一、SCID小鼠的免疫重建及其B淋巴细胞的抗癌作用（论文文献综述）
刘昊川,李新贺,陈冰[1]（2022）在《红细胞人源化小鼠模型的构建及其临床应用研究进展》文中研究说明红细胞人源化小鼠模型是一类能够稳定重建人红细胞的人源化小鼠,其对于人红细胞相关疾病临床前期研究起至关重要的作用。人源化小鼠模型的构建能够模仿人体免疫机能,在整体水平上反映人类生理和病理情况,探讨红细胞人源化小鼠模型的发展过程、构建方法及其在临床工作中的应用,可为后续优化该模型提供理论依据。现主要对人源化小鼠模型的发展、人源化小鼠人红细胞重建现状、人源化小鼠中人红细胞重建的影响因素、人红细胞相关疾病的研究和未来发展规划等几个方面进行综述。
李晓娟,冯帆,李瑞生,貌盼勇[2]（2021）在《肝细胞癌人源异种移植模型应用研究进展》文中指出人源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）模型是将取自临床患者的新鲜肿瘤标本直接异种移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的动物模型,可以较好的保持原发肿瘤的组织形态、异质性以及基因异常等特征,并保留与患者相似的遗传特性。本文就人肝细胞癌PDX模型构建的实验动物、移植组织类型和方式的选择、最新应用进展以及PDX未来在肝细胞癌中的运用展望进行综述,以期为肝细胞癌的个性化治疗提供新的研究方向。
师绍敏[3]（2021）在《二氢辣椒碱对黑素瘤细胞增殖与转移的体内外抑制作用及其机制研究》文中研究说明第一部分二氢辣椒碱在体外抑制黑素瘤细胞的增殖、迁移与侵袭目的:探讨二氢辣椒碱（Dihydrocapsaicin,DHC）在体外对黑素瘤细胞增殖、迁移与侵袭的影响,以及潜在的分子机制。方法:1.使用DHC处理A375和MV3黑素瘤细胞,通过MTT实验、EdU染色实验评价DHC对黑素瘤细胞增殖的影响。2.使用DHC处理A375和MV3黑素瘤细胞,通过流式细胞术观察细胞周期的变化,进而通过免疫印迹实验和荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测cyclin D1、c-Myc和cyclin A2的变化。3.使用DHC处理A375和MV3黑素瘤细胞,通过划痕愈合实验和Transwell实验评价DHC对黑素瘤细胞迁移与侵袭的影响,进而通过免疫印迹实验和qRT-PCR检测β-catenin、MMP2和MMP7的变化。结果:1.MTT实验结果显示,黑素瘤细胞活力在DHC处理后受到明显抑制。经DHC处理后,黑素瘤细胞EdU阳性率明显降低。2.经DHC处理后,黑素瘤细胞出现明显的S期细胞周期阻滞。相应地,cyclin D1、c-Myc和cyclin A2的蛋白及m RNA表达呈浓度及时间依赖性下调。3.划痕愈合实验显示DHC可以明显延缓划痕的愈合速度。Transwell实验表明黑素瘤细胞的迁移与侵袭能力在DHC处理后受到明显抑制。相应地,β-catenin、MMP2和MMP7的蛋白表达呈浓度及时间依赖性下调。除β-catenin外,MMP2和MMP7的m RNA表达也呈相同模式下调。小结:1.DHC可以在体外抑制黑素瘤细胞的增殖,其机制可能是通过下调cyclin D1、c-Myc和cyclin A2蛋白表达并诱导S期细胞周期阻滞。2.DHC可以在体外抑制黑素瘤细胞的迁移与侵袭,其机制可能是通过下调迁移侵袭相关蛋白β-catenin、MMP2和MMP7的表达。第二部分二氢辣椒碱抑制黑素瘤细胞增殖与转移的在体研究目的:研究DHC在动物模型体内对黑素瘤生长和转移的影响。方法:1.通过软琼脂克隆形成实验评价DHC对黑素瘤细胞体外成瘤能力的影响。2.使用A375细胞构建NOD/SCID小鼠黑素瘤异种移植模型,比较DHC与DMSO处理组间肿瘤体积和重量间的差异,并通过免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色观察DHC对肿瘤细胞Ki67表达的影响。3.使用A375细胞构建NOD/SCID小鼠黑素瘤转移模型,通过H&E病理观察DHC对黑素瘤细胞肺转移的影响。结果:1.经DHC处理后,A375和MV3细胞形成的细胞克隆从大小和数量上低于对照组。2.经DHC处理后,NOD/SCID小鼠体内肿瘤体积和重量明显低于对照组;Ki67在实验组瘤体中的表达明显低于对照组。3.经DHC处理后,NOD/SCID小鼠肺脏中转移瘤数量明显低于对照组。小结:1.DHC可以抑制黑素瘤细胞的体外成瘤能力。2.DHC可以在NOD/SCID小鼠体内有效抑制黑素瘤生长。3.DHC可以在NOD/SCID小鼠体内有效抑制黑素瘤细胞肺转移。第三部分二氢辣椒碱通过下调β-catenin通路抑制黑素瘤细胞的增殖与转移目的:研究β-catenin在DHC抑制黑素瘤细胞增殖与转移过程中的作用,以及DHC对β-catenin的调节机制。方法:1.建立稳定过表达β-catenin和空质粒的A375和MV3黑素瘤细胞系,并进行DHC处理,通过MTT和EdU染色实验观察细胞活力与增殖情况。2.对过表达β-catenin和空质粒的黑素瘤细胞进行DHC处理,通过流式细胞术观察细胞周期的变化,进而通过免疫印迹实验和qRT-PCR检测cyclin D1、c-Myc和cyclin A2的变化。3.对过表达β-catenin和空质粒的黑素瘤细胞进行DHC处理,通过Transwell实验验证β-catenin对黑素瘤细胞迁移与侵袭能力的影响,进而通过免疫印迹实验和qRT-PCR检测MMP2和MMP7的变化。4.使用NOD/SCID小鼠构建β-catenin或空质粒过表达的A375细胞皮下异种移植瘤模型,比较DHC与DMSO处理组间肿瘤体积、重量间的差异。并通过IHC染色观察肿瘤组织中Ki67表达的变化。5.使用NOD/SCID小鼠构建β-catenin或空质粒过表达的A375细胞肺转移模型,通过H&E病理比较DHC与DMSO处理组间肺转移瘤数目的差异。6.通过蛋白周转率实验和泛素化实验探索DHC调控β-catenin蛋白表达的分子机制。结果:1.MTT实验结果显示,β-catenin过表达可以削弱DHC对黑素瘤细胞活力的抑制;EdU染色实验表明,DHC诱导的EdU阳性率下降在β-catenin过表达细胞得到部分逆转。2.DHC诱导的S期细胞周期阻滞在β-catenin过表达后被部分解除。相应地,DHC诱导的cyclin D1、c-Myc和cyclin A2下调在过表达β-catenin之后也得到了部分逆转。3.在DHC处理下,过表达β-catenin的黑素瘤细胞穿过Transwell小室内膜的数量多于过表达空质粒的细胞。相应地,DHC在黑素瘤细胞中诱导的MMP2和MMP7下调被β-catenin过表达部分逆转。4.在DHC处理下,过表达β-catenin的A375细胞移植瘤体积、重量及Ki67表达水平高于过表达空质粒的A375细胞移植瘤。5.在DHC处理下,过表达β-catenin的A375细胞在NOD/SCID小鼠肺脏内形成的转移瘤数目高于过表达空质粒的A375细胞。6.DHC可以加快黑素瘤细胞中β-catenin蛋白的降解速率,并上调E3泛素连接酶BTRC的表达;泛素化实验表明DHC可以增加β-catenin的泛素化水平。小结:1.过表达β-catenin可以削弱DHC对黑素瘤细胞增殖的抑制。2.过表达β-catenin可以削弱DHC对黑素瘤细胞迁移与侵袭的抑制。3.过表达β-catenin可以削弱DHC对NOD/SCID小鼠体内黑素瘤生长和肺转移的抑制。4.DHC在黑素瘤细胞中上调E3泛素连接酶BTRC的表达,并促进β-catenin蛋白泛素化降解。结论:1.DHC通过调节细胞周期进展和迁移侵袭相关蛋白表达在体外抑制黑素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。2.DHC在动物模型体内可以有效抑制黑素瘤的生长和肺转移。3.DHC可能是通过下调β-catenin信号通路发挥抗黑素瘤作用。4.DHC在黑素瘤细胞中对β-catenin的调节机制可能是通过上调E3泛素连接酶BTRC表达,从而促进β-catenin蛋白泛素化降解。
张伟[4]（2020）在《阻断CTLA-4免疫抑制分子增强膀胱癌CD8+T淋巴细胞抗肿瘤效应的实验研究》文中研究说明恶性肿瘤仍是全球范围内最主要的死亡原因之一。几十年来,恶性肿瘤的治疗因为缺乏可靠有效的治疗手段使得肿瘤患者的生存受到了挑战。术后复发转移或不可切除的进展期肿瘤,必须依靠放化疗等传统手段进行治疗,但临床疗效往往有限,并伴随着严重的不良反应。肿瘤免疫治疗的进步和发展,使得利用免疫疗法治疗癌症变得越来越重要。研究人员开发了多种激活免疫反应的策略,其中IL-2是最早的免疫增强药物之一,因其能够促进T细胞的增殖和分化,增强T细胞功能,而获批用于肾癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤的治疗,成为最早的肿瘤免疫治疗方法之一。但是,第一代免疫疗法的局限性在于其低应答率和高不良事件发生率。寻找可靠的免疫治疗策略及方法,通过调节T细胞活化和增殖来增强免疫治疗的疗效成为肿瘤免疫治疗的主要研究方向。近年研究发现,免疫检测点在T细胞活化及杀伤过程中,发挥着重要的调节功能,其中细胞毒性T淋巴细胞抗原4（Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4,CTLA-4）、程序性死亡受体-1（programmed cell death-1,PD-1）、IDO-1、Tim3等免疫抑制分子对T细胞的免疫调节功能越来越受到重视。有研究证实,T细胞活化的早期出现CTLA-4的表达升高,与其配体B7结合而发挥竞争性抑制,使B7-CD28共刺激信号通路减弱,从而导致“免疫刹车”效应,阻碍了T细胞的活化。T细胞活化的同时,INF-γ大量释放,导致T细胞表面的PD-1大幅升高,与其配体PD-L1结合造成“T耗竭”,从而导致T细胞活化、增殖及杀伤功能的降低。因而,近年来对程序性死亡因子1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）的研究进展迅速。针对免疫检查点的研究及治疗是目前免疫治疗研究的热点[1]。两种T细胞共抑制分子CTLA-4和PD-1的发现使得癌症免疫疗法和靶向疗法在如何治疗癌症,尤其是在晚期疾病患者中带来了革命性的变化[2]。因而大量临床前和临床研究围绕着PD-1和CTLA-4开展,其中以PD-1为靶点的免疫治疗在抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植等方面均有较深入的研究。以CTLA-4为靶点的免疫治疗,在抗肿瘤免疫等方面也表现出显着的治疗作用。随着CTLA-4和PD-1阻滞剂的深入研究及其在癌症治疗中的成功,靶向PD-1及CTLA-4的抗体类药物迅速出现并获得FDA批准上市,逐渐应用于多种恶性实体肿瘤的临床治疗[3]。CTLA-4是成功在临床上应用靶向的免疫检查点之一。针对CTLA-4的单克隆抗体靶向药物（ipilimumab）已获批用于治疗黑色素瘤等疾病,后续的研究表明在肺癌等多种肿瘤治疗中同样有效。迄今为止,已批准7种靶向CTLA-4/PD-1的药物用于治疗各种类型的癌症。众所周知T淋巴细胞是人体主要的免疫细胞,其中CD4+T细胞主要表达于辅助T细胞（Th）,被称为辅助性T细胞（helper T cell）,而CD8+T细胞被称为细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell,CTL）是通过细胞裂解和细胞凋亡的方式特异性杀伤靶细胞而发挥着细胞毒性T细胞的作用,与细胞免疫以及抗肿瘤效应有关。CD4+T细胞的主要功能是辅助CD8+T细胞消灭体内的病毒、细菌以及异常发生的肿瘤细胞。大量研究表明PD-1阻断剂在可增强CD4+和CD8+T细胞反应。本研究的目的在于,采用抗体阻断CTLA-4免疫抑制分子是否能有效的增强细胞毒性CD8+T淋巴细胞的抗肿瘤效应。为此我们通过研究膀胱癌患者的外周血中T细胞PD-1和CTLA-4表达特点,检测PD-1和CTLA-4是否在活化的T细胞上存在高表达。随后,采用抗体阻断外周血T细胞表面的免疫性负调节分子CTLA-4,测试抗体封闭后能否增强细胞免疫反应和细胞杀伤毒性,验证阻断细胞毒T淋巴细胞表面CTLA-4分子的表达,（cytotoxic T cell,CTL）是否能增强其在体外的杀伤效率和皮下移植瘤模型的抗肿瘤效果。