一、NDV地方分离株的分离鉴定及生物学特性研究（论文文献综述）
撒薇[1]（2021）在《PPMV-1的分离鉴定、代表性毒株的全基因组序列分析及细胞凋亡通路相关因子RT-qPCR方法的建立》文中认为鸽的新城疫（Newcastle disease,ND）是目前养鸽业最常见的病毒性传染病,该病主要由被认为是新城疫病毒（Newcastle disease viruses,NDV）变异株的鸽Ⅰ型副粘病毒（Pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1）引起。近年来,该病在国内多地的鸽群发生和流行,给养鸽业带来巨大的经济损失。因此,本研究将开展PPMV-1分离鉴定、基因组测序和分子遗传变异分析等研究,这对了解病毒的流行情况、进化趋势以及ND防控都具有重要意义。论文的主要研究内容与结果如下:1.PPMV-1的分离鉴定及其F基因测序和分子进化分析本研究对2019-2020年收集广西各地暴发疑似鸽新城疫的临床样品进行了PPMV-1病毒分离和鉴定,并对分离株F基因序列测定以及分子进化分析。结果,从发病鸽群共分离鉴定了六株PPMV-1毒株,分别命名为pi/CH/GX1001/2019、pi/CH/GX1101/2019、pi/CH/GX1201/2019、pi/CH/GX1202/2019、pi/CH/GX0108/2020和pi/CH/GX0114/2020;分离株F基因测序结果表明,六株病毒分离株F基因编码区长度均为1662核苷酸（nt）,编码553氨基酸。分离株的F蛋白裂解位点序列为112RRQKRF117,符合强毒株特征;将测定的毒株序列结合Gen Bank数据库中的参考毒株基因序列分别构建数据集,通过贝叶斯系统动力学分析方法,对毒株进行系统发育、分子钟及地理系统发育分析。分子进化分析结果表明,pi/CH/GX1201/2019和pi/CH/GX1202/2019属于基因VI.2.1.1.2.1亚型（原Ⅵj）,而pi/CH/GX1001/2019、pi/CH/GX1101/2019、pi/CH/GX0108/2020和pi/CH/GX0114/2020则属于VI.2.1.1.2.2亚型（原Ⅵk）,这两种基因亚型是国内PPMV-1毒株的优势基因型。分子钟结果表明基因VI型PPMV-1毒株大约在上世纪60年代开始出现进化分岐。基因VI.2.1.1.2.1亚型和VI.2.1.1.2.2亚型毒株的最近共同祖先（tMRCA）可追溯至1989年（95%HPD,1986.82-1992.02）。地理系统动力分析结果为国内NDV的溯源分析推测提供依据,VI.2.1.1.2.1和VI.2.1.1.2.2这两个亚基因型的NDV可能由一个来自欧洲（如意大利或比利时）的共同祖先首次传入中国后不断发生独立进化而来的。2.四株代表性PPMV-1全基因序列的测定及遗传变异分析选取了基于F基因序列属于VI.2.1.1.2.1亚型的pi/CH/GX1202/2019与属于VI.2.1.1.2.2亚型的pi/CH/GX1001/2019、pi/CH/GX1026/2016和pi/CH/GX1101/2019的共四株广西PPMV-1代表性毒株在BHK-21细胞进行蚀斑纯化,并对纯化病毒进行全序测定以及分子进化分析,从病原分子水平探索毒株的特性,了解广西地区PPMV-1毒株的流行情况及遗传变异规律,为鸽新城疫防控提供理论依据。结果显示,经过连续三代纯化得到四株纯化的PPMV-1病毒。四株毒株核苷酸全长为15192 nt,其中包含6个开放阅读框,依次为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,相应编码了六个结构蛋白分别为:NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白。全基因序列系统发育进化树分析结果表明,四株PPMV-1毒株属于两个亚基因型,其中pi/CH/GX1202/2019属于基因VI.2.1.1.2.1亚型,pi/CH/GX1001/2019、pi/CH/GX1026/2016和pi/CH/GX1101/2019属于VI.2.1.1.2.2亚型,分型结果与根据F基因序列分型结果一致。4株PPMV-1分离株全基因序列核苷酸相似性为92.3%～98.3%。四株毒株F蛋白在七肽重复区（A和B）保守,在信号肽和融合肽区有突变;HN蛋白糖基化位点和半胱氨酸残基位点保守,中和表位上只有pi/CH/GX1101/2019（H199R）和pi/CH/GX1202/2019（I352V）各有一个位点的变化。3.PPMV-1感染鸡的细胞凋亡通路相关因子实时荧光定量PCR方法的建立本研究根据课题组用PPMV-1毒株感染鸡后通过RNA-Seq技术进行转录组分析筛选出5个细胞凋亡通路差异表达的基因（TRIM25、CAS8、CDKN1A、BIRC2、IKBα）,分别设计了5对扩增其基因的特异性引物,从鸡全血淋巴细胞扩增出相应的5条目的基因,成功构建了重组质粒作为标准品,建立其荧光定量PCR标准曲线,同时分别进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果显示:细胞因子基因荧光定量PCR的标准曲线相关性好,溶解曲线呈单一溶解峰,各基因的批内和批间重复试验标准差和变异系数均符合要求。本研究成功建立了5个细胞凋亡因子实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）检测方法,该方法为快速准确和定量分析细胞凋亡通路细胞因子在m RNA转录水平提供了技术支持,为后续进一步深入研究鸡感染PPMV-1固有免疫机制打下良好的基础。综上所述,本研究分离并鉴定了六株PPMV-1广西分离株,发现广西鸽群主要流行VI.2.1.1.2.1亚型和VI.2.1.1.2.2亚型的PPMV-1,通过贝叶斯方法对分离株进行了系统发育及溯源分析,在分子水平揭示了中国PPMV-1分离株基因遗传多样性的变化规律,而且再次印证国内的基因VI型PPMV-1毒株可能主要是从比利时或意大利等欧洲国家传入,并且是由一个共同的祖先首次传入中国后不断发生独立进化而来的;实验完成了pi/CH/GX1202/2019、pi/CH/GX1001/2019、pi/CH/GX1026/2016和pi/CH/GX1101/2019四株广西代表性PPMV-1毒株的纯化与全基因组序列测定及遗传变异分析,PPMV-1全基因组的分型结果与基于病毒F基因序列的分型结果一致,丰富了NDV毒株生物信息;成功建立了鸡细胞凋亡通路的5个差异表达基因实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究为探索NDV流行病学研究、丰富病毒全基因组生物学信息库以及了解病毒致病机理和免疫应答研究提供理论依据和技术支持,对ND的防控也具有重要的参考价值。
展天松[2]（2021）在《鸽源新城疫病毒的进化和宿主偏嗜性分子机制研究》文中认为新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒引起的严重危害全球养殖业的主要疫病之一。鸽源新城疫病毒,也称为鸽Ⅰ型副黏病毒（pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1）,是鸡源NDV在鸽体内适应后形成的变异株,遍布世界各地,给养鸽业带来了巨大的经济损失。PPMV-1自上个世纪80年代传入我国之后,便在我国多个省份和地区长期存在并流行,严重阻碍了我国养鸽业的健康发展。为了解鸽群中PPMV-1的流行情况,本研究对2016～2020年从我国部分地区分离到的19株PPMV-1进行了分子流行病学调查,并测定了其生物学特性。接着进一步对我国PPMV-1进行了进化动力学分析,旨在阐明我国PPMV-1的进化和传播动态,同时也为制定科学的PPMV-1防控措施提供理论依据。已有研究表明,鸽源NDV具有明显的宿主偏嗜性,但是相关的分子机制并不明确,为此,本研究系统地比较了PPMV-1和鸡源NDV的生物学特性、致病性以及传播特性差异,然后利用反向遗传学技术进一步探究了 PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制。1.2016～2020我国部分地区鸽源新城疫病毒的分子流行病学2016～2020年从我国部分地区的发病鸽的病料中共分离到19株PPMV-1。F基因遗传进化分析表明所有分离株均属于VI.2.1.1.2.2亚型。19株PPMV-1的F及HN核苷酸序列的同源性分别是96～99.9%和96.4～99.9%,氨基酸序列的同源性分别为96.4～99.8%和 96.5～99.8%,与欧洲毒株 PPMV-1/Belgium/11-09620/201 1 处于同一分支。19株分离株与目前我国广泛使用的疫苗株La Sota遗传距离较远,所有分离株与La Sota的F及HN基因核甘酸同源性分别为83.4～84.2%和81.8～82.6%,氨基酸序列的同源性分别为87.5～88.8%和86.7～87.4%。与VI.2.1.1.2.1亚型PPMV-1的F和HN蛋白进行对比,所有分离株均出现了特异性的氨基酸变化。19株PPMV-1分离株的F蛋白裂解位点基序均为112RRQKRF117,呈典型的强毒特征,但是ICPI测定结果显示,所有的分离株均属于中等毒力株,表明除了 F蛋白裂解位点之外,还有其他基因或者结构域影响了病毒毒力。值得注意的是,本研究发现虽然有些PPMV-1分离株在鸽源细胞和鸽中的复制水平相似,但是在鸡源细胞和鸡中的复制能力却有显着性差异,这提示在鸡源细胞上和鸡中能够高效复制的PPMV-1具有在鸡群中引起大流行的潜在风险。综上所述,本章揭示了当前我国部分地区PPMV-1的流行情况,也为进一步研究我国PPMV-1的进化动力学奠定了基础。2.我国鸽源新城疫病毒的进化动力学为了阐明我国PPMV-1的进化动力学,本研究首先基于427株NDV的F基因编码区绘制最大似然进化树,结果显示来自中国地区的186株PPMV-1均属于基因Ⅵ型,其中大多数毒株属于Ⅵ.2.1.1.2.2亚型。接着对186株PPMV-1的宿主来源进行统计,结果显示186株PPMV-1中有178株来源于鸽,这也进一步说明了 PPMV-1对鸽具有明显的宿主偏嗜性。历史种群大小重建表明我国PPMV-1的种群大小变化共经历了 6个不同的时期。采用贝叶斯方法对我国PPMV-1进行时空动力学分析,结果表明华东和华南地区是我国PPMV-1主要的扩散中心,介导了 PPMV-1八条迁移路线,在我国PPMV-1的传播过程中发挥着至关重要的作用。适应性进化分析表明,我国PPMV-1的6个基因均存在正向选择位点,其中大部分正向选择位点位于NP、P和L基因上面。氨基酸序列分析表明,与鸡源NDV相比,PPMV-1的6个蛋白中均有特异性氨基酸的替代,其中有23个位点位于NP、P和L蛋白上,其余9个位点位于M、F和HN蛋白上。适应性进化分析和氨基酸序列分析结果提示NP、P和L三个基因可能与PPMV-1的宿主偏嗜性有一定的关系。综上所述,本章系统地分析了我国PPMV-1的进化动力学,为了解我国PPMV-1的进化及制定合理的PPMV-1防控措施提供了理论参考,也为进一步深入研究PPMV-1的宿主偏嗜性提供了线索。3.鸽源和鸡源新城疫病毒的致病性和传播特性比较为了找到探究PPMV-1宿主偏嗜性分子机制的关键切入点,本研究系统地比较了PPMV-1（NT-10和JS/09/16/Pi）与鸡源NDV（Kuwait256）的生物学特性、致病性和传播特性差异。毒力指标MDT和ICPI测定结果表明Kuwait256为强毒株,NT-10和JS/09/16/Pi为中等毒力株。膜融合能力、病毒受体结合特性和神经氨酸酶活性分析结果表明Kuwait256的膜融合能力、受体结合能力和神经氨酸酶活性均明显高于NT-10和JS/09/16/Pi。此外,生长曲线测定结果表明Kuwait256在鸡源细胞中的复制能力显着强于NT-10和JS/09/16/Pi,相反Kuwait 256在鸽源细胞中的复制能力却不及NT-10和JS/09/16/Pi,但这3株病毒在哺乳动物细胞中的复制水平并没有显着差异。致病性试验结果表明Kuwait256能导致SPF鸡全部发病死亡,然而NT-10和JS/09/16/Pi并不能使SPF鸡产生明显的临床症状且在鸡体内的复制水平较低。值得注意的是,Kuwait 256,NT-10和JS/09/16/Pi均能导致鸽发病并死亡。鸽子传播试验结果表明NT-10和JS/09/16/Pi均能在鸽中有效传播,然而Kuwait 256却不能在鸽中进行传播。上述结果表明与鸡源NDV相比,鸽源NDV毒株在鸡体内复制能力弱,但在鸽中具有很强的传染能力,这为进一步研究PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制提供了重要参考。4.鸽源新城疫病毒宿主偏嗜性的分子机制基于本研究已有结果,继续探讨PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制。本研究首先构建了 Kuwait256株和NT-10株的感染性克隆,接着以NT-10株为骨架,利用反向遗传学技术,将Kuwait 256株的内部蛋白NP、P、L或者外部蛋白M、F、HN联合替换至NT-10上,成功构建并拯救了 2株重组病毒（rNT-KMFHN和rNT-KNPPL）。进一步评价了 2株重组病毒及其母本病毒的生物学特性、致病性以及传播特性差异。结果表明,NT-10骨架中同时表达Kuwait 256的NP、P和L基因时,重组病毒rNT-KNPPL的毒力和在鸡源细胞中的复制能力明显增强,与rKuwait256相似。此外,rNT-KNPPL对鸡的致病性以及在鸡中的复制能力也明显强于rNT-KMFHN和rNT-10。然而,与rNT-KMFHN和rNT-10相比,重组病毒rNT-KNPPL丧失了在鸽中的传播能力。综上所述,本研究结果表明NP、P和L基因是决定PPMV-1宿主偏嗜性的关键基因。
