;脾脏红白髓增生和肉芽肿生成减少,结构清晰度增加;肝脏结构清晰度增加,胞浆着色变浅,胞核大幅度减少且分布均匀。（3）免疫组化染色检测、ELISA检测、硝酸还原酶法检测、Western blot检测以及RT-PCR检测结果显示:模型组大鼠血清、脾及滑膜组织中TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平均明显高于正常组（P<0.05）。药物干预20d后,大黄素组和地塞米松组TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平较之模型组均减少（P<0.05）。其中,膝关节滑膜组织中TNF-α、HIF-1α及iNOS蛋白均表现为中剂量组下降最多（P<0.05）;血清中TNF-α蛋白表达为地塞米松组下降最多,低剂量组次之（P<0.05）,而HIF-1α、iNOS及NO均表现为中剂量组下降最多（P<0.05）;脾脏中TNF-α、HIF-1α及iNOS mRNA基因表达均表现为中剂量组下降最多（P<0.05）。HIF-1α蛋白表现为中剂量组下降最多（P<0.05）,而TNF-α与iNOS蛋白表现为高剂量组下降最多（P<0.05）。3.（1）人滑膜细胞甲苯胺蓝和HE染色显示:以梭形为主的滑膜细胞均贴壁生长,卵圆形胞核居于细胞中央,RA-FLS明显比正常-FLS增长迅速。（2）ELISA与硝酸还原酶法检测结果显示:RA-FLS细胞培养液中TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达在24h、48h、72h、96h均明显高于正常组（P<0.05）,不同浓度大黄素不同时间段给药后TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达均有降低,尤其是给药80μmol.L-1,干预96h下降最多（P<0.05）。（3）Western blot检测结果显示:药物干预96h后,大黄素组和地塞米松组RA-FLS细胞中TNF-α、HIF-1α及iNOS蛋白表达较之模型组均有减少,其中高剂量组下降幅度最大,低剂量组下降幅度最小,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.随着关节炎病情发展,CIA大鼠血清、脾脏以及膝关节滑膜组织中TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平显着升高。大黄素可以抑制CIA大鼠血清、脾脏及膝关节滑膜组织中TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平,并且大黄素给药剂量为40mg.kg-1时下调作用最显着,控制炎症反应,减少骨与软骨损伤,阻碍血管增生,改善CIA大鼠病变症状。2.随着关节炎病情发展,人RA-FLS中TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达会逐渐增加,尤其在细胞培养96h增加最多。大黄素可以剂量依赖性下调人RA-FLS中TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达,并且在给药80μmol·L-1,干预96h下调作用最显着。3.大黄素可以抑制TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路开放,下调相关细胞和组织中TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平,控制炎性发展,降低骨与软骨关节损伤,减少新生血管形成,发挥治疗RA的作用。
朱小娜[9]（2019）在《雷公藤内酯醇联合5-FU抗胃癌的作用及其机制研究》文中提出背景胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,5年生存率低,严重危害人类的健康。对于晚期胃癌和术后复发的胃癌,化学治疗是主要的治疗方式。大剂量的化疗对正常组织和器官会产生较大的毒副作用,使患者的生存质量下降,且胃癌患者容易对化疗药物产生耐药性,导致化疗失败。雷公藤内酯醇是从我国传统中药材雷公藤根部提取的一种环氧二萜内酯化合物,具有抗炎及免疫抑制作用。近年来发现雷公藤内酯醇能抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移。5-氟尿嘧啶是胃癌化疗方案中最基础的药物,雷公藤内酯醇能否增强5-FU对胃癌细胞的杀伤作用,提高胃癌对5-FU的化疗敏感性没有报道。目的明确在体外实验中,雷公藤内酯醇是否能抑制胃癌细胞SGC-7901和KATOIII的增殖、诱导胃癌细胞凋亡。研究雷公藤内酯醇是否能提高胃癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性,并探索雷公藤内酯醇发挥该作用的潜在分子机制。方法CCK-8法检测不同浓度梯度的雷公藤内酯醇单药（5-40μg/ml）及对应浓度的雷公藤内酯醇联合低浓度5-FU（3μg/ml）处理胃癌细胞系SGC-7901和KATO Ⅲ 48小时后细胞的存活性,并在光学显微镜下观察两组细胞的形态改变。