第一部分免疫抑制分子PD-1和CTLA-4表达特征的实验研究目的:检测PD-1和CTLA-4两种共抑制分子在膀胱癌患者和健康志愿者的外周血单核细胞的表达特征。方法:1.分别采集膀胱癌患者（n=62）及健康志愿者（n=32）外周血50ml,肝素抗凝并PBS稀释1倍;采用Ficoll法离心获得PBMC;吸出白膜层（PBMC）置于50ml离心管中,加入PBS,800×g、10min离心洗2次。在洗出血小板后获得PBMC。经分离培养,贴壁细胞培育DC细胞,检测DC表型,悬浮细胞培育CIK细胞。2.CD3抗体刺激T细胞活化。检测外周血中T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力。T淋巴细胞特异性的表达CD3,并又进一步分为CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群;3.流式检测膀胱癌患者及健康志愿者两组的PD-1和CTLA-4在CD4+和CD8+T细胞的表达特点,4.进行PD-1和CTLA-4的表达与膀胱癌患者的年龄、性别、组织学分级、肿瘤大小等临床参数的相关性分析。结果:1.膀胱癌患者中CD4+T细胞中PD-1的表达与健康的志愿者相比较无统计学差异（平均14.7%±3.5%比13.6%±4.6%,Fig.1A）。相比之下,在CD8+T细胞中PD-1的表达明显高于健康的志愿者（平均频率12.8%±4.5%比8.1%±2.9%,Fig.1B）。2.在CD4+T细胞中,CTLA-4的表达频率可与膀胱癌患者和健康献血者（Fig.1C）相比较表达无统计学差异。与此同时,在膀胱癌患者中,CD8+T细胞中的CTLA-4的表达比健康对照组的表达高（平均10.2%±3.2%比7.5%±2.8%）（Fig.1D）;3.在CD8+T细胞上的PD-1表达与任何临床参数之间没有显着的相关性。然而CTLA-4的表达与肿瘤大小和TNM分期之间有密切的相关性（表1）。结论:PD-1和CTLA-4在膀胱癌患者的外周血中CD8+T细胞的表达较健康志愿者明显升高。第二部分阻断CTLA-4的CD8+T淋巴细胞体外抗肿瘤效应的实验研究目的:检测抗CTLA-4抗体封闭后的DC-CTL对肿瘤细胞的体外杀伤效应。方法:1.采集肿瘤病人外周血,提取血中的单状核细胞,Focill方法分离,然后贴壁法分离出DC细胞和T细胞;DC细胞扩增并负载细胞株抗原,制备出DC疫苗,2.检测UM-UC-3、TCCSUP、J82、T24,5637五种膀胱癌细胞CTLA-4配体CD80/86的表达水平,选择CD80/86高表达的细胞株作为靶细胞,3.T细胞培养扩增至第7天,应用抗CTLA-4抗体封闭CTLA-4后加入DC疫苗制备CTL;CTL继续扩增2天,应用流式细胞术检测第7、14和21天CTLA-4的表达,4.制备的肿瘤特异性细胞毒T细胞（CTL）分组:第一组:未干预组CTLs（特异性细胞毒性T淋巴细胞）、第二组:生理盐水空白对照组,第三组:抗CTLA-4抗体治疗组,检测CTL的细胞增殖,每7天进行一次检测,持续时间为21天;流式检测三组细胞的CTLA-4的表达水平,5.ELISA测定法测定实验组CTL和对照组CTL的培养基中的IFN-γ和TNF-α分泌量;6.实验组及对照组行96孔板细胞体外杀伤实验;结果:1.抗CTLA-4抗体封闭后,应用流式细胞术检测第7、14和21天CTLA-4的表达,抗CTLA-4治疗组CTL较对照组CTLA-4的表达明显受到抑制,二者相比结果具有统计学上的意义（P<0.05）（图.1A）。对照组CTLA-4在CTL上的表达从9.1%增加到17.6%;在CTLA-4阻断组中,CTLA-4表达从4.1%增加到9.2%。2.对未抗体干预组CTL、空白对照组和抗CTLA-4治疗组CTL的细胞增殖,每7天进行一次检测,持续时间为21天。在培养期间,我们发现CTL的增殖不受CTLA-4阻断的影响。随着时间延长,细胞的增殖逐渐增多,不同组的细胞增殖变化无明显差异,无统计学意义（图.1B）。3.抗CTLA-4治疗组和对照组CTL的上清液中,ELISA法检测细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌能力的变化。CTLA-4阻断后的CTL产生的IFN-γ和TNF-α水平更高（图.1C）。4.在5种膀胱癌细胞UM-UC-3、TCCSUP、J82、T24、5637中检测CTLA-4的配体CD80/86表达水平,其中T24表达最高,UM-UC-3表达水平最低,不同肿瘤细胞CD80/86表达水平相比具有统计学意义（P>0.05）（图.1D）。5.抗CTLA-4抗体阻断的CTLs对T24细胞的细胞毒性显着提高,且呈剂量依赖性,CTL上的CTLA-4的抗体阻断增强细胞的抗肿瘤活性。结论:CTLA-4诱导的T细胞失活被认为是免疫抑制的一种机制,阻断CTLA-4/B7通路后增强CTL对膀胱癌细胞的抗肿瘤活性。第三部分阻断CTLA-4的CD8+T淋巴细胞体内抗肿瘤效应的实验研究目的:进一步验证抗CTLA-4封闭后的CTL抗肿瘤免疫杀伤效果,评估封闭CTLA-4后特异性CTL体内抗肿瘤效应。方法:1.动物模型建立:采用人源单个核细胞建立具有人免疫功能的SCID模型小鼠,并建立了T24细胞的异种移植模型,流式检测重建效率。免疫重建的小鼠,将5周龄雄性SCID小鼠（中国科学院）尾静脉注射4×107外周血淋巴细胞,肿瘤直径为6-9mm,建立SCID小鼠模型。2.预防试验抗-CTLA-4抗体阻断后的1×107CTLs和对照组通过尾静脉注射,然后SCID小鼠皮下移植T24细胞,剂量为1×106个细胞,悬浮于100μl PBS中（每组n=5）（图1A）。自开始接种后测量抗-CTLA-4抗体封闭组或对照CTL后小鼠的肿瘤体积（n=5）（图1B）。采用抗-CTLA-4抗体阻断或对照组CTL对肿瘤组织进行PCNA免疫组化染色（图1C）。3.治疗试验首先将T24细胞接种在SCID小鼠中。当肿瘤生长至接近100mm 3时,将小鼠随机分组,并用抗CTLA-4抗体处理的1×107个实验组CTL和对照组分别行尾静脉注射（每组n=5）。饲养条件遵循动物中心的指导方针:温度20-22℃;湿度50-70%;正常饮食,无特定病原体。每3天用游标卡尺测量肿瘤体积。27天后处死小鼠。通过计算肿瘤体积来监测肿瘤负荷。肿瘤体积计算如下:体积=（长度）×（宽度）2/2。自开始接种后测量抗-CTLA-4抗体封闭组或对照组CTL的小鼠的肿瘤体积（n=5）（图1E）。采用抗-CTLA-4抗体阻断或对照组CTL对肿瘤组织进行PCNA免疫组化染色（图1F）。通过CTLA-4抗体封闭后制备CTL进行杀伤实验。4.分组1)抗CTLA-4抗体封闭的CTL实验组;2)对照组CTL;3)（生理盐水）空白对照组。5.统计学分析数据报告为来自至少三次独立实验的平均值±标准差。使用SPSS（V13.0,Chicago,USA）进行统计学分析。通过χ2检验比较CTLA-4表达与临床参数之间的相关性。通过Student’s t-检验评估体外和体内测定中的组间差异。方差分析用于在多个组之间进行比较。P<0.05有统计学意义。结果:1.尾静脉注射单核细胞方法构建人源化SCID小鼠模型,将人源化移植瘤模型小鼠分为:CTLA-4抗体封闭组和CTL对照组,与对照组相比,抗CTLA-4抗体封闭组的肿瘤生长明显减慢,这表明被抗CTLA-4抗体封闭后肿瘤的生长出现延缓。与此同时,CTLA-4抗体实验组的PCNA阳性细胞也显着减少。2.预防性试验:接种1×107剂量的对照组CTL和抗-CTLA-4抗体封闭的CTL治疗组细胞,然后以1×106细胞的剂量皮下移植T24细胞（图.1A）,每组（n=5）。与对照组相比,抗-CTLA-4实验组肿瘤生长明显减慢,说明CTLA-4抗体延缓了T24移植瘤的潜伏期（图1B）,同时,抗-CTLA-4组中PCNA阳性细胞也明显减少（图.1C）。3.治疗性实验:与对照组相比,抗-CTLA-4治疗组的肿瘤体积明显减小,表明CTLA-4抗体封闭后在体内的抗肿瘤活性增强（每组n=5）（图1E）。同样,CTLA-4抗体封闭组CTL增殖指数PCNA及免疫反应活性也降低（图.1F）。4.CTLA-4抗体封闭组较CTL对照组对T24细胞有更强的抗肿瘤杀伤效应;CTLA-4抗体封闭组较生理盐水组对T24细胞有更强的抗肿瘤杀伤效应,二者相比具有统计学上的意义。DC-CTL组较生理盐水组有更强的抗肿瘤杀伤效应。5.ELISA法检测上清液中细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌量:CTLA-4抗体阻断后的CTL产生更高水平的IFN-γ和TNF-α（表1）。结论:1.CTLA-4抗体封闭后增强了其对膀胱癌细胞免疫反应和细胞毒性,2.CTLA-4抗体封闭后CTL在皮下异种移植的SCID小鼠模型中显示出具有更好的抗肿瘤活性。3.CTLA-4抗体封闭后的CTL产生更高水平的IFN-γ和TNF-α。4.CTLA-4抗体封闭组肿瘤生长明显减慢,说明CTLA-4抗体延缓了肿瘤的生长。
王静林[5]（2019）在《香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究》文中提出香菇（Lentinus edodes）是着名的药食两用菌,既味道鲜美、营养丰富,又具有多种药理活性。香菇多糖（Lentinan）是从香菇子实体中提取得到的最有效生物活性成分,作为一种典型的β-（1-3）-D-葡聚糖,它具有降血糖、降胆固醇、抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等多种药理活性。早在1980年代香菇多糖既作为抗癌药物上市,在临床上作为免疫增强剂用于癌症的辅助治疗。然而,其抗肿瘤作用的分子机制尚不明确,在一定程度上限制了其临床应用。目前普遍认为香菇多糖仅能通过激活免疫系统发挥间接抗肿瘤作用,而不能直接杀伤肿瘤细胞;且主要表现为T淋巴细胞免疫系统依赖。然而,本课题组在前期研究中发现,香菇多糖能显着抑制多种肿瘤细胞的体外增殖,即发挥了非免疫途径的抗肿瘤作用。因此,本论文旨在探究香菇多糖是否具有非免疫途径的直接抗肿瘤作用及其内在分子机制,为拓宽香菇多糖的临床应用、充分发挥其药用价值及开发肿瘤治疗新制剂提供理论及实验基础。本论文以房县小香菇子实体为原料,沿用课题组已建立的工艺,提取、分离、纯化得到精制香菇多糖（SLNT）并通过一系列手段进行质量评价。通过体外实验探究了香菇多糖对人结肠癌HT-29细胞的非免疫途径抗肿瘤作用;并建立T细胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型及T、B、NK细胞缺陷且巨噬细胞及补体系统等受损的HT-29荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠模型,探讨香菇多糖能否在不同程度免疫系统缺陷的小鼠体内发挥其非免疫途径的直接抗肿瘤活性;并着重从Ⅰ型程序性死亡（细胞凋亡）及Ⅱ型程序性死亡（自噬性细胞死亡）两个角度探索了其可能的分子机制。本课题研究不仅补充了香菇多糖抗肿瘤分子机制的理论基础,且有助于其作为功能性食品及抗肿瘤临床用药的开发应用。第一部分香菇多糖SLNT的制备香菇多糖的制备沿用本课题组已建立并优化的工艺技术:采用水提醇沉法从房县小香菇子实体中提取香菇粗多糖,再经H2O2脱色法除去色素及部分杂质得到脱色后多糖,最后通过超滤法分离纯化得到精制香菇多糖,经冷冻干燥后为白色絮状物,性状稳定。对提取的香菇多糖进行纯度及分子量鉴定:苯酚‐硫酸法检测精制香菇多糖的糖含量约为98.54%;高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测得精制香菇多糖的重均分子量约为6.23×105 Da,且分子量均一;紫外扫描结果显示其几乎不含蛋白质和核酸。本部分实验结果表明,香菇多糖的提取工艺成熟可靠、易于控制、结果稳定;提取得到的精制香菇多糖（SLNT）分子量均一、纯度高、几乎不含其它杂质,满足后续实验要求。第二部分香菇多糖对人HT-29结肠癌体内外的非免疫途径抗肿瘤作用研究结肠癌是全球癌症致死数量排名第二的癌症,每年约有100多万新增病例和约50多万死亡病例。目前临床上主要通过手术切除病灶并通过化学疗法进行治疗。尽管化学治疗有助于缓解症状、延长病患的生命,但是其不可避免的副作用（如腹泻、恶心、呕吐、急性心肌梗死、脑血管伤害等）极大地降低了病患的生活质量,严重的甚至可能威胁生命。因此,寻找筛选具有低毒、高效抗肿瘤活性的天然产物变得十分重要。