何颖[3]（2020）在《鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析》文中指出鸽Ⅰ型副粘病毒（Pigeon paramyxoviruses-1,PPMV-1）是新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中的基因VI型NDV,广泛分布于世界各地,引起鸟类和家禽感染,并主要引起鸽科鸟类感染发病。目前,针对对此类病原的监测报告和有关疫病的研究尚不充分,导致PPMV-1遗传进化信息和控制措施的缺乏,本文将从PPMV-1的致病机理、诊断方法、遗传多样性和病原学特性等方面进行研究。为了解PPMV-1在野鸽组织中的分布情况,阐明PPMV-1对野鸽的致病机理,本研究采用免疫组化IHC方法,针对2010～2016年间美国自然感染死亡的14只欧亚领鸽和3只岩鸽的48份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本,进行PPMV-1病原检测和病理组织学研究。结果表明,PPMV-1在17只发病鸽子的多器官组织中均有分布,其中以肾脏、肝脏和脾脏组织阳性率最高,在欧亚领鸽和岩鸽3种脏器中病原阳性率分别为92.9%、92.9%、83.3%和66.7%、33.3%、66.7%。急性至亚急性间质性肾炎和坏死性胰腺炎是野鸽感染PPMV-1后最常见的组织学病变,在欧亚领鸽和岩鸽中样本阳性率分别为50.0%、66.7%和100%、100%;病原在宿主体内广泛分布,并造成多器官的组织学损伤,这些结果证明了PPMV-1对野鸽的潜在致病力和致死原因。为研发适用于FFPE和体液组织样本中PPMV-1诊断的NGS检测技术,对美国野鸽和中国广西养鸽场中PPMV-1流行毒株的遗传多样性进行监测,并为建立最新国际统一的NDV命名分类系统提供数据支持,本文采用第二代测序技术（Next Generation Sequencing,NGS）,对48份美国野鸽FFPE样本和18份广西肉鸽分离株尿囊液样本开展了PPMV-1的全基因组测序,同时比较NGS与和IHC、RT-PCR法的检测结果,研究NGS方法应用于部分核酸降解FFPE样本和体液组织样本的可行性。结果显示,NGS与IHC法阳性样本检测符合率为79.3%,与RT-PCR法的阳性样本检测符合率为100%;FFPE和尿囊液样本中分别测得2,624,877和60,883,067个NDV读数,分别获得美国源23株和中国源18株基因VI型NDV的全基因组序列,覆盖了99-100%的NDV表征。这些毒株的F融合蛋白的氨基酸裂解位点均具有113RKKR↓F117 NDV强毒株的特征。经遗传进化分析,23个美国野鸽FFPE样本中的NDV分类命名为VI.2.1.1.1亚型NDV,分别位于VI.2.1.1.1（VI＿a）和VI.2.1.1.1（VI＿n）两个分支上,遗传距离为4.2%,并且这两个亚型的NDV在遗传进化树上的分支位置与欧亚领鸽和岩鸽这两个野鸽物种在美国的地理分布是一致的。另外,18株广西肉鸽分离NDV分类命名为VI.2.1.1.2.1（VI＿k）和VI.2.1.1.2.2（VI＿j）两个亚型,遗传进化距离为5.3%,是在国内独立维持和持续进化了20多年的两个NDV亚型,与1980～2018年间在世界范围内引起疫情的其他型别的NDV有显着的不同。同时,这些NDV的宿主贮存库仍未知,病毒有可能同时在广西的鸽场和野鸟种群中流行。以上研究所获的41条NDV的F融合基因序列信息纳入了2019年国际统一NDV新分类命名系统的试点数据集和遗传进化树构建指南中。最后,为进一步解析PPMV-1的遗传多样性造成的对不同宿主的致病性和与现有疫苗之间的差异,本研究比较了广西肉鸽PPMV-1和NDV强毒株在鸡和鸽子体内的复制水平、病理组织学变化以及传播方式,并通过分析PPMV-1与Class II NDV疫苗的F融合基因和HN血凝素-神经氨酸酶基因之间抗原性、疏水性和氨基酸位点的变异特征来研究PPMV-1的病原学特性。结果显示,广西肉鸽PPMV-1分离株的平均致死时间MDT在62～114h之间;对1日龄SPF鸡的致病指数ICPI在0.00～0.63之间,说明均为中等或低毒力的NDV毒株。病毒感染鸽子后引起肾脏、胰脏和脑等组织损伤导致死亡;同时研究观察到,PPMV-1虽然引起鸡的脑、心脏、肾脏和肺等组织的部分细胞变性坏死,但不表现临床症状;鸽子和鸡分别感染PPMV-1后,前者体内的病毒滴度和阳性抗体水平均显着高于后者（P<0.01）。PPMV-1和La Sota的血清交叉抑制试验的R系数均小于0.8。另外,分离毒株与La Sota疫苗株相比,F和HN基因的部分氨基酸位点和抗原性、疏水性发生变异。这些结果表明,广西肉鸽PPMV-1分离株与La Sota疫苗株之间存在轻微的抗原差异,这可能是近年来养鸽场使用其他基因型NDV疫苗而得不到完全保护的原因。同时,病毒可在鸡体内复制分泌而不引起临床症状,也意味着PPMV-1的循环对家禽业构成潜在的威胁风险。综上所述,本研究建立了适用于FFPE组织和体液样本中PPMV-1的NGS检测诊断方法,并且采用该方法获得了美国野鸟和广西肉鸽来源的PPMV-1的全基因组测序,为最新国际NDV分类命名系统的建立提供了数据支持,同时本研究对PPMV-1的遗传多样性和病原学特性进行了分析,这些数据将有助于PPMV-1流行病学研究、疫苗开发以及对鸽子和家禽新城疫的有效防控。
蒲路莎[4]（2020）在《鹅源星状病毒的分离鉴定及相关生物学特性的研究》文中认为星状病毒（Astrovirus,AstV）是一种没有囊膜且单股正链的RNA病毒,属于星状病毒科。该病毒目前已从多种哺乳动物以及鸡、火鸡、鸭、鹅和鸽子等禽类中检测出来,与多种动物的腹泻疾病有关。自2017年,在我国山东、安徽、广东、湖南和江苏等地陆续出现雏鹅内脏型痛风病的报道,鹅源星状病毒是引起该病的病原,其致死率可达30%以上,导致养鹅产业严重的经济损失。本研究利用RT-PCR检测鹅源星状病毒阳性;收集结果为阳性的死亡鹅病料的内脏研磨上清进行病毒分离;分离获得两株稳定繁殖的星状病毒毒株:GAstV/Goose/2019/HLJPF和GAstV/Goose/2018/HLJ01;其中GAstV/Goose/2019/HLJPF的ELD50为10-2.6/0.2mL。鹅胚分离传代结果表明病毒接种鹅胚可使胚体全身出血、体生长发育受到抑制或死亡等病变。分析NCBI上公布的GAstV序列,设计合成了一组引物,采取了RT-PCR技术来扩增GAstV的基因组片段,获取GAstV的核酸序列进而拼接GAstV的全基因组,并分析了GAstV的结构组成、抗原表位、系统发育与重组以及氨基酸的突变。测序与分析的结果显示GAstV/Goose/2019/HLJPF与GAstV/Goose/2018/HLJ01的病毒基因组全长分别为7 233bp和7 166 bp,编码3个开放阅读框（ORFs）,即ORF1a、ORF1b和ORF2。对2株GAstV病毒的序列进行系统发育分析显示它们属于Avastrovirus,并与Avastrovirus 3和TURKEY Astrovirus有密切关系。此外,ORF1a和ORF2的突变率较高。突变的ORF2蛋白三级结构光滑,其抗原表位高度突变,这可能与病毒的致病性有关,是由宿主的抗体压力引起的。基于鹅源星状病毒的遗传学以及生物特性,本研究采取了原核蛋白表达系统对HLJ01株ORF2衣壳蛋白进行了原核表达,利用纯化后获得的重组ORF2蛋白免疫小鼠制备了针对GAstV ORF2衣壳蛋白的多克隆抗体。同时针对保守区域设计了一对特异性引物,建立了用于检测鹅源星状病毒的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。综上所述,本研究对鹅源星状病毒进行了分离鉴定,同时开展了鹅源星状病毒的生物学特性的研究,并对其基因组序列进行了系统发育分析,预测其蛋白结构功能,建立了用于检测鹅源星状病毒的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,制备了针对其衣壳蛋白的特异性多克隆抗体。为进一步掌握GAstV的发生发展而提供了部分的实践基础和理论支持。
张远琴[5]（2020）在《基因Ⅵj亚型鸽源NDV的分离鉴定和不同基因型NDV对鸽的致病性与转录组学的研究》文中研究指明新城疫病毒（Newcastle disease viruses,NDV）是危害家禽业的重要病原之一,可引起鸽发生新城疫（Newcastle disease,ND）,也称鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1）病。近十年,该病常在我国肉鸽群发生和流行,给养鸽业造成巨大的经济损失。为了探究广西鸽新城疫的流行情况及不同基因型NDV对鸽的致病性和NDV感染鸽的转录组学的差异,本研究进行了鸽NDV流行毒株的分离鉴定,并用三株不同基因型NDV毒株进行鸽的致病性试验及感染鸽的转录组测序并验证。主要研究内容和结果如下:1、本研究采集最近冬季发生的鸽新城疫病例临床样品,进行样品检测和NDV的分离鉴定,结果分离到一株鸽源NDV毒株,命名为Pi/CH/GX1220/2019株。对分离株的F基因进行克隆和基因序列分析,结果表明,分离株F蛋白裂解位点氨基酸基序为112RRQKRF117,符合NDV强毒株裂解位点的特征;Pi/CH/GX1220/2019属于基因VI.2.1.1.2.1（VIj）NDV;遗传进化分析发现该分离株与近年广西地区流行的PPMV-1毒株亲缘关系较近;分子钟结果表明本分离株可能来源于广东。2、基因Ⅵ型NDV为感染宿主鸽的优势基因型,基因Ⅶ型NDV仍是我国鸡群中主要流行株,基因Ⅷ型NDV在近10年再次在国内分离到,但目前尚未见基因Ⅷ型NDV对鸽的致病性研究。为了探索这三个不同基因型的NDV毒株对宿主鸽的致病性强弱,本研究使用基因Ⅵ型鸽源pi/CH/GXP22/2000株、基因Ⅶ型鸽源pi/CH/GXP40/2001株和基因Ⅷ型斗鸡源game-fowl/CH/GXGB2011/2011株进行人工感染鸽试验,结果表明,感染后三个感染组均出现发病,发病鸽组织病理学结果表现脾脏出血坏死、胰腺和盲肠扁桃体炎性细胞浸润、坏死。三个毒株感染鸽子后第3天和7天的鸽脾脏均能检测到病毒载量;pi/CH/GXP22/2000感染组的发病症状和病理变化最轻,无死亡,脾脏组织病毒载量也较低;而pi/CH/GXP40/2001感染组发病症状和病变最严重。结果表明,这三株NDV对鸽的致病性存在差异。3、目前,由于不同基因型NDV感染鸽的转录组学比较研究较少,更缺乏基因Ⅷ型感染鸽的转录组分析资料。因此,本研究利用RNA-Seq技术对上述三株不同基因型NDV感染鸽在感染0天、感染后3天和7天的脾脏组织进行转录组分析。