流式细胞术检测不同药物处理后的细胞凋亡比例。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测分子COX-2和iNOS mRNA和蛋白水平的表达变化。结果CCK-8检测结果显示,雷公藤内酯醇单药浓度≥20ug/ml时有抑制胃癌细胞增殖的作用,而当雷公藤内酯醇与低浓度的5-FU联合用药时,雷公藤内酯醇的浓度≥10ug/ml即能显着抑制胃癌细胞的增殖且抑制的程度与雷公藤内酯醇呈剂量依赖性。且两药联合的增殖抑制效果高于对应浓度的雷公藤内酯醇单药以及5-FU单药。光学显微镜下观察各组药物处理后细胞形态学的变化,发现雷公藤内酯醇与5-FU联合处理SGC-7901和KATOIII细胞48小时,可显着诱导癌细胞的凋亡和坏死,细胞变圆、肿胀、脱壁、细胞膜破损轮廓不清,并且凋亡诱导作用与联合的雷公藤内酯醇的剂量呈正相关。流式细胞学的结果也证实,相较于单药雷公藤内酯醇或单药5-FU处理胃癌细胞,雷公藤内酯醇和5-FU联合处理后凋亡细胞的比例明显增高,且细胞凋亡的程度与雷公藤内酯醇的剂量正相关。同时,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法显示,雷公藤内酯醇单药组和两药联合组处理的胃癌细胞COX-2和iNOS的mRNA和蛋白表达水平均显着下调,雷公藤内酯醇的浓度越高,COX-2和iNOS的表达抑制越明显。5-FU单药对COX-2和iNOS的表达没有影响。结论雷公藤内酯醇可以抑制胃癌细胞SGC-7901和KATO III的增殖,与低浓度的5-FU联合处理明显增强了对胃癌细胞的增殖抑制作用。雷公藤内酯醇可以促进5-FU介导的凋亡诱导作用,增加胃癌细胞对5-FU的化疗敏感性。其机制可能通过雷公藤内酯醇抑制胃癌细胞COX-2和iNOS的表达,进而发挥对5-FU的化疗增敏作用。
郭燕[10]（2019）在《鼻-鼻窦炎与NO浓度分布相关性的数值模型研究与临床应用》文中进行了进一步梳理一氧化氮（Nitric Oxide,NO）在鼻腔鼻窦功能中具有抗细菌、抗真菌、抗病毒作用、促进鼻粘膜腺体分泌、维持黏膜粘液纤毛运输、调节鼻黏膜血管张力等重要生理作用,鼻腔鼻窦内NO浓度改变及异常分布与鼻腔鼻窦疾病的发生发展关系密切。目前NO在国内外已被较广泛用于监测鼻-鼻窦的免疫和炎症情况,但人鼻腔鼻窦NO浓度分布和流动情况并不十分清楚,鼻-鼻窦炎症与鼻腔鼻窦中NO浓度分布及水平的关系尚不明确,现主要通过鼻呼出气NO浓度检测来间接了解正常和炎症状态下鼻腔鼻窦NO浓度分布情况,并通过这个检测值来研究推断NO浓度分布变化与鼻-鼻窦炎之间的相互影响和关联,但是这个检测值目前国内外的研究结果存在较大差异,未能形成统一并大家认可的参考标准值,而且鼻腔鼻窦结构复杂,鼻呼出气NO浓度并不能真正代替鼻腔鼻窦具体各处的NO浓度分布,所以本研究从生物力学角度建立鼻腔鼻窦NO浓度分布数值模型研究平台,利用计算流体动力学的方法,模拟分析研究人正常情况下和鼻窦炎手术前后鼻腔鼻窦NO浓度分布和流动情况。本研究主要有以下内容:第一节:目的:为研究鼻腔鼻窦内NO浓度分布,了解与之密切相关的鼻腔气流情况。方法:获取一志愿者鼻腔鼻窦CT高分辨图像,建立数值模型,行数值模拟计算,对气流场特征进行分析。结果:总鼻道和中鼻道气流最大,下鼻道次之,嗅裂区最小。结论:总鼻道气流起通气作用,中鼻道气流很可能起将上颌窦内排出的NO带到鼻腔和上下呼吸道的作用,嗅裂区气流为嗅觉服务。第二节:目的:研究健康人鼻腔鼻窦NO浓度分布、流动情况和NO分布在鼻腔鼻窦功能中所起的生理作用,并对数值模型模拟计算结果进行可信性验证;通过数值模拟,找到无创、直接求得鼻腔各处和上颌窦内NO浓度的方法。方法:在第一节的数值模型基础上,增加上颌窦内NO和空气混合,进行数值模拟计算,对NO在鼻腔鼻窦鼻咽部的气流场特征进行分析;通过计算鼻呼出气NO浓度与上颌窦NO浓度比值与网查文献的二者比值进行比较,验证模型计算结果的可信性。通过设定不同大小的上颌窦NO浓度值,数值模拟计算得到相应鼻呼出气NO浓度,检验二者是否呈正比例直线关系,并计算比值k。结果:呼气期进入对侧的NO量非常少,越近鼻窦口NO浓度越高,自上颌窦口向远处形成浓度梯度,越靠近鼻腔和鼻咽外侧壁浓度越高。NO在鼻腔随呼吸气流流动,吸气和呼气时气流大多局限于中鼻道,向后下进入鼻咽部,向前下出前鼻孔。呼气初期NO才能几乎布满鼻腔。吸气期鼻咽部的NO浓度相对较高;通过本研究的数值模拟计算鼻呼出气NO浓度和上颌窦NO浓度比值与网查文献二者比值相比较,前者在后者的范围内;前鼻孔呼出气NO浓度与上颌窦NO浓度为正比例直线相关,并计算出比值k。结论:NO对对侧鼻腔NO浓度影响很小,NO在健康人鼻腔鼻咽部的浓度分布有梯度,各处并不相同,并随呼吸时间而变化,不同浓度在不同的部位发挥其生理作用,鼻腔鼻窦数值模拟可以进行鼻腔鼻窦NO浓度分布个性化的定性定量分析。经本研究数值模拟计算鼻呼出气NO浓度和上颌窦NO浓度比值与网查文献二者比值相比较,认为本研究的数值模拟计算结果可信。