本论文选用了来源为人结肠癌原发灶、属于TNMⅠ期结肠癌、在裸鼠及NOD/SCID小鼠体内成瘤性极好、且多种癌基因表达呈阳性的人结肠癌HT-29细胞系作为研究载体,探究了天然产物香菇多糖对人HT-29结肠癌体内外的非免疫途径直接抗肿瘤作用。通过MTT比色法考察了香菇多糖（SLNT）对人结肠癌HT-29细胞体外增殖的抑制作用。结果显示,将不同浓度香菇多糖（12.5-1600μg/mL）与HT-29细胞共培养48小时后,HT-29细胞的增殖均被显着抑制,且随着香菇多糖浓度增加,抑制率增加,具有一定剂量依赖性。当香菇多糖浓度为1600μg/mL时,抑制率达到66.84%,抗肿瘤作用显着,仅次于阳性对照组氟尿嘧啶（800μg/mL）的抑制率74.24%。通过光学显微镜观察细胞形态,发现香菇多糖组中大量细胞体积变小、贴壁不紧密、与周围细胞连接消失、细胞质浓缩;而正常细胞贴壁紧密,成团生长,细胞质未出现浓缩。建立T淋巴细胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型,探究香菇多糖是否能发挥T淋巴细胞免疫系统非依赖的抗肿瘤作用。采用皮下注射HT-29细胞植瘤建立荷瘤裸鼠模型,并随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）,阳性对照组（5-FU,20 mg/kg氟尿嘧啶）,香菇多糖低、中、高剂量组（0.2、1.0、5.0 mg/kg SLNT）;每组6只,采取尾静脉注射方式,隔天给药,共给药10次,同时记录裸鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,对离体肿瘤组织及脾脏称重,计算脾指数、抑瘤率,并检测裸鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。结果显示,香菇多糖各剂量组裸鼠体重在正常范围内,而氟尿嘧啶组体重严重低于正常水平;低、中、高剂量香菇多糖对HT-29荷瘤裸鼠移植瘤的抑制率分别为17.88%、48.87%和57.90%,具有一定剂量依赖性;氟尿嘧啶的抑制率为67.23%,表明香菇多糖能发挥T淋巴细胞免疫系统非依赖的抗肿瘤作用。且与阴性对照组相比,香菇多糖各剂量对裸鼠的脾指数及血清中IL-6的水平无明显影响,没有统计学差异,表明香菇多糖未提高其他免疫系统功能;而结果又显示,香菇多糖显着增加了血清中TNF-α的水平,我们猜测香菇多糖的抗肿瘤作用可能与肿瘤坏死因子有一定关联。为了进一步排除香菇多糖免疫调节作用对其直接抗肿瘤作用的影响,我们采用了T、B、NK细胞缺陷且巨噬细胞及补体系统等受损的联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠作为动物模型,并选用与裸鼠实验中相同的给药方式及剂量进行实验。随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）、香菇多糖低剂量组（1.0 mg/kg SLNT）及香菇多糖高剂量组（5.0 mg/kg SLNT）;每组5只,采取尾静脉注射,隔天给药,共给药10次,同时记录小鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,计算脾指数、抑瘤率、评估香菇多糖的毒副作用,并检测NOD/SCID小鼠血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ及TNF-α水平。结果显示,香菇多糖治疗对小鼠未产生毒副作用;香菇多糖（1 mg/kg and 5mg/kg）各剂量对HT-29荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠移植瘤的生长均有明显抑制作用,抑瘤率分别为45.05%和50.61%;且香菇多糖给药未刺激小鼠脾指数及其血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ水平的上调,证明香菇多糖在免疫系统功能缺失的情况下抑制了HT-29移植瘤的生长,即发挥了其非免疫途径的直接抗肿瘤作用。而与裸鼠实验结果相似的,香菇多糖高剂量组显着上调了小鼠血清中TNF-α的水平,提示TNF-α可能参与了香菇多糖的直接抗肿瘤作用。总而言之,本部分研究证实了香菇多糖对人结肠癌HT-29细胞发挥了非免疫途径的直接抗肿瘤作用,且其抑瘤效果显着。并且通过两种免疫缺陷动物模型,证实了香菇多糖同样能在体内实验中发挥其T淋巴细胞免疫系统非依赖性的,甚至免疫系统非依赖的直接抗肿瘤作用。为后文香菇多糖非免疫途径抗肿瘤作用的分子机制研究奠定了基础。第三部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡作用的研究由于细胞凋亡（Ⅰ型程序性死亡）被公认为是最主要的导致细胞死亡的分子机制,于是本部分我们通过多种手段及技术探究了香菇多糖是否能诱导HT-29细胞凋亡而发挥其直接抗肿瘤活性。首先,通过流式细胞仪检测发现400、800、1600μg/mL SLNT与HT-29细胞共培养48小时后,HT-29细胞的凋亡率分别达到20.26%、31.80%、48.50%,均明显高于阴性对照组（NC,7.31%）,且具有一定剂量依赖性。为了进一步验证其结果,我们通过DAPI染色法、AO/EB及Annexin V-FITC/PI双荧光染色法观察了SLNT对HT-29细胞凋亡形态学的影响。DAPI染色法可见SLNT组细胞出现不同程度的核固缩（呈致密浓染蓝色荧光）及核碎裂,可见半球状、新月牙状细胞核,呈典型凋亡细胞核形态,而NC组细胞核完整,染色均匀一致;AO/EB染色法可见SLNT组细胞核被染成绿色、黄绿色或橘红色且呈固缩状或圆珠状,细胞核碎裂,而NC组细胞核结构完整,着绿色且均匀一致;Annexin V-FITC/PI染色可见SLNT组出现绿色或红色的早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞,且随着剂量增加,凋亡细胞增多。最后,我们检测了线粒体凋亡发生早期的标志性事件—线粒体膜电位下降。结果显示,香菇多糖显着降低了HT-29细胞线粒体膜电位。以上研究结果证明了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞凋亡,从而发挥了其直接抗肿瘤作用。随后,我们通过对裸鼠及NOD/SCID小鼠HT-29肿瘤组织进行H&E染色,初步考察了肿瘤组织中细胞凋亡的情况。形态学观察发现SLNT组肿瘤组织中可见散布凋亡细胞（细胞体积缩小,胞质致密、核固缩或碎裂等）,且随着剂量增加,凋亡区域面积加大,而NC组细胞排列紧密,细胞核完整呈圆形和椭圆形。表明在体内实验中,香菇多糖也可能诱导了细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。总而言之,本部分研究证明了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞凋亡,从而发挥了其非免疫途径的直接抗肿瘤作用,也为下一部分的机制研究奠定了基础。第四部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡的机制研究细胞凋亡主要由两种途径诱导:内源性途径（线粒体凋亡通路）和外源性途径（死亡受体凋亡通路）。由于上一部分结果发现香菇多糖显着降低了HT-29细胞线粒体膜电位,提示香菇多糖激活了线粒体凋亡通路。因此,我们首先通过免疫印迹实验及免疫组化实验检测了香菇多糖对HT-29细胞及肿瘤组织中线粒体凋亡通路相关蛋白的影响。结果发现,香菇多糖给药显着激活了凋亡效应酶Caspase-3及凋亡起始酶Caspase-9,并上调了胞浆中细胞色素C（Cytochrome c）的水平及Bax/Bcl-2的比值,表现为线粒体凋亡通路激活。随后,我们评估了线粒体凋亡通络上游刺激因子活性氧（ROS）的水平及其与凋亡的关系。流式细胞仪及荧光显微镜观测发现,香菇多糖显着升高了HT-29细胞中ROS的水平,且具有剂量依赖性;而经过活性氧抑制剂NAC预培养后,香菇多糖组的凋亡率由32.91±1.21%显着降低至21.49±1.62%(***p<0.001);且抑制活性氧上升后,香菇多糖诱导的胞浆中Cytochrome c及Bax/Bcl-2比值的上调被阻断了,上述结果表明活性氧的升高有利于香菇多糖诱导HT-29细胞线粒体凋亡。但同时结果显示,与NAC组相比（6.94±0.57%）,NAC+SLNT组的凋亡率（21.49±1.62%）仍显着增高,提示香菇多糖可能同时通过死亡受体途径诱导HT-29细胞凋亡。死亡受体凋亡通路可由肿瘤坏死因子受体（TNFR1）、凋亡相关因子（Fas）等与相应配体（TNF-α、FasL等）结合而诱导,从而激活下游凋亡起始酶Caspase-8,继而活化凋亡效应酶Caspase-3,引发细胞凋亡。我们运用多种方法（免疫印迹、免疫组化、免疫荧光法）检测了HT-29细胞及肿瘤组织中死亡受体凋亡通路相关蛋白的水平。结果发现,SLNT显着激活了凋亡效应酶Caspase-8并抑制了NF-κB的活化。结合第二部分实验结果,香菇多糖明显上调了裸鼠及NOD/SCID小鼠血清中TNF-α的水平,提示香菇多糖可能通过TNF-α/TNFR1途径诱导死亡受体凋亡。因此,我们进一步检测了HT-29细胞分泌TNF-α的水平。结果显示细胞经香菇多糖刺激后,其分泌的TNF-α水平显着增高,表明表明香菇多糖有可能通过TNF-α/TNFR1途径激活了死亡受体凋亡通路。前期结果已发现SLNT激活了HT-29细胞及肿瘤组织中的Caspase-3,但为了进一步验证SLNT诱导的HT-29细胞凋亡是否通过Caspase-3激活介导,我们使用Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO进行了实验。流式细胞仪结果显示,经过Ac-DEVD-CHO预培养后,香菇多糖组的凋亡率由32.91±1.21%显着降低至15.88±1.58%(***p<0.001),表明香菇多糖诱导的HT-29细胞凋亡极大程度上通过Caspase-3激活介导。而抑制了Caspase-3的激活后,Ac-DEVD-CHO+SLNT组的凋亡率（15.88±1.58%）仍比Ac-DEVD-CHO组（7.77±0.79%）高,提示香菇多糖较小程度上可能通过非Caspase-3激活的途径介导细胞凋亡,有待进一步探究。本部分研究证明香菇多糖同时激活了线粒体及死亡受体凋亡通路,并因此诱导了HT-29细胞及肿瘤组织的凋亡。其分子机制总结如下图:（1）内源性线粒体途径—活性氧急剧增加,线粒体膜电位下降,Bax/Bcl-2比值增大促进细胞色素C由线粒体释放入胞浆,导致凋亡起始酶Caspase-9活化从而激活凋亡效应酶Caspase-3,诱导细胞凋亡。（2）死亡受体途径—上调TNF-α水平,激活TNF-α/TNFR1通路,抑制NF-κB炎症反应,从而活化凋亡起始酶Caspase-8,激活凋亡效应酶Caspase-3,诱导细胞凋亡。第五部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞自噬作用及初步机制研究自噬（Autophagy）即“自食（self-eating）”,是除细胞凋亡（apoptosis）即“自杀（self-killing）”以外的另一种细胞自我“毁灭”的过程。自噬性细胞死亡也被归Ⅱ型程序性死亡,也是导致细胞死亡的一种分子机制。因此,本部分我们进一步探讨了香菇多糖是否诱导HT-29细胞的自噬作用及其可能的分子机制。LC3是目前被广泛认可的自噬标志蛋白,常被用于自噬的监测。当自噬发生时,弥散性分布于细胞胞浆中的LC3-I会被修饰加工,形成LC3-II并定位于自噬体,从而指示自噬体生成。通过免疫印迹实验发现,与阴性对照组相比,香菇多糖组的HT-29细胞及肿瘤组织中LC3-II显着增加;且LC3免疫荧光实验结果显示,香菇多糖组细胞中绿色斑点（自噬体）较正常细胞明显增多,表明香菇多糖显着刺激了HT-29细胞内自噬体的形成。同时免疫印迹实验显示,香菇多糖显着刺激了自噬体形成关键蛋白Beclin 1的上调,再一次佐证了香菇多糖发挥了促进HT-29细胞自噬体形成的作用。而自噬体的增加并不一定意味着自噬作用增强,也有可能是由于自噬体与溶酶体融合受阻导致。因此,我们通过以下三个实验检测香菇多糖对HT-29细胞自噬流的影响:（1）检测自噬降解过程的标志蛋白p62,其含量降低表明自噬降解过程通畅;（2）mCherry-GFP-LC3B双荧光标记法,同时反映自噬体及自噬溶酶体的数量;（3）透射电镜观察自噬形态。