结果发现,与同一日龄对照组相比,三个感染组脾组织在7 dpi富集到的差异基因均比3 dpi多。三个病毒感染组引起差异显着上调的基因主要有炎症反应因子IL1B、IL18、SOCS1等;白介素家族相关基因如IL1R2、IL22R2、I17EL、IL7RA、IL2RA等;干扰素及其诱导的相关蛋白基因如IFI6、IFIT5、MX、ISG15、OASL等;趋化因子CCL3、CCL19、CCL21等;以及其他免疫应答、细胞凋亡相关基因如RIG-I、TLR22、BIRC1、RSAD2、β防御素7等。下调表达的基因主要与代谢相关,如GLR、GLUL、PLA2G、PA21B、CBPB1等。GO富集分析发现大多数与分子功能有关,KEGG通路分析发现NDV感染鸽子脾脏差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。NDV感染鸽子脾脏差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。基因Ⅵ型NDV最早激活鸽免疫应答,而基因Ⅶ型和基因Ⅷ型NDV激活鸽免疫应答虽然较晚,但是应答比基因Ⅵ型NDV强。本研究还成功建立了鸽RIG-I样信号通路和细胞凋亡通路相关因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,包括鸽子RIG-I、TRIM25、MITA、IKK?、IκBα、Apaf1、BIRC2和GADD45B8个基因。该方法验证转录组学结果,两者趋势基本一致。综上所述,本研究分离鉴定了一株基因VI.2.1.1.2.1（VIj）亚型鸽源NDV,分析了该毒株遗传进化关系及来源。对三株不同基因型NDV毒株pi/CH/GXP22/2000、pi/CH/GXP40/2001和game-fowl/CH/GXGB2011/2011感染鸽进行致病性比较研究,发现pi/CH/GXP40/2001的致病性最强。对NDV感染鸽脾脏的转录组学分析获得了主要差异基因,这些病毒感染相关的差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。为探索NDV分子流行病学研究、致病机理和免疫应答提供资料,并为NDV的防控提供参考依据。
刘帆[6]（2019）在《传染性支气管炎病毒的分离鉴定、生物学特性及疫苗候选株的初步研究》文中指出鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种鸡急性、高度接触性呼吸道传染病。IB首次爆发于上世纪30年代,现今已在全世界范围流行,给养禽业带来巨大的经济损失。IBV众多血清型之间仅存在部分交叉免疫保护性,免疫失败的现象频繁发生。因此,对IBV流行毒株进行调查研究,筛选理想的毒株作为研制疫苗株的候选毒株,对其免疫原性及交叉免疫保护性进行研究具有重要意义。从2017年～2018年山东、安徽、江苏等省市送检的病料中,分离鉴定了9株IBV,对其进行了遗传变异的研究。S1基因序列的遗传进化分析结果显示,9株IBV中7株属于QX型为代表的基因I型,2株属于基因VI型。7株IBV与QX型参考株的核苷酸及其氨基酸序列的同源性为94.8%～97%和93.6%～96.1%,与基因VI型的2株分离株的S1基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性较低,分别为67.4%～68%和60.9%～62%。9株IBV分离株与疫苗毒株H120株的S1基因相比存在广泛的点突变、基因插入及缺失的现象,核苷酸及氨基酸序列的同源性仅65.4%～78.1%和58.4%～77.3%,且其裂解位点的氨基酸序列也存在较大的差异,表明了我国流行毒株和常规疫苗株的基因型不同,同源性较低。根据分离株的背景信息、结合S1基因的遗传进化分析结果及生物学特性等试验结果,本试验对QX型IBV代表毒株JS-96和基因VI型代表株AH-48进行了致病力研究,以105.0EID50/0.1 m L的攻毒剂量感染10日龄SPF鸡。结果显示,JS-96株毒力较强,在攻毒后14 d的死亡率达65%,发病鸡表现出轻微的呼吸道症状,剖检有明显的肾脏肿大、花斑肾等病理变化;AH-48株攻毒组攻毒14 d的死亡率为17.5%,病鸡主要表现典型的IBV呼吸道症状,剖检观察有严重的气管卡他性粘液等病理变化。攻毒后对试验鸡进行抗体监测的结果显示,JS-96株攻毒组试验鸡的阳性抗体产生时间较AH-48攻毒组早3～7天。本实验选择了致病性较强株JS-96和商品疫苗株M41,按照国家IBV灭活联苗中免疫效力试验的规程,进行免疫原性和交叉免疫保护性研究。对21日龄SPF鸡经肌肉接种单价灭活油乳剂疫苗,免疫后35 d使用不同基因型的IBV毒株经滴鼻、点眼的途径攻毒。结果显示,JS-96制备的灭活苗免疫组的各攻毒组仅出现轻微症状,发病率为10%～20%,死亡率为0～20%,M41株灭活苗免疫组的各攻毒组发病率和死亡率存在显着差异（p<0.05）,分别为0～60%和0～30%。抗体检测结果显示疫苗免疫后7～14 d产生抗体,且随时间变化呈上升趋势,JS-96株免疫组在二免21 d后的抗体滴度较高,其免疫原性较好。从攻毒后组织和拭子病毒分离情况来看,M41免疫组的病毒分离率为0～50%,JS-96免疫组的病毒分离率为0～20%,对QX型IBV的保护力极显着高于非免疫攻毒组（p<0.01）,对异源毒株的攻击也有80%～90%的保护率。JS-96株制备的灭活苗对基因VI型的IBV保护力高于商品株M41油乳剂灭活苗,这一结果可为防控基因VI型IBV提供参考。本研究结果表明,常规疫苗株M41不能对当前流行毒株产生完全的保护作用,分离株JS-96制备的油乳剂灭活苗与当前IBV流行毒株匹配性好、保护率高,且显着降低水平传播的风险。本研究为筛选免疫原性较好的毒株以研制IBV多价苗的候选毒株,提供了综合防治的理论依据。
李晖[7]（2019）在《2018年江苏部分地区新城疫病毒的分离鉴定与遗传进化分析》文中进行了进一步梳理新城疫是由新城疫病毒引发的一种常见禽类疫病,可诱发多种呼吸系统和神经系统病症,又被称为亚洲鸡瘟。该病自1926年被确认以来,已引起四次全球范围的大流行,给世界经济造成了巨大损失。根据病毒对鸡的致病程度不同,一般将其分为强毒、中毒、弱毒三种致病型。依据新城疫主要毒力蛋白——F蛋白的核苷酸序列,将其分为class Ⅰ和classⅡ两大类,class Ⅰ类通常为弱毒株,至少可分为基因1a、1b、1c、1d 4种亚型,一般存在于野生水禽和活禽市场中;class Ⅱ类至少有18种基因型（Ⅰ-ⅩⅧ）,包含绝大多数的强毒株。对新城疫病毒进行流行病学调查,有利于研究其进化发展规律,对疾病的预警和防控具有重要意义。本研究对江苏部分地区的野生动物自然保护区及活禽交易市场进行新城疫病毒的分离与鉴定,采集了 1973份样品,共分离出4株新城疫病毒,毒株样品来源分别为一份野生白骨顶鸡咽拭子、一份家鸡咽拭子、一份野鸭咽拭子和一份野鸭肛拭子,宿主临床表征均为正常。新城疫总阳性分离率为0.203%,其中野生动物分离率为0.218%,高于活禽市场的分离率0.168%。扩增并获得了 4株分离株的F基因全长,其开放阅读框均为1662nt,编码氨基酸数量为553个。分析F蛋白裂解位点处氨基酸序列,发现均为典型的弱毒株序列特征,因此预测为弱毒株;分析其氨基酸序列发现,4株分离株在F蛋白重要位点以及主要功能区处发生部分氨基酸突变,但基本与其所在基因亚型的其他毒株保持一致。遗传进化结果显示:4株分离株分别属于class Ⅰ类基因1d亚型、classⅡ类基因Ⅱ型、classⅡ类基因Ⅰb型。其中class Ⅰ类基因1d型毒株与2010年美国分离株Mallard/USA/MN/AI12-3156/2010同源关系最近,因此可能为外来株;classⅡ类基因Ⅱ亚型分离株与疫苗株La Sota同源性最高,可能为疫苗株或疫苗株的进化株;class Ⅱ类基因Ⅰb亚型毒株与2015年俄罗斯分离株Uriaaalge/Russia/TyuleniyIsland/109/2015、2016 年国内分离株 NDV/Anser fabalis/CN/HN/F2-119-2/2016同源,因此可能为外来株或国内已有毒株的感染毒株。对分离出的一株class Ⅰ类毒株Coot/B559/Jiangsu/2018进行全基因组扩增,获得基因组全长15198nt,符合新城疫毒株复制的六碱基原则,序列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,基因组特征分析结果与其他class Ⅰ类毒株基本保持一致。遗传进化结果显示其为基因1d亚型,与北美分离株具有较高同源性,该亚型毒株为国内首次确认的class Ⅰ类基因1d亚型毒株,表明国内新城疫病毒基因类型有所增加。本研究为江苏地区新城疫病毒流行病学研究提供了新的数据支持,对新城疫病毒的进化分析和疾病防控具有重要意义。
蒋大秀[8]（2019）在《2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究》文中研究表明H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）对家禽表现为低致病性,引起呼吸道症状、产蛋下降等轻微症状,感染鸡排毒时间长,如若继发感染其它病原体死淘率将增加,造成养禽业严重的经济损失。近年来,不断有H9N2亚型AIV感染人的病例出现,甚至有患者病情严重,H9N2病毒对哺乳动物致病力的机制的研究与其它亚型禽流感病毒相比相对较少。H9N2亚型AIV具有流行范围广、传播效率高的流行特点,而且能够提供内部基因给其它亚型流感病毒产生重组病毒,具有大流行的风险,应对其进行长期监测和病原特点分析。本研究对2016年10月至2018年9月期间华东地区活禽交易市场（Live poultry markets,LPMs）和家禽养殖场进行了禽流感病毒流行病学监测,并对H9N2亚型AIV进行了病毒的分离鉴定和基因测序,同时选取了代表性H9N2亚型AIV进行了传播性试验、S基因型H9N2亚型AIV进行了小鼠的致病性试验。1、H9N2亚型禽流感病毒病原学调查2016年10月至2018年9月期间,在华东地区LPMs共采集泄殖腔/喉头棉拭子样品2183份,经SPF鸡胚分离和血凝-血凝抑制试验鉴定了 518株AIV和NDV病毒,病毒总阳性分离率为23.73%,其中H9N2亚型252株（11.54%,252/2183）;养鸡场疑似H9N2临床样品中分离鉴定156株H9N2亚型AIV。LPMs病毒阳性样品中H9N2病毒分离率最高（48.65%,252/518）,其次是 H5 亚型（21.81%,113/518）、H3 亚型（14.1%,73/518）、H7亚型（4.83%,25/518）等。2011年7月到2016年9月（统计周期约为12个月）分离率在 0.21%-0.78%,2016 年 10 月至 2018 年 9 月为 8.49%-15.12%,LPMs 中 H9N2 亚型AIV阳性分离率有明显上升。鸡仍然是H9N2亚型AIV的易感宿主;样品主要来源于华东地区江苏、安徽、山东等省市;近两年LPMs中的H9N2亚型AIV在夏季亦有较高的分离率,未表现出明显的季节性流行特征,可能与病毒的热稳定性增强有关。2、华东地区家禽中流行的H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征本文对测得的394个HA基因、302个NA基因、69组内部基因的核苷酸及其编码氨基酸进行了系统性分析,并选取其中具有代表性的69个分离株绘制出全基因系统发生树进行遗传进化分析。运用MEGA6.0邻接法（neighbor-joining method,NJ）绘制出了各基因片段的系统发生树,经分析,HA基因、NA基因均属于Y280-Like,内部基因PB2基因、M基因属于G1-Like,其余4个内部基因均属于F/98-Like,本研究中的H9N2亚型分离株均属于S基因型。H9N2分离株潜在糖基化位点与2012年分离株WJ57基本一致,389个分离株（389/394）HA蛋白具有7个潜在N-糖基化位点（HA1:11,123,280,287,295;HA2:154,213）,与Y280相比,缺失了 HA1 200位糖基化位点,增加了 HA1 295位糖基化位点;294株（294/302）病毒NA蛋白具有5个潜在N-糖基化位点（69,86,146,200,234）,与WJ57/12相似。