通过数值模拟的方法由可测知的鼻呼出气NO浓度计算得到鼻窦NO浓度,这是一种无创、直接、方便的测量方法,因实际临床中的二者比值与计算出的比值k是相一致的,我们可以通过对比值k的研究,来研究鼻腔鼻窦NO的分布。第三节:目的:研究鼻腔不同体积流速对呼气期鼻腔NO浓度分布和鼻呼出气NO浓度值的影响,对不同流速引起鼻NO浓度分布改变与鼻-鼻窦炎的发生和治疗的相关性进行基础研究。方法:在第二部分的数值模型基础上,改变数值模型的鼻咽入口体积流速条件,计算鼻腔和鼻呼出气NO浓度分布变化。结果:如果NO的上颌窦源固定数值输出,呼气体积流速或流量越大,鼻腔内NO浓度梯度越小,分布范围越小,鼻呼出气NO浓度越低,前鼻孔处NO也有浓度梯度。结论:鼻腔内NO浓度分布、鼻呼出气NO浓度与鼻气体体积流速和流量密切相关,呈负相关。鼻呼出气测定应统一测量时的呼出气体积流速或流量和测量头的朝向和深度,并且测量时间越短越好,有利于鼻呼出气NO浓度测量值的标准形成和统一。第四节:目的:通过对上颌窦口大小变化后对鼻腔鼻窦NO浓度分布的研究,了解窦口大小变化对鼻窦炎的发生发展的影响和行窦口开放手术后迁延不愈及反复的原因。方法:在第二部分数值模型的基础上,改变一侧上颌窦口大小,分别建立五个不同大小窦口的模型,并再建立两个包括上颌窦的不同窦口大小的模型,计算不同模型鼻腔、前鼻孔的NO浓度分布和窦腔内NO浓度分布。结果:窦口越小,NO在鼻腔侧窦口周围浓度梯度越小,鼻腔内NO浓度越低,分布范围越小,鼻呼出气NO浓度越小。窦口越大,窦腔侧窦口周围越近窦口浓度越低,浓度梯度越明显。结论:黏膜肿胀、息肉形成等病因使窦口缩小是引起鼻窦炎的重要原因。鼻呼出气NO浓度检测可作为检测上颌窦口通畅与否或大小的指标。窦口开放过大是引起上颌窦内炎症迁延不愈或反复的重要原因之一。第五节:目的:通过模拟上颌窦积脓、外伤、手术等导致上颌窦腔容积的改变,研究其对鼻腔NO浓度分布的影响。方法:在第二部分数值模型的基础上,改变上颌窦体积,建立四个不同体积的数值模型,其余条件不变,计算鼻腔NO浓度分布。结果:上颌窦体积变化但鼻腔内NO浓度分布基本无差异。上颌窦体积缩小时,产生NO的黏膜表面积相对体积缩小较慢,可能对NO在鼻腔和鼻呼出气中的浓度影响不大。结论:在手术或外伤导致的上颌窦体积变小,可能不影响鼻腔内的NO浓度分布及其生理功能,但炎症引起的上颌窦体积变小需进一步研究。第六节:目的:通过对中鼻道横径大小变化对鼻腔和鼻呼出气NO浓度的影响,来了解鼻窦炎时中鼻甲手术和中鼻道病变是否会对鼻腔NO浓度分布和鼻呼出气NO浓度产生影响。方法:在第二部分数值模型的基础上,将中鼻道容积横向扩大,计算鼻腔NO浓度分布和鼻呼出气NO浓度与第二部分的健康人结果相比较。结果:数值模拟中鼻道横径变宽,除中鼻道外其他部位的NO浓度均升高。结论:中鼻道扩大导致鼻腔鼻咽部NO浓度升高,会影响上下呼吸道的生理功能。建议在鼻窦炎术前术后测量鼻呼出气NO浓度时结合中鼻道横径是否有变化,有利于鼻呼出气NO浓度值的统一和差异减小,能够更准确的反映鼻窦炎术后恢复情况和窦口的开放情况。第七节:鼻窦炎上颌窦黏膜内NO与一氧化氮合酶含量研究目的:通过检测鼻窦黏膜内NO及一氧化氮合成酶的量,间接了解鼻窦炎状态下鼻窦内NO浓度是否升高,分析鼻窦炎时鼻呼出气NO浓度降低原因,并且分析NO参与鼻窦炎致病机理。方法:检测鼻窦炎和对照组窦腔黏膜标本中的NO和一氧化氮合成酶的量,进行比较和统计学分析。结果:真菌性鼻窦炎组NO和一氧化氮合成酶的量最高,慢性鼻窦炎组次之,对照组最低。结论:NO浓度变化是鼻窦炎致病重要因素之一;鼻窦炎时鼻窦内NO浓度很可能也升高,结合之前的窦口大小对鼻腔NO浓度影响的数值研究,鼻窦炎的鼻呼出气NO浓度降低,很大可能是由于是由于窦口变小所致。
二、诱导性一氧化氮合酶的表达与胃癌肿瘤血管形成及预后的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、诱导性一氧化氮合酶的表达与胃癌肿瘤血管形成及预后的关系（论文提纲范文）
（1）内皮型一氧化氮合酶影响胃癌腹膜转移的机制及其作为胃癌治疗靶点的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于泛癌症分析研究NOS3在胃癌中的表达及临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 TCGA、GTEx及GEO数据集的下载 |
| 2.2.2 分析NOS3在肿瘤和正常组织中的差异表达 |
| 2.2.3 NOS3表达和临床表型分析 |
| 2.2.4 细胞系中NOS3表达 |
| 2.2.5 胃癌患者病例收集 |
| 2.2.6 免疫组化染色 |
| 2.2.7 免疫组化染色结果评估 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NOS3 mRNA在癌组织和正常组织中的表达水平 |
| 3.2 NOS3 mRNA在癌细胞系中的表达水平 |
| 3.3 NOS3在癌组织及正常组织中差异表达分析 |
| 3.4 NOS3 mRNA表达与临床表型之间的关联 |
| 3.5 生物信息学分析NOS3在胃癌中的临床意义 |