上述实验结果显示,香菇多糖能促进HT-29细胞中自噬流增强,即激活了HT-29细胞自噬。通过免疫印迹实验检测细胞及肿瘤组织中自噬相关蛋白的含量,结果显示香菇多糖显着降低了p-mTOR、PI3K、p-AKT的含量,而显着增加了p-JNK及细胞中p-AMPK的含量。因此,推测香菇多糖可能通过以下途径诱导了HT-29细胞自噬:（1）抑制PI3K/Akt通路并激活了AMPK通路,共同直接或间接地抑制了下游自噬负调控蛋白mTOR的活性,激活自噬。（2）激活了JNK蛋白,促进其磷酸化Bcl-2/Bcl-XL,使自噬关键蛋白Beclin 1与其解离,激活自噬。总而言之,本部分研究证实了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞自噬,并对其内在的分子机制做了初步的探索,更详细全面的机制研究有待进一步探索。第六部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响自噬作用不同于凋亡作用（Ⅰ型细胞程序性死亡）,凋亡作用的最终结果是杀死细胞,而自噬作用对细胞生存的影响却具有双重性—既可保护又可杀伤肿瘤细胞。本部分研究承接第五部分,进一步探讨香菇多糖诱导的HT-29细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响。我们选用了两种公认的自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）及氯喹（CQ）用于实验。MTT实验结果显示,自噬抑制剂氯喹及3-MA组对HT-29细胞的增殖基本无影响;而HT-29细胞经过CQ或3-MA预培养后,香菇多糖对HT-29细胞增殖的抑制率由56.04%（SLNT）分别显着降低至34.89%（SLNT+CQ）、37.63%（SLNT+3-MA）,表明香菇多糖诱导的自噬作用有助于其对HT-29细胞的直接抗肿瘤作用。为了进一步探究自噬激活对香菇多糖体内发挥直接抗肿瘤作用的影响,我们建立了自噬抑制的HT-29荷瘤NOD/SCID小鼠模型。采取皮下注射HT-29细胞植瘤,并随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）、自噬抑制剂氯喹组（5.0 mg/kg CQ）、香菇多糖组（5.0 mg/kg SLNT）、香菇多糖+氯喹组（5.0 mg/kg SLNT+5.0 mg/kg CQ）;每组5只,采取尾静脉注射,隔天给药,共给药10次,同时记录小鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,对离体肿瘤组织称重,计算抑瘤率并评估氯喹用药的毒副作用。结果显示,香菇多糖组对移植瘤的抑制率为50.61%,而当其与氯喹联用时,抑瘤率显着降低（*p<0.05）至35.23%。本部分研究证明了香菇多糖诱导的自噬作用有助于其对HT-29细胞的直接杀伤作用,即表现为自噬性细胞死亡（Ⅱ型细胞程序性死亡）。总的来讲,香菇多糖能够通过激活人结肠癌HT-29细胞凋亡及自噬性死亡,而发挥其非免疫途径的直接抗肿瘤作用。本论文的研究为香菇多糖作为新型抗肿瘤药物应用于临床提供了充足的理论依据及实验基础。
张海强[6]（2019）在《抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的构建及生物活性验证》文中研究说明胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,预后相对较差,严重威胁人类健康。早期胃癌临床症状不典型,故多数患者确诊时已为进展期,这些患者预后较差,除手术治疗外,均需辅助内科化疗等后续治疗。胃癌的内科治疗主要包括化疗、免疫治疗和靶向治疗。但化疗有效率有限,而且毒副作用高,免疫治疗尚未寻找到胃癌特异性靶点而进展缓慢。靶向治疗已在乳腺癌、肺癌治疗中广泛采用,特别是曲妥珠单抗（trastuzumab）在乳腺癌治疗中已被广泛认可。鉴于靶向治疗的精准性,人们已开始探索靶向治疗在胃癌中的应用。本研究旨在以HER2蛋白为靶点,构建并合成融合基因工程蛋白,探讨其对HER2阳性胃癌细胞的杀伤效果。单克隆抗体是目前应用较广泛的靶向治疗药物,抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）是单抗发挥杀伤作用的重要机制,但单抗抗体分子量大,难以穿透肿瘤组织,这些弊端限制了单抗的应用,同时具有免疫杀伤作用的T细胞因表面缺乏与单抗结合的受体而不能被有效介导,从而削弱了机体对肿瘤的免疫反应。单链抗体（sc Fv）仅含有全抗的可变区片段,具有免疫源性小、分子量小、穿透力强的特点,因此是理想的肿瘤治疗靶向载体。CCL19是一类可趋化免疫细胞定向移动的小分子蛋白,可诱导T细胞、NK细胞、DC细胞等发挥抗肿瘤作用。IL7在T细胞的发育、分化及增殖过程中发挥着重要作用,可通过促进IFN-γ、TNF-α等细胞因子分泌抑制多种实体瘤的生长。所以本研究设计了以人源HER2 sc Fv为靶向载体,连接免疫细胞趋化因子CCL19及介导T细胞活化的IL7,构建了抗HER2sc Fv-CCL19-IL7全基因序列的慢病毒载体,转染并筛选出稳定表达融合基因工程蛋白的HEK293T细胞株,并从其培养上清中成功获得目标蛋白。获得目标蛋白后,第二部分实验验证了抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HER2靶向性及生物学活性。第三部分实验为融合蛋白抗肿瘤疗效研究,选用高表达HER2蛋白的NCI-N87胃癌细胞和HER2阴性的SGC7901细胞分别给予不同剂量融合蛋白,观察其杀伤效果。同时建立了人源化NOD/SCID小鼠模型,并建立胃癌移植瘤小鼠模型,给予抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白进行治疗,观察肿瘤体积变化,检测体内IFN-γ和IL-2细胞因子分泌水平,评价其体内抗肿瘤效果。第一部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白表达载体的构建及真核表达目的:构建抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的表达质粒并筛选出稳定表达融合基因工程蛋白的HEK293T稳定细胞株。方法:从Genbank数据库中检索到人CCL19 c DNA序列（gene ID6363）,目的基因大小294bp,人IL7 c DNA序列（gene ID 9606）,目的基因大小531bp,抗人HER2 sc Fv基因由本实验室制备的鼠抗人HER2单克隆抗体杂交瘤细胞株中的VH、VL基因,经过密码子优化及人源化合成获得。按照抗HER2 sc Fv基因-连接肽基因-CCL19基因-连接肽基因-IL7基因形式排列,并于整段基因合成序列的两端分别设置的XhoⅠ/HindⅢ酶切位点,全基因序列合成,合成后的基因序列亚克隆在pc DNA3.1载体中,经过XhoⅠ/HindⅢ内切酶的酶切反应,将HCI-pc DNA3.1质粒中的抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因连接到慢病毒表达载体质粒上,酶切检验目的基因片段大小,并回收测序无误后使用慢病毒转染的方式将目的基因转染至HEK293T细胞中,并用PURO筛选转染后的细胞,以获得稳定表达融合蛋白的HEK293T细胞体系。将筛选得到的高表达融合蛋白的HEK293T细胞大量扩增培养,提取培养上清内表达的融合蛋白,利用His标签,通过镍柱亲和层析纯化目标蛋白,并通过Western-blot检测该融合蛋白在HEK293T细胞培养上清中的表达情况。结果:1.通过基因工程技术,成功合成了抗HER2 scFv-CCL19-IL7全基因序列,并亚克隆在pc DNA3.1载体中,通过基因测序证明基因序列正确,无突变。2.成功构建含有抗HER2 scFv-CCL19-IL7全基因序列的慢病毒载体,并通过慢病毒转染的方式成功的将目的基因序列成功转染至HEK293T细胞中,并筛选出稳定表达抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HEK293T细胞株。3.Western blot检测到抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在HEK293T细胞培养上清中表达。第二部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白靶向性验证及生物活性分析目的:验证抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HER2靶向性及生物活性方法:以流式细胞术检测人NCI-N87胃癌细胞、SGC7901胃癌细胞中HER2蛋白表达情况;流式细胞术测定分析抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白抗HER2抗原靶向性及生物学活性;ELISA法测定纯化获得的融合蛋白中的IL7含量及生物学活性;测定抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的结合常数,证实抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白具有与HER2抗原亲和力,并具备生物活性,为进一步验证其体内外抗肿瘤研究奠定基础。结果:1.流式细胞术检测发现人NCI-N87胃癌细胞表面HER2蛋白呈高表达、SGC7901胃癌细胞表面HER2蛋白呈低表达或无表达。2.流式细胞术检测后分析荧光强度显示抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可与赫赛汀、HER2-FITC竞争性结合人胃癌NCI-N87细胞表面的HER2抗原。3.蛋白结合常数测定显示抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白具有与HER2抗原结合的抗体活性,具有一定亲和力。4.ELISA法检测到HEK293T细胞培养基中含有IL7,并且结果显示随着培养时间的延长,培养基中IL-7含量呈上升趋势。第三部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白体内外抗肿瘤的实验研究目的:探讨抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在体外对HER2过表达胃癌细胞的杀伤效力及对HER2阳性胃癌移植瘤小鼠模型的抗肿瘤作用。方法:CCK-8法检测体外HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白介导PBMCs对HER2过表达及低表达胃癌细胞的杀伤作用;ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。鼠尾静脉注射人外周血单个核细胞构建人源化NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达情况。人源化NOD/SCID小鼠接种HER2过表达的NCI-N87人胃癌细胞建立胃癌移植瘤动物模型。成瘤后将动物随机分为三组,分别给予生理盐水、赫赛汀、抗HER2sc Fv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白初始负荷治疗量1次,维持治疗量3次,每周给药1次,共治疗4次,定期测量肿瘤体积变化,计算三组小鼠移植瘤平均体积和SD值。ELISA检测各组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的分泌量。肿瘤标本进行病理切片,HE染色观察其形态,免疫荧光组化法观察肿瘤组织内T淋巴细胞、DC细胞的浸润情况。结果:1.不同效靶比下抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白体外介导PBMCs对HER2阳性NCI-N87细胞及HER2阴性SGC7901细胞的杀伤效率随着效靶比的增加而明显提高。2.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可介导活化免疫细胞,增加IFN-γ和IL-2分泌量。3.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在体内对HER2阳性胃癌细胞杀伤效果显着。4.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可趋化T细胞、DC细胞等淋巴细胞向肿瘤内迁移。结论:1.携带抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的全基因序列,通过慢病毒转染的方式成功的转染至HEK293T细胞中,并可稳定表达抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白。2.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可特异性靶向肿瘤细胞表面的HER2蛋白,并具有抗体抗原结合活性。3.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可介导活化免疫细胞,增加IFN-γ和IL-2分泌量。4.通过鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并通过肿瘤细胞株皮下注射成功建立了胃癌移植瘤模型。抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可特异性识别HER2抗原,并通过趋化DC细胞,活化T细胞等途径介导免疫系统发挥抗肿瘤作用。