其中,有11（11/302）个分离株增加了 NA蛋白第44位、14（14/302）个增加了第402位潜在N-糖基化位点。可影响病毒的受体结合特性的HA蛋白226位几乎（392/394）均发生了 Q→L突变,更倾向于结合哺乳动物受体。前期研究表明HA蛋白381K与PA蛋白672L是影响H9N2亚型AIV气溶胶传播特性的关键氨基酸位点,本研究中6个毒株（6/394）发生了 K381R的突变,PA蛋白第672位均为L。PA蛋白K356R、PB2蛋白E627K是影响H9N2亚型AIV对哺乳动物致病性的重要的氨基酸位点,本研究中所有的分离株PB2蛋白均为627E、PA蛋白均为356R。3、H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性初步研究2016年以来H9N2病毒在鸡群中分离率明显上升,且不断有人感染病例报道,不同基因型毒株传播能力、致病性是否不同,目前还没有系统的研究。从近12年H9N2亚型AIV中筛选出16株进行气源性传播试验,包括3株O基因型（SD07、W4和Dh0801D11）,1株T基因型（HeN86）,和12株S基因型。16株病毒中符合HA381K和PA672L的毒株有W4、HeN86、C1、HeN131、SQ68、WJ57、TM118、SDKD1、AH320、AH463、FJ1802 和 292HZ共12株。S基因型H9N2亚型AIV均具有气源性传播特性,即使GC510、A6的HA蛋白381为R,但是2008年分离株C1只能检测到血清转化而无排毒;其它基因型毒株中除HeN86具有上述分子标记但无气溶胶传播特性,其余病毒均符合。近两年的S基因型毒株气源性传播能力增强,暴露组排毒时间早、排毒持续时间长（第9天）、血清转化水平高;AH320和SDKD1毒株可跨宿主传播（鸡-豚鼠）,而且在检测期范围内暴露组豚鼠排毒直到暴露后14天。8个S基因型H9N2亚型AIV对小鼠低致病性,体重增长率在17.06%-22.89%,均有不同程度的增重降低,SDKD1组增重最少。病毒复制水平和组织分布差异明显,主要在肺脏复制,特别是攻毒后第3天和第5天,部分毒株在心脏、肾脏、肝脏和脾脏中亦能检测到病毒。感染后第3天、5天,各个攻毒组小鼠肺脏均呈现出以瘀血、出血、肺泡间质增生或广泛的炎性细胞渗透等间质性肺炎变化。因此,S基因型病毒普遍具有气源性传播能力、对小鼠低致病性但可从鸡传播给豚鼠,且在小鼠中组织分布更广,提示对公共卫生可能存在威胁。
罗洋洋[9]（2017）在《禽腺病毒分子流行病学及FAdV-4的生物学特性与间接ELISA方法研究》文中指出血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus 4,FAdV-4）病是引起心包积液和包涵体肝炎为主要特征的一种急性、高度接触传染性疾病。2010年之前我国对该病的报道较少,但在2015年后在我国北方大量暴发,之后逐渐向全国蔓延,给养禽业带来巨大的经济损失。目前对FAdV-4的研究处于初始阶段,生物学特征及基因组功能尚不清楚,检测方法也主要针对抗原,尚无商品化的ELISA试剂盒,因此对FAdV-4生物学特性、全基因分析和抗体检测方法的研究对该病的防控具有重大意义。本研究于20152016年期间从我国10个省市自治区发病鸡场采集病样130余份,分离鉴定了83株禽腺病毒,其中81株为血清4型I亚群腺病毒,2株为血清8b型I亚群腺病毒。81株FAdV-4的主要分离地区集中在江苏、浙江、广东和云南等地区,2株FAdV-8b均分离自江苏。六邻体是主要的衣核蛋白,含有型、群、亚群特异性抗原决定簇,其遗传进化分析表明:81株FAdV-4的核苷酸同源性在98.7100%之间,同国内外已报导的毒株核苷酸同源性也在97%以上。本研究分别对华东、华南和西南地区的分离毒株（CH/JS/TCZHP2015、CH/GD/XCJFQ2016及CH/SC/MSLQH2016）进行全基因组测序分析,结果显示3株毒株之间的同源性及与国内近期的分离株CHSDDZ2015、C HSXC Z2015、CHJSXZ2015、CHAHBZ2015、CHHNJZ2015、HB1501、HB1510、SD1501和JSJ13之间的同源性均几乎一致,而同国外的代表株相比同源性有一定的差异（6%6.4%）,这证明FAdV-4从国外传入后的确产生了一些变异,此外近期的研究发现国内分离毒株与国外毒株相比存在ORF29变异和ORF19缺失的情况,但目前还不能确定是否是由于这种变异导致了此次国内腺病毒的暴发流行。为了研究FAdV-4的生物学特性,本研究建立了Taq Man荧光定量PCR方法,结果显示:构建的标准曲线在所选择的相应浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数可达0.997,特异性、灵敏性和重复性均良好。用建立的Taq Man荧光定量方法对尿囊腔、卵黄囊和绒毛尿囊膜接种鸡胚后各组织带毒量进行检测,发现卵黄囊接种方式能使病毒在鸡胚内大量繁殖,且肝脏的毒价远高于其它组织。细胞繁殖实验表明:鸡肝癌细胞对FAdV-4的细胞培养具有较好效果,鸡成纤维细胞尽管能够繁殖病毒,但需要一定是的适应期,且繁殖效率较低。致病性试验表明3株FAdV-4分离株（CH/JS/TCZHP2015、CH/GD/XCJFQ2016及CH/SC/MSLQH2016）都具有高致病性(攻毒剂量为105.0EID50时,死亡率高达90%100%),组织嗜性检测证明FAd V-4对肝嗜性最强,其次为脾脏、胰腺和大肠。使用CH/JS/TCZHP2015毒株灭活乳化后制成的疫苗免疫后,对不同地区的毒株（CH/JS/TCZHP2015、CH/GD/XCJFQ2016及CH/SC/MSLQH2016）具有良好的交叉保护效果。本研究还选用Hexon蛋白Domain 1功能区和pCold-GST冷休克表达载体构建重组蛋白,低温诱导表达纯化后用作包被抗原建立间接ELISA方法。分别对包被条件、封闭液及封闭时间、一抗稀释比例及作用时间、二抗稀释比例及作用时间、显色液作用时间进行优化,最后确定纯化的蛋白稀释100倍以4℃包被过夜,使用1%的BSA封闭1 h,血清稀释200倍孵育1 h,酶标二抗2000倍稀释左右1h,室温显色10min时为最佳条件,阴阳性临界值为0.191。建立的方法具有良好的特异性、重复性和敏感性,可用于FAdV-4抗体检测。
谭华龙[10]（2017）在《12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定》文中认为新城疫是由NDV引起禽呼吸道、消化道黏膜严重出血的一种传染病,是目前养禽业极为重视的传染病之一。近年来我国水禽感染NDV的病例报道越来越多,而且水禽感染NDV已经表现出新的流行特点,临床症状不再局限于一般的生产能力下降,感染NDV的水禽发病率、死亡率正在逐渐升高,并以逐年增加的趋势向全国大部分区域蔓延,使得对NDV流行动态作研究分析十分必要。本研究对1997-2016年期间从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似患新城疫家禽病料分离鉴定获得的12株NDV,采用RT-PCR方法对12株NDV的F基因和HN基因扩增,扩增产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株作遗传进化和同源性分析,并对1株番鸭源NDV作了较为系统的生物特性测定,为今后的诊断与免疫防控研究提供更多详细的参考资料。F基因遗传进化分析结果显示:（1）12株分离株中有9株属于基因Ⅶ型,这9株病毒来源禽种覆盖鸡、鸭和鹅,来源地域覆盖广东省4个地级市的6个县级市,来源时间覆盖最初的1997年至最近的2016年。提示,近20年来,基因Ⅶ型可能一直是广东各地、各种禽NDV流行的优势基因型,且自2007年以来,水禽NDV分离率有明显增高;（2）1株来自1997年病鸡的毒株（CK/FS-SS/N/1997株）和1株来自2014年病鸭的毒株（MDK/FS-SS/485/2014株）属于基因Ⅸ型,其来源均为佛山市三水区,提示,基因Ⅸ型一直存在流行的威胁,已经由鸡向水禽传染（或由水禽向鸡传染）,但传播流行速度尚较缓慢,具有一定的区域局限性;（3）鸽源PG/GZ-HD/PN/2011株属于基因Ⅵ型,与国内外鸽源分离株所属基因型一致。F基因和HN基因相似性分析结果显示:（1）12株毒株与参考毒株间的相似性存在较大的差异,所有分离株与目前使用的疫苗株LaSota、B1、Mukteswar和Clone30的相似性在80.9%91.9%之间;（2）2株基因Ⅸ型毒株与传统强毒株F48E8的相似性高于99%,推测2株毒株为F48E8株的亲缘性较近;（3）12株毒株间相似性的差异较大,9株基因Ⅶ型的毒株中的5株鹅源毒株和1株鸭源毒株之间的相似性高于97%,但与其他3株Ⅶ型病毒（MDK/FS-SS/E/2007、WDK/FS-NH/A/2006和CK/YF-LD/L/1997）之间的相似性仅在83.4%87.8%之间。提示,本省流行的基因型相同的毒株之间存在基因亚型的差异。NDV的F基因与HN基因推导的氨基酸序列分析结果显示,12株分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10株病毒的HN基因第514氨基酸残基出现I→V的变异,有9株分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。另外,2011年后分离的7株毒株中,有6株毒株的HN基因第347氨基酸残基出现E→D。由此推测,当前广东地区大部分的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,这可能是目前大部分禽群对于NDV免疫失败的原因之一。本研究对鸭源NDV（MDK/FS-SS/E/2007）的生物特性测定结果显示,该毒株对鸭胚半数致死量为10-8.668/0.1 mL,MDT为75.2 h,ICPI为1.725和IVPI为2.48,均与NDV强毒标准相符。MDK/FS-SS/E/2007株对雏鸭和雏鹅的人工感染试验结果显示,感染雏鸭和雏鹅出现精神沉郁,瘫痪和扭颈等神经症状,剖检可见脑部充血、出血,胰腺、脾脏和肝脏等器官出现变性坏死,其临床症状与病理变化都呈现典型新城疫的特征。另外,利用MDK/FS-SS/E/2007株制备成灭活油乳疫苗免疫雏番鸭,结果表明,对番鸭于1、2、3周龄进行三次免疫后,HI抗体水平均值在第7周龄达到8log2,用约105个ELD50病毒液攻击番鸭,番鸭保护率达100%。提示本毒株对番鸭具有良好的免疫原性和免疫保护效果。另外,本题尚对该毒株的F蛋白进行了表达,并利用抗His标签鼠单克隆抗体对产物进行了Western blot验证,显示在53 kDa位置只有一条清晰的蛋白印迹,可为制备针对F基因的单克隆抗体和诊断水禽源新城疫病提供参考,也为研究相关基因工程疫苗打下了一定基础。
二、NDV地方分离株的分离鉴定及生物学特性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NDV地方分离株的分离鉴定及生物学特性研究（论文提纲范文）
（1）PPMV-1的分离鉴定、代表性毒株的全基因组序列分析及细胞凋亡通路相关因子RT-qPCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文主要中英文缩写对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 新城疫病毒分子生物学特性 |
| 1.2 新城疫的毒力及致病型 |
| 1.2.1 NDV的毒力因素 |
| 1.2.2 NDV的致病型 |
| 1.3 新城疫的流行病学 |
| 1.3.1 新城疫的流行历史 |
| 1.3.2 新城疫的宿主 |
| 1.3.3 新城疫的传播 |
| 1.3.4 新城疫病毒的分离 |
| 1.4 鸽I型副粘病毒(PPMV-1) |
| 1.5 新城疫的防控 |
| 1.5.1 活疫苗 |
| 1.5.2 灭活苗 |
| 1.5.3 重组技术疫苗 |