| 3.6 胃癌患者病理组织中NOS3的临床意义 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:NOS3在胃癌腹膜转移过程中的作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MKN-45P细胞系的建立 |
| 2.2.3 siRNA转染 |
| 2.2.4 伤口愈合实验 |
| 2.2.5 Transwell实验检测细胞迁移能力 |
| 2.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力 |
| 2.2.7 粘附实验 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 GSEA分析 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 敲低NOS3表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.2 抑制NOS3表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.3 生物信息学分析胃癌中NOS3表达相关通路 |
| 3.4 胃癌细胞中干预NOS3表达对MAPK通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌腹膜转移的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT实验 |
| 2.2.3 伤口愈合实验、粘附实验、Transwell实验和western实验 |
| 2.2.4 集落形成实验 |
| 2.2.5 胃癌腹膜转移模型构建 |
| 2.2.6 免疫组化实验 |
| 2.2.7 分子对接 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 蟾毒灵是以NOS3为靶点的抗肿瘤药物 |
| 3.2 蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌细胞的恶性生物学行为的影响 |
| 3.3 动物实验证实蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌腹膜转移的作用 |
| 3.4 蟾毒灵抑制NOS3活性对其下游信号的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 上皮间充质转化与肿瘤腹膜转移的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）L-NIL通过调控CXCL5/CXCR2信号抑制MDSCs浸润抗口腔鳞癌肺转移的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:髓样细胞对口腔鳞癌肺转移的影响研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 细胞株及临床组织标本来源 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养,传代,冻存和复苏 |
| 2.2.2 体外诱导M2型TAMs和条件培养基的收集 |
| 2.2.3 M2型巨噬细胞的鉴定 |
| 2.2.4 实时荧光定量多聚核苷酸链式反应 |
| 2.2.5 免疫组织化学染色 |
| 2.2.6 M2型巨噬细胞对口腔癌细胞EMT的影响 |
| 2.2.7 M2型巨噬细胞对口腔癌细胞干性的影响 |
| 2.2.8 M2型巨噬细胞对口腔癌细胞侵袭迁移的影响 |
| 2.2.9 B931和B866皮下移植瘤肺转移模型 |
| 2.2.10 体内清除MDSCs动物模型 |
| 2.2.11 HE染色 |
| 2.2.12 小鼠口腔癌组织免疫组织化学染色 |
| 2.2.13 流式细胞术检测肿瘤组织及脾中MDSCs |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 髓样细胞在人口腔癌组织中的分布 |
| 3.2 M2型巨噬细胞对口腔癌细胞EMT的影响 |
| 3.3 M2型巨噬细胞对口腔癌细胞干性的影响 |
| 3.4 M2型巨噬细胞对口腔癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 3.5 体内清除MDSCs效率验证 |
| 3.6 体内清除MDSCs细胞对口腔鳞癌肺转移的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 L-NIL对口腔鳞癌生长及肺转移的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 肺转移结节来源口腔癌细胞系建立 |
| 2.2.3 荧光素酶病毒转染细胞及鉴定 |
| 2.2.4 B931和B866皮下移植瘤肺转移模型 |
| 2.2.5 体内L-NIL处理和标本收集 |