谭庆龙[7]（2018）在《巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价》文中进行了进一步梳理肿瘤微环境是一个复杂结构系统,具有增强或逃避宿主免疫监视和杀伤的作用。组成肿瘤免疫环境的核心免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞和中性粒细胞。肿瘤微环境中的免疫细胞的位置、数量、功能表型和Closstalk影响肿瘤的免疫应答、治疗和预后结果。因此,重塑肿瘤免疫环境中免疫细胞的特征和削弱其在肿瘤免疫治疗中抑制性,对开发针对癌症的新型免疫治疗和化疗抵抗至关重要。由于肿瘤生长通常伴随着髓系细胞在肿瘤中的积累和免疫表型改变,从而抑制T细胞靶向肿瘤的免疫治疗。本研究针对肿瘤微环境中关键的“保安”巨噬细胞和“特种兵”T淋巴细胞入手,分别探寻调节巨噬细胞免疫极化表型的物质及其机制,和构建人源化T细胞免疫的小鼠膀胱癌肿瘤评价模型,希冀为重塑肿瘤免疫环境的治疗关键问题提供启示。1、巨噬细胞具有两种作用相反的表型,经典激活的M1表型和选择激活的M2表型,M1型巨噬细胞抵抗入侵病原体、抑制肿瘤、吞噬微生物、促进炎症反应和增强免疫监视功能。相反,M2型为“休息”表型,抑制免疫反应、促进组织愈合、降低炎症发生和促进肿瘤生长。猪苓多糖具有免疫调节作用已被证实,在本研究中,通过甲醇脱脂、水提醇沉提取猪苓粗多糖,经过滤、Savage法去蛋白、冷冻干燥、DEAE-Cellulose及Sephadex G-100柱层析分离猪苓均一多糖（Polyporus polysaccharide,PPS）;发现纯化的PPS极化M-CSF诱导人M2(CD206 high)型巨噬细胞极化为M1(CD86 high)型,且PPS影响巨噬细胞的粘附和诱变细胞形态;降低PD1表达,升高MHCⅡ分子表达;促进细胞因子白细胞介素（IL）‐1β、IL‐6、IL‐8、IL10及肿瘤坏死因子（TNF）‐α（P<0.01）分泌;增强M2巨噬细胞对肿瘤杀伤的能力（P<0.05）;降低FN、COLⅢ和ICMA-1转录水平（P<0.05）,升高TLR2、TLR4和NF-κB蛋白的表达（P<0.05）;RNA-seq也证实NF-κB信号及细胞生理的基质组成参与了PPS对巨噬细胞的作用。本研究发现PPS抑制M2巨噬细胞的粘附和伪足生成,且具有显着增强巨噬细胞免疫和抗肿瘤功能。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）对非肌层浸润性膀胱癌有效,其激活了免疫系统和加剧炎症反应,其中巨噬细胞为BCG的重要靶细胞之一。实验探讨了BCG在巨噬细胞极化调控中的作用和潜在机制,以及和信号调节蛋白-α（SIRPα）的关系。将单核细胞系THP-1分化为M2巨噬细胞(CD206 high和Th2细胞因子分泌细胞),观察到BCG诱导的M2极化为M1表型(CD86 high、CD197 high和Th1细胞因子分泌细胞);下调SIRPα（CD172α）;促进IL-1β、IL-6、TNF-α、干扰素（IFN）-γ和诱导型一氧化氮合酶（i NOS）等促炎因子的表达（P<0.05）。与BCG处理的M2巨噬细胞共培养的人膀胱癌T24和RT4细胞,显示出CD47高表达的于生长抑制作用的正相关（P<0.05）。此外,BCG以剂量依赖性方式显着增加Janus激酶2（JAK2）和p信号转导物和转录激活物1（STAT1）蛋白的表达。实验结果表明JAK2/STAT1途径介导BCG极化巨噬细胞为M1和抑制SIRPα表达是BCG作用于巨噬细胞为杀伤膀胱癌的重要机制。另外,通过体内研究BCG（0.25、1.25和6.25μg/小鼠,i.v.）在NOD/scid IL2Rg-/-（NSI）小鼠膀胱癌肿瘤模型中的作用和潜在机制。惊讶的是,观察到NSI小鼠T24膀胱癌模型在尾静脉注射BCG后,显示巨噬细胞标志物CD11b+F4/80+高水平浸润以及肿瘤体积的显着减少（P<0.05）。与对照组相比,外周巨噬细胞的M2比例显着下降（P<0.05）,血清和肿瘤上清中巨噬细胞相关炎症和分化细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12P70、RANKL和MCP-1的水平也显着增加（P<0.05）。此外,BCG促进骨髓中促分化基因PU-1、EGR-1、NF-κB和C-Fos m RNA转录的表达（P<0.05）。结合分析,本研究结果表明体内注射BCG可以靶向巨噬细胞来抑制膀胱癌的生长,其机制与巨噬细胞成熟、免疫激活和浸润膀胱肿瘤的巨噬细胞数量增加有关。2、人源化小鼠或小鼠-人类嵌合体已成为研究体内替代活生物体的重要模型。近年来,人源化小鼠模型在人类艾滋病、癌症、传染病、血液疾病和退行性疾病领域研究得到了广泛的认可和应用。患者来源的异种移植肿瘤（PDX）保留了原始的肿瘤特征如组织学异质性、生物分子特征、临床恶性表型、基因型、肿瘤结构和肿瘤脉管系统,可提供相关评估特别是新型癌症疗法和对临床结果的具有预见性,与肿瘤细胞系相比为更可靠的药物研发平台,已成为公认的临床前药物评价模型。Atezolizumab（MPDL3280A）作为化免疫治疗药物为膀胱肿瘤近30年以来的首个重大药物,开启了膀胱癌精准免疫靶向治疗。实验建立PBMC人源化NSI皮下荷瘤T24膀胱癌CDX小鼠模型,Atezolizumab（10mg/kg,i.v）每周尾静脉给药2次,连续治疗4周,对Atezolizumab的免疫治疗效果和机制进行评价。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;但对T细胞亚群CD8+/CD4+比例无影响;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1、TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）但对T细胞激活分子CD25、CD69均无影响。实验另进行了人源化NSI膀胱癌PDX小鼠模型构建,观测Atezolizumab（高、中、低:20、10、5 mg/kg,i.v）对患者来源肿瘤样本（PDX）的治疗作用。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;能明显增加CD4+亚群细胞数量;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）,但对外周T细胞激活CD25、CD69无影响。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1和TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）,对T细胞激活分子CD25和CD69均无影响。本次建立的人源化膀胱癌PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,且具有与CDX某些不同的特征表型,特别是T细胞浸润情况,CDX模型中浸润T细胞远大于PDX模型肿瘤。实验建立的人源化膀胱癌CDX或PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,为具有T淋巴细胞特征的肿瘤免疫评价模型。实验表明Atezolizumab不仅对肿瘤PD-L1具有明显抑制作用,还能间接抑制PD1促进NSI小鼠体内人源T细胞的增加,具有重塑肿瘤免疫环境的作用。PDX与CDX模型的差异,能为患者肿瘤的异质性、不同免疫浸润环境和精准治疗提供临床前依据。
韩锦胜[8]（2017）在《PSCA靶向嵌合抗原受体T细胞对前列腺癌抗肿瘤治疗的临床前研究》文中进行了进一步梳理前列腺癌是男性高发的恶性肿瘤,在西方国家其死亡率位居于癌症死亡率第二位,在我国也呈逐年增加趋势。前列腺特异抗原PSA的发现提高了前列腺癌的确诊率,但是并没有降低死亡风险。早期前列腺癌是可以治愈的,但是复发和晚期转移的前列腺癌是不可治愈的,治疗手段上包括抗雄激素治疗,放射治疗、化学药物治疗等方法收到的治疗效果欠佳。近几年免疫治疗成为肿瘤治疗的新方法。本研究希望采用细胞免疫疗法提高前列腺癌的治疗效果。过继性嵌合抗原受体修饰的T细胞回输成功的治疗了难治性血液恶性肿瘤,这也暗示了这种方法在实体恶性肿瘤治疗应用的可能性。靶标抗原的选择极其重要,如前列腺癌表达很多特异性抗原,并且不在其他组织表达。这些组织限制性抗原可能成为CAR T细胞治疗前列腺癌的潜在靶标。以往的临床前研究中,已使用PSMA和PSCA作为CAR T细胞的靶标,但是治疗效果欠佳。所以本次研究全新设计了靶向PSCA的第三代CAR T细胞,采用了非病毒载体微环DNA作为转染的质粒,通过电转染的方法制造出全新的靶向PSCA的CAR T细胞,并对其生物功能和表达情况进行研究。获得靶向PSCA的CAR-T细胞后,检测其杀伤活性最直接的办法就是对靶细胞进行体外杀伤实验。第二部分实验设计了PSCA-CAR T细胞不同效靶比分别对靶细胞RT4和PC-3M细胞株进行体外杀伤实验,同时检测了细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。体外的实验结果为体内实验提供了良好的基础,但是体外和体内环境因素的差异可能对PSCA-CAR T细胞发挥作用造成不同的影响,为此第三部分实验建立了人源化NOD/SCID小鼠模型,模拟人类肿瘤患者的体内环境,建造前列腺癌移植瘤小鼠模型后,给予PSCA-CAR T细胞治疗,观察肿瘤的体积情况,检测PSCA-CAR T细胞在体内的存活情况,以及体内IFN-γ和IL-2细胞因子分泌水平,评价体内抗肿瘤的疗效。第一部分第三代嵌合抗原受体PSCA scFv-CD28-CD137-CD3ζ的构建及CAR T细胞转染的实验研究目的:构建第三代嵌合抗原受体PSCA scFv-CD28-CD137-CD3ζ（PSCA-CAR）的结构,连接至微环DNA载体中,并对T细胞进行转染,检测CAR T细胞的生物功能。方法:通过全基因序列合成PSCA-CAR的结构并构建于pUC57载体中,通过基因工程技术将PSCA-CAR结构连接到亲本微环DNA载体中,提取含有目的片段的微环DNA并使用电转染的方法转染T细胞,获得PSCA-CAR T细胞。观察微环DNA转染T细胞的效果及转染效率,电转染对T细胞存活率的影响,微环DNA和电转染方法对T细胞表型的影响,流式细胞术检测PSCA-CAR在T细胞表面的表达情况,Western blot检测PSCA-CAR蛋白在T细胞的表达情况。结果:1成功的将PSCA-CAR结构通过基因工程技术连接到亲本微环DNA载体中,提取含有目的片段的微环DNA质粒,通过基因测序未发现目的片段有基因突变。2通过电转染的方法成功的将微环DNA转染了人T淋巴细胞,获得第三代PSCA-CAR T细胞,转染效率约58%,电转染后T细胞的存活率约60.2%。3电转染的方法对PSCA-CAR T细胞的增殖造成短暂的影响,经过后期细胞因子刺激培养后增殖活性恢复。4电转染的方法以及微环DNA载体对PSCA-CAR T细胞的表面分子表型没有影响。