| 1.6 新城疫病毒感染诱导宿主的天然免疫反应 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 第二章 PPMV-1的分离鉴定、F基因测序及分子进化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 临床样本来源及其背景 |
| 2.1.2 实验主要材料、试剂和仪器 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 处理数据所需软件及数据集的收集 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病原分离鉴定及血清学试验 |
| 2.2.2 病毒分离物病原基因组RNA的提取及cDNA 的合成 |
| 2.2.3 PCR扩增 |
| 2.2.4 其他病毒检测排除试验 |
| 2.2.5 PPMV-1分离株F基因的克隆与测定结果 |
| 2.2.6 PPMV-1分离株分子进化分析 |
| 2.2.6.1 分离株系统发育树的构建 |
| 2.2.6.2 分离株分子钟分析 |
| 2.2.6.3 分离株的地理动力学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定及血清学结果 |
| 2.3.2 病毒RT-PCR实验结果 |
| 2.3.3 其他病毒排除试验结果 |
| 2.3.4 病毒分离株F基因序列的克隆与测定结果 |
| 2.3.5 病毒分离株F基因分子进化分析结果 |
| 2.3.5.1 分离株系统发育树构建结果 |
| 2.3.5.2 PPMV-1分离株分子钟分析结果 |
| 2.3.5.3 分离株地理系统分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 四株代表性PPMV-1全基因序列的测定及遗传变异分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 主要试验试剂及仪器 |
| 3.1.3 全基因组测序引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PPMV-1病毒的蚀斑纯化 |
| 3.2.2 PPMV-1克隆毒株RNA提取以及RT-PCR |
| 3.2.3 目的基因的回收 |
| 3.2.4 目的基因的克隆与全序拼接 |
| 3.2.5 全基因组序列分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 四株PPMV-1毒株蚀斑纯化结果 |
| 3.3.2 纯化毒株全基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.3 全基因组序列的拼接与比对分析结果 |
| 3.3.4 分离株全基因组系统发育树 |
| 3.3.5 分离株F蛋白序列的分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PPMV-1感染鸡的细胞凋亡通路相关因子实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 4.1 试验主要材料、试剂及仪器 |
| 4.2 试验具体方法 |
| 4.2.1 细胞因子引物的设计和合成 |
| 4.2.2 总RNA的提取及c DNA 的合成 |
| 4.2.3 PCR扩增和电泳鉴定 |
| 4.2.4 目的基因产物回收 |
| 4.2.5 目的基因的克隆 |
| 4.2.6 质粒的提取及制备标准品 |
| 4.2.7 标准曲线的建立 |
| 4.2.8 重复性以及敏感性试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PCR结果 |
| 4.3.2 质粒浓度及拷贝数 |
| 4.3.3 标准曲线的建立结果 |
| 4.3.4 细胞因子溶解曲线分析结果 |
| 4.3.5 重复性及敏感性试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）鸽源新城疫病毒的进化和宿主偏嗜性分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述 鸽源新城疫病毒的进化和宿主偏嗜性研究进展 |
| 1 新城疫病毒概述 |
| 2 鸽新城疫的流行情况 |
| 3 鸽源新城疫病毒的进化 |
| 4 鸽源新城疫病毒的宿主偏嗜性 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第一章 2016～2020年我国部分地区鸽源新城疫病毒流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 鸡胚、鸽胚、细胞和实验动物 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2 病毒的纯化 |
| 2.3 病毒RNA提取与反转录 |
| 2.4 PCR反应与琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.5 PCR产物回收与序列测定 |
| 2.6 病毒F和HN基因序列分析 |
| 2.7 病毒的生物学特性测定 |
| 2.8 病毒感染鸡和鸽子的排毒监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 2016～2020年PPMV-1流行病学监测情况 |
| 3.2 F基因序列分析 |
| 3.3 HN基因序列分析 |
| 3.4 病毒生物学特性分析 |
| 3.5 病毒感染鸡和鸽子的排毒情况 |
| 4 讨论 |
| 第二章 我国鸽源新城疫病毒的进化动力学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 数据材料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 12株PPMV-1全基因组序列的测定 |
| 2.2 序列处理 |
| 2.3 遗传进化分析 |
| 2.4 进化速率计算和历史种群大小重建 |
| 2.5 时空动力学分析 |
| 2.6 适应性进化分析 |
| 2.7 氨基酸序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 遗传进化分析 |
| 3.2 进化速率和历史种群大小估算 |
| 3.3 中国地区PPMV-1时空动力学研究 |
| 3.4 适应性进化分析结果 |
| 3.5 氨基酸序列分析结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 鸽源和鸡源新城疫病毒的致病性和传播特性比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 鸡胚、鸽胚、细胞和实验动物 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的生物学特性测定 |
| 2.2 病毒对SPF鸡和鸽子的致病性分析 |
| 2.3 鸽子传播试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒毒力比较 |
| 3.2 膜融合能力分析 |
| 3.3 病毒受体结合特性分析 |
| 3.4 病毒神经氨酸酶活性分析 |
| 3.5 病毒生长曲线测定 |
| 3.6 病毒对SPF鸡和鸽子的致病性分析 |
| 3.7 鸽子传播试验 |
| 4 讨论 |
| 第四章 鸽源新城疫病毒宿主偏嗜性的分子机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、质粒和细胞 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 Kuwait 256和NT-10全长感染性克隆的构建、病毒拯救及生物特性测定 |
| 2.2 Kuwait 256和NT-10基因互换重组全长质粒构建及重组病毒拯救 |
| 2.3 重组病毒的生物学特性测定 |
| 2.4 重组病毒对5周龄SPF鸡的致病性分析 |
| 2.5 重组病毒在鸽子中的传播性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 Kuwait 256和NT-10全长感染性克隆构建及病毒拯救 |
| 3.2 拯救毒株rKuwait 256和rNT-10的生物学特性测定 |
| 3.3 重组病毒的构建与拯救 |
| 3.4 重组病毒生物学特性分析 |
| 3.5 重组病毒对鸡的致病性分析 |
| 3.6 重组病毒在鸽子中的传播特性 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（3）鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽副粘病毒和新城疫病毒简介 |
| 1.2 NDV的分类命名 |
| 1.2.1 基于毒力和宿主病理特征的NDV分类 |
| 1.2.2 基于基因组序列的早期NDV命名分类系统 |
| 1.2.3 基于基因组序列最新的NDV命名分类系统 |
| 1.3 NDV的检测诊断方法 |
| 1.3.1 NDV的临床诊断 |
| 1.3.2 基于病毒生物学特性的早期检测诊断方法 |
| 1.3.3 传统的分子生物学检测诊断方法 |
| 1.3.4 基于第二代基因组测序技术的检测诊断方法 |
| 1.4 鸽I型副粘病毒(PPMV-1) |
| 1.5 NDV疫苗 |
| 1.5.1 NDV活疫苗 |
| 1.5.2 NDV灭活苗 |
| 1.5.3 NDV重组疫苗 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 感染PPMV-1野鸽的IHC病理诊断分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 野鸽FFPE组织样本来源 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 野鸽FFPE组织样本的制备 |
| 2.2.2 IHC法检测PPMV-1抗原和判定标准 |
| 2.2.3 RT-PCR方法复核检测野鸽FFPE组织样本中的PPMV-1抗原 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PPMV-1感染野鸽的体内各组织中病原分布情况 |
| 2.3.2 PPMV-1感染野鸽的病理组织学变化结果 |
| 2.3.3 PPMV-1感染野鸽的病理组织学变化和组织器官病原阳性率统计结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于NSG的 PPMV-1全基因组测序及遗传多样性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 野鸽PPMV-1的FFPE组织样本 |
| 3.1.2 肉鸽PPMV-1尿囊液样本 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 野鸽PPMV-1 FFPE样本的IHC诊断检测 |
| 3.2.2 肉鸽PPMV-1尿囊液样本的RT-PCR检测 |
| 3.2.3 FFPE蜡块组织中总RNA的抽提 |
| 3.2.4 尿囊液中总RNA的抽提 |
| 3.2.5 RNA质量分析 |
| 3.2.6 DNA文库的建立和质量分析 |
| 3.2.7 DNA文库的测序上样 |
| 3.2.8 NGS测序及数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 野鸽FFPE组织样本中PPMV-1的IHC检测结果 |
| 3.3.2 肉鸽分离株尿囊液样本中PPMV-1的RT-PCR检测结果 |
| 3.3.3 样本总RNA抽提及构建DNA文库的质量分析 |
| 3.3.4 不同方法对FFPE和尿囊液组织样本中PPMV-1的检测结果与比较 |
| 3.3.5 美国野鸽FFPE样本PPMV-1的遗传多样性分析结果 |