| 2.2.6 小动物活体成像 |
| 2.2.7 生存分析 |
| 2.2.8 肺组织HE染色 |
| 2.2.9 NO代谢产物测定 |
| 2.2.10 iNOS免疫组织组织化学染色 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肺转移结节来源口腔癌细胞系建立 |
| 3.2 B931细胞荧光素酶转染及表达 |
| 3.3 iNOS在口腔鳞癌组织中的分布及表达 |
| 3.4 体内应用L-NIL可抑制小鼠口腔鳞癌生长 |
| 3.5 L-NIL抑制口腔鳞癌肺转移 |
| 3.6 L-NIL延长B866荷瘤小鼠生存率 |
| 3.7 L-NIL降低外周血中NO代谢产物水平 |
| 3.8 体内应用L-NIL对各主要脏器的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 L-NIL阻断CXCL5介导的MDSCs浸润抑制口腔鳞癌肺转移 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 流式抗体 |
| 2.1.4 质谱流式抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组织化学染色 |
| 2.2.2 流式细胞术 |
| 2.2.3 质谱流式细胞术 |
| 2.2.4 肿瘤组织内蛋白提取及BCA测浓度 |
| 2.2.5 细胞因子微阵列分析实验 |
| 2.2.6 CXCR2抑制剂SB225002体内清除MDSCs细胞 |
| 2.2.7 肺组织HE染色 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 L-NIL对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响 |
| 3.2 L-NIL对免疫微环境的影响 |
| 3.2.1 质谱流式(CyTOF)检测B931肿瘤组织中免疫细胞亚群的变化 |
| 3.2.2 免疫组化和流式细胞术验证MDSCs的变化 |
| 3.2.3 免疫组化和流式细胞术检测巨噬细胞的变化 |
| 3.3 L-NIL对体内细胞因子的影响 |
| 3.3.1 血浆中细胞因子的变化 |
| 3.3.2 肿瘤组织局部细胞因子的变化 |
| 3.4 CXCR2抑制剂SB225002对口腔癌肺转移的影响 |
| 3.5 SB225002对MDSCs细胞浸润的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 髓样细胞在肿瘤发生发展和治疗中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）GCH-1调控胃腺癌BH4水平抑制肿瘤生长的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 四氢生物喋呤代谢紊乱与疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）氧化应激诱导的胃癌iNOS表达与顺铂化疗敏感性关系的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ROS与胃癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）线粒体NOS1调控结肠癌化疗耐药与Ⅰ型干扰素通路的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 NOS1定位于结肠癌细胞线粒体 |
| 一 材料和方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 NOS1通过增加SIRT3酶活性导致结肠癌化疗耐药 |
| 一 材料和方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 Hsp90协助NOS1向线粒体转移 |
| 一 材料和方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 NOS1通过增加H_2O_2抑制结肠癌Ⅰ型干扰素通路 |
| 一 材料和方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 全文综述 |
| 参考文献 |
| 统计学审稿证明 |
| 缩写词简表 |
| 博士研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）BH4/iNOS与胃腺癌组织中淋巴管生成关系的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）基于网络药理及分子对接探讨断藤益母汤靶向MAP3K2治疗类风湿关节炎的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 类风湿关节炎研究进展 |
| 一、中医药对类风湿关节炎的认识 |