5流式细胞术检测了PSCA-CAR在T细胞表面的表达最高达88.96%。6 Western blot检测到T细胞中PSCA-CAR蛋白的表达。第二部分PSCA-CAR T细胞体外抗肿瘤的实验研究目的:研究PSCA-CAR T细胞体外抗肿瘤的作用。方法:PSCA-CAR T细胞分别与细胞表面不表达PSCA的PC-3M细胞株及天然高表达PSCA的RT4细胞株体外共培养,CCK8法检测CAR T细胞的体外选择性杀伤活性,ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。结果:1 PSCA-CAR T细胞对PSCA阳性表达的RT4细胞有较高杀伤效率,对不表达PSCA的PC-3M细胞的杀伤效率与普通T细胞相比无明显差别。2 PSCA阳性的RT4细胞可以明显刺激PSCA-CAR T细胞分泌大量IFN-γ和IL-2,而与不表达PSCA的PC-3M细胞共培养后IFN-γ和IL-2的分泌量极低,有明显统计学差异。第三部分PSCA-CAR T细胞体内抗肿瘤的实验研究目的:探讨PSCA-CAR T细胞对前列腺癌移植瘤小鼠模型的抗肿瘤作用。方法:采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法构建人源化的NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达情况,PCR法检测人源化小鼠骨髓细胞中人特异性ALU基因序列的表达情况。利用人源化的NOD/SCID小鼠制造前列腺癌移植瘤动物模型,成瘤后将动物随机分为三组进行试验,分别给予盐水、普通T细胞、PSCA-CAR T细胞治疗两次,观察肿瘤的生长体积。治疗4周后用流式细胞术检测PSCA-CAR T细胞在小鼠外周血的比例,ELISA法检测各组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的分泌量。肿瘤标本进行病理切片,并免疫组化标记PSCA及人CD3的表达情况。结果:1人源化的NOD/SCID小鼠外周血中检测到人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达,表达比例在正常成人水平。PCR法检测到人特异性ALU基因序列在人源化小鼠骨髓细胞中表达。2 PSCA-CAR T细胞治疗组小鼠肿瘤体积明显缩小,与盐水组及T细胞组相比统计学分析有显着差异。3治疗4周后采用流式细胞术仍能检测到PSCA-CAR T细胞治疗组小鼠外周血中PSCA-CAR的表达,ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-2的分泌量与其他组比较也明显升高,统计学分析有显着差异。4各组前列腺癌肿瘤标本免疫组化结果均高表达PSCA抗原,盐水治疗组的肿瘤组织无CD3表达,T细胞治疗组可见少量散在CD3表达,PSCA-CAR T细胞治疗组可见强烈的CD3表达。结论:1携带PSCA-CAR结构的微环DNA载体通过电转染的方法成功转染了人T淋巴细胞获得第三代PSCA-CAR T细胞,并且PSCA-CAR在T细胞上高水平表达。2 PSCA-CAR T细胞具有抗原依赖性激活的特征,体外在PSCA抗原的刺激下有强烈的抗肿瘤作用,并且分泌大量的IFN-γ及IL-2。3采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并在此基础上制造人前列腺癌移植瘤模型。PSCA-CAR T细胞可以在体内有效聚集到肿瘤组织发挥良好的抗肿瘤作用,使肿瘤体积明显缩小。
王甲甲[9]（2011）在《鼻咽癌双特异性抗独特型抗体疫苗的生物学活性鉴定及免疫机制研究》文中指出第一章鼻咽癌人源双特异性抗独特型抗体疫苗的制备及活性鉴定目的：构建能够表达全人源鼻咽癌双特异性抗独特型抗体的原核表达载体pET25b-G22-I50及单价抗独特型抗体的原核表达载体pET25b-G22、pET25b-I50,并对其表达产物作初步鉴定。方法：利用分子克隆技术依次或分别将G22、I50插入到原核表达载体pET25b（+）中,转化入E.coli DH5a,经菌落PCR、双酶切验证并测序。将阳性重组子转化入表达菌株E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,表达的重组蛋白经His-tag纯化试剂盒纯化后复性。用Western blot方法鉴定抗独特型抗体G22-I50、G22、I50的表达,ELISA方法分析其蛋白活性。结果：构建的原核表达载体pET25b-G22-I50、pET25b-G22、pET25b-I50经测序验证,序列正确。三种蛋白G22-I50、G22、150均以包涵体形式高效表达,经纯化后纯度达90%以上。Western blot鉴定表达的蛋白相对分子质量（Mr）分别约42 000,27 000,15 000,与预期相符。ELISA方法鉴定复性后的蛋白均已恢复活性,能够用于体外实验。结论：成功获得了有活性的人源双特异性抗独特型抗体G22-I50及单价的抗独特型抗体G22、I50,为研究鼻咽癌抗独特型抗体疫苗的主动免疫机制鉴定了坚实的基础。第二章双特异性抗独特型抗体体外抗肿瘤免疫机制研究目的：比较鼻咽癌双价双特异性抗独特型抗体G22-I50与单价的抗独特型抗体G22、I50在体外抗肿瘤免疫情况,并对其可能的机制作初步探讨。方法：诱导表达G22-I50、G22、I50三种蛋白并用Western blot及ELISA方法进行活性鉴定。常规分离人外周血单个核细胞（PBMC）,分别用G22-I5C、G22、150抗独特型抗体刺激并培养,采用MTT法、LDH释放法分别观察淋巴细胞增殖情况和细胞毒作用,ELISA方法测定用各抗独特型抗体刺激后培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4水平的变化,流式细胞术检测刺激后淋巴细胞表型的改变。结果：与G22、I50组相比,G22-I50刺激后的PBMC增殖明显,且对鼻咽癌细胞HNE2有特异的杀伤作用。G22-I50刺激后的PBMC培养上清液中IFN-y、IL-2水平均比G22、I50组有所增加,而对IL-4水平没有明显影响。流式细胞术显示刺激后的PBMC中CD4+CD8+T细胞比例增加,CD4/CD8的比率增加,而CD4+CD25+Treg细胞的比例有所减少,其中以G22-I50组最为明显。结论：G22-I50具有更强的免疫原性并能增强PBMC的特异性杀瘤作用,其机制可能与促进PBMC的增殖,诱导具有抗肿瘤作用的Thl细胞因子的分泌并活化CD8+T细胞,抑制CD4+CD25+Treg细胞的表达有关。第三章双特异性抗独特型抗体体内抗肿瘤免疫机制研究目的：分别利用Balb/c小鼠和hu-PBL-SCID小鼠模型研究双特异性抗体疫苗的抗肿瘤效应,并对其可能的机制作深入探讨。方法：将双特异性抗独特型抗体疫苗G22-I50及单价的抗独特型抗体疫苗G22、I50分别免疫Balb/c小鼠,通过间接ELISA、竞争抑制ELISA法检测各蛋白疫苗免疫后诱导的体液免疫反应情况；通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后小鼠的细胞免疫反应情况；通过检测Th1、Th2型细胞因子的表达情况,以判断各蛋白疫苗免疫后的免疫反应类型。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系统并进行鉴定,分别将上述几种抗独特型抗体疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠,并接种鼻咽癌细胞HNE2,或先接种HNE2细胞后再用各种疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠,评价疫苗的抗肿瘤免疫保护与免疫治疗作用。定期检测肿瘤体积、记录肿瘤形成的潜伏期,生存时间,并对肿瘤组织作病理学检查。同时,用双抗夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中细胞因子的分泌情况,用LDH法检测脾淋巴细胞的杀伤活性,以FCM法、免疫组织化学法检测肿瘤组织周围浸润的淋巴细胞情况。结果：分别用G22-I50、G22、I50免疫Balb/c小鼠后,通过间接ELISA和竞争抑制ELISA法检测发现,G22-I50免疫后小鼠能够产生较高水平的Ab3抗体,且具有较强的竞争结合HNE2细胞相关抗原的能力；G22-I50免疫后小鼠的脾淋巴细胞具有较强的增殖能力,并能表达高水平的IFN-γ、IL-2。成功的重建了SCID小鼠的免疫系统,并通过免疫保护实验、免疫治疗实验对其抗肿瘤效应进行了评估,发现G22-I50能够延长肿瘤形成的潜伏期,生存时间,能够抵抗肿瘤的生长,并通过病理学检查得以证实。通过ELISA法检测发现G22-I50组的脾淋巴细胞分泌的细胞因子最多,且以Th1型细胞因子为主,脾淋巴细胞的特异性杀伤能力也有明显增强,以FCM法、免疫组织化学法检测发现G22-I50组肿瘤周围浸润的CD4+CD25+Treg细胞显着减少,CD3+T细胞显着增加。结论：G22-I50能够同时激活机体的体液免疫反应和细胞免疫反应,并能诱导Thl细胞因子的分泌,促进CD3+T细胞的浸润,抑制CD4+CD25+Treg细胞的浸润,从而发挥其抗肿瘤效应。第四章含人GM-CSF的双特异性抗独特型抗体融合蛋白疫苗免疫应答及免疫保护机制研究目的：构建并表达含人GM-CSF的双特异性抗独特型抗体疫苗GM-CSF-G22-I50,观察人GM-CSF和G22-I50的协同抗肿瘤作用,并对其机制作探讨。方法：常规分离人PBMC并抽提其RNA, PCR扩增GM-CSF基因,分别插入空载体pET25b（+）和已构建的重组质粒pET25b-G22-I50的上游多克隆位点,构建重组质粒pET25b-GM-CSF, pET25b-GM-CSF-G22-I50,以酶切和测序法进行鉴定。通过诱导表达、纯化、复性等一系列过程获得有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白,并用Western blot、ELISA方法来验证蛋白的活性。将不同的蛋白疫苗GM-CSF、G22-I50、GM-CSF-G22-I50分别于背部皮下接种Balb/c小鼠,PBS免疫作为阴性对照,分别通过间接ELISA、竞争抑制ELISA法,淋巴细胞增殖实验、细胞毒性实验检测免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫反应情况,并通过双抗夹心ELISA法检测免疫小鼠的细胞因子分泌情况。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系统,分别将上述几种抗独特型抗体疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠,并接种鼻咽癌细胞HNE2,定期检测肿瘤体积、记录肿瘤形成的潜伏期,生存时间；以RT-PCR法检测了肿瘤组织中转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3的表达情况,并检测了肿瘤组织中ITAC及脾细胞中CXCR3的表达,以双抗夹心ELISA法检测了小鼠脾细胞培养上清中IFN-γIL-4、IL-10、IL-17和TGF-β的水平,以评价各疫苗的抗肿瘤效应。结果：成功的构建了原核表达载体pET25b-GM-CSF, pET25b-GM-CSF-G22-I50,并获得了有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白。将各种蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠后,通过间接ELISA、竞争抑制ELISA法检测发现GM-CSF-G22-I50蛋白免疫组小鼠体内能够产生较强的Ab3抗体,且该抗体可以与Ab1（FC2 mAb）竞争结合HNE2细胞相关抗原；淋巴细胞增殖实验显示,各组免疫小鼠的脾脏淋巴细胞在体外经1μg/mL蛋白刺激后,淋巴细胞增殖能力最强,且以GM-CSF-G22-I50蛋白免疫组为着,分泌的细胞因子主要以Thl型细胞因子为主；细胞毒性实验结果发现,与G22-I50、GM-CSF、PBS组相比,GM-CSF-G22-I50组小鼠脾淋巴细胞对HNE2细胞的特异性杀伤作用明显增强。利用hu-PBL-SCID小鼠模型,观察各疫苗的抗肿瘤免疫保护作用,结果发现,与G22-I50、GM-CSF、PBS组相比,GM-CSF-G22-I50蛋白免疫组小鼠的肿瘤形成潜伏期明显延长,肿瘤体积减小,生存时间延长；RT-PCR法检测发现,GM-CSF-G22-I50组小鼠肿瘤组织周围T-bet、GATA-3、RORyt、ITAC及脾细胞CXCR3的表达明显增加,且脾细胞培养上清中分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17明显增多,而IL-10、TGF-P明显减少。结论：含人GM-CSF的双特异性抗独特型抗体融合蛋白疫苗能够显着增强体液免疫、细胞免疫反应能力,从而发挥其抗肿瘤免疫保护作用,这可能与肿瘤周围浸润的正向调节T细胞增多,抑制性T细胞减少有着密切的关系。