| 3.3.6 中国广西肉鸽PPMV-1分离株的遗传多样性分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 美国野鸽PPMV-1流行株的遗传进化分析 |
| 3.4.2 NGS和 IHC应用于FFPE样本中NDV病原的检测 |
| 3.4.3 中国广西鸽场PPMV-1流行株的遗传进化分析 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 广西肉鸽PPMV-1分离毒株的病原学特性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 标准毒株和疫苗株 |
| 4.1.2 细胞和鸡胚 |
| 4.1.3 实验动物和地点 |
| 4.1.4 HA和HI抗原和阳性血清 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PPMV-1病毒的分离和鉴定 |
| 4.2.2 PPMV-1 平均鸡胚致死时间 MDT 的测定 |
| 4.2.3 PPMV-1 雏鸡脑内致病指数 ICPI 的测定 |
| 4.2.4 PPMV-1 分离株与La Sota疫苗株的血清交叉中和抑制实验 |
| 4.2.5 NDV攻毒试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 广西肉鸽PPMV-1分离株的噬斑纯化结果 |
| 4.3.2 广西肉鸽PPMV-1分离株的毒力判定 |
| 4.3.3 PPMV-1分离株和La Sota疫苗株的血清交叉中和抑制实验结果 |
| 4.3.4 PPMV-1对不同宿主的致病性研究 |
| 4.3.5 PPMV-1在不同宿主体内的复制水平和传播方式研究 |
| 4.3.6 F基因和HN基因的变异对PPMV-1致病性的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 PPMV-1的致病机理和传播方式研究 |
| 4.4.2 广西肉鸽PPMV-1分离株的致病性分析 |
| 4.4.3 广西肉鸽PPMV-1分离株的抗原性和疏水性分析 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 下一步工作计划及展望 |
| 全文总结 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）鹅源星状病毒的分离鉴定及相关生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 星状病毒概述 |
| 1.2 AstV的病原学特征 |
| 1.2.1 病毒分类 |
| 1.2.2 形态与结构 |
| 1.2.3 基因组结构和特点 |
| 1.2.4 病毒非结构蛋白与结构蛋白 |
| 1.3 星状病毒的培养特性与理化性质 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 临床症状及发病机制 |
| 1.6 检测方法 |
| 1.6.1 电镜观察法 |
| 1.6.2 病毒分离 |
| 1.6.3 分子诊断学 |
| 1.7 研究的目的及意义 |
| 2 鹅源星状病毒的分离与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样本采集 |
| 2.1.2 鹅胚、SPF鸡胚、SPF鸡血及实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂耗材 |
| 2.1.5 相关溶液及配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌学检查 |
| 2.2.2 病毒学检查 |
| 2.2.3 病毒分离 |
| 2.2.4 GAstV的传播途径研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 自然感染病例的临床症状及病变 |
| 2.3.2 细菌学与病毒学检测结果 |
| 2.3.3 病毒分离及毒价 |
| 2.3.4 GAstV的传播途径研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 鹅源星状病毒全基因组序列分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 主要试剂耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 全基因组序列扩增 |
| 3.2.3 3 ’RACE-PCR扩增基因组3’端序列扩增 |
| 3.2.4 基因组序列分析与相关结构分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 全基因组序列测定 |
| 3.3.2 基因组测序和突变分析 |
| 3.3.3 基因鉴定和抗原表位分析 |
| 3.3.4 鹅源星状病毒的系统发育分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 鹅源星状病毒ORF2 蛋白的抗原性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、毒(菌)株、实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鹅源星状病毒ORF2 蛋白的表达 |
| 4.2.2 大肠杆菌ORF2 蛋白多克隆抗体制备 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鹅源星状病毒ORF2 蛋白的表达 |
| 4.3.2 大肠杆菌ORF2 蛋白多克隆抗体制备 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 鹅源星状病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株 |
| 5.1.2 主要试剂耗材 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物的设计和合成 |
| 5.2.2 标准品准备 |
| 5.2.3 荧光定量PCR扩增体系和条件 |
| 5.2.4 标准曲线的建立 |
| 5.2.5 特异性检测 |
| 5.2.6 敏感性试验 |
| 5.2.7 重复性试验 |
| 5.2.8 临床样品的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 质粒标准品的制备 |
| 5.3.2 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 5.3.3 标准曲线的建立 |
| 5.3.4 特异性试验结果 |
| 5.3.5 敏感性试验结果 |
| 5.3.6 重复性试验结果 |
| 5.3.7 临床样品的检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）基因Ⅵj亚型鸽源NDV的分离鉴定和不同基因型NDV对鸽的致病性与转录组学的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要中英文简写对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.2 鸽源新城疫的流行病学 |
| 1.3 NDV对鸽的致病性 |
| 1.3.1 NDV对鸽的致病特点 |
| 1.3.2 鸽源NDV致病的分子机制 |
| 1.4 NDV感染宿主鸽的免疫应答 |
| 1.4.1 RIG-I样信号通路 |
| 1.4.2 细胞凋亡 |
| 1.5 RNA-Seq技术 |
| 1.5.1 RNA-Seq概述 |
| 1.5.2 RNA-Seq测序的应用 |
| 1.6 实时荧光定量RT-PCR |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 第二章 一株基因Ⅵ .2.1.1.2.1(Ⅵj)亚型鸽源NDV分离鉴定及遗传进化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源及背景 |
| 2.1.2 实验主要动物、试剂和仪器 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 序列收集 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒的分离 |
| 2.2.2 血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HI) |
| 2.2.3 RT-PCR扩增鉴定及强弱毒分型 |
| 2.2.4 其他病毒的排除试验 |
| 2.2.5 分离株F基因的克隆测序 |
| 2.2.6 遗传进化分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定结果 |
| 2.3.2 RT-PCR鉴定及强弱毒分型结果 |
| 2.3.3 其他病毒的排除试验结果 |
| 2.3.4 分离株F基因测序与分析结果 |
| 2.3.5 遗传进化分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 三株不同基因型NDV对鸽致病性及宿主应答差异研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物试验 |
| 3.2.2 抗体检测 |
| 3.2.3 检测感染鸽脾脏病毒载量 |
| 3.2.4 制备病理切片 |
| 3.2.5 转录组测序 |
| 3.2.6 测序结果分析 |
| 3.2.7 差异表达分析 |
| 3.3 不同基因型NDV感染鸽子试验结果 |
| 3.3.1 发病情况与剖检病变结果 |
| 3.3.2 不同基因型NDV感染鸽子抗体效价结果 |
| 3.3.3 感染鸽脾脏的病毒载量 |
| 3.3.4 病理组织切片结果 |
| 3.3.5 转录组数据分析结果 |
| 3.3.6 转录组差异表达基因筛选结果 |
| 3.3.7 转录组GO数据库注释及显着性富集分析 |
| 3.3.8 转录组KEGG数据库注释及显着性富集分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 鸽RIG-I样信号通路和细胞凋亡通路相关因子RT-q PCR方法的建立及其在NDV感染鸽表达差异验证 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2. 试验方法 |
| 4.2.1 引物设计及合成 |
| 4.2.2 获得鸽淋巴细胞c DNA |
| 4.2.3 PCR扩增目的基因 |
| 4.2.4 目的基因克隆及测序鉴定 |
| 4.2.5 质粒标准品的提取与制备 |
| 4.2.6 RT-q PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.7 敏感性和重复性检验 |
| 4.2.8 应用建立的好RT-q PCR方法验证基因表达差异 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 PCR结果 |
| 4.3.2 质粒浓度及拷贝数结果 |
| 4.3.3 RT-q PCR标准曲线的建立 |
| 4.3.4 融解曲线分析结果 |
| 4.3.5 敏感性及重复性试验结果 |
| 4.3.6 RT-q PCR验证部分免疫相关的差异表达基因结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（6）传染性支气管炎病毒的分离鉴定、生物学特性及疫苗候选株的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 1 前言 |
| 1.1 IBV的研究进展 |
| 1.1.1 病毒的分类及形态结构 |
| 1.1.2 IBV基因组及结构特征 |