| 二、现代医学对类风湿关节炎的治疗进展 |
| 三、小结 |
| 第二节 网络药理学研究进展 |
| 一、网络药理学概述 |
| 二、中医药的整合机制研究 |
| 三、网络药理学研究内容 |
| 四、网络药理学研究方法 |
| 五、小结 |
| 第三节 分子对接研究进展 |
| 一、基于配体的分子对接原理及方法 |
| 二、基于受体的分子对接原理及方法 |
| 三、基于配体-受体相互作用的对接原理和方法 |
| 四、小结 |
| 第四节 断藤益母汤研究进展 |
| 一、断藤益母汤概述 |
| 二、断藤益母汤药物研究 |
| 三、断藤益母汤药理学机制研究 |
| 四、断藤益母汤临床研究 |
| 五、小结 |
| 第五节 MAP3K2研究概述 |
| 一、MAP3K2概述 |
| 二、MAP3K2在肿瘤中的作用 |
| 三、MAP3K2在类风湿关节炎中的作用 |
| 四、MAP3K2在骨代谢中的作用 |
| 五、小结 |
| 第二章 基于网络药理学的断藤益母汤作用机制研究 |
| 一、目的 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 基于分子对接的断藤益母汤作用机制研究 |
| 一、目的 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第四章 断藤益母汤对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MAP3K2表达的影响 |
| 一、目的 |
| 二、实验对象和材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、统计学分析 |
| 五、结果 |
| 六、讨论 |
| 第五章 断藤益母汤对胶原诱导型小鼠类风湿关节炎模型的治疗作用 |
| 一、目的 |
| 二、实验对象与材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、统计学分析 |
| 五、结果 |
| 六、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）基于TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路探讨大黄素干预类风湿关节炎的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 实验用药的配制 |
| 1 虎杖中大黄素成分提取和质量控制 |
| 2 动物实验用药配制 |
| 3 细胞实验用药配制 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 大黄素基于TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路干预CIA大鼠的实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 CIA大鼠模型的建立 |
| 1.2.3 药物干预 |
| 1.2.4 取材 |
| 1.2.5 观察指标 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 CIA大鼠模型建立验证 |
| 1.3.2 大黄素对RA大鼠脾脏、肝脏及膝关节滑膜组织形态学的影响 |
| 1.3.3 大黄素对RA大鼠膝关节滑膜组织TNF-α、HlF-1α以及iNOS蛋白表达的影响 |
| 1.3.4 大黄素对RA大鼠血清中TNF-α与HIF-1α蛋白表达的影响 |
| 1.3.5 大黄素对RA大鼠血清中iNOS与NO表达的影响 |
| 1.3.6 大黄素对RA大鼠脾脏中TNF-α、HIF-1α及iNOS蛋白表达的影响 |
| 1.3.7 大黄素对RA大鼠脾脏中TNF-α、HIF-1α及iNOS mRNA表达的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 2 大黄素基于TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路干预人RA-FLS的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞样本 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 滑膜细胞培养 |
| 2.2.2 滑膜细胞给药 |
| 2.2.3 滑膜细胞鉴定 |
| 2.2.4 ELISA法检测人RA-FLS细胞培养液中TNF-α与HIF-1α表达水平 |
| 2.2.5 硝酸还原酶法检测人RA-FLS细胞培养液中iNOS与NO表达水平 |
| 2.2.6 Western blot法检测人RA-FLS细胞中TNF-α与HIF-1α以及iNOS表达水平 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 细胞生长和形态观察 |