周海滨[10]（2010）在《EJ致敏的DC疫苗对人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠的抗癌作用研究》文中研究说明目的：建立具有人免疫学特性的NOD/SCID小鼠模型；制备膀胱肿瘤EJ细胞裂解物致敏的DC疫苗,将其应用于具有人免疫学特性的荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠进行膀胱癌的治疗,分析评价DC疫苗在模型小鼠体内抗膀胱癌的生物学效应,为DC疫苗治疗膀胱癌提供新的思路和理论基础。方法：第一部分：人免疫重建NOD/SCID小鼠模型的建立及其鉴定1.将经过渗漏筛查的16只正常NOD/SCID小鼠随机分为2组：实验组8只,每只腹腔注射人PBMC 4×107/0.5ml,作为人免疫重建组；对照组8只,每只腹腔注射0.5ml无菌PBS,作为空白对照组。2.从生物学特性和免疫学特性两个方面对小鼠模型进行鉴定：观察小鼠的生物学体征；第4周、8周、12周分别收集两组小鼠外周血、脾脏、肝脏：利用流式细胞术检测小鼠血中人CD3+T、CD19+B淋巴细胞；通过免疫组织化学染色的方法检测小鼠脾脏和肝脏组织中人CD3+T、CD19+B淋巴细胞的浸润情况；通过ELISA实验测定小鼠血中人IgG蛋白的含量。第二部分：EJ致敏的DC对人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠的抗肿瘤作用1.利用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a联合作用于经人外周血来源的单核细胞,体外培养诱导分化出DC细胞,通过细胞形态学以及细胞表面特异性标志来鉴定DC细胞；用冻融法获得的EJ肿瘤细胞裂解物致敏DC细胞,制备全肿瘤抗原致敏的DC疫苗；将DC疫苗腹腔注射于人免疫重建NOD/SCID小鼠,4周后取小鼠脾脏磁性细胞分选器（MACS）分选出人T淋巴细胞,[3H]-TdR掺入试验测定负载EJ抗原的DC对自体T细胞的增殖能力,51Cr释放试验检测两组DC（DC组和EJ-DC组）激活的T细胞细胞毒作用。2.将人膀胱癌EJ细胞接种于20只人免疫重建24h后的NOD/SCID小鼠,建立人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠模型；第10天后将其随机分为2组：DC-EJ疫苗组,10只,每只腹腔注射疫苗0.2ml（含EJ裂解物致敏的DC细胞数为2×105个）；DC组,10只,同法注射未致敏的DC细胞悬液0.2 ml（含未致敏DC细胞数为2×105个）。观察小鼠的生物学特性包括小鼠的生命体征及肿瘤组织的生长情况；治疗后利用ELISA检测小鼠血清中人IFN-γ浓度；免疫组织化学检测小鼠肝脏组织人T细胞、DC的浸润,流式细胞术检测脾脏、肿瘤组织人T细胞及DC的浸润；以及组织病理观察肿瘤组织病理情况。结果：第一部分：1. NOD/SCID小鼠移植人外周血单个核细胞4周后流式细胞仪测得小鼠外周血中人CD3+T、CD19+B细胞百分率分别为85.6%、76.7%。2.免疫组织化学结果显示小鼠脾脏中存在人CD3+T、CD19+B细胞。3.移植人外周血单个核细胞4周、8周、12周后ELISA测得小鼠血清中人免疫球蛋白IgG的含量分别达到863μg/ml、1217μg/ml、958μg/ml。第二部分：1.负载与未负载EJ裂解物致敏的DC对自体T淋巴细胞的增殖刺激指数分别为7.2、1.0,负载与未负载EJ裂解物致敏的DC激发和扩增的CTL对EJ杀伤率分别为63.1±5.7%、21.5±4.8%,显着差异（P<0.05）。2.全部小鼠成瘤率均为100%,与DC组比较,DC-EJ组小鼠生存期显着延长、肿瘤体积增长幅度明显降低（P<0.01）。3.治疗后第1、2、3周DC-EJ组小鼠体内血清中人IFN-γ含量分别为19.6、26.8、23.7 IU/ml：而DC组在1、2、3周的含量分别仅为7.2、13.5、15.6 IU/ml,DC-EJ组均显着高于DC组（P<0.01）。流式细胞仪检测发现脾脏组织和肿瘤组织中人CD4+、CD8+T淋巴细胞、DC细胞的浸润EJ-DC组较DC组明显；但两组小鼠肝脏组织免疫组织化学染色未发现人CD4+、CD8+T淋巴细胞以及DC细胞的浸润；病理学证实小鼠肿瘤为膀胱癌。结论：1.经NOD/SCID小鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞,成功地人免疫重建NOD/SCID小鼠模型；重建后的模型为进一步实验打下了良好的基础。2.人外周血PBMC经粘附贴壁获得的DC前体细胞,进一步联合应用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a诱导,可获得大量典型的DC。3.负载肿瘤裂解物DC疫苗在体外能激活比较强的抗肿瘤免疫反应；作用在人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠体内可以明显减慢肿瘤生长速度、显着延长小鼠生存期。
二、SCID小鼠的免疫重建及其B淋巴细胞的抗癌作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SCID小鼠的免疫重建及其B淋巴细胞的抗癌作用（论文提纲范文）
（1）红细胞人源化小鼠模型的构建及其临床应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 人源化小鼠模型 |
| 1.1 scid基因突变 |
| 1.2 NOD-scid小鼠 |
| 1.3 Il2rg-/-免疫缺陷小鼠 |
| 1.3.1 Hu-PBL-SCID小鼠模型 |
| 1.3.2 Hu-SRC-SCID小鼠模型 |
| 1.3.3 BLT小鼠模型 |
| 2 红细胞人源化小鼠模型的重建现状 |
| 3 人源化小鼠中人红细胞重建的影响因素 |
| 3.1 补体 |
| 3.2 巨噬细胞 |
| 3.3 中性粒细胞 |
| 3.4 内皮细胞 |
| 4 人红细胞疾病的相关研究及发展瓶颈 |
| 5 红细胞人源化小鼠模型的未来发展方向 |
（2）肝细胞癌人源异种移植模型应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 肝细胞癌PDX模型实验动物的选择 |
| 1.1 裸小鼠 |
| 1.2重度联合免疫缺陷（severe combinedimmunodefi ciency,SCID）小鼠 |
| 1.3 NOD/SCID小鼠 |
| 1.4 NOG小鼠 |
| 1.5 B-NSG小鼠 |
| 2 肝细胞癌PDX模型移植部位和方法的选择 |
| 2.1 皮下移植 |
| 2.3 人源化异种移植模型 |
| 3 PDX模型在肝细胞癌研究中的应用 |
| 3.1 肝细胞癌发病机制研究 |
| 3.2 临床前抗肿瘤药物疗效评估 |
| 3.2.1 PDX模型在肝细胞癌信号通路研究中的应用 |
| 3.2.2 PDX模型在肝细胞癌药物敏感性方面的研究应用 |
| 4 PDX模型相关研究存在的问题 |
| 5 总结与展望 |
（3）二氢辣椒碱对黑素瘤细胞增殖与转移的体内外抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 二氢辣椒碱在体外抑制黑素瘤细胞的增殖、迁移与侵袭 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 二氢辣椒碱抑制黑素瘤细胞增殖与转移的在体研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 二氢辣椒碱通过下调β-catenin通路抑制黑素瘤细胞的增殖与转移 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 晚期黑素瘤的治疗现状与植物化合物抗黑素瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）阻断CTLA-4免疫抑制分子增强膀胱癌CD8+T淋巴细胞抗肿瘤效应的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 免疫抑制分子PD-1和CTLA-4 的表达特点 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 阻断CTLA-4的CD8~+T淋巴细胞体外抗肿瘤效应的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 阻断CTLA-4的CD8~+T淋巴细胞体内抗肿瘤效应的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肿瘤免疫治疗的研究与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 香菇多糖SLNT的制备 |
| 1.香菇多糖SLNT的提取、分离、纯化 |
| 2.香菇多糖SLNT的纯度及分子量测定 |
| 3.结果与讨论 |
| 第二部分 香菇多糖对人HT-29 结肠癌体内外的非免疫途径抗肿瘤作用研究 |
| 1.香菇多糖对HT-29 细胞体外增殖的抑制作用 |
| 2.香菇多糖对HT-29 荷瘤免疫缺陷裸鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.香菇多糖对HT-29 荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 4.结果与讨论 |
| 第三部分 香菇多糖体内外诱导人HT-29 结肠癌细胞凋亡作用 |
| 1.香菇多糖体外诱导HT-29 细胞凋亡作用的研究 |
| 2.香菇多糖体内诱导HT-29 细胞凋亡作用的研究 |
| 3.结果与讨论 |
| 第四部分 香菇多糖诱导HT-29 细胞凋亡的机制研究 |
| 1.香菇多糖对HT-29 细胞及肿瘤组织中线粒体凋亡通路相关蛋白的影响 |
| 2.活性氧对香菇多糖诱导HT-29 细胞线粒体凋亡的影响 |
| 3.香菇多糖对HT-29 细胞及肿瘤组织中死亡受体凋亡通路相关蛋白的影响 |
| 4.Caspase-3 在香菇多糖诱导HT-29 细胞凋亡中发挥的作用 |
| 5.结果与讨论 |
| 第五部分 香菇多糖诱导人HT-29 结肠癌细胞自噬作用及初步机制研究 |
| 1.香菇多糖体外诱导HT-29 细胞自噬作用的研究 |
| 2.香菇多糖体内诱导HT-29 细胞自噬作用的研究 |
| 3.香菇多糖诱导HT-29 细胞自噬的初步机制研究 |
| 4.结果与讨论 |
| 第六部分 香菇多糖诱导人HT-29 结肠癌细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 1.MTT法检测体外香菇多糖诱导自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 2.建立自噬抑制HT-29 荷瘤NOD/SCID小鼠模型观察香菇多糖体内诱导自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 3.结果与讨论 |
| 研究总结 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 中英文缩略词对照表 |
| 附录2 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录3 实验动物合格证 |