| 1.1.3 IBV编码的结构蛋白及生物学功能 |
| 1.2 IBV的变异机理 |
| 1.3 IBV分型 |
| 1.3.1 临床分型 |
| 1.3.2 血清分型 |
| 1.3.3 基因分型 |
| 1.4 IBV的诊断技术 |
| 1.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.4.2 血清学实验 |
| 1.4.3 分子生物学技术 |
| 1.5 IB的防治 |
| 1.5.1 IB弱毒活疫苗 |
| 1.5.2 IB灭活苗 |
| 1.5.3 IB基因工程亚单位疫苗 |
| 1.5.4 IBDNA疫苗 |
| 1.5.5 IB重组活载体疫苗 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 SPF鸡胚和实验动物 |
| 2.1.2 毒株与疫苗 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂及配置 |
| 2.1.5 引物设计与合成 |
| 2.2 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2.1 病料分离 |
| 2.2.2 RT-PCR鉴定 |
| 2.3 IBV分离株的鉴定与S1基因序列的测定 |
| 2.3.1 IBV分离株S1基因的克隆测序 |
| 2.3.2 IBV分离株S1基因的序列分析与比较 |
| 2.4 HA试验与外源病毒的检测 |
| 2.5 新城疫病毒干扰试验 |
| 2.6 鸡胚半数感染量的测定 |
| 2.7 IBV分离株在Vero细胞上的培养 |
| 2.8 IBV分离株对SPF鸡的致病力试验 |
| 2.8.1 试验鸡分组 |
| 2.8.2 临床症状观察 |
| 2.8.3 组织带毒检测及组织切片制备 |
| 2.8.4 血清制备与抗体检测 |
| 2.9 IBV分离株灭活疫苗的研制与免疫评价 |
| 2.9.1 病毒的初步纯化及不同代次EID50的测定 |
| 2.9.2 纯净性检验 |
| 2.9.2.1 HA 试验和外源病毒检测 |
| 2.9.2.2 无菌检验与支原体检验 |
| 2.9.3 灭活苗的制备与检验 |
| 2.9.4 攻毒保护试验设计 |
| 2.9.5 免疫效果检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 3.1.1 RT-PCR鉴定 |
| 3.1.2 HA与外源病毒检测结果 |
| 3.2 IBV分离株的S1基因序列及遗传进化分析 |
| 3.2.1 IBV分离株的S1 基因的RT-PCR扩增及克隆测序 |
| 3.2.2 IBV分离株S1基因遗传进化分析 |
| 3.2.3 IBV分离株裂解位点分析 |
| 3.2.4 IBV分离株S1基因点突变、缺失及插入分析 |
| 3.3 致鸡胚矮小化试验 |
| 3.4 新城疫干扰试验 |
| 3.5 IBV分离株的EID50 |
| 3.6 JS-96 株和AH-48 株致Vero细胞病变 |
| 3.7 JS-96株和AH-48株的致病性研究 |
| 3.7.1 临床表现与存活率曲线 |
| 3.7.2 病死鸡剖检观察 |
| 3.7.3 病理组织切片观察 |
| 3.7.4 组织与拭子病毒检测结果 |
| 3.7.5 抗体检测结果 |
| 3.8 IBV分离株免疫原性的研究 |
| 3.8.1 分离株的初步纯化 |
| 3.8.2 分离株不同代次的效价 |
| 3.8.3 灭活苗的制备及检验 |
| 3.8.4 攻毒保护试验结果 |
| 3.8.5 免疫后抗体检测 |
| 3.8.6 攻毒后抗体检测 |
| 3.8.7 组织与拭子病毒检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IBV的分离与鉴定 |
| 4.2 IBV分离株S1基因序列测定与遗传进化分析 |
| 4.3 JS-96株和AH-48株致病性研究 |
| 4.4 IBV分离株的免疫原性研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士期间发表论文情况 |
（7）2018年江苏部分地区新城疫病毒的分离鉴定与遗传进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 新城疫概述 |
| 2 新城疫病毒 |
| 2.1 病毒结构 |
| 2.2 蛋白分布及功能 |
| 2.3 生物学特性 |
| 2.4 病毒分型 |
| 2.5 流行历史与现状 |
| 2.6 疫苗防控 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 2018年江苏部分地区NDV的分离鉴定与F基因进化分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与鸡胚 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 病毒分离与鉴定 |
| 2.3 病毒的传代 |
| 2.4 病毒RNA的提取 |
| 2.5 反转录 |
| 2.6 引物设计与合成 |
| 2.7 NDV毒株的鉴定 |
| 2.8 F基因全长的扩增 |
| 2.9 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.10 序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 3.2 F基因全长扩增 |
| 3.3 F基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 新城疫病毒分离株COOT/B559/JIANGSU/2018全基因组测序与进化分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 片段扩增 |
| 2.3 核酸电泳与胶回收 |
| 2.4 感受态细胞的制备 |
| 2.5 重组载体的连接 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 重组载体的鉴定 |
| 2.8 全基因组序列拼接与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 全基因组各片段的扩增 |
| 3.2 全基因组序列拼接与分析 |
| 3.3 NP基因遗传进化分析 |
| 3.4 P基因遗传进化分析 |
| 3.5 M基因遗传进化分析 |
| 3.6 F基因遗传进化分析 |
| 3.7 HN基因遗传进化分析 |
| 3.8 L基因遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述: H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究 |
| 前言 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒流行病学 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒基因片段遗传进化及表达蛋白功能 |
| 3 H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性研究 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒病原学调查 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 华东地区家禽中流行的H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性初步研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）禽腺病毒分子流行病学及FAdV-4的生物学特性与间接ELISA方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 腺病毒概述 |
| 2 禽腺病毒血清4型的病原学研究 |
| 2.1 禽腺病毒的分类 |
| 2.2 FAd V-4 的病毒结构和理化性质 |
| 2.3 FAd V-4 的病毒基因组结构 |
| 3 FAd V-4 的流行病学研究 |
| 3.1 病毒的宿主及感染天龄 |
| 3.2 FAd V-4 的携带与传播 |
| 3.3 FAd V-4 的潜伏期 |
| 4 I亚群腺病毒的致病性及临床表现 |
| 4.1 包涵体肝炎 |
| 4.2 心包积液综合征 |
| 4.3 鸡胃糜烂症 |
| 4.4 火鸡腺病毒感染 |
| 4.5 鸭和鹅腺病毒感染 |
| 4.6 鸽腺病毒感染 |
| 5 FAd V-4 的诊断 |
| 5.1 病原的分离 |
| 5.2 组织病理学诊断 |
| 5.3 分子生物学诊断 |
| 5.4 血清学诊断 |
| 6 FAd V-4 的防治措施 |
| 7 研究的目的与意义 |
| 第一章 2015-2016 年FAd V流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 疑似发病样品 |
| 1.2 主要试剂及配制 |
| 1.3 试验鸡胚、动物 |
| 1.4 酶 |
| 1.5 其他试剂 |
| 1.6 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 病料的处理 |
| 2.2 PCR鉴定 |
| 2.3 FAd V分离株hexon基因的克隆与分子流行病学研究 |
| 2.3.1 测序引物的设计与合成 |
| 2.3.2 S1基因的PCR扩增 |
| 2.3.3 PCR产物的回收与纯化 |
| 2.3.4 PCR纯化产物与载体的连接 |
| 2.3.5 连接产物转化感受态细胞 |
| 2.3.6 重组质粒的筛选和鉴定 |
| 2.3.7 禽腺病毒hexon序列的测定及序列比较分析 |
| 2.4 血清4型FAd V全基因组序列的测定及分析 |
| 2.4.1 FAd V-4 全基因序列引物的设计与合成 |
| 2.4.2 FAd V-4 全基因序列的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 毒株分离鉴定结果 |
| 3.2 FAd V地方分离株信息统计与分析 |
| 3.3 FAd V hexon基因序列的测定与分析 |
| 3.3.1 hexon基因PCR扩增及T克隆结果 |
| 3.3.2 hexon基因序列核酸和氨基酸数的统计 |
| 3.3.3 hexon基因的遗传进化分析 |
| 3.3.4 分离株hexon基因同源性分析 |
| 3.4 血清4型FAd V全基因组序列的测定及分析 |
| 3.4.1 株血清4型FAd V分离株全基因组序列的测定 |
| 3.4.2 3株血清4型FAd V分离株全基因组序列的分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 血清4型禽腺病毒的生物学特性 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 试验用鸡胚、动物 |
| 1.3 引物和酶 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 1.5 其它试剂及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 3株FAd V-4 的鉴定 |
| 2.1.1 PCR鉴定方法 |
| 2.1.2 鸡胚繁殖 |
| 2.1.3 细胞繁殖 |
| 2.1.4 血凝试验 |
| 2.1.5 间接免疫荧光 |
| 2.2 动物回归试验 |
| 2.3 Taq Man荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.3.1 引物和探针的设计 |
| 2.3.2 荧光定量标准品的制备 |