| 2.3.2 大黄素对人RA-FLS细胞培养液中TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达的影响 |
| 2.3.3 大黄素对人RA-FLS细胞中TNF-α、HIF-1α以及iNOS表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略语表 |
| 附录二 综述 虎杖大黄素通过调控NO/NOS系统干预RA的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录三 致谢 |
| 附录四 个人简介 |
（9）雷公藤内酯醇联合5-FU抗胃癌的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写、符号清单、术语表 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 雷公藤内酯醇对胃癌细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 雷公藤内酯醇联合5-FU对胃癌细胞形态学影响 |
| 3.3 雷公藤内酯醇增强5-FU对胃癌细胞的促凋亡效应 |
| 3.4 雷公藤内酯醇联合5-FU对胃癌细胞COX-2和iNOS mRNA表达的抑制作用 |
| 3.5 雷公藤内酯醇联合5-FU对胃癌细胞COX-2和iNOS蛋白表达的抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（10）鼻-鼻窦炎与NO浓度分布相关性的数值模型研究与临床应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一节 鼻腔鼻窦解剖及生理 |
| 第二节 健康人鼻腔气道气流生物力学模型研究 |
| 一、研究材料及方法 |
| 二、研究结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三节 人鼻腔气道及单侧上颌窦NO流动及浓度分布数值分析 |
| 一、研究材料及方法 |
| 二、研究结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第四节 健康人不同体积流速对鼻腔NO浓度分布影响的数值分析 |
| 一、研究方法 |
| 二、研究结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第五节 上颌窦口大小变化对鼻腔鼻窦NO浓度分布影响的数值分析 |
| 一、研究材料及方法 |
| 二、研究结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第六节 上颌窦腔体积改变对鼻腔鼻窦NO浓度分布影响的数值分析 |
| 一、研究方法 |
| 二、研究结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第七节 中鼻道宽度变化对鼻腔NO浓度分布影响的数值分析.. |
| 一、研究方法 |
| 二、研究结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第八节 鼻窦炎时上颌窦粘膜内NO与一氧化氮合霉含量研究 |
| 一、实验对象和方法 |
| 二、实验结果及统计学方法 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、诱导性一氧化氮合酶的表达与胃癌肿瘤血管形成及预后的关系（论文参考文献）
- [1]内皮型一氧化氮合酶影响胃癌腹膜转移的机制及其作为胃癌治疗靶点的研究[D]. 邹丹. 中国医科大学, 2021(02)
- [2]L-NIL通过调控CXCL5/CXCR2信号抑制MDSCs浸润抗口腔鳞癌肺转移的研究[D]. 李杏. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]GCH-1调控胃腺癌BH4水平抑制肿瘤生长的研究[D]. 刘宥苡. 昆明医科大学, 2021(01)
- [4]氧化应激诱导的胃癌iNOS表达与顺铂化疗敏感性关系的研究[D]. 王嘉鑫. 昆明医科大学, 2020
- [5]线粒体NOS1调控结肠癌化疗耐药与Ⅰ型干扰素通路的研究[D]. 王千里. 南方医科大学, 2019(02)
- [6]BH4/iNOS与胃腺癌组织中淋巴管生成关系的研究[D]. 闫志军. 昆明医科大学, 2019(05)
- [7]基于网络药理及分子对接探讨断藤益母汤靶向MAP3K2治疗类风湿关节炎的作用机制[D]. 王强. 广州中医药大学, 2019(03)
- [8]基于TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路探讨大黄素干预类风湿关节炎的实验研究[D]. 潘书涵. 贵州中医药大学, 2019(02)
- [9]雷公藤内酯醇联合5-FU抗胃癌的作用及其机制研究[D]. 朱小娜. 浙江大学, 2019(03)
- [10]鼻-鼻窦炎与NO浓度分布相关性的数值模型研究与临床应用[D]. 郭燕. 大连医科大学, 2019(04)