（6）抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的构建及生物活性验证（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白表达载体的构建及真核表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白靶向性验证及生物活性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白体内外抗肿瘤的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 HER2阳性胃癌的靶向治疗现状和研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 巨噬细胞与肿瘤免疫治疗相关进展 |
| 一、巨噬细胞来源和功能分型 |
| 二、目前的肿瘤相关的巨噬细胞 |
| 三、TAM在肿瘤治疗中的作用与治疗策略 |
| 第二节 人源化PDX小鼠肿瘤模型研究进展 |
| 一、国内外研究现状发展趋势评述 |
| 二、人源化鼠的模型建立方法 |
| 三、人源化PDX小鼠模型研究与应用 |
| 第三节 中药猪苓研究进展 |
| 一、化学成分研究 |
| 二、现代药理作用研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究 |
| 第一部分 猪苓多糖对人巨噬细胞的形态及抗肿瘤作用的影响 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果分析 |
| 四、小结 |
| 第二部分 卡介苗增强THP-1 源巨噬细胞的抗膀胱癌作用及其机制 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第三部分 卡介苗(BCG)在膀胱癌NOD /scid~(IL2Rg -/-) (NSI)小鼠模型中通过靶向巨噬细胞的免疫治疗研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第二节 人源化肿瘤小鼠模型的建立与Atezolizumab免疫治疗评价 |
| 第一部分 人源化膀胱癌CDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 第二部分 人源化膀胱癌PDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校发表论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）PSCA靶向嵌合抗原受体T细胞对前列腺癌抗肿瘤治疗的临床前研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 第三代嵌合抗原受体PSCA sc Fv-CD28-CD137-CD3ζ的构建及CAR T细胞转染的实验研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分PSCA-CAR T细胞体外抗肿瘤的实验研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分PSCA-CAR T细胞体内抗肿瘤的实验研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 前列腺癌的免疫治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）鼻咽癌双特异性抗独特型抗体疫苗的生物学活性鉴定及免疫机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩写词简表 |
| 前言 |
| (一) 抗独特型抗体疫苗的分类及优越性 |
| (二) 细胞因子在肿瘤疫苗中的应用 |
| (三) hu-PBL-SCID小鼠模型在肿瘤研究中的应用 |
| 技术路线 |
| 第一章 鼻咽癌人源双特异性抗独特型抗体疫苗的制备及活性鉴定 |
| 第一节 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 质粒和菌株 |
| 1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 1.4 PCR引物 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 主要溶液配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 原核表达载体pET25b-G22,pET25b-I50,pET25b-G22-I50的构建 |
| 2.2 原核表达蛋白G22,I50,G22-I50的表达与鉴定 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第二节 结果 |
| 1 目的基因的扩增 |
| 2 重组原核表达载体的构建和鉴定 |
| 3 重组蛋白的表达及表达蛋白的分布 |
| 4 蛋白的活性鉴定 |
| 第三节 讨论 |
| 第二章 双特异性抗独特型抗体体外抗肿瘤免疫机制研究 |
| 第一节 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 质粒及菌株 |
| 1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 常用溶液配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 蛋白的制备及验证 |
| 2.2 外周血单个核细胞的增殖作用 |
| 2.3 检测各组培养上清中细胞因子的含量 |
| 2.4 流式细胞术检测各组PBMC亚群的变化 |
| 2.5 细胞毒性实验 |
| 2.6 统计学分析 |
| 第二节 结果 |
| 1 抗独特型抗体对PBMC的体外增殖作用 |
| 2 刺激后淋巴细胞培养上清中细胞因子水平的变化 |
| 3 体外刺激后淋巴细胞表型的变化情况 |
| 4 细胞毒性试验 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 双特异性抗独特型抗体体内抗肿瘤免疫机制研究 |
| 第一节 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 外周静脉血 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 主要试剂和试剂盒 |
| 1.6 主要仪器 |
| 1.7 主要溶液配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 双特异性抗独特型抗体疫苗诱导的免疫应答研究 |
| 2.2 双特异性抗独特型抗体疫苗的免疫保护与免疫治疗作用 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第二节 结果 |
| 1 G22-I50,G22,I50免疫Balb/c小鼠后的免疫应答情况 |
| 1.1 体液免疫反应 |
| 1.2 淋巴细胞增殖反应 |
| 1.3 细胞因子表达情况 |
| 2 G22-I50,G22,I50免疫hu-PBL-SCID小鼠后的免疫保护与治疗机制研究 |
| 2.1 hu-PBL-SCID模型的鉴定 |
| 2.2 各疫苗的免疫保护作用 |
| 2.3 各疫苗的免疫治疗作用 |
| 2.4 肿瘤组织病理学观察 |
| 2.5 免疫组化法检测肿瘤周围浸润的CD3~+T细胞的情况 |
| 2.6 细胞因子分泌情况 |
| 2.7 细胞毒性试验 |
| 2.8 疫苗免疫保护/治疗组小鼠肿瘤组织中CD4~+CD25~+Treg细胞的比例检测 |
| 第三节 讨论 |
| 第四章 含人GM-CSF的双特异性抗独特型抗体融合蛋白疫苗免疫应答及免疫保护机制研究 |
| 第一节 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 主要试剂和试剂盒 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 主要溶液配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 pET25b-GM-CSF-G22-I50/pET25b-GM-CSF载体的构建 |
| 2.2 GM-CSF-G22-I50/GM-CSF蛋白的诱导表达、纯化、复性 |
| 2.3 GM-CSF-G22-I50/GM-CSF蛋白活性的鉴定 |
| 2.4 GM-CSF-G22-I50蛋白诱导的免疫应答反应情况 |
| 2.5 GM-CSF-G22-I50蛋白的免疫保护作用 |
| 2.6 统计学分析 |
| 第二节 结果 |
| 1 目的基因的获得 |
| 2 pET25b-GM-CSF-G22-I50和pET25b-GM-CSF载体的构建和鉴定 |
| 3 GM-CSF-G22-I50/GM-CSF蛋白的表达 |
| 4 GM-CSF-G22-I50/GM-CSF蛋白活性的鉴定 |
| 5 GM-CSF-G22-I50免疫小鼠后的免疫应答情况 |
| 5.1 间接ELISA法检测GM-CSF-G22-I50免疫小鼠的体液免疫反应情况 |
| 5.2 竞争抑制ELISA法检测GM-CSF-G22-I50免疫小鼠的体液免疫反应情况. |
| 5.3 淋巴细胞增殖实验 |
| 5.4 细胞毒性实验 |
| 5.5 细胞因子表达情况 |
| 6 GM-CSF-G22-I50免疫小鼠后的免疫保护情况 |
| 6.1 各实验组小鼠肿瘤生长特性的比较 |
| 6.2 各实验组小鼠生存状态的比较 |
| 6.3 疫苗免疫鼠肿瘤组织病理检查 |
| 6.4 疫苗免疫鼠肿瘤组织中各转录因子的表达情况 |
| 6.5 疫苗免疫鼠肿瘤组织中ITAC及脾细胞趋化因子受体CXCR3的表达 |
| 6.6 脾脏淋巴细胞培养上清中细胞因子的含量 |
| 第三节 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要的研究成果 |
（10）EJ致敏的DC疫苗对人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠的抗癌作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 正文 |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、SCID小鼠的免疫重建及其B淋巴细胞的抗癌作用（论文参考文献）
- [1]红细胞人源化小鼠模型的构建及其临床应用研究进展[J]. 刘昊川,李新贺,陈冰. 吉林大学学报(医学版), 2022(01)
- [2]肝细胞癌人源异种移植模型应用研究进展[J]. 李晓娟,冯帆,李瑞生,貌盼勇. 传染病信息, 2021(03)
- [3]二氢辣椒碱对黑素瘤细胞增殖与转移的体内外抑制作用及其机制研究[D]. 师绍敏. 河北医科大学, 2021(02)
- [4]阻断CTLA-4免疫抑制分子增强膀胱癌CD8+T淋巴细胞抗肿瘤效应的实验研究[D]. 张伟. 河北医科大学, 2020(01)
- [5]香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究[D]. 王静林. 华中科技大学, 2019(03)
- [6]抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的构建及生物活性验证[D]. 张海强. 河北医科大学, 2019(02)
- [7]巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价[D]. 谭庆龙. 广州中医药大学, 2018(01)
- [8]PSCA靶向嵌合抗原受体T细胞对前列腺癌抗肿瘤治疗的临床前研究[D]. 韩锦胜. 河北医科大学, 2017(01)
- [9]鼻咽癌双特异性抗独特型抗体疫苗的生物学活性鉴定及免疫机制研究[D]. 王甲甲. 中南大学, 2011(12)
- [10]EJ致敏的DC疫苗对人免疫重建荷人膀胱癌NOD/SCID小鼠的抗癌作用研究[D]. 周海滨. 昆明医学院, 2010(08)