| 2.3.3 FAd V-4 Taq Man荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.3.4 标准曲线的建立 |
| 2.3.5 特异性试验、敏感性试验及重复性试验 |
| 2.4 外源病原的检测 |
| 2.5 FAd V-4 的纯化 |
| 2.6 FAd V-4 在鸡胚上增殖的特性 |
| 2.6.1 病毒对鸡胚的致病力 |
| 2.6.2 FAd V-4 不同鸡胚接种途径对病毒繁殖的影响 |
| 2.7 灭活的CH/JS/TC ZHP2015毒株对不同地区毒株的保护效果 |
| 2.7.1 CH/JS/TC ZHP2015毒株的灭活乳化 |
| 2.7.2 试验设计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 3株FAd V-4 的鉴定 |
| 3.1.1 PCR鉴定 |
| 3.1.2 病毒在鸡胚上的繁殖 |
| 3.1.3 病毒在细胞上的繁殖 |
| 3.1.4 血凝试验 |
| 3.1.5 间接免疫荧光试验 |
| 3.1.6 动物回归试验 |
| 3.2 Taq Man荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.2.1 重组质粒标准品的制备 |
| 3.2.2 Taq Man荧光定量PCR反应条件的优化及标准曲线的建立 |
| 3.2.3 特异性、灵敏性和重复性试验 |
| 3.3 外源病原的检测 |
| 3.4 病毒的纯化 |
| 3.5 FAd V-4 在鸡胚上增殖的特性 |
| 3.5.1 病毒对鸡胚的致病力 |
| 3.5.2 不同鸡胚接种途径对病毒繁殖的影响 |
| 3.6 灭活的CH/JS/TC ZHP2015毒株对不同地区毒株的保护效果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 血清4型禽腺病毒ELISA方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株、质粒和血清 |
| 1.2 酶类及其他相关试剂 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 SDS-PAGE胶电泳所需试剂的配制 |
| 1.3.2 Western-blotting相关溶液配制 |
| 1.3.3 蛋白纯化溶液 |
| 1.3.4 ELISA试验主要工作液的配置 |
| 1.4 其他试剂 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 FAd V-4 hexon基因的T克隆 |
| 2.1.1 引物的设计与合成 |
| 2.1.2 FAd V-4 hexon基因Domain 1 的扩增 |
| 2.1.3 hexon1482的T克隆 |
| 2.1.4 p MD19- hexon1482重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2 重组表达载体p Cold- hexon的构建 |
| 2.2.1 hexon1482基因片段与表达载体p Cold GST的连接 |
| 2.2.2 重组质粒的转化、筛选及纯化 |
| 2.2.3 重组质粒p Cold- hexon的双酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒p Cold- hexon在大肠杆菌中的表达 |
| 2.3.1 重组质粒p Cold- hexon在BL21感受态中的诱导表达 |
| 2.3.2 重组质粒p Cold- hexon表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.4 表达产物的Western-blotting分析 |
| 2.5 重组蛋白的重组蛋白的可溶性分析及纯化 |
| 2.5.1 重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.5.2 重组蛋白包涵体的纯化 |
| 2.6 血清4型禽腺病毒间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.6.1 重组蛋白浓度的测定 |
| 2.6.2 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 2.6.3 最佳抗原包被条件的确定 |
| 2.6.4 封闭的优化 |
| 2.6.5 酶标二抗的优化 |
| 2.6.6 TMB最佳显色时间的确定 |
| 2.6.7 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定 |
| 2.6.8 敏感性试验 |
| 2.6.9 特异性试验 |
| 2.6.10 重复性试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组表达载体p Cold- hexon的构建及原核表达 |
| 3.1.1 FAd V-4 hexon基因Domain 1 的扩增 |
| 3.1.2 p Cold-hexon重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.1.3 重组p Cold- hexon的SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 3.1.4 重组蛋白的可溶性分析 |
| 3.1.5 重组蛋白诱导条件的确定 |
| 3.1.6 重组蛋白的纯化 |
| 3.1.7 重组蛋白的Western Blotting分析 |
| 3.2 血清4型禽腺病毒间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.1 蛋白浓度的测定 |
| 3.2.2 酶标板的均一性测定 |
| 3.2.3 最佳抗原包被浓度及血清稀释度的确定 |
| 3.2.4 最佳抗原包被条件的确定 |
| 3.2.5 最佳封闭液与封闭条件的确定 |
| 3.2.6 最佳血清孵育时间的确定 |
| 3.2.7 最佳二抗浓度和作用时间的确定 |
| 3.2.8 底物作用时间的优化 |
| 3.2.9 临界值的确定 |
| 3.2.10 敏感性实验 |
| 3.2.11 特异性实验 |
| 3.2.12 重复性试实验 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（10）12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词英汉对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 NDV生物学特性 |
| 1.1.1 NDV结构特征 |
| 1.1.2 NDV的理化特性 |
| 1.1.3 NDV的培养特性 |
| 1.1.4 NDV毒力与致病性 |
| 1.1.5 血凝活性与神经氨酸酶活性 |
| 1.2 NDV基因组与结构蛋白特性 |
| 1.2.1 NDV基因组 |
| 1.2.2 NDV结构蛋白的特性 |
| 1.3 NDV的流行病学 |
| 1.4 NDV疫苗学概况 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、标准血清和抗原及雏禽 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒复壮 |
| 2.2.2 病毒HA/HI测定 |
| 2.2.3 F基因与HN基因克隆与遗传进化分析 |
| 2.2.4 MDK/FS-SS/E/2007株的生物学特性检测 |
| 2.2.5 动物致病性试验 |
| 2.2.6 动物免疫保护试验 |
| 2.2.7 鸭源MDK/FS-SS/E/2007株F蛋白原核表达载体构建和表达 |
| 2.2.8 阳性重组表达质粒表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 HA与HI试验结果 |
| 3.2 F基因与HN基因的PCR扩增结果 |
| 3.3 F基因核苷酸序列与氨基酸序列分析 |
| 3.3.1 F基因遗传进化分析 |
| 3.3.2 F基因核苷酸序列同源性分析 |
| 3.3.3 F蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.4 HN基因核苷酸序列与氨基酸序列分析 |
| 3.4.1 HN基因核苷酸序列分析 |
| 3.4.2 HN蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.5 MDK/FS-SS/E/2007株的毒力指标的测定结果 |
| 3.5.1 MLD与MDT测定结果 |
| 3.5.2 ICPI的测定结果 |
| 3.5.3 IVPI的测定结果 |
| 3.6 鸭胚ELD_(50)的测定结果 |
| 3.7 动物攻毒试验结果 |
| 3.7.1 雏番鸭攻毒试验结果 |
| 3.7.2 雏鹅攻毒试验结果 |
| 3.8 MDK/FS-SS/E/2007株疫苗免疫保护试验结果 |
| 3.8.1 MDK/FS-SS/E/2007株疫苗对雏鸭免疫应答结果 |
| 3.8.2 免疫保护试验结果 |
| 3.9 F蛋白原核表达载体构建结果 |
| 3.9.1 MDK/FS-SS/E/2007株的F基因PCR扩增结果 |
| 3.9.2 重组质粒pET30a-F-E双酶切鉴定结果 |
| 3.10 表达产物的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.10.1 诱导时间的优化结果 |
| 3.10.2 IPTG诱导浓度的优化结果 |
| 3.10.3 重组蛋白可溶性分析结果 |
| 3.11 表达产物的Western-blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 水禽源NDV的流行情况 |
| 4.2 12株NDV的F基因与HN基因序列分析 |
| 4.3 12株NDV的F蛋白与HN蛋白的抗原变异分析 |
| 4.4 MDK/FS-SS/E/2007株毒力测定与攻毒试验结果分析 |
| 4.5 MDK/FS-SS/E/2007株灭活疫苗免疫保护试验分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
四、NDV地方分离株的分离鉴定及生物学特性研究（论文参考文献）
- [1]PPMV-1的分离鉴定、代表性毒株的全基因组序列分析及细胞凋亡通路相关因子RT-qPCR方法的建立[D]. 撒薇. 广西大学, 2021(12)
- [2]鸽源新城疫病毒的进化和宿主偏嗜性分子机制研究[D]. 展天松. 扬州大学, 2021(02)
- [3]鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析[D]. 何颖. 广西大学, 2020(02)
- [4]鹅源星状病毒的分离鉴定及相关生物学特性的研究[D]. 蒲路莎. 黑龙江八一农垦大学, 2020(09)
- [5]基因Ⅵj亚型鸽源NDV的分离鉴定和不同基因型NDV对鸽的致病性与转录组学的研究[D]. 张远琴. 广西大学, 2020(02)
- [6]传染性支气管炎病毒的分离鉴定、生物学特性及疫苗候选株的初步研究[D]. 刘帆. 华南农业大学, 2019(02)
- [7]2018年江苏部分地区新城疫病毒的分离鉴定与遗传进化分析[D]. 李晖. 南京农业大学, 2019(08)
- [8]2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究[D]. 蒋大秀. 扬州大学, 2019
- [9]禽腺病毒分子流行病学及FAdV-4的生物学特性与间接ELISA方法研究[D]. 罗洋洋. 华南农业大学, 2017(08)
- [10]12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定[D]. 谭华龙. 佛山科学技术学院, 2017(01)